A Identificação da ERGIC-53 (LMAN1) como um receptor de transporte intracellular de α1-antitripsina

Beat Nyfeler,1 Veronika Reiterer,1 Markus W. Wendeler,1 Eduard Stefan,2 Bin Zhang,3 Stephen W. Michnick,2 and Hans-Peter Hauri1


RESUMO

As proteínas secretadas são exportadas a partir do retículo endoplasmático (ER) pelo fluxo de carga e/ou transporte mediado por receptor. Nosso entendimento desse processo é limitado devido ao pequeno número de receptores de transporte identificados e as correspondentes proteínas carregadas. Nas células dos mamíferos, a proteína lectina de 53 quilo-dáltons do compartimento intermediário entre o Golgi e o ER (ERGIC-53 ou LMAN1) representa o receptor de carga melhor caracterizado. Ela ajuda na exportação de um sub-conjunto de glicoproteínas pelo Retículo Endoplasmático, incluindo os fatores de coagulação V e VIII e as catepsinas C e Z. Aqui, nós relatamos uma nova estratégia de sondagem para identificar interações de proteínas na luz da via secretória usando um ensaio de complementação de proteína baseado na proteína fluorescente amarela. Por sondagem de uma biblioteca de DNA complementar do fígado humano, nós identificamos a alfa1-antitripsina (α1-AT) como uma carga da ERGIC-53 previamente não identificada e mostramos que a captura da carga é dependente da conformação e do carbo-hidrato. As células com ERGIC-53 eliminada ou reduzida exibem um defeito específico na secreção da α1-AT que é corrigido pela reintrodução da ERGIC-53. Os resultados revelam que a ERGIC-53 é um receptor de transporte da α1-AT e proporcionam evidência direta da exportação de proteínas solúveis secretadas do ER mediada por receptor ativo nos eucariotos superiores.


INTRODUÇÃO

O lúmen (luz) do ER (Retículo Endoplasmático) proporciona um ambiente oxidativo único para o dobramento e modificação das proteínas. Uma terço de todas as proteínas recém sintetizadas são translocatadas para dentro do ER e processadas por múltiplas enimas residentes no ER. Um sistema de controle de qualidade elaborado monitora o estado conformacional das proteínas nascentes e as retém no ER durante o processo de dobramento (Ellgaard e Helenius, 2003). Quando ocorre o dobramento correto, as proteínas são exportadas do ER em vesículas de proteínas de revestimento II (COPII) (Lee e outros, 2004). Embora as proteínas transmembrana possam interagir diretamente com a malha de COPII citosólica (Barlowe, 2003), algumas proteínas solúveis do lúmen requerem receptores de carga para seu recrutamento seletivo dentro das vesículas COPII (Belden e Barlowe, 2001; Baines e Zhang, 2007). O receptor de carga melhor caracterizado é a oligomérica lectina de membrana de tipo I ERGIC-53 (Schweizer e outros, 1988). A ERGIC-53 faz ciclos entre o ER e o compartimento intermediário do Golgi e do ER (ERGIC), captura glicoproteínas solúveis no lúmen do ER, e liga-se a COPII por meio de um motivo dihidrofóbico de exportação do ER em seu caule citosólico (Hauri e outros,2000; Appenzeller-Herzog e Hauri, 2006). Como um receptor de carga, a ERGIC-53 media a exportação pelo E dos fatores de coagulação V e VIII e das catepsinas C e Z (Nichols e outros, 1998; Vollenweider e outros. 1998; Appenzeller e outros, 1999). Além disso, a ERGIC-53 foi recentemente apresentada por assistir à reunião dos polímeros da IgM no ER (Agnelli e outros, 2007).Com somente algumas proteínas carregadas pela ERGIC-53 identificadas, não se sabe, entretanto, se a exportação do ER mediada por receptor é o mecanismo de transporte predominante para o transporte de proteínas solúveis. O principal problema na identficação de complexos receptores de carga é sua natureza transitória em um ambiente iônico e oxidativo único. Além disso, as técnicas existentes em proteômica para identificação de interações proteína-proteína (ou seja, a purificação da afinidade/ espectrometria de massa ou o sistema de duas leveduras híbridas) não são facilmente aplicáveis ou não são apropriados ao estudo de proteínas de membrana. Entretanto, os ensaios de complementação de fragmento de proteína (PCAs) realmente permitem a detecção de ambas as interações transitória e dinâmica entre proteínas em células vivas intactas, incluindo aquelas para proteínas de membrana (Remy e outros, 1999; Michnick e outros, 2007). Um ensaio de complementação de fragmento de proteína (PCA) baseado em uma YFP (proteína fluorescente amarela) variante (citrina) tem-se demonstrado aplicável para interações proteína-proteína da via secretória dentro do lúmen (Nyfeler e outros, 2005). No PCAYFP, os fragmentos nos terminais N- e C- não fluoresscentes da YFP (YFP1 e YFP2) são individualmente fundidos às sequências codificadoras de duas proteínas separadas e expressados nas células mamíferas. Se as duas proteínas fundidas interagirem, os fragmentos das YFP serão trazidos à proximidade (um do outro), permitindo a dobradura e reconstituição da YFP fluorescente in vivo. Usando este ensaio específico e sensitivo, nós demosntramos que a oligomerização da ERIC-53 e suas interações com múltiplas proteínas 2 de deficiência de fator de coagulação (MCDF2) e com as catepsinas C e Z são logo visíveis nas células vivas. Aqui n´s descrevemos uma estratéia de sondagem de biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA para identificação de novas proteínas carregadas pela ERGIC-53. A verificação de uma bilbioteca de cDNA de fígado humano adulto identificou a α1-antitripssina (α1-AT) como uma nova parceira de interação da ERGIC-53 e a validação de nossos estudos estabeleceu a ERGIC-53 como um receptor de transporte para a α1-AT.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Baseados em uma estratégia de sondagem de biblioteca de cDNA de PCA em geral (Remy e Michnick, 2004a,b), nós desevolvemos uma abordagem de verificação desenhada para identificar proteínas que se ligam a receptores de carga no lúmen do ER. A ERGIC-53 foi usada como isca e foi etiquetada no N terminal com YFP2 (yellow fluorescent protein 2= proteína fluorescente amarela 2), o que localiza a YFP2 no lado luminal da membrana e permite a verificação de interações proteína-proteína dentro do lúmen do ER. Proteínas presas foram etiquetadas com YFP1 no terminal C e expressadas a partir de uma fusão de cDNA-YFP1 de uma biblioteca. Essa orientação na fusão assegura que proteínas de membrana e secretadas codificadas pela biblioteca não sejam perturbadas. Entretanto, nós não contamos com identificar os padrões de interação já conhecidos da ERGIC-53 com essa bibioteca de cDNA-YFP1 devido às características específicas dessas proteínas ou devido à orientação específica da TFP1 presa junto ao citosol. Por exemplo, o etiquetamento das catepsinas Z e C no terminal C impede a interação com ERGIC-53 (Nyfeler e outros, 2005), enquanto a MCDF2-YFP1 é improvavelmente identificada devido a suas interações com a ERGIC-5 serem estritamente dependentes da lente total da proteína MCDF2 (Nyfler e outros 2008).

Além disso, a interação da ERGIC-53 com si mesma não pode ser detectada pois a oligomerização da ERGIC-53 requer seu domínio transmembrana (Nufer e outros,2003), o qual localiza a YFP1 de todas as proteínas YFP1-ERGIC-53 competentes na oligomerização e presas ao citosol. Esse requerimento topológico específico do compartimento é uma característic única da abordagem de PCA, proporcionando informação sobre a orientação de proteínas presas associadas à membrana. Nossa estratégia de etiquetamento do terminal C requer que as inserções à biblioteca careçam de seu códon finalizador para evitar o término da tradução antes da sequencia da YFP1. Para este fim, nós usamos cDNAs gerados por transcrição reversa de mRNA iniciada aleatóriamente, o que enriquece as extremidades 5’. Os cDNA intercalados foram sub-clonados de uma biblioteca de cDNA de fígado adulto humano dentro de vetores de expressão pcDNA3 contendo a YFP1 em todas as três sequências de leitura. A biblioteca de cDNA-YFP1 resultante continha aproximadamente 106 clones e os inseridos alternavam de 1 a 2,5 quilobases de tamanho aproximadamente. Como de se esperar para uma biblioteca gerada a partir de um tecido de secreção como o fígado, os cDNA codificadores de proteínas secretadas foram bem representados.

A sondagem da biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA foi desempenhada em células COS-1 (de rins de macaco verde africano), as quais expressam o grande antígeno T e replicam plasmídios contendo a origem de replicação do SV40 eucariótico.
[OBS.: O virus símio 40 (SV40) e o Vírus Polioma do camundongo (PY) são viroses de tumor de pequeno DNA que têm sido extensivamente usadas para estudar a transformação celular. A primeira região do SV40 codifica três antígenos de tumor, o grande T (LT), o pequeno T (ST) e o 17KT que contribuem para a transformação celular. Enquanto o PY também codifica o LT e o ST, o médio T (MT) sozinho gera a maior parte da atividade de transformação. A transformação mediada pelo LT do SV40 requer a ligação a proteínas de supressão tumoral Rb e p53 no núcleo e a ligação do ST à proteína fosfatase PP2A no citoplasma. O LT do SV40 também se liga a várias proteínas celulares adicionais incluindo p300, CBP, Cul7, IRS1, Bub1, Nbs1 e Fbxw7 que contribuem para a transformação pelo vírus. A transformação pelo MT do PY é dpendente da ligação à PP2a e às proteínas da família das cinases de tirosina Src (PTK) e da reunião de um complexo de sinalização nas membranas da célula que leva à transforação de modo similar a Her2/neu. A fosforilação dos resíduos de tirosina da MT ativa moléculas de sinalização chaves incluindo Shc/Grb2, PI3K e PLCgama1. As contribuições únicas do LT e ST do SV40 e do MT do PY para a transformação celular tem proporcionado significativos esclarecimentos para nossa compreensão dos supressores de tumor, oncogenes e processos de oncogênese. PMID: 19505649 ]


Devido à essa característica, os plasmídios de bibliotecas de cDNA-YFP1 serão replicados na transfecção, o que assegura a expressão suficiente de proteínas roubadas (as proteínas do plasmídio) individuais e simplifica a recondução e análise de clones positivos. A co-expressão de YFP2-ERGIC-53 e da biblioteca de cDNA-YFP1 resultou na detecção de 1,63% de células COS-1 fluorescentes amarelas, e a YFP PCA pode fartamente contabilizar para o sinal detectado pois poucas células positivas foram obtidas na expressão de YFP2-ERGIC-53 ou da biblioteca de cDNA-YFP1 sozinhas. Na seleção, a YFP2-ERGIC-5 e o cDNA-YFP1da biblioteca foram transfectadas em uma razão de 10:1 para reduzir o número de plasmídios da biblioteca transfectados por célula. Isso baixou a porcentagem de células positivas para o,12% (dados não publicados). Várias centenas de células YFP positivas foram coletadas por FACS e clones presas foram reconduzidos, 48 dos quais foram individualmente reanalizados por YFP PCA em células COS-1. A co-expressão com YFP2-ERGIC-53 resultou em sinais YFP positivos para os plasmídios presas numerados com 17, 32, 33 e 44. A recondução de somente 4 positivos fora dos 48 plasmídios presa reanalidados não foi devida ao inespecificidade de nosso ensaio porém mais à captura de vários plasmídios presas por célula transfectada. Uma célula YFP positiva contém o plasmídio presa positivo tanto como muitos plasmídios negativos co-transfectados, os quais serão subsequentmente reconduzidos também.

Análises de sequência de DNA identificaram a α1-AT como o cDNA correspondente inserido nos plasmídios presa 17, 32, 33 e 44. Dois tipos de α1-AT inseridos foram encontrados, um de 1294 pares de base e uma variante de 1297 pares de base. Ambos os inseridos estava em sequencia e cobriram a sequencia codificadora completa da α1-AT com a exceção dos dois últimos aminoácidos do terminal C. A interação da ERGIC-53 com a α1-AT foi validade pelo YFP PCA nas células HeLa usando a lente total da α1-AT etiquetada no terminal N com YFP2.



A α1-AT é uma glicoproteína do fígado de 52 quilo-dáltons carregando três glicanos ligados na ponta N. Após sua síntese nos hepatócitos, a α1-AT é secretada no sangue, onde atua como uma protease inibidora de serina, principalmente contra a elastase do neutrófilo. Como uma doas maiores proteínas sintetizadas no fígado, a α1-AT é aceitavelmente altamente abundante em nossa biblioteca não normalizada. Quando a YFP-ERGIC-52 e o cDNA-YFP1 da biblioteca foram expressados nas células COS-1 após o silenciamento da α1-AT mediado por siRNA, uma redução de 30 a 50% das células YFP positivas foi observada (dados não publicados). Assim, a α1-AT parece ser responsável por mais da metade de todas as células YFP positivas em nossa verificação (Gross e outros 1982) e foi sugerido que os glicanos em N- podem servir como sítios de reconhecimento para um receptor de transporte do ER para o Golgi (Lodish e Kong, 1984). Será a ERGIC-53 um receptor de transporte para a α1-AT? Primeiro nós analisamos a especificidade do carbohidrato da interação ERGIC-53- α1-AT através da execução de um YFP PCA com a ERGIC-53 mutante em N156A e um triplo mutante de N10,107,171Q. A ERGIC-53N156A é incapaz de ligar-se aos oligossacarídeos ligados em N- nas glicoproteínas (Appenzeller e outros,1999) e a α1-ATn70,107,271Q permanece não glicosilada devido à mutagênese direcionada ao sítio dos três sítios de consenso de glicosilação do N-. Em comparação a suas equivalentes de tipo selvagem, a ERGIC-53N156A e a α1-AT N70,107,271Q mostraram uma marcada redução no sinal de YFP PCA. Esses achados sugerem que a ERGIC-53 liga-se a α1-AT de um modo dependente de carbohidrato. Nós também analisamos singularmente os mutantes N70Q, N107Q e N271Q de α1-AT e achamos que a mutagênese do segundo sítio de glicosilação em N- (N107Q) tem o efeito mais forte na interação entre a ERGIC-53 e a α1-AT [obs.: deve ser a mutação que mais prejudica a interação dessas proteínas.] Esse resultado está em total acordo com um estudo prévio mostrando que a α1-AT mutante N107Q tem um tempo de retenção intracelular significativamente mais longo do que outras mutações (Samandari e Brown, 1993). Interessantemente, todos os três sítios de glicosilação singular em N- mutantes tem taxas de degradação similares e solubilidade (Samandari e Brown, 1993). Consequentemente, o carbohidrato fixado na N107 (asparagina107) é particularmente importante para a exportação pelo ER.



Depois nós endereçamos a especificidade da conformação da interação ERGIC-53- α1-AT pela análise de duas versões da α1-AT dobradas erradamente conhecidas como as mutantes (α1-ATZ) e Hong Kong (α1-ATHK) (Stoller e Aboussouan,2005). Embora a α1-ATHK seja solúvel e degradada pela degradação associada ao ER envolvendo o proteassomo [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).], a α1-ATZ se agrega no ER e é submetida à deradação pelo proteossoma e pelo lisossomo (Cabral e outros, 2000; Teckman e outros, 2001).Notavelmente, em nosso YFP PCA, nem a α1-ATHK nem α1-ATZ ligaram-se à ERGIC-53. A α1-ATZ foi expressada em níveis intracelulares similares à YFP2- α1-ATWT e não foi afetada pelos dois inibidores de degradação proteassômica [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).] a Lactacistina (lactacystin) e a cifunensina (Kifunensine). Nós não pudemos descartar a possibilidade de que a agregação diminua o volume da ERGIC-53 solúvel ligando-se a α1-ATZ competente, dessa forma reduzindo o sinal YFP PCA. No caso da α1-ATHK, a inibição da degradação proteassômica pela lactacistina e cifunensina claramente aumentaram os níveis de YFP- α1-ATHK. Embora a quantidade de YFP2- α1-ATHK fosse desse modo restaurada àquela do manipulado de tipo selvagem, o sinal YFP PCA não foi aumentado. Esses dados sugerem que a interação ERGIC- α1-AT é dependente da conformação e sustenta uma função da ERGIC-53 de controle secundário de qualidade pela captura apenas das proteínas nativas de carga para exportação pelo ER (Ellgaard e Helenius,2003; Appenzeller-Herzog e outros, 2005).

Para confirmar que a ERGIC-53 captura a α1-AT para exportação pelo ER, nós analisamos o transporte da α1-AT endógenos em células HepG2 nas quais a ERGIC-53 foi derrubada por siRNA. O silenciamento da ERGIC-53 por 96 horas reduziu os níveis totais da proteína ERGIC-53 para menos de 20%. Intrigantemente, a derrubada da ERGIC-53 levou a uma acumulação de α1-AT em estabilidade dentro da célula. Esse efeito foi analisado além pelo estudo de transporte e secreção da α1-AT em experimentos de pulso de perseguição usando [S] metionina. A α1-AT é sintetizada como uma glicoproteína com muita manose, é submentida a complexa glicosilação no Goli, e é subsequentemente secretada no meio de cultura. Nas células HepG2 transfectadas com siRNA de controle, a α1-AT de alta manose foi rapidamente convertida nessa forma de complexo glicosilado e aproximadamente metade das proteínas foi secretada após 30 minutos de perseguição. Em contraste, nas células com a ERGIC-53 silenciadas, a α1-AT permaneceu consideravelmente mais tempo em sua forma de muita manose e somente aproximadamente 15% da proteína foi secretada após 30 minutos. A secreção ineficiente da α1-AT não é causada por um defeito geral na secreção porque a secreção da albumina endógena não foi alterada. Além disso, estudos prévios nas células HeLa tem realmente mostrado que nem a depleção nem a localização errada da ERGIC-53 mudam a morfologia da via secretora ou afetam a secreção de toda a proteína. Consequentemente, níveis reduzidos de ERGIC-53 retardam significativamente a secreção da α1-AT de maneira específica.

Para determinar se a secreção remanescente da α1-AT é causada por uma ERGIC-53, nós estudamos o transporte da α1-AT transfectada para dentro de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) derivados de camundongos sem ERGIC-53 (-/-) e camundongos de tipo selvagem (+/+). Os experimentos de pulso de perseguição revelaram um intervalo de secreção de aproximadamente 60 minutos nas células MEFs. As células MEFs sem ERGIC-53 secretaram no mesmo tempo somente aproximadamente 25% das α1-AT recém sintetizadas e mostraram uma conversão significativamente mais lenta da forma de muita manose para complexo glicosilado da α1-AT. O defeito da secreção em geral pode ser excluído novamente por as MEFs sem ERGIC secretaram fibronectina endógena como as MEFs de tipo selvagem. Esses resultados demonstram que a secreção de α1-AT é significativamente atrasada sem a ERGIC-53 mas que uma alternativa menos eficiente na via de exportação do ER existe.


Se a ERGIC-53 é um receptor de transporte para a α1-AT, a reintrodução da ERGIC-53 certamente corrigirá a secreção defeituosa da α1-AT nas células sem ERGIC-53. De fato, quando a ERGIC-53 humana foi co-expressada com a α1-AT, a α1-AT intracelular foi consideravelmente reduzida nas células MEFs -/- num estado estável. Além disso, a ERGIC-53 aumentou a secreção da α1-AT nas MEFs -/- para o nível das MEFs +/+ após uma hora de perseguição. Consequentemente, a sobre-expressão da ERIC-53 nas MEFs sem ERGIC-53 podem restaurar a secreção de α1-AT completamente. Estudos prévios sobre a função da ERGIC-53 foram baseados principalmente em análises genéticas (Nichols e outros; 1998), estudos de transporte com uma ERGIC-53 mutante retida no ER dominante-negativa (Vollenweider e outros, 1998; Appenzeller e outros, 1999 ), ou a caracterização das interações da ERGIC-53 com as cargas (Appenzeller e outros 1999; Appenzeller-Herzog e outros, 2005; Nyfeler e outros,2005; Zhang e outros, 2005). Os estudos correntes proporcionam agora a evidência direta para uma exportação pelo ER mediada por receptor ativo de proteínas secretadas nas células dos mamíferos. Além disso, nossos dados indicam que os receptores de transporte dão ao transporte de carga mais rapidez e eficiência, mas o transporte de carga não é inteiramente bloqueado na sua ausência. A α1-AT pode possuir um Segundo receptor de transporte ou pode sair do ER por um fluxo volumoso de certa extensão. A abordagem de seleção que nós descrevemos aqui pode ser igualmente aplicada usando-se a α1-AT como uma isca para identificar novos receptores de carga. Com a α1-AT, nós agora identificamos um atrativo modelo de proteína secretada para estudar o mecanismo de exportação de proteína do ER mediado por receptor, em detalhes.


Em conclusão, esse estudo não somente identifica um receptor de transporte intracelular de α1-AT mas também abre uma avenida sem precedentes para a sondagem do genoma em sua amplitude nas interações proteína-proteína na via de secreção. A identificação profícua de uma nova proteína de carga da ERGIC-53 por sondagem de uma fusão do complexo de cDNA-YFP1 com biblioteca baseada em YFP PCA proporciona uma estratégia geral para identificar novos complexos protéicos no lúmen. Com bibliotecas normalizadas e condições ótimas de transfecção, a seleção por saturação e amplo genoma será executável no futuro próximo. Adicionalmente, a YFP PCA tem um potencial promitente para sondagen de alta produtividade de chaperones (proteínas acompanhantes) químicas e moleculares (Burrows e outros,2000) que pode resgatar defeitos de conformação (dobramento) de α1-AT mutantes e fornecer-lhes a secreção competente pela promoção de sua interação com ERGIC-53.

NOTAS
Abbreviations used in this paper: α1-AT, α1-antitrypsin; COPII, coat protein II; ERGIC, ER Golgi intermediate compartment; MCFD2, multiple coagulation factor deficiency protein 2; MEF, mouse embryonic fibroblast; PCA, protein fragment complementation assay.

FONTE:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=18283111