Domesticando a víbora: Novos Genes Eucariotos Oriundos de Viroses de RNA
Eugene V Koonin
RESUMO
Genomas de várias especies de leveduras contém cópias de DNA integradas de genomas completos ou genes individuais de viroses de RNA de fita dupla não retrovirais como relatado em um artigo recente da BMC Biology por Taylor e Bruenn. As sequências específicas de vírus integradas são ao menos parcialmente expressadas e parecem evoluir sob pressão da seleção de purificação, indicando que esses genes são funcionais. Junto com relatos similares sobre cópias integradas de algumas viroses de RNA de animais, esses resultados sugerem que a integração de cópias de DNA de viroses de RNA não reversamente transcritas deveriam se muito mais comuns do que o se pensava previamente.
COMENTÁRIO
Em um recente artigo na BMC Biology, Taylor e Bruenn pela primeira vez relataram um estudo molecular e evolutivo detalhado dos genes de vírus de RNA não retrovirais integrados dentro dos genomas eucariotos (mais adiante NIRV, viroses de Rna integradas não retrovirais). As conclusões são não menos que atordoantes: os NIRV são não somente difundidos nos fungos como também eles se tornaram legítimos genes funcionais. Para viroses retróides, a integração dentro do DNA genômico do hospedeiro é um estágio regular do ciclo reprodutivo e as sequências derivadas de retro-elementos compreendem quase a metade do DNA genômico dos mamíferos e, surpreendentemente, mais de 75% do DNA genômico em algumas plantas como o milho; nos genomas fungosos mais compactos, as sequências derivadas de retro-elementos são menos abundantes mas também comums.
Até agora, o NIRV tem sido uma história completamente diferente: fidedígnos relatos da integração de cópias de DNA de genes de vírus de RNA não retrovirais dentro dos genomas dos hospedeiros podem ser contados nos dedos da mão. A idéia de que transcriptase reversa (RT) presente nas células eucarióticas poderia produzir NIRV foi defendida primeiramente por Zhdanov logo após a RT ter sido descoberta, seguida de reportagens sobre cópias integradas de várias viroses diversas de RNA de fita única. Entretanto, essas reportagens não foram confirmadas independentemente, com uma notável exceção em que sequências específicas de vírus integrados foram descobertas em camundongos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica (CLMV), levando à intrigante hipótese de que cópias integradas deveriam ter contribuído para a imunidade vitalícia de animais sobreviventes. Mais recentemente, longas sequências integradas, aparentemente derivadas de um novo flavivírus, foram detectadas nos genomas dos mosquitos Aedes albopicus e do Aedes aegypti. A mudança do curso do NIRV parece vir do recente trabalho de Frank e Wolfe que observaram os genomas disponíveis de Hemiascomycete fungi (Saccharomycotina) para sequências homólogas àquelas das viroses e plasmídios, e detectaram em torno de 10 inserções derivadas de viroses de RNA de dupla fita, a classe dominante das viroses de RNA de fungos, em cinco espécies de fungos. O trabalho de Taylor e Bruenn extende os resultados de Frank e Wolfe através de uma caracterização detalhada dos NIRV derivados de uma família específica de viroses de dsRNA (Totiviridae, tipificado pelo vírus L-A da Saccharomyces cereviciae) em cinco genomas de fungos, alguns dos quais carregam cópias completas dos genomas virais enquanto outros possuem somente genes virais individualmente, e adiciona vários achados chave que demonstram a relevância biológica dos NIRV. Primeiro, Taylor e Bruenn provaram inequivocamente que existe integração dos genomas virais de dupla fita de RNA nos genomas dos fungos pela análise da reação em cadeia da polimerase das fronteiras entre a cópia do genoma do vírus integrado e o DNA do hospedeiro; a identificação de sequências quiméricas leva à ausência de dúvida de que sequências específicas de vírus estão, de fato, integradas ao genoma do fungo. Segundo, mostrou-se que os NIRV são completamente, ou parcialmente, transcritos em mRNAs poliadenilados mas nenhuma partícula de dsRNA ou viral é formada. Terceiro, análises filogenéticas mostram que as sequências dos NIRV de fungos relativamente distantes formam clados distintos nas árvores de proteínas homólogas de totiviroses exógenas (a proteína do capsídio (CP) e a RNA polimerase dependente de RNA (RdRp)) sugerindo que os NIRVs se espalham por transferência horizontal de genes (HGT) entre os fungos. Quarto e talvez o mais notável, uma comparação das sequências dos NIRV de diferentes espécies de fungos mostra que suas taxas de subsstituição de nucleotídeos não sinônimos para sinônimos (Kn/Ks) é significativamente menos que 1 o que é evidência da evolução sob a pressão da seleção purificadora (embora, julgando a partir dos valores de Kn/Ks, essa pressão é relativamente fraca). O trabalho de Taylor e Bruenn não proporciona nenhuma pista direta do mecanismo de integração do NIRV mas não resta dúvida de que a transcrição reversa toma parte, mais provavelmente, com a RT proporcionada por retroelementos Ty. Muito recentemente, o papel dos retro-transposons endógenos na integração do LCMV nos camundongos foi mostrado diretamente.
Tomados juntos, esses resultados indicam que o NIRV nos genomas fungosos codifica proteínas funcionais. Então quê funções poderiam ter estas (proteínas)? Uma possibilidade bastante óbvia é a proteção contra infecção com viroses exógenas e os resultados de Taylor e Bruenn proporcionam alguma sustentação para essa hipótese. Em adição à sua função como proteína do capsídeo, a CP do totivírus também é uma enzima que intativa mRNAs do hospedeiro pela remoção de seu capuz na extremidade 5’ (enzima desencapusadora). A comparação dos NIRVs com sequências homólogas de totiviroses exógenas mostra que os resíduos de aminoácidos requeridos para a atividade desencapuzante são principalmente substituídos nos NIRVs , de acordo com a possibilidade de a CP codificada pelo NIRV ser um inibidor dominante negativo da encapsulação do vírus; tal função também é compatível com a duplicação do gene da CP em alguns genomas de fungos. Em contraste, a RdRp do NIRV, ao menos a versão do Debaryomyces hansenii que está disponível no GenBank retém os resíduos catalíticos (EVK, observações não publicadas), sugerindo que poderiam estar enzimaticamente ativos. Uma especulação intrigante é que a RdRp do NIRV poderia contribuir para a imunidade antiviral pela amplificação de transcritos específicos do vírus que deveriam proteger a célula por via do mecanismo de RNA de interferência. É claro que é impossível excluir que os NIRVs e seus produtos protéicos possuam outras funções celulares normais em adição a ou mesmo ao invés de seu suspeito papel na imunidade antiviral. Entretanto, a distribuição esporádica do NIRV no genoma do fungp e, ainda mais importante, sua distribuição aceitavel pela via da HGT parece ter melhor compatibilidade com a hipótese da imunidade. A possibilidade de que os NIRVs dos fungos proporcionam resistência contra viroses exógenas os põe dentro do contexto do desabrochar da área de pesquisa da ‘imunidade baseada na integração’. Uma nova forma de imunidade antiviral adaptativa adquirida que foi recentemente descoberta na bactéria e na archaea é mediada pelas então chamadas sistema CRISPR (repetições palindrômicas curtas interespaceadas regularmente em conjunto). Esse sistema funciona pela integração de pequenos segmentos de DNA de vírus (bacteriófagos) dentro de lócus específicos do genoma do hospedeiro e os utiliza para impedir a replicação do vírus cognato, mais provavelmente por via do mecanismo de tipo RNA de interferência. O sistema CRISPR em funcionamento envolve um mecanismo molecular especializado intrincado mediado pelos genes Cas (associados a CRISPR). A imunidade mediada pelo NIRV, se for um fenômeno real, parece jazer em um mecanismo mais genérico de expressão regular de genes. O princípio da imunidade adquirida, não obstante, permaneceria o mesmo: captura de sequências específicas do vírus e seu uso subseqüente contra o vírus. A imunidade baseada na integração deve ser ainda mais comum: relatos recentes revelam múltiplas insersões de sequencias de para-retrovírus em um genoma de videira, uma planta que parece ser resistente à viroses ativas desse grupo e inserções de curtos fragmentos de ambos os genomas virais em RNA e DNA em insetos e crustáceos. Uma tentativa de especulação geral é que a integração de sequências específicas dos vírus no genoma do hospedeiro resultando na imunidade adquirida seja uma rota ubíqua da interação vírus-hospedeiro que é manifestada através de abundantes mecanismos específicos.
A segunda mensagem importante da história do NIRV é a relativamente recente aparição da HGT entre os fungos. A prevalência e os papéis da HGT na evolução eucariota é uma matéria bastante controversa, com relativamente poucos casos vestidos de ferro. Entretanto, as observações sobre os NIRVs, sobre as quais as recentes demonstrações de múltiplas aquisições de genes bacterianos pelos fungos mostra que, embora a HGT seja provavelmente muito menos penetrante nos eucariotos do que nos procariotos, o seqüenciamento de múltiplos genomas eucariotos diversos revela um substancial tráfego genético lateral. Com o advento da nova geração dos métodos de seqüenciamento, a genômica está se expandindo rapidamente, e não há duvida de que nós seremos muito mais surpreendidos.
ABREVIATURAS
CP: capsid protein; CRISPR: cluster regularly interspersed short palindromic repeats; ds: double stranded; HGT: horizontal gene transfer; NIRV: non-retroviral integrated Rna viruses; LCMV: lymphocytic choriomeningitis virus; RdRp: RNA-dependant RNA polymerase; RT: reverse transcriptase.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2823675/?tool=pubmed
domingo, 28 de fevereiro de 2010
Beta-Glicanas
Β-Glicanas (beta-glicanas) são polissacarídeos de monômeros de Dlglicose ligados por pontes glicosídicas. As beta-glicanas são um grupo diversificado de moléculas que podem variar em relação à massa molecular, solubilidade, viscosidade e em sua configuração tridimensional. Elas ocorrem mais comumente como celulose nas plantas, o farelo de certos grãos, a parede celular de leveduras de fermento de pão, certos fungos, cogumelos e bactérias. Algumas formas das beta-glicanas são úteis à nutrição humana como agentes de texturização e como suplemento de fibras solúveis, mas podem ser problemáticas no processo de fermentação.
As beta-glicanas das leveduras e dos cogumelos medicinais são notáveis por sua habilidade de modular o sistema imune. Pesquisas tem mostrado que beta-glicanas insolúveis (1,3/1,6) , têm maior atividade biológica que as beta-glicanas (1,3/1,4). As diferenças entre as ligações das beta-glicanas e sua estrutura química são significativas com respeito à solubilidade, modo de ação, e atividade biológica em geral.
As glicanas são polissacarídeos que só contém glucose enquanto seus componentes estruturais, e estão ligadas com pontes beta-glicosídicas.
Em geral, distingue-se entre as pontes alfa e beta-glicosídicas, dependendo em se os grupos substituintes nos carbonos flanqueando o anel de oxigênio estão apontando nas mesmas direções ou direções opostas no padrão de fermentação dos açúcares. Uma ligação alfa-glicosídica para um D-açúcar emana sob o plano do açúcar, visto que o hidroxil (ou outro grupo substituinte) em outro carbono aponta sobre o plano (configuração oposta), enquanto a ponte beta-glicosídica emana por cima deste plano.
http://www.biosolutions.info/2010/02/beta-glucan-video.html
Beta-Glicanas MH3 – Sistema Imune
As beta glicanas são conhecidas como “modificadores de resposta biológica” devido à sua habilidade de ativar o sistema imune. Imunologistas na Universidade de Louisville descobriram que um receptor na superfície das células do sistema imune inato chamado receptor do complemento 3 (CR3 ou CD11b/CD18) é responsável pela ligação a beta-glicanas, permitindo às células imunes reconhecerem-nos como “não próprios”. Entretanto, poder-se-ia notar que a atividade das beta-glicanas é diferente a partir de algumas drogas farmacêuticas que têm a abilidade se sobre-estimular o sistema imune. Drogas farmacêuticas têm o potencial de induzir o sistema imune à sobre-estimulação, e então são contra-indicadas para indivíduos com doenças auto-imunes, alergias ou infecções por leveduras. As beta-glicanas parecem fazer o sistema imune trabalhar melhor sem se tornar super-ativo. Em adição ao aumento da atividade do sistema imune, as beta-glicanas também notoriamente reduzem os níveis de colesterol elevado, auxiliam na cicatrização de feridas, ajudam a prevenção de infecções, e têm potencial como um adjuvante no tratamento do câncer.
Beta-glicanas, como as lentinanas (derivadas do cogumelo Shiitake) [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8b/Lentinan.png] e polissacarídeos K têm sido usadas como uma terapia imuno-adjuvante para o tratamento do câncer desde 1980, primeiramente no Japão. Existe uma grande coleção de pesquisas que demonstra que as beta-glicanas têm atividade anti-tumoral e anti-cancerígena. Em um estudo com modelo de camundono, a glicana 1,3 com o interferon gama inibiu tumores e a metástase no fígado. Em alguns estudos, as glicanas 1,3 beta aumentaram os efeitos da quimioterapia. Em experimentos com câncer, usando-se um camundongo como modelo, a administração de ciclofosfamida [um agente alquilante com atividade anti-tumoral e empregos similares aps da substância original, a mostarda nitrogenada (cloridrato de mecloretamina); também é supressor da atividade das células B e da produção de anticorpos, sendo usada no tratamento das doenças auto-imunes. Stedman. Alquilação é a introdução de um radical alquila e alquila é o radical formado com a retirada de um hidrogênio de um hidrocarboneto alifático. Dic. Aurélio], em conjunção com as glicanas 1,3 beta derivadas de leveduras resultou na redução da mortalidade. Em pacientes humanos com câncer gástrico ou colo-retal, a administração das glicanas 1,3 beta dos cogumenos Shiitake, em conjunção com a quimioterapia resultou no prolongamento do tempo de vida.
Estudos pré-clínicos mostraram que uma beta-glicana solúvel produto da levedura, denominada PGG, quando usada em combinação com certos anticorpos monoclonais ou vacinas para câncer, oferecem significativas melhoras no tempo de vida em contraste com os anticorpos sozinhos. Esse benefício, entretanto, não resulta da Betafectina aumentando a ação predadora específica dos anticorpos. A atividade anti-tumoral é causada por um mecanismo de morte celular único que envolve os neutrófilos que são forçados a atuar pela Betafectina e que normalmente não estão envolvidos na luta contra o câncer. Recentes pesquisas de Hong e outros demonstram que esse mecanismo de ação é efetivo contra um largo espectro de cânceres quando usado em combinação com anticorpos monoclonais específicos que ativam ou levam o complemento a se ligar ao tumor. O complemento habilita esses neutrófilos forçados a acharem e se ligarem ao tumor, o que facilita a morte tumoral. As células do sistema imune inato são a primeira linha de defesa do corpo e circulam por todo o corpo engajando uma resposta contra “estranhos” desafiadores (bactérias, fungos e parasitas). Tipicamente, os neutrófilos não são envolvidos na destruição dos tecidos cancerosos porque essas células imunes vêem o câncer como “próprio” mais do que como estranhos ou “não-próprio”. As imunoterapias correntes para o câncer envolvem anticorpos monoclonais e vacinas, os quais estimulam a resposta imune adquirida, mas não fazem nada para mudar a identificação do câncer como “próprio” pelas células do sistema imune. Como resultado, os anticorpos monoclonais sozinhos não engajam ou iniciam a potencial capacidade de assassinato das células tumorais pelas células do sistema imune, que é a nossa primeira defesa contra infecções por bactérias e leveduras (fungos).
O Dr. Gordon Ross e o Dr. Vaclav Vetvicka, respeitados imunologistas e pesquisadores do câncer na Universidade de Louisville, descobriram que um receptor na superfície dessas células imunes inatas chamado Receptor de Complemento 3 (CR3 ou CD11b/CD18) era responsável pela ligação ao fungo ou à levedura, permitindo às células imunes reconhecerem-nas como “não-próprias”. Esse receptor é um receptor de dupla ocupação pois ele tem dois sítios de ligação. O primeiro sítio é responsável pela ligação a um tipo de complemento, um proteína solúvel do sangue, conhecida como C3 (ou iC3b).
O C3 é fixado aos patógenos que anticorpos específicos tenham mirado e opsonizado. O segundo sítio desse receptor se liga a um carbohidrato nas células de leveduras e fungos e permite que as células do sistema imune reconhecerem as leveduras e os fungos como “não-próprios”. Ambos esses sítios receptores devem ser simultâneamente ocupados para disparar a célula imune inata na destruição das leveduras e fungos. Primeiro, o corpo usualmente não gera anticorpos naturais suficientes para se ligarem ao tumor, e isso impede a ativação e fixação do complemento na superfície da célula cancerígena. Por isso, os neutrófilos não se ligam ao câncer pela via desse sítio receptor do CR3. O segundo obstáculo é que ainda quando a resposta de anticorpos naturais é suplementada com anticorpos monoclonais que fixam o complemento e a ligação ocorre no primeiro sítio, os tumores não contém carbohidratos estranhos servindo como um “segundo sinal” em sua superfície que permita aos neutrófilos reconhecerem o câncer como “não-próprio”. Outros receptores humanos tem sido identificados como habilitados a receberem sinais de beta-glicanas tais como Dectina-1, lactosilceramida, e receptores de células mortas.
O Dr. Ross descobriu que um fragmento bio-processado chamado PGG liga-se especificamente ao Segundo sítio do receptor CR3 nos neutrófilos. Quando os neutrófilos se ligam aos tumores, a Betafectina os permite “verem” o câncer como se fosse um patógeno como a levedura ou o fungo e proporciona o “segundo sinal” para matarem-no. Em resumo, a Betafectina atrai os neutrófilos à luta contra o câncer, aumentando dramática e sinergisticamente a efetividade da ativação do complemento pelos anticorpos monoclonais e vacinas através de diferentes mecanismos de extermínio.
Pesquisas multinacionais têm demonstrado sucessivamente que a forma oral da Beta 1,3-D glicana da levedura tem efeitos protetores similares ao da versão injetada, inclusive a defesa contra doenças infecciosas e câncer. Recentemente, as glicanas entregues oralmente foram encontradas aumentando significativamente a proliferação e ativação dos monócitos no sangue periférico de pacientes com câncer de mama avançado.
A tecnologia tem ampla aplicabilidade para a terapia do câncer. Cada forma de célula de tumor cancerígena tem antígenos específicos na superfície celular, alguns dos quais são comuns a outros tipos de câncer. (Exemplo: a mucina 1 está presente em aproximadamente 70% de todos os tipos de célula do câncer.) Diferentes imunoterapias miram antígenos diferentes para a ligação de anticorpos monoclonais às células de tumor. Isso tem resultado no desenvolvimento de milhares de anticorpos monoclonais, muita mira sobre diferentes antígenos específicos nas células do câncer. Em estudos com pesquisa, a Betafectina tem melhorado a efetividade de todos os anticorpos monoclonais ativadores do complemento testados inclusive nos cânceres de mama, fígado e pulmões. A magnitude do sucesso varia com base em anticorpos monoclonais específicos usados e o tipo de câncer.
PREVENÇÃO DA INFECÇÃO
Até a presente data têm havido numerosos estudos e testes clínicos conduzidos com a beta-glicana solúvel da levedura e o composto de glicana completa (substância composta de partículas separadas). Esses estudos têm-se alternado do impacto da beta-glicana nas infecções hospitalares pós-operatórias até o papel das beta-glicanas de levedura no tratamento de infecções por antrax. [Obs.: Bacillus anthracis – a virulência depente da cápsula bacteriana e do complexo da toxina. A cápsula é um poli-D-ácido glutâmico que protege contre a fagocitose leucocitária e a lise. http://emedicine.medscape.com/article/830004-overview]
Infecções pós-cirúrgicas são um sério desafio que se segue às principais cirurgias com taxa estimativa de 25 a 27% após a cirurgia. As tecnologias Alfa-Beta conduziram uma série de testes clínicos em humanos nos anos noventa para avaliar o impacto da terapia com beta-glicana no controle de infecções em pacientes cirúrgicos de alto risco. No teste inicial, trinta e quatro pacientes foram aleatóriamente (dupla blindagem, e placebos de controle) designados para grupos de tratamento ou de placebos. Os paciente que receberam glicana PGG tiveram significativamente menos complicações infecciosas do que o grupo placebo (1,4 infecções por paciente infectado para o grupo da glicana PGG versus 3,4 infecções por paciente infectado para o grupo placebo). Dados adicionais dos testes clínicos revelaram que houve diminuição no uso de antibióticos intravenosos e estadias mais curtas na unidade de tratamento intensivo para pacientes que recebiam a glicana PGG versus pacientes que recebiam placebo.
Um teste clínico humano subsequente estudou ainda mais o impacto da beta-glicana na redução da incidência de infecção com pacientes de cirurgia da alto risco. Os autores encontraram um resultado similar com a tendência da resposta à dose (doses mais altas proporcionavam maior redução na ocorrência de infecções do que doses menores). No teste clínico humano, 67 pacientes foram escolhidos aleatoriamente e receberam tanto uma dose de placebo quanto doses de 0,1; 0,5; 1,0; ou 2,0 miligramas de glicana PGG por quilo de massa corporal. Infecções sérias ocorreram em quatro pacientes que receberam o placebo, três pacientes que receberam a dose mais baixa (o,1 mg/kg) de glicana PGG e somente uma infecção foi observada nas doses mais altas de 2,o mg/kg de glicana PGG.
Os resultados da terceira fase do teste clínico humano mostraram que a terapia dom glicana PGG reduziu sérias infecções pós-operatórias em 39% após as operações de alto risco não colo-retais. Esse estudo foi conduzido em pacientes que já estavam em alto risco por causa do tipo de cirurgia e eram mais suscetíveis a infecções e outras complicações.
Neste ponto do desenvolvimento de uma forma injetável da b-glicana (Betafectina glicana PGG) a maioria dos cientistas já concluíra que a glicana beta derivada da levedura promovia a fagocitose e a morte subseqüente da bactéria patogênica. Um teste clínico de fase III foi proposto e conduzido em trina e nove centros médicos nos Estados Unidos envolvendo 1.249 indivíduos estratificados conforme fossem pacientes cirúrgicos colo-retais e não colo-retais. A glicana PGG foi dada pré-operatoriamente uma vez e três vezes pós-operatoriamente a zero, 0,5 ou 1,0 mg/kg de peso corporal. A medida do resultado foi séria infecção ou morte de sujeitos dentro de 30 dias após a cirurgia. Os resultados dos testes clínicos de fase III mostraram que a terapia com glicana PGG injetável reduziu sérias infecções pós-operatórias em 39% após operações de alto risco não colo-retais.
Há estudos com modelos humanos e animais que sustentam ainda mais a eficácia de glicanas beta no combate de várias doenças infecciosas. Um estudo sobre humanos demonstrou que o consumo oral de partículas de glicanas integrais aumentou a habilidade das células imunes em ingerir a bactéria desafiadora (fagocitose). O número total de células fagocíticas e a eficiência da fagocitose na saúde humana dos participantes do estudo aumentou enquanto consumiam uma partícula de beta-glicana de levedura comercializada. Esse estudo demonstrou o potencial da beta-glicana de levedura em aumentar a taxa de reação do sistema imune aos desafios infecciosos. O estudo concluiu que o consumo oral de partículas de glicanas integrais representava um bom estímulo da imunidade natural.
O Anthrax é uma doença que não pode ser testada em estudos humanos por motivos óbvios. Em um estudo concluído pelo Departamento de Defesa do Canadá, o Dr. Kournikakis mostrou que beta glicanas de levedura administrados oralmente dados com ou sem antibióticos protegeram camundongos contra a infecção por Anthrax. Uma dose de antibióticos junto com partículas de glicana integrais (2 mg/Kg de massa corporal ou 20 mg/Kf de massa corporal) por oito dias antes da infecção com o Bacillus anthracis protegeu os camundongos contra a infecção por anthrax por dez dias após o período de teste de exposição. Os camundongos tratados só com antibiótico não sobreviveram.
Um segundo experimento foi conduzido para investigar o efeito da beta glicana da levedura oralmente consumida após a exposição dos camundongos ao B. anthracis. Os resultados foram similares aos previamente experimentados com uma taxa de sobrevivência entre 80 e 90% para camundongos tratados com glicana beta, mas somente 30% para o grupo de controle após 10 dias de exposição. A inferência promissora é que resultados similares poderiam ser observados em humanos.
http://www.biosolutions.info/2010/02/beta-glucan-mh3-immune-system-video.html
Β-Glicanas (beta-glicanas) são polissacarídeos de monômeros de Dlglicose ligados por pontes glicosídicas. As beta-glicanas são um grupo diversificado de moléculas que podem variar em relação à massa molecular, solubilidade, viscosidade e em sua configuração tridimensional. Elas ocorrem mais comumente como celulose nas plantas, o farelo de certos grãos, a parede celular de leveduras de fermento de pão, certos fungos, cogumelos e bactérias. Algumas formas das beta-glicanas são úteis à nutrição humana como agentes de texturização e como suplemento de fibras solúveis, mas podem ser problemáticas no processo de fermentação.
As beta-glicanas das leveduras e dos cogumelos medicinais são notáveis por sua habilidade de modular o sistema imune. Pesquisas tem mostrado que beta-glicanas insolúveis (1,3/1,6) , têm maior atividade biológica que as beta-glicanas (1,3/1,4). As diferenças entre as ligações das beta-glicanas e sua estrutura química são significativas com respeito à solubilidade, modo de ação, e atividade biológica em geral.
As glicanas são polissacarídeos que só contém glucose enquanto seus componentes estruturais, e estão ligadas com pontes beta-glicosídicas.
Em geral, distingue-se entre as pontes alfa e beta-glicosídicas, dependendo em se os grupos substituintes nos carbonos flanqueando o anel de oxigênio estão apontando nas mesmas direções ou direções opostas no padrão de fermentação dos açúcares. Uma ligação alfa-glicosídica para um D-açúcar emana sob o plano do açúcar, visto que o hidroxil (ou outro grupo substituinte) em outro carbono aponta sobre o plano (configuração oposta), enquanto a ponte beta-glicosídica emana por cima deste plano.
http://www.biosolutions.info/2010/02/beta-glucan-video.html
Beta-Glicanas MH3 – Sistema Imune
As beta glicanas são conhecidas como “modificadores de resposta biológica” devido à sua habilidade de ativar o sistema imune. Imunologistas na Universidade de Louisville descobriram que um receptor na superfície das células do sistema imune inato chamado receptor do complemento 3 (CR3 ou CD11b/CD18) é responsável pela ligação a beta-glicanas, permitindo às células imunes reconhecerem-nos como “não próprios”. Entretanto, poder-se-ia notar que a atividade das beta-glicanas é diferente a partir de algumas drogas farmacêuticas que têm a abilidade se sobre-estimular o sistema imune. Drogas farmacêuticas têm o potencial de induzir o sistema imune à sobre-estimulação, e então são contra-indicadas para indivíduos com doenças auto-imunes, alergias ou infecções por leveduras. As beta-glicanas parecem fazer o sistema imune trabalhar melhor sem se tornar super-ativo. Em adição ao aumento da atividade do sistema imune, as beta-glicanas também notoriamente reduzem os níveis de colesterol elevado, auxiliam na cicatrização de feridas, ajudam a prevenção de infecções, e têm potencial como um adjuvante no tratamento do câncer.
Beta-glicanas, como as lentinanas (derivadas do cogumelo Shiitake) [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8b/Lentinan.png] e polissacarídeos K têm sido usadas como uma terapia imuno-adjuvante para o tratamento do câncer desde 1980, primeiramente no Japão. Existe uma grande coleção de pesquisas que demonstra que as beta-glicanas têm atividade anti-tumoral e anti-cancerígena. Em um estudo com modelo de camundono, a glicana 1,3 com o interferon gama inibiu tumores e a metástase no fígado. Em alguns estudos, as glicanas 1,3 beta aumentaram os efeitos da quimioterapia. Em experimentos com câncer, usando-se um camundongo como modelo, a administração de ciclofosfamida [um agente alquilante com atividade anti-tumoral e empregos similares aps da substância original, a mostarda nitrogenada (cloridrato de mecloretamina); também é supressor da atividade das células B e da produção de anticorpos, sendo usada no tratamento das doenças auto-imunes. Stedman. Alquilação é a introdução de um radical alquila e alquila é o radical formado com a retirada de um hidrogênio de um hidrocarboneto alifático. Dic. Aurélio], em conjunção com as glicanas 1,3 beta derivadas de leveduras resultou na redução da mortalidade. Em pacientes humanos com câncer gástrico ou colo-retal, a administração das glicanas 1,3 beta dos cogumenos Shiitake, em conjunção com a quimioterapia resultou no prolongamento do tempo de vida.
Estudos pré-clínicos mostraram que uma beta-glicana solúvel produto da levedura, denominada PGG, quando usada em combinação com certos anticorpos monoclonais ou vacinas para câncer, oferecem significativas melhoras no tempo de vida em contraste com os anticorpos sozinhos. Esse benefício, entretanto, não resulta da Betafectina aumentando a ação predadora específica dos anticorpos. A atividade anti-tumoral é causada por um mecanismo de morte celular único que envolve os neutrófilos que são forçados a atuar pela Betafectina e que normalmente não estão envolvidos na luta contra o câncer. Recentes pesquisas de Hong e outros demonstram que esse mecanismo de ação é efetivo contra um largo espectro de cânceres quando usado em combinação com anticorpos monoclonais específicos que ativam ou levam o complemento a se ligar ao tumor. O complemento habilita esses neutrófilos forçados a acharem e se ligarem ao tumor, o que facilita a morte tumoral. As células do sistema imune inato são a primeira linha de defesa do corpo e circulam por todo o corpo engajando uma resposta contra “estranhos” desafiadores (bactérias, fungos e parasitas). Tipicamente, os neutrófilos não são envolvidos na destruição dos tecidos cancerosos porque essas células imunes vêem o câncer como “próprio” mais do que como estranhos ou “não-próprio”. As imunoterapias correntes para o câncer envolvem anticorpos monoclonais e vacinas, os quais estimulam a resposta imune adquirida, mas não fazem nada para mudar a identificação do câncer como “próprio” pelas células do sistema imune. Como resultado, os anticorpos monoclonais sozinhos não engajam ou iniciam a potencial capacidade de assassinato das células tumorais pelas células do sistema imune, que é a nossa primeira defesa contra infecções por bactérias e leveduras (fungos).
O Dr. Gordon Ross e o Dr. Vaclav Vetvicka, respeitados imunologistas e pesquisadores do câncer na Universidade de Louisville, descobriram que um receptor na superfície dessas células imunes inatas chamado Receptor de Complemento 3 (CR3 ou CD11b/CD18) era responsável pela ligação ao fungo ou à levedura, permitindo às células imunes reconhecerem-nas como “não-próprias”. Esse receptor é um receptor de dupla ocupação pois ele tem dois sítios de ligação. O primeiro sítio é responsável pela ligação a um tipo de complemento, um proteína solúvel do sangue, conhecida como C3 (ou iC3b).
O C3 é fixado aos patógenos que anticorpos específicos tenham mirado e opsonizado. O segundo sítio desse receptor se liga a um carbohidrato nas células de leveduras e fungos e permite que as células do sistema imune reconhecerem as leveduras e os fungos como “não-próprios”. Ambos esses sítios receptores devem ser simultâneamente ocupados para disparar a célula imune inata na destruição das leveduras e fungos. Primeiro, o corpo usualmente não gera anticorpos naturais suficientes para se ligarem ao tumor, e isso impede a ativação e fixação do complemento na superfície da célula cancerígena. Por isso, os neutrófilos não se ligam ao câncer pela via desse sítio receptor do CR3. O segundo obstáculo é que ainda quando a resposta de anticorpos naturais é suplementada com anticorpos monoclonais que fixam o complemento e a ligação ocorre no primeiro sítio, os tumores não contém carbohidratos estranhos servindo como um “segundo sinal” em sua superfície que permita aos neutrófilos reconhecerem o câncer como “não-próprio”. Outros receptores humanos tem sido identificados como habilitados a receberem sinais de beta-glicanas tais como Dectina-1, lactosilceramida, e receptores de células mortas.
O Dr. Ross descobriu que um fragmento bio-processado chamado PGG liga-se especificamente ao Segundo sítio do receptor CR3 nos neutrófilos. Quando os neutrófilos se ligam aos tumores, a Betafectina os permite “verem” o câncer como se fosse um patógeno como a levedura ou o fungo e proporciona o “segundo sinal” para matarem-no. Em resumo, a Betafectina atrai os neutrófilos à luta contra o câncer, aumentando dramática e sinergisticamente a efetividade da ativação do complemento pelos anticorpos monoclonais e vacinas através de diferentes mecanismos de extermínio.
Pesquisas multinacionais têm demonstrado sucessivamente que a forma oral da Beta 1,3-D glicana da levedura tem efeitos protetores similares ao da versão injetada, inclusive a defesa contra doenças infecciosas e câncer. Recentemente, as glicanas entregues oralmente foram encontradas aumentando significativamente a proliferação e ativação dos monócitos no sangue periférico de pacientes com câncer de mama avançado.
A tecnologia tem ampla aplicabilidade para a terapia do câncer. Cada forma de célula de tumor cancerígena tem antígenos específicos na superfície celular, alguns dos quais são comuns a outros tipos de câncer. (Exemplo: a mucina 1 está presente em aproximadamente 70% de todos os tipos de célula do câncer.) Diferentes imunoterapias miram antígenos diferentes para a ligação de anticorpos monoclonais às células de tumor. Isso tem resultado no desenvolvimento de milhares de anticorpos monoclonais, muita mira sobre diferentes antígenos específicos nas células do câncer. Em estudos com pesquisa, a Betafectina tem melhorado a efetividade de todos os anticorpos monoclonais ativadores do complemento testados inclusive nos cânceres de mama, fígado e pulmões. A magnitude do sucesso varia com base em anticorpos monoclonais específicos usados e o tipo de câncer.
PREVENÇÃO DA INFECÇÃO
Até a presente data têm havido numerosos estudos e testes clínicos conduzidos com a beta-glicana solúvel da levedura e o composto de glicana completa (substância composta de partículas separadas). Esses estudos têm-se alternado do impacto da beta-glicana nas infecções hospitalares pós-operatórias até o papel das beta-glicanas de levedura no tratamento de infecções por antrax. [Obs.: Bacillus anthracis – a virulência depente da cápsula bacteriana e do complexo da toxina. A cápsula é um poli-D-ácido glutâmico que protege contre a fagocitose leucocitária e a lise. http://emedicine.medscape.com/article/830004-overview]
Infecções pós-cirúrgicas são um sério desafio que se segue às principais cirurgias com taxa estimativa de 25 a 27% após a cirurgia. As tecnologias Alfa-Beta conduziram uma série de testes clínicos em humanos nos anos noventa para avaliar o impacto da terapia com beta-glicana no controle de infecções em pacientes cirúrgicos de alto risco. No teste inicial, trinta e quatro pacientes foram aleatóriamente (dupla blindagem, e placebos de controle) designados para grupos de tratamento ou de placebos. Os paciente que receberam glicana PGG tiveram significativamente menos complicações infecciosas do que o grupo placebo (1,4 infecções por paciente infectado para o grupo da glicana PGG versus 3,4 infecções por paciente infectado para o grupo placebo). Dados adicionais dos testes clínicos revelaram que houve diminuição no uso de antibióticos intravenosos e estadias mais curtas na unidade de tratamento intensivo para pacientes que recebiam a glicana PGG versus pacientes que recebiam placebo.
Um teste clínico humano subsequente estudou ainda mais o impacto da beta-glicana na redução da incidência de infecção com pacientes de cirurgia da alto risco. Os autores encontraram um resultado similar com a tendência da resposta à dose (doses mais altas proporcionavam maior redução na ocorrência de infecções do que doses menores). No teste clínico humano, 67 pacientes foram escolhidos aleatoriamente e receberam tanto uma dose de placebo quanto doses de 0,1; 0,5; 1,0; ou 2,0 miligramas de glicana PGG por quilo de massa corporal. Infecções sérias ocorreram em quatro pacientes que receberam o placebo, três pacientes que receberam a dose mais baixa (o,1 mg/kg) de glicana PGG e somente uma infecção foi observada nas doses mais altas de 2,o mg/kg de glicana PGG.
Os resultados da terceira fase do teste clínico humano mostraram que a terapia dom glicana PGG reduziu sérias infecções pós-operatórias em 39% após as operações de alto risco não colo-retais. Esse estudo foi conduzido em pacientes que já estavam em alto risco por causa do tipo de cirurgia e eram mais suscetíveis a infecções e outras complicações.
Neste ponto do desenvolvimento de uma forma injetável da b-glicana (Betafectina glicana PGG) a maioria dos cientistas já concluíra que a glicana beta derivada da levedura promovia a fagocitose e a morte subseqüente da bactéria patogênica. Um teste clínico de fase III foi proposto e conduzido em trina e nove centros médicos nos Estados Unidos envolvendo 1.249 indivíduos estratificados conforme fossem pacientes cirúrgicos colo-retais e não colo-retais. A glicana PGG foi dada pré-operatoriamente uma vez e três vezes pós-operatoriamente a zero, 0,5 ou 1,0 mg/kg de peso corporal. A medida do resultado foi séria infecção ou morte de sujeitos dentro de 30 dias após a cirurgia. Os resultados dos testes clínicos de fase III mostraram que a terapia com glicana PGG injetável reduziu sérias infecções pós-operatórias em 39% após operações de alto risco não colo-retais.
Há estudos com modelos humanos e animais que sustentam ainda mais a eficácia de glicanas beta no combate de várias doenças infecciosas. Um estudo sobre humanos demonstrou que o consumo oral de partículas de glicanas integrais aumentou a habilidade das células imunes em ingerir a bactéria desafiadora (fagocitose). O número total de células fagocíticas e a eficiência da fagocitose na saúde humana dos participantes do estudo aumentou enquanto consumiam uma partícula de beta-glicana de levedura comercializada. Esse estudo demonstrou o potencial da beta-glicana de levedura em aumentar a taxa de reação do sistema imune aos desafios infecciosos. O estudo concluiu que o consumo oral de partículas de glicanas integrais representava um bom estímulo da imunidade natural.
O Anthrax é uma doença que não pode ser testada em estudos humanos por motivos óbvios. Em um estudo concluído pelo Departamento de Defesa do Canadá, o Dr. Kournikakis mostrou que beta glicanas de levedura administrados oralmente dados com ou sem antibióticos protegeram camundongos contra a infecção por Anthrax. Uma dose de antibióticos junto com partículas de glicana integrais (2 mg/Kg de massa corporal ou 20 mg/Kf de massa corporal) por oito dias antes da infecção com o Bacillus anthracis protegeu os camundongos contra a infecção por anthrax por dez dias após o período de teste de exposição. Os camundongos tratados só com antibiótico não sobreviveram.
Um segundo experimento foi conduzido para investigar o efeito da beta glicana da levedura oralmente consumida após a exposição dos camundongos ao B. anthracis. Os resultados foram similares aos previamente experimentados com uma taxa de sobrevivência entre 80 e 90% para camundongos tratados com glicana beta, mas somente 30% para o grupo de controle após 10 dias de exposição. A inferência promissora é que resultados similares poderiam ser observados em humanos.
http://www.biosolutions.info/2010/02/beta-glucan-mh3-immune-system-video.html
sábado, 20 de fevereiro de 2010
*163730 NITRIC OXIDE SYNTHASE 2A; NOS2A
Títulos Alternativos
NOS2
NOS2A, INDUTÍVEL,
SINTASE INDUTÍVEL DE ÓXIDO NÍTRICO; INOS
SINTASE DE ÓXIDO NÍTRICO DO MACRÓFAGO
Lócus do Gene Mapeado 17cen-q1.2
DESCRIÇÃO
O óxido nítrico (NO) é uma molécula mensageira com diversas funções no corpo. No cérebro e no sistema nervoso periférico, o NO exibe muitas propriedades de um neurotransmissor; ele está implicado na neurotoxidade associada com derrame cerebral e doenças neurodegenerativas, regulação neural da musculatura lisa, incluindo o peristaltismmo e a ereção. O NO também é responsável pela atividade do fator de relaxamento (EDRF) derivado do endotélio regulando a pressão do sangue. Nos macrófagos, o NO media as ações tumoricidas e bactericidas, como indicado pelo fato de que inibidores da sintase de NO (NOS) bloqueiam esses efeitos. A NOS neuronal (omim 163731) e a NOS do macrófago são isoformas distintas (Lowenstein e outros, 1992). Ambas as formas neuronal e dos macrófagos são incomuns entre as enzimas oxidativas no requerimento de vários doadores de elétrons: FAD, FMN, NADPH e tetrahidrobiopterina.
CLONAGEM
Lowenstein e outros (1992) clonaram o cDNA da forma da NOS dos macrófagos e expressaram a enzima em células de rim humanas. A enzima do macrófago apresentou 50% de identidade sequencial em relação à enzima neuronal. Do mesmo jeito que a forma neuronal, a NOS2 tem sítios de reconhecimento para FAD, FMN e NADPH, e também tem um sítio de ligação a calmodulina. Encontrou-se que o mRNA da NOS do macrófago é notoriamente indutível; ela estava ausente em macrófagos quiescentes ou no baço mas proeminente em duas a seis horas após o tratamento com endotoxina.
O óxido nítrico é sintetizado a partir da L-arginina pela ação de sintase(s) de óxido nítrico, gerando citrolina como um co-produto. As sintases de NO, proteínas heme do tipo P450, são todas dependentes de NADPH-, FMN e de tetrahidrobiopterina. Nas células endoteliais e tecidos neuronais, a atividade da sintase de NO é constitutivamente expressada e tem um requerimento para Ca(2+) e calmodulina. Em contraste, a sintase de NO é indutível nos macrófagos e em alguns outros tecidos. A sintase de NO indutível nessas células não requer a Ca(2+) ou calmodulina para sua atividade, e a indução é inibida por glucocorticóides. A sintase de NO é indutível nos condrócitos articulares. [Condrócitos são células cartilaginosas que não se dividem e ocupam uma lacuna na matriz cartilaginosa. Stedman] A interleucina-1 beta (IL1B; omim 147720) induz a enzima nos condrócitos humanos onde a indução é independente de Ca(2+) e marginalmente afetada por glucocorticóides. Charles e outros (1993) isolaram um clone de cDNA que codificava uma proteína de 1.153 aminoácidos com uma massa molecular de 131.213 dáltons e um ponto isoelétrico calculado de 7,9. A sequência deduzida de aminoácidos da sintase de NO indutível nos condrócitos apresentou 51% de identidade e 68% de similaridade com a sintase de NO endotelial (omim 163729) e 54% de identidade e 70% de similaridade com a sintase de NO neuronal. A similaridade de (88%) entre a sequencia do cDNA da sintase de NO do condrócito e a relatada para o macrófago murino sugere que a classe indutível da enzima está conservada entre diferentes tipos de celulas e através das espécies. A indução da sintase de NO em células humanas tinha sido mostrada previamente somente para hepatócitos (Nussler e outros, 1992). Geller e outros (1993) clonaram o cDNA para uma sintase de NO indutível dos hepatócitos humanos. A sequência diferiu da sequência dos condrócitos humanos em sete posições de aminoácidos.
Usando um cDNA parente da NOS II bovina para sondar duas bibliotecas genômicas humanas, Bloch e outros (1995) isolaram clones contendo três genes independentes. Um clone codificava o gene previamente identificado chamado previamente de NOS2 e chamado por eles de NOS2A. Os dois outros genes especificavam aminoácidos homólogos, mas não idênticos, para aqueles especificados pelo gene NOS2A; esses foram designados NOS2B (omim 600719) e NOS2C (600720).
ESTRUTURA DO GENE
Usando ambos os cDNAs de NOS indutíveis do macrófago murino e do hepatócito humano como provas, Chartrain e outros (1994) isolaram clones para o gene NOS2 de cosmídeos sobrepostos [plasmídeos engenheirados por recombinação de genes. Stedman] de uma biblioteca genômica humana. O gene foi estimado em 37 quilobases de comprimento e consistia de 26 éxons e 25 íntrons. Eles mapearam o sítio de iniciação transcricional a trinta pares de base a jusante da sequência TATA. Xu e outros (1996) concluíram que de fato a sequência aberta de leitura do NOS2 é codificada por 27 éxons, com iniciação de tradução e terminação no éxon 2 e no éxon 27, respectivamente.
FUNÇÃO DO GENE
Napolitano e outros (2000) investigaram as interações entre ET1 (omim 131240) e o sistema NO na unidade placental do feto. Eles examinaram a expressão do mRNA de ET1, NOS indutível (iNOS), e NOS endotelial (eNOS; omim 163729) em células trofoblásticas placentárias humanas cultivadas obtidas de grávidas com preclâmpsia (PE; omim 189800) e normotensas. A expressão da ET1 estava aumentada nas células PE, enquanto a iNOS, a qual representa a principal fonte de síntese de NO, estava diminuída; inversamente, a expressão da eNOS estava aumentada. A ET1 era capaz de influenciar sua própria expressão bem como a expressão da isoforma de NOS nas células trofoblásticas cultivadas normais e PE. Os achados sugeriram a existência de um relacionamento funcional entre ET(s) e isoformas de NOS que poderiam constituir um mecanismo biológico levando ao reduzido fluxo de sangue placentário e ao aumento da resistência do fluxo na circulação feto-maternal que são a caracteristica da patofisiologia da preeclâmpsia.
A geração da imunidade mediada por células contra muitos patógenos infecciosos envolve a produção de interleucina 12 (veja omim 161560), um sinal chave do sistema imune inato. Ainda, para muitos patógenos, as moléculas que induzem a produção de IL12 pelos macrófagos e os mecanismos pelos quais eles o fazem permanecem indefinidos. Brightbill e outros (1999) demonstraram que as lipoproteínas microbianas são potentes estimuladores da produção de IL12 pelos macrófagos humanos e que a indução é mediada pelos receptores toll-like (TLRs; veja omim 603030). Várias lipoproteínas estimularam a transcrição de sintase indutível de óxido nítrico dependente de TLR e a produção de óxido nítrico, uma poderosa via microbicida. A ativação dos TLRs pelas lipoproteínas microbianas pode iniciar mecanismos de defesa inata contra patógenos infecciosos.
Diefenbach e outros (1999) estudaram o relacionamento da IL12 e da sintase 2 de óxido nítrico (NOS2) com a imunidade inata para o parasita Leishmania no camundongo. Na ausência da atividade da NOS2, a IL12 era incapaz de impedir a disseminação dos parasitas Leishmania, não estimulava as células matadoras naturais (NK) para a citotoxidade ou liberação de interferon gama (IFN gama) (omim 147570), e falhava em ativar TYK2 (Cinase de Tirosina - omim 176941- 19p13.2, mesmo sítio do receptor de insulina - Firmbach-Kraft e outros (1990) descobriram que a expressão da TYK2 aumentou em cinco vezes em uma linha de células pró-mielocíticas a seguir à diferenciação induzida por ácido retinóico. Eles acharam um ligeiro aumento na expressão de TYK2 após a diferenciação induzida por forbol ester de uma linha de células mielóides) e fosforilar a tirosina da STAT4 (omim 600558 - A STAT4 é fosforilada em resposta à interleucina 12 e é essencial para a transdução de sinal da IL12), o transdutor de sinal central da IL12 nas células NK. A ativação da TYK2 nas células matadoras naturais (NK) pelo interferon alfa/beta (interferon de tipo I; veja 107470) também requereu NOS2. [Obs.: a ceruloplasmina é induzida por IL6 (como o FVIII), interferon gama, regulada por insulina e tem um tipo de elemento de resposta a ferro na região não traduzida da ponta 3 do mRNA para entrar no ribossomo.]
A exposição de ilhas pancreáticas à uma mistura de citocinas induz a expressão de iNOS, diminui a função da célula beta, e induz a apoptose. Johannesen e outros (2001) copiaram todos os 27 éxons do gene da NOS2 e concluíram o teste de desequilíbrio de ligação dos polimorfismos identificados da NOS2 em uma coleção de famílias dinamarquesas com IDDM (omim 222100 – Diabetes Melitus de Tipo I) em todo o País. O teste de desequilíbrio de transmissão foi desempenhado usando 257 famílias dinamarquesas; 154 famílias eram pares de famílias com parentes afetados, e 103 eram famílias simples. No total, 10 polimorfismos foram identificados em oito éxons, dos quais quatro foram testados no material familiar. Um polimorfismo de um só nucleotídeo de C para T no éxon 16 resultando em uma substituição do aminoácido serina 608 para leucina, mostrou a ligação do diabetes melitus de tipo I com antígeno leucocitário humano DR3/4 positivo (P=0,008; corrigido para P = 0,024) na geração afetada. Nenhum outro padrão de transmissão distorcida foi encontrado para nenum outro polimorfismo de um só nucleotídeo ou haplótipos construídos com a exceção daqueles incluindo dados do éxon 16. Os autores concluíram que a ligação do gene NOS2 com o IDDM em um sub-conjunto de pacientes sustenta o papel patogênico do óxido nítrico no diabetis melitus de tipo I humano.
Em uma revisão dos intermediários do oxigênio reativo e do nitrogênio, Nathan e Shiloh (2000) notaram que as infecções, produtos microbianos e citocinas não induzem consistentemente a expressão de NOS2 quando aplicados nos fagócitos mononucleares do sangue humano, embora esses estímulos realmente induzam a produção nos macrófagos dos tecidos dos roedores. Os autores reforçaram a importância da avaliação do tecido além dos macrófaos do sangue para a expressão da NOS2 humana.
Vouldoukis e outros (1995) descobriu que a ligação do receptor de IgE de baixa afinidade (CD23; omim 151445) induz a produção de NOS pelos macrófagos derivados de monócitos ‘in vitro’. A ligação da CD23 levou à execução intracelular seguida de morte dos parasitas maiores da Leishmania, o que poderia ser bloqueado pelo inibidor de NOS, o NG-monometil-L-arginina monoacetato (NMMA).
Nicholson e outros (1996) relataram que os macrófagos dos pulmões de pacientes de tuberculose (TB) expressam NOS2 em quantidades potencialmente micobactericidas.
Nozaki e outros (1997) demonstraram por RT-PCR e análises de imunofluorescência que os macrófagos alveolares (AMs) obtidos de pacientes com fibrose pulmonar, mas não de pacientes com câncer nos pulmões, infectados com a vacina não virulenta da linhagem de micobactéria bovina (BCG) produziram altos níveis de iNOS. Ensaios de formação de colônias mostraram que esses AMs infectados mataram efetivamente os BCG, mas eles estavam menos hábeis após o tratamento com NMMA.
Usando análises de imuno-borrões e imuno-histoquímicas, Facchetti e outros (1999) mostraram a expressão de uma proteína NOS2 de 130 quilo-dáltons no citoplasma de macrófagos CD68 positivos em tecidos de granuloma infeccioso [CD68 – omim 153634 – 17p13 - a CD68 é uma glicoproteína de 110 quilo-dáltons que é altamente expressada em monócitos e macrófagos do tecido humanos. Holness e Simmons (1993) isolaram clones de cDNA codificadores de CD68 pela expressão transitória em células de ovário de ramster e imuno-seleção usando anticorpos monoclonais anti-CD68. Dois tipos de clones de cDNA foram isolados, diferido pela inserção de dois pequenos segmentos na porção termial N do domínio extracelular. A sequência de cDNA previu uma proteína integral de membrana de tipo I com 354 resíduos com um domínio extracelular pesasamente glicosilado de 298 resíduos contendo nove sítios de glicosilação ligados ao N (nitrogênio) e numerosos sítios de glicosilação ligados ao O (oxigênio). O domínio extracelular consiste de duas regiões distintas separadas por uma dobradiça de prolina estendida: um domínio distante de tipo mucina e um domínio próximo com significativa homologia sequecial com uma família de proteínas de manobra entre a membrana plasmática e o lisossomo (exemplo LAMP1; omim 153300). A CD68 é um membro da família das moléculas de tipo mucina hematopoiética que induzem a leucosialina/CD43 (omim182160) e o antígeno das células-tronco CD34 (omim 142230).] bem como na sarcoidose [omim 181000 – Um número assinalado com sustenido é usado com essa entrada pois há evidência de que a variação no gene da HLA-DRB1 no cromossomo 6p21.3 é um contribuidor principal para a suscetibilidade à sarcoidose (SS1).
A sarcoidose é uma desordem granulomatosa associada com uma acumulação de células T CD4+ e uma resposta imune de células Th1. Na infância, dois tipos distintos de sarcoidose foram descritos (Shetty e Gedalia, 1998). Usualmente a doença é detectada em crianças mais velhas por radiografia do tórax, e as manifestações clínicas são caracterizadas pelo clássico envolvimento em tríade dos pulmões, linfonodos e olhos, similares às dos adultos. Em contraste, o estabelecimento precoce da sarcoidose (EOS; omim 609464), a qual aparece usualmente nos mais jovens com menos de quatro anos de idade, é rara e uma tríade distinta de desordem da pele, juntas e olhos, sem envolvimento pulmonar aparente. Comparados com uma doença de curso assintomático e que desaparece naturalment às vezes nas crianças mais velhas, a EOS (de estabelecimento precoce) é progressiva e em muitos casos causa severas complicações como cegueira, destruição das juntas e envolvimento das vísceras.] e na doença de Kikuchi, mas não em granulomas estranhos ao corpo ou na síndrome de Omenn (omim 603554).
Choi e outros (2002) examinaram pulmões ressecados de oito pacientes de TB para a expressão de NOS e nitrotirosina, um marcador da expressão de NO. Análises imuno-histoquímicas e morfométricas revelaram que a iNOS, nitrotirosina, eNOS, TNFA (omim 191160), mas não a nNOS (NOS1; omim 163731), eram expressadas nos macrófagos epitelióides positivos para CD68 e nas células gigantes na zona inflamatória dos granulomas dos pacientes, mas não no tecido histologicamente normal obtido de pacientes de câncer como sujeitos de controle. A expressão do TNF era maior nas áreas necróticas.
A sub-unidade 26S do proteossomo é a principal via responsável pela degradação da iNOS. Proteínas alvo da degradação proteossômica podem requerer sua ligação covalente às cadeias de multi-ubiquitinas (isto é, ubiquitinação). Kolodziejski e outros (2002) relataram resultados de experimentos indicando que a iNOS é sujeita à ubiquitinação, a qual é requerida para sua degradação.
O óxido nítrico gerado de sintase de NO indutível (iNOS) tem sido implicado na enxaqueca (omim 157300) com base em evidências farmacológicas em animais e humanos. No modelo do rat, Reuter e outros (2002) mostraram que o doador de NO gliceril trinitrato (GTN) causou a expresão de NOS2A nos macrófagos, mediada pelo aumento da atividade do fator de transcrição nuclear kappa-B (NFKB1; omim 164011), resultando na geração de NO dentro da dura máter craniana (parte encefálica) dos roedores seis horas depois. O partenolide, uma lactona [um anidrido orgânico intramolecular formado a partir de um hidroxiácido pela perda de água entre uma hidroxila e um grupamento carboxila. Stedman] encontrada na herva medicinal Crisântemo parthenium que tem sido usado com sucesso no tratamento de condições inflamatórias e enxaqueca, bloqueou a expressão da NOS2A na dura mater pela inibição do NFKB1. [O partenolide previne a formação de coágulos sanguíneos e também é usado para aliviar a artrite. http://en.wikipedia.org/wiki/Parthenolide]
Kim e outros (2005) mostraram que a iNOS liga-se especificamente à ciclo-oxigenase 2 (COX 2; omim 600262) e as nitrosila em S (enxofre), aumentando atividade catalítica da COX2. A ruptura seletiva da ligação iNOS-COX2 impediu a ativação da COX2 mediada pelo óxido nítrico. Kim e outros (2005) sugeriram que o sinergismo molecular entre a iNOS e a COX2 pode representar um mecanismo maior das respostas inflamatórias.
Tezuka e outros (2007) mostraram que a alternação da recombinação da imunoglobulina de classe A (IgA) está enfraquecida nos camundongos deficientes em sintase indutível de óxido nítrico (camundongos nulos em iNOS). A iNOS regula a recombinação alternada da classe IgA dependente da célula T através da expressão de um receptor de fator beta de crescimento de transformação (veja TGFBR1, omim 190181 – 19q13.1), e a recombinação alternada da classe IgA independente de célula T através da produção de ligantes de indutores de proliferação (APRIL, também chamada de TNFSF13, omim 604472) e um fator de ativação da célula B da família do fator de necrose tumoral (BAFF; omim 603969). Notavelmente, a iNOS é expressada preferencialmente nas células dendríticas do tecido linfóide associado à mucosa (MALT) em resposta ao reconhcimento de bactérias comensais pelos receptores toll-like (TLR, veja 603030). Além disso, transferidores adotivos das células dendríticas positivas em iNOS resgatam a produção de IgA nos camundongos nulos em iNOS. Análises adicionais revelaram que as células dendríticas (MALT) são um sub-conjunto de células dendríticas produtoras de TNFA/iNOS, originalmente identificadas nos camundongos infectados com Listéria monocitogenes. A presença de um sub-conjunto de células dendríticas produtoras de TNFA/iNOS ocorrendo naturalmente pode explicar a predomiância da produção de IgA no MALT, crítica para a homeostase do intestino.
MAPEAMENTO
Por análise de Southern das linhas de células somáticas híbridas, Marsden e outros (1994) mapearam o gene da NOS2 no cromossomo 17; eles refinaram a assinatura em 17q11.2-q12 por uma fluorescência no sítio de hibridização. Jenkins e outros (1994), a qual se referia à sintase indutível de NO nos macrófagos do camundongo como Nos-1, descobriu que o gene mapeia no cromossomo 11 do camundongo homólogo ao cromossomo humano 17q. Eles previram que o gene humano deveria jazer no cromossomo 17q11.2.
Mehrabian e outros (1994) da mesma forma mapearam o homólogo do camundongo no cromossomo 11, usando análises de ligação RFLVs em um cruzamento retroativo (acasalamento do primeiro híbrido de uma geração com um de seus progenitores) interespecífico. Chartrain e outros (1994) usaram análises de reação em cadeia da polimerase de DNA genômico de um painel híbrido de células somáticas humanas e de roedores e fluorescência em sítio de hibridização para mapear o gene da NOS2 em 17cen-q 11.2. Xu e outros (1994) mapearam o gene da NOS2 em 17cen-q 11 por análises de Pigmentação Southern de DNAs obtidos de um painel de linhas celulares híbridas de humanos e roedores. Por fluorescência em sítio de hibridização eles encontraram sinais na região pericentromérica do cromossomo 17p11-q11. Gerling e outros (1994) mapearam o gene da Nos2 no cromossomo 11 do camundongo.
Usando hibridização de pigmentação Southern, Bloch e outros (1995) demonstraram que os genes da NOS2A, da NOS2B e da NOS2C estão localizados todos no cromossomo 17 entre as bandas 17p13.1 e 17q25.
GENÉTICA MOLECULAR
Rutherford e outros (2001) proporcionaram evidência para a localização de ao menos um lócus de suscetibilidade à hipertensão no cromossomo 17. Análises de 177 pares de parentes afetados ofereceram evidência para um excesso significativo do partilhamento de alelo com o marcador D17S949 no cromossomo 17q22-q24, com partilhamento de alelelo significativo também para um marcador adicional D17S799, localizado junto do centrômero. Como essas duas regiões genômicas estão bem separadas, os resultados indicaram que pode haver mais de um lócus no cromossomo 17 afetando a pressão sanguínea. Além disso, investigações adicionais usando um polimorfismo dentro do promotor do gene candidato a NOS2A revelou ambos o aumento do partilhamento do alelo entre os pares de parentes e a associação positiva da NOS2A com a hipertensão essencial. Morris (2002) chamaram à causa as conclusões de Rutherford e outros (2001); Griffiths (2002), o autor mais antigo do papel de Rutherford e outros (2001), respondido.
Kun e outros (1998) examinaram se as altas concentrações de NO no plasma encontradas na malária severa (veja omim 611162) eram devidas à variação na região promotora da NOS2. A heterosigosidade para um SNP de G para C na posição 969 estava presente em 30 das 100 crianças da Gâmbia com malára, mas em somente 17 das 100 crianças com malária severa. O SNP não foi encontrado em nenhum dos 100 alemãos. Os indivíduos heterosigotos também estavam com risco significativamente menor para reinfecção.
Hobbs e outros (2002) postularam que os polimorfismos no promotor da NOS2 poderiam afetar a resistência à malária severa como manifestada pela malária cerebral, anemia malariana severa, e dificuldade respiratória ou acidose metabólica (Marsh e outros, 1995). A partir de estudos na Tanzania e no Kenia, Hobbs e outros (2002) identificaram um novo polimorfismo de nucleotídeo, de C para T na posição 1173, no promotor de NOS2 que estava significativamente associado com a proteção à malária sintomática e à anemia malariana severa.
Hao e outros (2004) concluíram um estudo de controle de casos de larga escala explorando as associações de 426 polimorfismos de um só nucleotídeo (SNPs) com o nascimento prematuro (PTD) em 300 mães de PTD e e 458 mães de nascituros no tempo normal. Vinte e cinco genes candidatos foram incluídos na análise final de haplótipo (genes do mesmo par de alelos). Genes haplótipos em IL1R2 (omim 147811 – receptor de interleucina 1) em negros, NOS2A em brancos e OPRM1 (omim 600018 – receptor de opióide) em espanhóis estavam associados com o PTD somente nesses grupos étnicos.
Em um subgrupo de 73 famílias com doença de Parkinson (PD; omim 168600) no qual ao menos um mebro tinha a doença estabelecida antes dos 40 anos, Hancock e outros (2006) acharam uma associação significativa entre a PD e dois SNPs no gene da NOS2A: o alelo T mais frequente era rs2255020 e o menos frequente era o alelo A rs1060826 (p= 0,000059 e 0,0062, respectivamente). Os haplótipos dos dois SNP mostraram uma a associação ainda forte com a PD (p = 0,000013). Associações similares não foram observadas em um grande complexo do agrupamento de 286 famílias incluindo todas as idades de estabelecimento. Estudos epidemiológicos relataram consistentemente uma associação inversa entre a doença de Parkinson e o tabagismo. Em um grupo de 243 famílias sobrepostas, Hancock e outros (2006) acharam uma associação significativa entre o tabagiso e dois alelos de risco; entretanto quando estratificaram o estatus da PD, a presença desses alelos atenuoava a associação inversa protetora entre o tabagismo e a PD. Hancock e outros (2006) postularam que uma alteração na regulação da NOS2A poderia resultar na atividade prolongada e no dano celular e concluiu adicionalmente que a NOS2A poderia ser um fator de risco para a PD pela influência na idade de estabelecimento e pela modificação da associação inversa entre a PD e o tabagismo.
Entre 340 pacientes germânicos de PD com estabelecimento da doença na média etária de 52 anos, Schulte e outros (2006) não encontraram associação entre a desordem e doze polimorfismos no gene de NOS2A.
Eumicetoma é uma infecção fúngica tumorosa, tipicamente das mãos e dos pés, caracterizada pela infiltração de grande número de neutrófilos. Ela é causada pela Madurella mycetomatis, um patógeno que é abundante no sole e na vegetação do Sudão, onde a doença é comum. Van de Sande e outros (2007) notaram que o ELISA mostrava soropositividade de IgG quase universaç nos pacientes de micetoma e controles de áres endêmicas, mas nenhuma soropositividade nos controles europeus, implicando em que a maioria dos indivíduos nas áreas endêmicas são expostos ao patógeno, mas somente uma pequena porcentagerm desenvolv a doença. Van de Sande e outros (2007) estudaram 11 SNPs nos genes envolvidos na função do neutrófilo em 125 pacientes de micetoma sudaneses e 140 controles etinica e geograficamente misturados e encontraram significativas diferenças nas distribuições dos alelos para SNPs em IL8 (omim 146930), IL8RB (omim 146928), TSP4 (THBS4; mim 600715), NOS2, e CR1 (120620). A IL8 do soro estava significativamente mais alta nos pacientes em comparação com os controles, enquanto os níveis de nitrito/nitrato estavam mais baixos nos pacientes e pareciam estar associados com atraso na cicatrização das feridas. Van de Sande e outros (2007) concluíram que existe uma predisposição genética com relação à suscetibilidade ao micetoma.
MODELO ANIMAL
Em camundongos imunodeficientes inoculados com células mononucleares do sangue periférico humano, Koh e outros (2004) examinaram artérias humanas transplantadas de disfunção de célula endotelial e de célula vascular da musculatura lisa. Dentro de 7 a 9 dias, as artérias transplantadas desenvolveram disfunção endotelial mas permaneceram sensíveis ao NO exógeno. Por duas semanas, os enxertos desenvolveram sinais de disfunçaõ da celula vascular do músculo liso, incluindo enfraquecimento da contractibilidade e insensibilidade ao NO. Essas mudanças dependentes de células T correlacionaram-se com a perda da NOS endotelial e da expressão da NOS indutível. A neutralização do IFN-gama impediu completamente a disfunção vascular e as mudanças na expressão de NOS; a neutralização do TNF reduziu a produção de IFN-gama e preveniu parcialmente a disfunção. A inibição da iNOS preservou parcialmente as respostas ao NO em duas semanas e reduziu a expansão interna do enxerto após quatro semanas ‘in vivo’. Koh e outros (2004) concluíram que o IFN-gama é um mediador central da disfunção vascular através da desregulação da produção de NO.
Colton e outros (2006) descobriram que camundongos transgênicos expressando a proteína precursora da amilóide mutante (APP; omim 104760) em um segundo plano nulo para Nos2 desenvolveram hiperfosforilação patológica de tau (MAPT; omim 157140 – proteína associada ao microtúbulo tau – 17q21.1) com formação de agregados no cérebro. A falta de Nos2 aumentou os níveis de APP insolúvel, a degeneração neuronal, a ativação da caspase 3 (CASP3; omim 600636), e a clivagem de tau, sugerindo que o óxido nítrico pode atuar em um ponto de junção entre as duas principais patologias que caracterizam a doença de Alzheimer (AD; omim 104300).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=163730
Títulos Alternativos
NOS2
NOS2A, INDUTÍVEL,
SINTASE INDUTÍVEL DE ÓXIDO NÍTRICO; INOS
SINTASE DE ÓXIDO NÍTRICO DO MACRÓFAGO
Lócus do Gene Mapeado 17cen-q1.2
DESCRIÇÃO
O óxido nítrico (NO) é uma molécula mensageira com diversas funções no corpo. No cérebro e no sistema nervoso periférico, o NO exibe muitas propriedades de um neurotransmissor; ele está implicado na neurotoxidade associada com derrame cerebral e doenças neurodegenerativas, regulação neural da musculatura lisa, incluindo o peristaltismmo e a ereção. O NO também é responsável pela atividade do fator de relaxamento (EDRF) derivado do endotélio regulando a pressão do sangue. Nos macrófagos, o NO media as ações tumoricidas e bactericidas, como indicado pelo fato de que inibidores da sintase de NO (NOS) bloqueiam esses efeitos. A NOS neuronal (omim 163731) e a NOS do macrófago são isoformas distintas (Lowenstein e outros, 1992). Ambas as formas neuronal e dos macrófagos são incomuns entre as enzimas oxidativas no requerimento de vários doadores de elétrons: FAD, FMN, NADPH e tetrahidrobiopterina.
CLONAGEM
Lowenstein e outros (1992) clonaram o cDNA da forma da NOS dos macrófagos e expressaram a enzima em células de rim humanas. A enzima do macrófago apresentou 50% de identidade sequencial em relação à enzima neuronal. Do mesmo jeito que a forma neuronal, a NOS2 tem sítios de reconhecimento para FAD, FMN e NADPH, e também tem um sítio de ligação a calmodulina. Encontrou-se que o mRNA da NOS do macrófago é notoriamente indutível; ela estava ausente em macrófagos quiescentes ou no baço mas proeminente em duas a seis horas após o tratamento com endotoxina.
O óxido nítrico é sintetizado a partir da L-arginina pela ação de sintase(s) de óxido nítrico, gerando citrolina como um co-produto. As sintases de NO, proteínas heme do tipo P450, são todas dependentes de NADPH-, FMN e de tetrahidrobiopterina. Nas células endoteliais e tecidos neuronais, a atividade da sintase de NO é constitutivamente expressada e tem um requerimento para Ca(2+) e calmodulina. Em contraste, a sintase de NO é indutível nos macrófagos e em alguns outros tecidos. A sintase de NO indutível nessas células não requer a Ca(2+) ou calmodulina para sua atividade, e a indução é inibida por glucocorticóides. A sintase de NO é indutível nos condrócitos articulares. [Condrócitos são células cartilaginosas que não se dividem e ocupam uma lacuna na matriz cartilaginosa. Stedman] A interleucina-1 beta (IL1B; omim 147720) induz a enzima nos condrócitos humanos onde a indução é independente de Ca(2+) e marginalmente afetada por glucocorticóides. Charles e outros (1993) isolaram um clone de cDNA que codificava uma proteína de 1.153 aminoácidos com uma massa molecular de 131.213 dáltons e um ponto isoelétrico calculado de 7,9. A sequência deduzida de aminoácidos da sintase de NO indutível nos condrócitos apresentou 51% de identidade e 68% de similaridade com a sintase de NO endotelial (omim 163729) e 54% de identidade e 70% de similaridade com a sintase de NO neuronal. A similaridade de (88%) entre a sequencia do cDNA da sintase de NO do condrócito e a relatada para o macrófago murino sugere que a classe indutível da enzima está conservada entre diferentes tipos de celulas e através das espécies. A indução da sintase de NO em células humanas tinha sido mostrada previamente somente para hepatócitos (Nussler e outros, 1992). Geller e outros (1993) clonaram o cDNA para uma sintase de NO indutível dos hepatócitos humanos. A sequência diferiu da sequência dos condrócitos humanos em sete posições de aminoácidos.
Usando um cDNA parente da NOS II bovina para sondar duas bibliotecas genômicas humanas, Bloch e outros (1995) isolaram clones contendo três genes independentes. Um clone codificava o gene previamente identificado chamado previamente de NOS2 e chamado por eles de NOS2A. Os dois outros genes especificavam aminoácidos homólogos, mas não idênticos, para aqueles especificados pelo gene NOS2A; esses foram designados NOS2B (omim 600719) e NOS2C (600720).
ESTRUTURA DO GENE
Usando ambos os cDNAs de NOS indutíveis do macrófago murino e do hepatócito humano como provas, Chartrain e outros (1994) isolaram clones para o gene NOS2 de cosmídeos sobrepostos [plasmídeos engenheirados por recombinação de genes. Stedman] de uma biblioteca genômica humana. O gene foi estimado em 37 quilobases de comprimento e consistia de 26 éxons e 25 íntrons. Eles mapearam o sítio de iniciação transcricional a trinta pares de base a jusante da sequência TATA. Xu e outros (1996) concluíram que de fato a sequência aberta de leitura do NOS2 é codificada por 27 éxons, com iniciação de tradução e terminação no éxon 2 e no éxon 27, respectivamente.
FUNÇÃO DO GENE
Napolitano e outros (2000) investigaram as interações entre ET1 (omim 131240) e o sistema NO na unidade placental do feto. Eles examinaram a expressão do mRNA de ET1, NOS indutível (iNOS), e NOS endotelial (eNOS; omim 163729) em células trofoblásticas placentárias humanas cultivadas obtidas de grávidas com preclâmpsia (PE; omim 189800) e normotensas. A expressão da ET1 estava aumentada nas células PE, enquanto a iNOS, a qual representa a principal fonte de síntese de NO, estava diminuída; inversamente, a expressão da eNOS estava aumentada. A ET1 era capaz de influenciar sua própria expressão bem como a expressão da isoforma de NOS nas células trofoblásticas cultivadas normais e PE. Os achados sugeriram a existência de um relacionamento funcional entre ET(s) e isoformas de NOS que poderiam constituir um mecanismo biológico levando ao reduzido fluxo de sangue placentário e ao aumento da resistência do fluxo na circulação feto-maternal que são a caracteristica da patofisiologia da preeclâmpsia.
A geração da imunidade mediada por células contra muitos patógenos infecciosos envolve a produção de interleucina 12 (veja omim 161560), um sinal chave do sistema imune inato. Ainda, para muitos patógenos, as moléculas que induzem a produção de IL12 pelos macrófagos e os mecanismos pelos quais eles o fazem permanecem indefinidos. Brightbill e outros (1999) demonstraram que as lipoproteínas microbianas são potentes estimuladores da produção de IL12 pelos macrófagos humanos e que a indução é mediada pelos receptores toll-like (TLRs; veja omim 603030). Várias lipoproteínas estimularam a transcrição de sintase indutível de óxido nítrico dependente de TLR e a produção de óxido nítrico, uma poderosa via microbicida. A ativação dos TLRs pelas lipoproteínas microbianas pode iniciar mecanismos de defesa inata contra patógenos infecciosos.
Diefenbach e outros (1999) estudaram o relacionamento da IL12 e da sintase 2 de óxido nítrico (NOS2) com a imunidade inata para o parasita Leishmania no camundongo. Na ausência da atividade da NOS2, a IL12 era incapaz de impedir a disseminação dos parasitas Leishmania, não estimulava as células matadoras naturais (NK) para a citotoxidade ou liberação de interferon gama (IFN gama) (omim 147570), e falhava em ativar TYK2 (Cinase de Tirosina - omim 176941- 19p13.2, mesmo sítio do receptor de insulina - Firmbach-Kraft e outros (1990) descobriram que a expressão da TYK2 aumentou em cinco vezes em uma linha de células pró-mielocíticas a seguir à diferenciação induzida por ácido retinóico. Eles acharam um ligeiro aumento na expressão de TYK2 após a diferenciação induzida por forbol ester de uma linha de células mielóides) e fosforilar a tirosina da STAT4 (omim 600558 - A STAT4 é fosforilada em resposta à interleucina 12 e é essencial para a transdução de sinal da IL12), o transdutor de sinal central da IL12 nas células NK. A ativação da TYK2 nas células matadoras naturais (NK) pelo interferon alfa/beta (interferon de tipo I; veja 107470) também requereu NOS2. [Obs.: a ceruloplasmina é induzida por IL6 (como o FVIII), interferon gama, regulada por insulina e tem um tipo de elemento de resposta a ferro na região não traduzida da ponta 3 do mRNA para entrar no ribossomo.]
A exposição de ilhas pancreáticas à uma mistura de citocinas induz a expressão de iNOS, diminui a função da célula beta, e induz a apoptose. Johannesen e outros (2001) copiaram todos os 27 éxons do gene da NOS2 e concluíram o teste de desequilíbrio de ligação dos polimorfismos identificados da NOS2 em uma coleção de famílias dinamarquesas com IDDM (omim 222100 – Diabetes Melitus de Tipo I) em todo o País. O teste de desequilíbrio de transmissão foi desempenhado usando 257 famílias dinamarquesas; 154 famílias eram pares de famílias com parentes afetados, e 103 eram famílias simples. No total, 10 polimorfismos foram identificados em oito éxons, dos quais quatro foram testados no material familiar. Um polimorfismo de um só nucleotídeo de C para T no éxon 16 resultando em uma substituição do aminoácido serina 608 para leucina, mostrou a ligação do diabetes melitus de tipo I com antígeno leucocitário humano DR3/4 positivo (P=0,008; corrigido para P = 0,024) na geração afetada. Nenhum outro padrão de transmissão distorcida foi encontrado para nenum outro polimorfismo de um só nucleotídeo ou haplótipos construídos com a exceção daqueles incluindo dados do éxon 16. Os autores concluíram que a ligação do gene NOS2 com o IDDM em um sub-conjunto de pacientes sustenta o papel patogênico do óxido nítrico no diabetis melitus de tipo I humano.
Em uma revisão dos intermediários do oxigênio reativo e do nitrogênio, Nathan e Shiloh (2000) notaram que as infecções, produtos microbianos e citocinas não induzem consistentemente a expressão de NOS2 quando aplicados nos fagócitos mononucleares do sangue humano, embora esses estímulos realmente induzam a produção nos macrófagos dos tecidos dos roedores. Os autores reforçaram a importância da avaliação do tecido além dos macrófaos do sangue para a expressão da NOS2 humana.
Vouldoukis e outros (1995) descobriu que a ligação do receptor de IgE de baixa afinidade (CD23; omim 151445) induz a produção de NOS pelos macrófagos derivados de monócitos ‘in vitro’. A ligação da CD23 levou à execução intracelular seguida de morte dos parasitas maiores da Leishmania, o que poderia ser bloqueado pelo inibidor de NOS, o NG-monometil-L-arginina monoacetato (NMMA).
Nicholson e outros (1996) relataram que os macrófagos dos pulmões de pacientes de tuberculose (TB) expressam NOS2 em quantidades potencialmente micobactericidas.
Nozaki e outros (1997) demonstraram por RT-PCR e análises de imunofluorescência que os macrófagos alveolares (AMs) obtidos de pacientes com fibrose pulmonar, mas não de pacientes com câncer nos pulmões, infectados com a vacina não virulenta da linhagem de micobactéria bovina (BCG) produziram altos níveis de iNOS. Ensaios de formação de colônias mostraram que esses AMs infectados mataram efetivamente os BCG, mas eles estavam menos hábeis após o tratamento com NMMA.
Usando análises de imuno-borrões e imuno-histoquímicas, Facchetti e outros (1999) mostraram a expressão de uma proteína NOS2 de 130 quilo-dáltons no citoplasma de macrófagos CD68 positivos em tecidos de granuloma infeccioso [CD68 – omim 153634 – 17p13 - a CD68 é uma glicoproteína de 110 quilo-dáltons que é altamente expressada em monócitos e macrófagos do tecido humanos. Holness e Simmons (1993) isolaram clones de cDNA codificadores de CD68 pela expressão transitória em células de ovário de ramster e imuno-seleção usando anticorpos monoclonais anti-CD68. Dois tipos de clones de cDNA foram isolados, diferido pela inserção de dois pequenos segmentos na porção termial N do domínio extracelular. A sequência de cDNA previu uma proteína integral de membrana de tipo I com 354 resíduos com um domínio extracelular pesasamente glicosilado de 298 resíduos contendo nove sítios de glicosilação ligados ao N (nitrogênio) e numerosos sítios de glicosilação ligados ao O (oxigênio). O domínio extracelular consiste de duas regiões distintas separadas por uma dobradiça de prolina estendida: um domínio distante de tipo mucina e um domínio próximo com significativa homologia sequecial com uma família de proteínas de manobra entre a membrana plasmática e o lisossomo (exemplo LAMP1; omim 153300). A CD68 é um membro da família das moléculas de tipo mucina hematopoiética que induzem a leucosialina/CD43 (omim182160) e o antígeno das células-tronco CD34 (omim 142230).] bem como na sarcoidose [omim 181000 – Um número assinalado com sustenido é usado com essa entrada pois há evidência de que a variação no gene da HLA-DRB1 no cromossomo 6p21.3 é um contribuidor principal para a suscetibilidade à sarcoidose (SS1).
A sarcoidose é uma desordem granulomatosa associada com uma acumulação de células T CD4+ e uma resposta imune de células Th1. Na infância, dois tipos distintos de sarcoidose foram descritos (Shetty e Gedalia, 1998). Usualmente a doença é detectada em crianças mais velhas por radiografia do tórax, e as manifestações clínicas são caracterizadas pelo clássico envolvimento em tríade dos pulmões, linfonodos e olhos, similares às dos adultos. Em contraste, o estabelecimento precoce da sarcoidose (EOS; omim 609464), a qual aparece usualmente nos mais jovens com menos de quatro anos de idade, é rara e uma tríade distinta de desordem da pele, juntas e olhos, sem envolvimento pulmonar aparente. Comparados com uma doença de curso assintomático e que desaparece naturalment às vezes nas crianças mais velhas, a EOS (de estabelecimento precoce) é progressiva e em muitos casos causa severas complicações como cegueira, destruição das juntas e envolvimento das vísceras.] e na doença de Kikuchi, mas não em granulomas estranhos ao corpo ou na síndrome de Omenn (omim 603554).
Choi e outros (2002) examinaram pulmões ressecados de oito pacientes de TB para a expressão de NOS e nitrotirosina, um marcador da expressão de NO. Análises imuno-histoquímicas e morfométricas revelaram que a iNOS, nitrotirosina, eNOS, TNFA (omim 191160), mas não a nNOS (NOS1; omim 163731), eram expressadas nos macrófagos epitelióides positivos para CD68 e nas células gigantes na zona inflamatória dos granulomas dos pacientes, mas não no tecido histologicamente normal obtido de pacientes de câncer como sujeitos de controle. A expressão do TNF era maior nas áreas necróticas.
A sub-unidade 26S do proteossomo é a principal via responsável pela degradação da iNOS. Proteínas alvo da degradação proteossômica podem requerer sua ligação covalente às cadeias de multi-ubiquitinas (isto é, ubiquitinação). Kolodziejski e outros (2002) relataram resultados de experimentos indicando que a iNOS é sujeita à ubiquitinação, a qual é requerida para sua degradação.
O óxido nítrico gerado de sintase de NO indutível (iNOS) tem sido implicado na enxaqueca (omim 157300) com base em evidências farmacológicas em animais e humanos. No modelo do rat, Reuter e outros (2002) mostraram que o doador de NO gliceril trinitrato (GTN) causou a expresão de NOS2A nos macrófagos, mediada pelo aumento da atividade do fator de transcrição nuclear kappa-B (NFKB1; omim 164011), resultando na geração de NO dentro da dura máter craniana (parte encefálica) dos roedores seis horas depois. O partenolide, uma lactona [um anidrido orgânico intramolecular formado a partir de um hidroxiácido pela perda de água entre uma hidroxila e um grupamento carboxila. Stedman] encontrada na herva medicinal Crisântemo parthenium que tem sido usado com sucesso no tratamento de condições inflamatórias e enxaqueca, bloqueou a expressão da NOS2A na dura mater pela inibição do NFKB1. [O partenolide previne a formação de coágulos sanguíneos e também é usado para aliviar a artrite. http://en.wikipedia.org/wiki/Parthenolide]
Kim e outros (2005) mostraram que a iNOS liga-se especificamente à ciclo-oxigenase 2 (COX 2; omim 600262) e as nitrosila em S (enxofre), aumentando atividade catalítica da COX2. A ruptura seletiva da ligação iNOS-COX2 impediu a ativação da COX2 mediada pelo óxido nítrico. Kim e outros (2005) sugeriram que o sinergismo molecular entre a iNOS e a COX2 pode representar um mecanismo maior das respostas inflamatórias.
Tezuka e outros (2007) mostraram que a alternação da recombinação da imunoglobulina de classe A (IgA) está enfraquecida nos camundongos deficientes em sintase indutível de óxido nítrico (camundongos nulos em iNOS). A iNOS regula a recombinação alternada da classe IgA dependente da célula T através da expressão de um receptor de fator beta de crescimento de transformação (veja TGFBR1, omim 190181 – 19q13.1), e a recombinação alternada da classe IgA independente de célula T através da produção de ligantes de indutores de proliferação (APRIL, também chamada de TNFSF13, omim 604472) e um fator de ativação da célula B da família do fator de necrose tumoral (BAFF; omim 603969). Notavelmente, a iNOS é expressada preferencialmente nas células dendríticas do tecido linfóide associado à mucosa (MALT) em resposta ao reconhcimento de bactérias comensais pelos receptores toll-like (TLR, veja 603030). Além disso, transferidores adotivos das células dendríticas positivas em iNOS resgatam a produção de IgA nos camundongos nulos em iNOS. Análises adicionais revelaram que as células dendríticas (MALT) são um sub-conjunto de células dendríticas produtoras de TNFA/iNOS, originalmente identificadas nos camundongos infectados com Listéria monocitogenes. A presença de um sub-conjunto de células dendríticas produtoras de TNFA/iNOS ocorrendo naturalmente pode explicar a predomiância da produção de IgA no MALT, crítica para a homeostase do intestino.
MAPEAMENTO
Por análise de Southern das linhas de células somáticas híbridas, Marsden e outros (1994) mapearam o gene da NOS2 no cromossomo 17; eles refinaram a assinatura em 17q11.2-q12 por uma fluorescência no sítio de hibridização. Jenkins e outros (1994), a qual se referia à sintase indutível de NO nos macrófagos do camundongo como Nos-1, descobriu que o gene mapeia no cromossomo 11 do camundongo homólogo ao cromossomo humano 17q. Eles previram que o gene humano deveria jazer no cromossomo 17q11.2.
Mehrabian e outros (1994) da mesma forma mapearam o homólogo do camundongo no cromossomo 11, usando análises de ligação RFLVs em um cruzamento retroativo (acasalamento do primeiro híbrido de uma geração com um de seus progenitores) interespecífico. Chartrain e outros (1994) usaram análises de reação em cadeia da polimerase de DNA genômico de um painel híbrido de células somáticas humanas e de roedores e fluorescência em sítio de hibridização para mapear o gene da NOS2 em 17cen-q 11.2. Xu e outros (1994) mapearam o gene da NOS2 em 17cen-q 11 por análises de Pigmentação Southern de DNAs obtidos de um painel de linhas celulares híbridas de humanos e roedores. Por fluorescência em sítio de hibridização eles encontraram sinais na região pericentromérica do cromossomo 17p11-q11. Gerling e outros (1994) mapearam o gene da Nos2 no cromossomo 11 do camundongo.
Usando hibridização de pigmentação Southern, Bloch e outros (1995) demonstraram que os genes da NOS2A, da NOS2B e da NOS2C estão localizados todos no cromossomo 17 entre as bandas 17p13.1 e 17q25.
GENÉTICA MOLECULAR
Rutherford e outros (2001) proporcionaram evidência para a localização de ao menos um lócus de suscetibilidade à hipertensão no cromossomo 17. Análises de 177 pares de parentes afetados ofereceram evidência para um excesso significativo do partilhamento de alelo com o marcador D17S949 no cromossomo 17q22-q24, com partilhamento de alelelo significativo também para um marcador adicional D17S799, localizado junto do centrômero. Como essas duas regiões genômicas estão bem separadas, os resultados indicaram que pode haver mais de um lócus no cromossomo 17 afetando a pressão sanguínea. Além disso, investigações adicionais usando um polimorfismo dentro do promotor do gene candidato a NOS2A revelou ambos o aumento do partilhamento do alelo entre os pares de parentes e a associação positiva da NOS2A com a hipertensão essencial. Morris (2002) chamaram à causa as conclusões de Rutherford e outros (2001); Griffiths (2002), o autor mais antigo do papel de Rutherford e outros (2001), respondido.
Kun e outros (1998) examinaram se as altas concentrações de NO no plasma encontradas na malária severa (veja omim 611162) eram devidas à variação na região promotora da NOS2. A heterosigosidade para um SNP de G para C na posição 969 estava presente em 30 das 100 crianças da Gâmbia com malára, mas em somente 17 das 100 crianças com malária severa. O SNP não foi encontrado em nenhum dos 100 alemãos. Os indivíduos heterosigotos também estavam com risco significativamente menor para reinfecção.
Hobbs e outros (2002) postularam que os polimorfismos no promotor da NOS2 poderiam afetar a resistência à malária severa como manifestada pela malária cerebral, anemia malariana severa, e dificuldade respiratória ou acidose metabólica (Marsh e outros, 1995). A partir de estudos na Tanzania e no Kenia, Hobbs e outros (2002) identificaram um novo polimorfismo de nucleotídeo, de C para T na posição 1173, no promotor de NOS2 que estava significativamente associado com a proteção à malária sintomática e à anemia malariana severa.
Hao e outros (2004) concluíram um estudo de controle de casos de larga escala explorando as associações de 426 polimorfismos de um só nucleotídeo (SNPs) com o nascimento prematuro (PTD) em 300 mães de PTD e e 458 mães de nascituros no tempo normal. Vinte e cinco genes candidatos foram incluídos na análise final de haplótipo (genes do mesmo par de alelos). Genes haplótipos em IL1R2 (omim 147811 – receptor de interleucina 1) em negros, NOS2A em brancos e OPRM1 (omim 600018 – receptor de opióide) em espanhóis estavam associados com o PTD somente nesses grupos étnicos.
Em um subgrupo de 73 famílias com doença de Parkinson (PD; omim 168600) no qual ao menos um mebro tinha a doença estabelecida antes dos 40 anos, Hancock e outros (2006) acharam uma associação significativa entre a PD e dois SNPs no gene da NOS2A: o alelo T mais frequente era rs2255020 e o menos frequente era o alelo A rs1060826 (p= 0,000059 e 0,0062, respectivamente). Os haplótipos dos dois SNP mostraram uma a associação ainda forte com a PD (p = 0,000013). Associações similares não foram observadas em um grande complexo do agrupamento de 286 famílias incluindo todas as idades de estabelecimento. Estudos epidemiológicos relataram consistentemente uma associação inversa entre a doença de Parkinson e o tabagismo. Em um grupo de 243 famílias sobrepostas, Hancock e outros (2006) acharam uma associação significativa entre o tabagiso e dois alelos de risco; entretanto quando estratificaram o estatus da PD, a presença desses alelos atenuoava a associação inversa protetora entre o tabagismo e a PD. Hancock e outros (2006) postularam que uma alteração na regulação da NOS2A poderia resultar na atividade prolongada e no dano celular e concluiu adicionalmente que a NOS2A poderia ser um fator de risco para a PD pela influência na idade de estabelecimento e pela modificação da associação inversa entre a PD e o tabagismo.
Entre 340 pacientes germânicos de PD com estabelecimento da doença na média etária de 52 anos, Schulte e outros (2006) não encontraram associação entre a desordem e doze polimorfismos no gene de NOS2A.
Eumicetoma é uma infecção fúngica tumorosa, tipicamente das mãos e dos pés, caracterizada pela infiltração de grande número de neutrófilos. Ela é causada pela Madurella mycetomatis, um patógeno que é abundante no sole e na vegetação do Sudão, onde a doença é comum. Van de Sande e outros (2007) notaram que o ELISA mostrava soropositividade de IgG quase universaç nos pacientes de micetoma e controles de áres endêmicas, mas nenhuma soropositividade nos controles europeus, implicando em que a maioria dos indivíduos nas áreas endêmicas são expostos ao patógeno, mas somente uma pequena porcentagerm desenvolv a doença. Van de Sande e outros (2007) estudaram 11 SNPs nos genes envolvidos na função do neutrófilo em 125 pacientes de micetoma sudaneses e 140 controles etinica e geograficamente misturados e encontraram significativas diferenças nas distribuições dos alelos para SNPs em IL8 (omim 146930), IL8RB (omim 146928), TSP4 (THBS4; mim 600715), NOS2, e CR1 (120620). A IL8 do soro estava significativamente mais alta nos pacientes em comparação com os controles, enquanto os níveis de nitrito/nitrato estavam mais baixos nos pacientes e pareciam estar associados com atraso na cicatrização das feridas. Van de Sande e outros (2007) concluíram que existe uma predisposição genética com relação à suscetibilidade ao micetoma.
MODELO ANIMAL
Em camundongos imunodeficientes inoculados com células mononucleares do sangue periférico humano, Koh e outros (2004) examinaram artérias humanas transplantadas de disfunção de célula endotelial e de célula vascular da musculatura lisa. Dentro de 7 a 9 dias, as artérias transplantadas desenvolveram disfunção endotelial mas permaneceram sensíveis ao NO exógeno. Por duas semanas, os enxertos desenvolveram sinais de disfunçaõ da celula vascular do músculo liso, incluindo enfraquecimento da contractibilidade e insensibilidade ao NO. Essas mudanças dependentes de células T correlacionaram-se com a perda da NOS endotelial e da expressão da NOS indutível. A neutralização do IFN-gama impediu completamente a disfunção vascular e as mudanças na expressão de NOS; a neutralização do TNF reduziu a produção de IFN-gama e preveniu parcialmente a disfunção. A inibição da iNOS preservou parcialmente as respostas ao NO em duas semanas e reduziu a expansão interna do enxerto após quatro semanas ‘in vivo’. Koh e outros (2004) concluíram que o IFN-gama é um mediador central da disfunção vascular através da desregulação da produção de NO.
Colton e outros (2006) descobriram que camundongos transgênicos expressando a proteína precursora da amilóide mutante (APP; omim 104760) em um segundo plano nulo para Nos2 desenvolveram hiperfosforilação patológica de tau (MAPT; omim 157140 – proteína associada ao microtúbulo tau – 17q21.1) com formação de agregados no cérebro. A falta de Nos2 aumentou os níveis de APP insolúvel, a degeneração neuronal, a ativação da caspase 3 (CASP3; omim 600636), e a clivagem de tau, sugerindo que o óxido nítrico pode atuar em um ponto de junção entre as duas principais patologias que caracterizam a doença de Alzheimer (AD; omim 104300).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=163730
quarta-feira, 17 de fevereiro de 2010
O Óxido Nítrico Inibe a Apoptose Dependente do Receptor de Transferrina Induzida Por Peróxido de Hidrogênio nas Células Endoteliais: Papel da Via Ubiquitina-Proteossomo
Srigiridhar Kotamraju,* Yoshiko Tampo,* Agnes Keszler,* Christopher R. Chitambar,† Joy Joseph,* Arthur L. Haas,‡ and B. Kalyanaraman
RESUMO
Nós investigamos aqui o mecanismo de cito-proteção do óxido nítrico (NO) nas células endoteliais da aorta bovina tratadas com H2O2 (peróxido de hidrogênio). NONOatos foram usados como doadores de NO que liberaram o NO lentamente em uma taxa bem definida nos ambientes extracelular e intracelular. A fluorescência de diclorofluoresceína intracelular mediada por H2O2 e a apoptose foram aumentadas pela captura de ferro mediada pelo receptor de transferrina (TfR). A NO inibiu a captura de ferro mediada pelo TfR, a fluorescência da diclorofluoresceína e a apoptose nas células tratadas com H2O2. A NO aumentou a atividade proteossômica e a degradação de TfR nitrados por via da ubiquitinação. O metil éster Nω-nitro-L-arginina, um inibidor não específico da biossíntese endógena de NO, diminuiu a atividade típica de tripsina da unidade 26S do proteossomo. O NO, pela ativação da proteólise, alivia a captura de ferro dependente de TfR, a oxidação da diclorohidrofluoresceína e a apoptose das células endoteliais de aorta bovina tratadas com H2O2. A relevância da nitração biológica na sinalização redox é discutida. [Redox é a contração oxidação-redução.Sinônimo: oxidorredução. Stedman]
[Obs.: A maioria dos NONOatos são estáveis em solução alcalina em torno de pH 8.0 (exemplo 10 mM de NaOH) e podem ser estocados a menos 20oC dessa forma por curto prazo. Para gerar NO a partir de NONOatos, o pH é rebaixado de acordo. Tipicamente, uma diluição da reserva da solução de NONOatos é feita em um tampão de fosfato (pH 7.4) e incubada na temperatura ambiente pelo tempo desejado para permitir ao NO acumular-se na solução. http://en.wikipedia.org/wiki/NONOate]
TEXTO
Embora numerosos estudos tenham focalizado na interação celular entre o óxido nítrico (NO) e no ânion de superóxido (O2-), sabe-se relativamente pouco sobre os efeitos celulares induzidos pelo NO e o H2O2. Esses efeitos celulares incluem a homeostase do ferro, estresse oxidativo, nitrativo e nitrosativo (nitroso é um composto nitrogenado com menos um átomo de oxigênio do que os compostos nítricos e em que o nitrogênio está presente em sua forma trivalente. Stedman), proliferação celular e apoptose. O efeito citoprotetor do NO contra a toxidade celular mediada pelo H2O2 tem sido atribuído à quelação do ferro, reciclagem de radicais, e restauração da respiração mitocondrial. Recentemente nós relatamos que a apoptose endotelial induzida por H2O2 era mediada pela captura de ferro celular dependente do receptor de transferrina (TfR), pois o bloqueio da captura de ferro por um anticorpo anti-TfR (de classe IgA) aboliu completamente o estresse e a apoptose oxidativa induzida pelo H2O2. A liberação de NO por suas moléculas doadoras inibiu a apoptose induzida por hidroperóxido nas células endoteliais. Dessa forma, o efeito anti-apoptótico do NO pode estar relacionado à regulação da sinalização celular do ferro.As células endoteliais adquirem ferro através dos TfRs localizados na superfície celular. Células expostas ao hidroperóxidos (H2O2) aumentam a expressão de mRNA de TfR resultante da indução da proteína 1 regulatória do ferro (IRP-1), citosólica e com 98 quilo-dáltons. Sob essas condições, a síntese de ferritina, um proteína intracelular de estocagem do ferro, diminui. As sínteses de TfR e de ferritina são reguladas pelo ferro no nível da tradução do mRNA pela interação das IRPs citoplasmáticas com os seus respectivos mRNAs. Tióis nitrosos têm sido mostrados por ativarem as IRPs através da nitrosação de cisteínas presentes nas IRPs. O objetivo desse estudo foi investigar o efeito do NO na sinalização do ferro mediada pelo TfR e a apoptose nas células endoteliais expostas a H2O2.
Células revestidas com a acumulação de proteínas oxidizadas, nitradas e nitrosadas aumentaram a proteólise. A degradação proteolítica celular envolve a ubiquitinação pós-tradução de proteínas modificadas. Este estudo testou duas hipóteses: 1) o efeito cito-protetor do NO é devido à estimulação da via do proteossomo pela ubiquitina (Ub), e 2) o NO regula a sinalização do ferro induzida por oxidante, a homeostase intracelular do ferro e o estresse oxidativo através da ativação proteolítica aumentada. Os resultados mostram que o NO, tanto exógeno quanto endógeno, aumenta a atividade proteossômica nas células endoteliais, e os inibidores do proteossomo abolem a cito-proteção mediada pelo NO.
RESULTADOS
Efeito do NO na Oxidação Intracelular de DCFH (2’,7’-diclorodihidrofluoresceína) Induzida por H2O2 e Apoptose.
As células BAECs (células endoteliais da aorta bovina) foram tratadas com H2O2 (1μM/min) geradas de glucose/GO (glucose oxidase). Antes da adição do DCFH-DA (2’,7’-diclorodihidrofluoresceína diacetato), as células foram lavadas livres de glucose/GO. A oxidação intracelular da prova ativa carboxi-DCFH para diclorofluoresceína (DCF), um agente fluorescente, produto da oxidação de dois elétrons, foi medida. A intensidade da fluorescência de DCF estava perto de 1000 vezes maior nas células endoteliais da aorta bovina do que no controle após um trataento com glucose/GO por quatro horas. A fluorescência da DCf intracelular induzida pelo H2O2 quase totalmente abolida pela DETA/NO (NONOato dietilenetriamina) que lentamente liberou NO (7,2 nM/min). As BAECs tratadas com H2O2 e DETA/NO foram extensivamente lavadas antes da adição da DCFH-DA. A figura 1C mostra que o tratamento com DETA/NO inibe a liberação do citocromo c da mitocôndria para dentro do citosol nas BAECs tratadas com glucose/glocose oxidase por oito horas. Após o tratamento das BAECs com H2O2 por oito horas, a atividade proteolítica da caspase 3 aumentou perto de cinco vezes em comparação com o controle. A DETA/NO diminui grandiosamente a ativação da caspase 3 de células tratadas com H2O2 , o que está consistente com a interpretação de que a liberação do citocromo c no citosol é um pré-requisito para a ativação da caspase 3. A apoptose foi adicionalmente confirmada pelo uso da técnica de etiquetamento do final dUTP (desóxi uridina trifosfato?) mediado pela desoxinucleotidiltransferase terminal (TUNEL). Os resultados mostraram que a incubação com DETA/NO (50 a 100 µM) diminuiu substancialmente a fração das BAECs positivas do TUNEL após o tratamento com glucose/glucose oxidase por oito horas.
A adição de DETA/NO (dietilenotriamina/NONOato) não afetou o H2O2 liberado pela glucose/glucose oxidade. Evidência adicional para o efeito inibidor do NO em danos oxidativos dependentes de H2O2 foi obtida pelo uso de doador de NO intracelular. Porque o NO extracelular é predominantemente oxidizado a NO2-/NO3-, concentrações relativamente mais altas (50 a 100 μM) de DETA/NO foram requeridas. Em contraste, o pró doador de NO específico de célula permeável a esterase AcOM-PYRRO/NO libera NO intracelularmente. [Obs.: esterase é um termo genérico para enzima. Stedman.] Assim, baixas concentrações (1 µM) de AcOM-PYRRO/NO inibiram o estresse oxidative induzido pelo H2O2. Esses resultados mostram que o NO mitiga (alivia) a formação de oxidantes intracelulares dependentes de H2O2 e a apoptose nas células endoteliais.
Efeito do NO em Alterações Induzidas por H2O2 em GSH (glutationa), Aconitase e Atividades de IRP-1
[OBS.: Aconitase citoplasmática – omim 100880 – 9p22-p13 – A ACO1, ou IRP1 (Proteína 1 Regulatória de Ferro), é uma proteína bifuncional com funções mutuamente exclusivas enquanto uma proteína de ligação a elemento responsivo a ferro (IRE) envolvida no controle do metabolismo do ferro ou como a isoforma citoplasmática da aconitase. As aconitases são proteínas e ferro e enxofre que requerem o conjunto de 4Fe-4S (quatro ferros e quatro enxofres) para sua atividade enzimática, no qual elas catalisam a conversão de citrato a isocitrato.
A aconitase-1 funciona como uma proteína de ligação a IRE (IREBP). Os IREs são sequências regulatórias da tradução na extremidade 5 da UTR (região não traduzida) do mRNA da ferritina (veja omim 143790) e na extremidade 3 da UTR do mRNA do receptor de transferrina (omim 190010). A IREBP citoplasmática interage com os IREs desses mRNAs. O estatus do ferro na célula determina a habilidade da IREBP em ligar-se a um IRE através da redução-oxidação reversível dos grupos sulfidril que são críticos para a alta afinidade da interação proteína-RNA. Assim, a IREBP atua num papel central na homeostase celular do ferro regulando a tradução do mRNA de ferritina e a estabilidade do mRNA de TFRC.
Obs.: Aconitase miticondrial (omim 100850 - 22q11.21-q13.31 – Mirel e outros (1998) clonaram e caracterizaram a essencial enzima metabólica dependente de ferro ACO2. Eles mostraram que o mRNA da ACO2 tem 2,7 quilobases de comprimento e é expressado ubiquamente. Eles detectaram múltiplas isoformas da proteína ACO2.
Em ensaios da proteína purificada da mitocôndria no coração bovino, Bota e Davies (2002) encontraram que a protease Lon seletivamente reconhecia e degradava a forma hidrofóbica oxidada da aconitase após modificações oxidativas moderadas. A oxidação severa resultava em uma agregação da aconitase, tornando-a um substrato pobre para a Lon {LON omim 605490 - 12p13.2 – Nos eucariotos, a proteólise dependente de ATP é concluída através da conjugação à ubiquitina (omim 191339) e pela protease 26S (veja PSMD5; omim 604452). As proteases Lon e Clp mediam a proteólise dependente de ATP nos procariotos e parecem quase distintas da protease 26S. Organelas eucariotas, entretanto, podem ter sistemas proteolíticos independentes.}.
Bulteau e outros (2004) descobriram que a atividade de aconitase pode passar por modulação dependente de citrato em resposta a pró-oxidantes. A Frataxina (omim 606829 – 9q13 – a frataxina é uma chaperone mitocondrial de ferro codificada no núcleo celular envolvida na biogênese de enxofre e ferro e na biossíntese de heme. Alguns estudos também sugeriram que a Frataxina funciona como uma molécula de estoque de ferro, um anti-oxidante e um supressor de tumor.) interagiu com aconitase de modo dependente de citrato e converteu a enzima inativa [3Fe-4S]1+ para a forma ativa da proteína [4Fe-4S]2+. Bulteau e outros (2004) concluíram que a frataxina é uma proteína chaperone de ferro que protege o conjunto aconitase [4Fe-4S]2+ da desagregação e promove a reativação da enzima.]Porque o NO inibiu fortemente o estresse oxidante induzido por H2O2, nós avaliamos o papel do NO nos níveis intracelulares de GSH e atividade total da aconitase. [Obs.: GSH é glutationa – um tripeptídeo da glicina, da Lcisteína e do L-glutamato com o L-glutamato que possui uma ligação isopeptídica com o radical amino da L-cisteína; é o tiol não-protéico mais prevalente. O dissulfeto de glutationa consiste em duas glutationas ligadas por uma ponte disulfeto. A deficiência de glutationa pode causar hemólise com estresse oxidativo. Também é utilizada no curso do metabolismo intermediário como uma doadora de grupamentos tiol (SH). A glutationa oxidada age nas células como um receptor de hidrogênio; é reduzida pela glutationa redutase; é o dissulfeto de glutationa e o termo dissulfeto já inclui sulfonas e sulfóxidos que já são oxidados. A glutationa peroxidase é uma enzima que catalisa a reação de duas glutationas com peróxido de hidrogênio (H2O2 ) formando dissulfeto de glutationa e duas moléculas de água; uma enzima fundamental na detoxificação do peróxido de hidrogênio.Stedman] As BAECs foram tratadas com glucose/glucose oxidase por quatro horas com e sem DETA/NO (dietilenotriamiamina/NONOato). A figura 2 A mostra que os níveis de GSH foram diminuídos em mais de 50% após as quatro horas de tratamento com H2O2. Entretanto, a adição de DETA/NO (50 e 100 μM) aumentou os níveis de GSH de 2,3 nmol/mg de proteína para 4 e 5 nmol/mg de proteína em células tratadas com H2O2. A DETA/NO sozinha não afeta os níveis de GSH significativamente. A atividade de aconitase foi medida no citosol e na mitocôndria das células BAECs tratadas com glucose/glucose oxidase na presença e na ausência de DETA/NO. O NO inibiu marcadamente a inativação, induzida por H2O2 , da atividade da aconitase mitocondrial mas não da atividade da aconitase citosólica
Resultados prévios indicam que a oxidação das DCFH (diclorodihidrofluoresceínas) dependente de H2O2 é devida a um aumento dos níveis de expressão dos TfR e da captura de ferro dependente dos TfR. A figura 2D mostra que a expressão dos TfR aumenta significativamente nas BAECs tratadas com glucose/glucose oxidase, enquanto na presença de DETA/NO (NONOato dietilenotriamina), a expressão dos TfRs é inibida. Sendo a síntese de TfR regulada pela ligação da IRP (Proteína Regulatória do Ferro) ao IRE (Elemento Responsivo à Ferro) e a atividade da IRP-1 estimulada pelo H2O2, nós avaliamos os efeitos da DETA/NO (dietilenotriamina/NONOato) na atividade da IRP-1 nas células BAEC tratadas com glucose/glucose oxidase. Para determinar se o aumento na atividade da IRP-1 com tratamento com H2O2 e DETA/NO era devido a um aumento na IRP-1 total, os lisados foram tratados com 1% de 2-mercaptoetanol [mercapto é um prefixo que indica a presença de um grupamento tiol (SH). Stedman] , o qual ativa a IRP-1 em sua forma de ligação a RNA com alta afinidade. Sob essas condições, as principais diferenças na ligação da IRP-1 ao IRE não foram observadas entre os controles e outros grupos de tratamento. A falta de inibição do NO sobre a ligação IRP-1/IRE nas células tratadas com H2O2 confunde, porque o NO diminuiu marcadamente a expressão do TfR nas células BAECs tratadas com H2O2. Uma explicação aceitável é que a diminuição na expressão do TfR (nas células) em DETA/NO- H2O2 é devida ao aumento da degradação dos TfR pelo sistema do proteossomo. Por isso, as células foram pré-incubadas com Lac, um inibidor de protease específico do proteossomo que modifica covalentemente duas sub-unidades beta do proteossomo. Na presença de Lac, a expressão do TfR nas células tratadas com H2O2 e DETA/NO aumentou. O aumento na expressão do TfR pelo inibidor de protease, Lac, sugere que o TfR provavelmente sofre degradação proteolítica na presença de NO e de H2O2. Esses resultados sugerem que o NO possivelmente modula a sinalização do ferro mediada por H2O2 e o estresse oxidativo pela estimulação da atividade do proteossomo.
O Efeito dos Inibidores de Proteossomo no Decréscimo do Estresse Oxidativo Celular Mediado pelo NO.
A próxima etapa foi identificar se os inibidores de proteossomo poderiam aumentar a captura de ferro e a oxidação de DCFH (diclorodihidrofluoresceína) nas células tratadas com H2O2. As células endoteliais foram pré-tratadas com vários inibidores de proteossomo (10 µM de Lac, 10 μM de MG-132, e 2 µM de epoxomicina). Os inibidores de proteossomo sozinhos, nas concentrações usadas não induzem nenhum estresse oxidativo ou apoptose nas BAECs. A oxidação da diclorohidrofluoresceína aumentou nas células pré-tratadas com inibidores de proteossomo por duas horas e expostas à glucose/glucose oxidase e DETA/NO. Entretanto, a fluorescência da diclorofluoresceína foi eliminada completamente nas células tratadas com o anticorpo anti-TfR (de classe IgA) que se liga especificamente ao domínio extracelular do TfR e inibe a endocitose do receptor.
Para provar o envolvimento do ferro, a captura do ferro etiquetado (55Fe) na presença da Lac foi medida. A captura do 55Fe foi perto de 2,3 vezes maior nas células tratadas com H2O2 do que nas células de controle. Não havia aumento na captura do 55Fe com DETA/NO. Esse achado é consistente com o decréscimo nos níveis de TfR observado nas células endoteliais da aorta bovina (BAECs) tratadas com H2O2 do que nas células de controle. O tratamento com Lac contrabalançou o efeito da DETA/NO, como evidenciado pelo aumento na captura de 55Fe nas células tratadas com Lac. A inibição do proteossomo com Lac também reverteu o efeito anti-apoptótico do NO. A figura 3C mostra que a Lac causou um aumento na atividade da caspase 3 nas células tratadas com H2O2 e com NO. Esses resultados sugerem que o efeito cito-protetor e anti-oxidativo da DETA/NO provavelmente é devido à estimulação do proteossomo.
Então nós presumimos que o NO protege contra o estresse oxidativo nas células tratadas com H2O2 através da ativação da proteólise intra-celular, a acumulação celular de proteína oxidada poderia ser inibida. Os níveis de proteínas com carbonila [grupamento CO das cetonas, aldeídos e ácidos orgânicos. Stedman] eram significamente maiores nas células tratadas com glucose/glucose oxidase do que nas células não tratadas. Entretanto, os níveis de proteínas carbonila eram diminuídos drasticamente na presença de DETA/NO. Na presença de Lac, as proteínas carbonilas foram aumentadas. Coletivamente, esses resultados indicam um papel anti-oxidante descaracterizado previamente para o NO como um estimulador da função do proteossomo.
Recentemente, um aumento na nitração das proteínas foi detectado em presença de NO, H2O2 e Ferro. O decréscimo nos níveis de TfR casou com o aumento da atividade do proteossomo nas células tratadas com DETA/NO e H2O2 e nos prontificou a examinar se o TfR é modificado pela nitração. A nitração do TfR foi avaliada por imunoprecipitação do TfR e pela prova deste com um anti-corpo monoclonal anti-nitro-tirosina. A nitração do TfR aumentou nas BAECs tratadas com H2O2 e Deta/NO por quarto horas. Os níveis de TfR nitrados, entretanto, decresceram durante um tempo prolongado de incubação (mais de seis horas). Isso provavelmente é devido à estimulação da atividade do proteossomo pelo NO.
Efeito do NO nas Atividades das Sub-Unidades 20S e 26S do Proteossomo: Degradação de TfR Nitrado por Ubiquitinação.
A degradação de proteínas, modificadas por oxidação ou nitradas, pelo proteossomo poderia ocorrer por um mecanismo dependente de ubiquitina ou independente. Por isso as atividades de peptidase das sub-unidades 26S e 20S do proteossomo em células tratadas com DETA/NO somente e na presença de H2O2 foram medidas. O tratamento das BAECs por seis horas com glucose/ glucose oxidase anulou quase totalmente ambas as atividades típicas de quimiotripsina e de tripsina da sub-unidade 26S do proteossomo. A DETA/NO sozinha aumentou significativamente a atividade típica de quimiotripsina nas células. As atividades da enzima permaneceram elevadas nas células durante o tratamento combinado de H2O2 e DETA/NO, sugerindo que o NO aumenta as atividades proteolíticas nas células endoteliais tratadas com H2O2. As atividades das sub-unidades 26S e 20S do proteossomo foram medidas na presença ou ausência da Lac e MG-132. Ambas a Lac e a MG-132 inibiram as atividades do proteossomo estimuladas pelo NO. Esses resultados indicam que o NO ativa a atividade do proteossomo nas células endoteliais tratadas com H2O2.
A ubiquitinação total das proteínas celulares e sua degradação na presença do H2O2 e da DETA/NO foi então investigada. As BAECs foram tratadas com glucose/glucose oxidase e sem DETA/NO por seis horas. A figura 4D mostra que o tratamento com glucose/glucose oxidase não altera as proteínas ubiquinadas em comparação com as células de controle, sugerindo que a ubiquitinação por si só não é afetada pelo H2O2 quando as células são tratadas por seis horas sob essas condições experimentais. A ubiquitinação das proteínas estava drasticamente mais baixa nas células tratadas com glucose/glucose oxidase e DETA/NO, o que é consistente com um aumento na atividade da sub-unidade 26S do proteossomo, levando a uma taxa aumentada da degradação de proteínas ubiquinadas.
Depois nós investigamos se a degradação do TfR depende da ubiquitinação dessa proteína. As células foram tratadas com glucose/glucose oxidase por seis horas e sem DETA/NO, e os extratos de células foram imunoprecipitados com um anticorpo monoclonal anti-TfR, dissipadas em um SDS/5% PAGE, e provadas com um anticorpo policlonal anti-ubiquitina. A Figura 4F mostra que o TfR submete-se à degradação dependente de ubiquitina, e que o TfR ubiquitinado (Ub-TfR) aumenta em células tratadas com H2O2 e diminui em células tratadas com H2O2 e DETA/NO. Isso está em consistência com as atividades aumentadas do proteossomo na presença de H2O2 e DETA/NO. Finalmente, nós investigamos os efeitos da Nω-nitro-L-arginina metil Ester (L-NAME) e sua análoga estrutural inativa (Nω-nitro-D-arginina metil Ester) na atividade da sub-unidade 26S do proteossomo. A L-NAME, um inibidor não específico da atividade da NO sintase (NOS), diminuiu a atividade típica de tripsina de modo dependente da dose. Isso sugere que o NO endógeno gerado pela NOS endotelial é essencial para a manutenção da atividade inerente ao proteossomo.
DISCUSSÃO
Esse estudo encontrou que o NO liberado lentamente por doadores de NO inibe a sinalização do ferro mediada pelo recpetor de transferrina (TfR), a oxidação intracelular da dioclorodihidrofluoresceína, e a apoptose nas células endoteliais tratadas com H2O2. O NO aumentou a nitração do TfR e a atividade proteossômica. A inibição da NO sintase diminuiu a atividade do proteossomo. Nós sugerimos que, pela estimulação da proteólise, o NO inibe a captura do ferro mediada pelo TfR, o estresse oxidativo, e a sinalização apoptótica em células endoteliais tratadas com H2O2.
O Envolvimento do TfR na Sinalização do Ferro Induzida por Peróxido de Hidrogênio, Estresse Oxidativo e Apoptose.
Relatos indicam que o dano celular causado por espécies de oxigênio reativo e nitrogênio é criticamente controlado pela homeostase intracelular do ferro. A exposição dos fibroblastos murinos ao H2O2 aumenta a expressão do mRNA de TfR e a fluorescência da diclorofluoresceína, implicando num elo em potencial entre o estresse oxidativo e a captura de ferro mediada pelo TfR. Recentemente nós mostramos que a adição exógena de um bolo [uma quantidade única, relativamente grande, de uma substância, geralmente aquela destinada a uso terapêutico, como uma dose maciça de um medicamento injetado por via intravenosa. Stedman] ou de H2O2 gerado continuamente para as células endoteliais causa uma oxidação aumentada da diclorodihidrofluoresceína a diclorofluoresceína que é regulada pela captura do ferro da transferrina mediada pelo TfR. O bloqueio da captura do ferro pelo anticorpo anti-TfR (de classe IgA) que se liga especificamente ao domínio extracelular do TfR abple a fluorescência da diclorofluoresceína induzida pelo H2O2. Esse achado intrigante sugere que a oxidação intracelular da diclorodihidrofluoresceína é catalisada por ambos o H2O2 e o ferro transportado pelo TfR. Aqui nós mostramos que o NO gerado pela DETA/NO regula para menos a expressão do TfR em células tratadas com H2O2 e inibe a captura de ferro mediada pelo TfR. Consequentemente, a oxidação da diclorodihidrofluoresceína intracelular diminui. Em células tratadas com Lac, os níveis de TfR fora regulados para mais, o que levou a uma aumentada captura de ferro e oxidação da diclorodihidrofluoresceína.
Nossos resultados demonstram que a ativação da caspase induzida pelo H2O2 é acompanhada por um aumento na captura de ferro mediada pelo TfR. A liberação do NO a partir da DETA/NO inibe a apoptose induzida pelo H2O2 e a captura de ferro mediada pelo TfR. Assim, o TfR atua como um efetivo “portão de entrada” e modulador da apopose endotelial induzida pelo H2O2. O NO alivia o estresse oxidativo induzido pelo H2O2 e a apoptose endotelial pela inibição da sinalização do ferro.
Degradação das Proteínas pelo Efeito do NO Modulador da Rota da Ubiquitina-Proteossomo.
A via da Ubiquitina-Proteossomo atua num papel principal na quebra das proteínas modificadas oxidativamente que por outro lado romperiam a função normal da célula. A proteína mirada para degradação é fixada covalentemente a várias moléculas de ubiquitina, uma proteína de 76 aminoácidos. A nitração mira tipicamente as proteínas modificadas para ubiquitinação e rápida degradação pelas sub-unidades 26S dos proteossomos. A proteína ubiquinada é subsequentemente escoltada à sub-unidade 26S do proteossomo onde se submete à degradação por meio de uma via envolvendo uma série de enzimas chamadas E1, E2 e E3. O cerne proteolítico do complexo 26S, a sub-unidade 20S do proteossomo, contém múltiplas atividades de peptidase incluindo a atividade de tipo quimiotripsina (uma endopeptidade de serina que hidrolisa as ligações peptídicas presentes no grupo carboxila de aminoácidos hidrofóbicos como a fenilalanina). A atividade de tipo quimiotripsina foi considerada crucial para a remoção de proteínas nitradas no plasma. As proteínas nitradas (ex. gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foram mostradas enquanto indutoras da via ubiquitina-proteossomo.
Os doadores de NO induziram a nitração de proteínas por meio de um mecanismo envolvendo ferro ativo em redox e H2O2. Similarmente, a proteína TfR foi nitrada na presença de ferro, H2O2 e NO. O TfR nitrado foi subsequentemente mirado para a degradação proteossômica. Trabalhos prévios mostraram que a atividade de enzimas conjugando-se a ubiquitina (E1 e E2) é reversivelmente inibida durante o estresse oxidativo, Os dados presentes mostram que ambos os sistemas 20S e 26S do proteossomo são inativados pela glucose/glucose oxidase, a qual efetivamente comprometeu a remoção de proteínas oxidizadas. Como um resultado, as proteínas com carbonilas eram em maior número nas células tratadas com H2O2. Entretanto, as proteínas com carbonilas estavam consideravelmente diminuídas na presença de DETA/NO. Embora uma reportagem recente sugira que a conjugação à ubiquitina não seja requerida para a degradação de proteínas oxidizadas pelo proteossomo, os dados aqui indicam que ambos as sub-unidades 20S e 26S dos proteossomos estão envolvidas na degradação de proteínas nitradas e oxidadas, pois ambas as atividades 20S e 26S do proteossomo fora reguladas para menos com o H2O2 e reguladas para mais no tratamento com H2O2 e DETA/NO.
Nitração de Proteínas Receptoras e Sinalização Redox.
A nitração de proteínas com radical tirosil (A tirosina (Tyr) é, sem dúvida, o sítio de formação de radicais livres nas proteínas mais frequentemente mencionado. Alguns radicais tirosil estão associados com atividade enzimática. Em: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=MImg&_imagekey=B9...8f0b435&ie=/sdarticle.pdf - 584 KB) tem sido relatadas modificando a função do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) causando alterações na sinalização celular. A nitração de sub-unidades do receptor de NMDA induzida por hipóxia aumentou o influxo de Ca2+ no cérebro de leitão recém nascido. A sintase de óxido nítrico neuronal que é co-localizada com os receptores de NMDA é ativada pelo influxo de Ca2+, levando ao aumento da produção de NO. A inibição da sintase de óxido nítrico impede ambas a nitração do receptor de NMDA e o influxo de Ca2+ mediado pelo receptor. Por isso a nitração é um mecanismo viável pelo qual o receptor sensível a redox pode adquirir um ganho ou perda de função. Nesse estudo nós postulamos que a nitração do TfR pode alterar a captura de ferro dependente de TfR. A estrutura cristalina do domínio externo homodimérico do TfR tem um domínio helicoidal (resíduos 607 a 760) que se liga à transferrina. Existem seis tirosinas (resíduos 611, 614, 628, 643, 683 e 689) no domínio de ligação à transferrina. A nitração das tirosinas presentes no domínio helicoidal provavelmente inibirá a ligação da transferrina devido ao bloqueio estérico [bloqueio da reação porque os sítios ativos não conseguem aproximação suficiente devido] e mudanças conformacionais. Essa proposta experimental explica como a nitração do TfR pode inibir a captura do ferro induzida pelo H2O2.
Conclusão
Esse estudo descreveu o papel do NO, gerado lentamente em taxas definidas a partir de NONOatos, na sinalização do ferro induzida por oxidante. Os NONOatos inibem a oxidação da diclorodihidrofluoresceína, a sinalização do ferro no TfR, e a apoptose de células endoteliais sob estresse oxidativo. Admitidamente, a resposta aos doadores de NO nas células é variada e frequentemente paradoxal. Duas fontes diferentes de doadores de NO elicitam efeitos opostos na mesma função celular. Se o NO aumenta ou suprime a atividade do proteossomo parece depender do status proliferativo de uma célula. A sinalização mediada pelo NO e a ativação dos proteossomo pode atuar num papel regulatório crítico na apoptose e sobrevivência da célula pela modulação da sinalização do ferro dependente de TfR nas células endoteliais submetidas à modificação oxidativa e nitrativa. A maioria das patologias vasculares (diabetes, hiperglicemia e aterosclerose) são caracterizadas por um decréscimo na produção endotelial de NO. Sob essas condições, os radicais de oxigênio e a degradação da proteína estão usualmente aumentados. Assim, o papel do NO (isto é, mantendo a função do proteossomo) é altamente significativa numa perspectiva patofisiológica.
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC196859/?tool=pubmed
Srigiridhar Kotamraju,* Yoshiko Tampo,* Agnes Keszler,* Christopher R. Chitambar,† Joy Joseph,* Arthur L. Haas,‡ and B. Kalyanaraman
RESUMO
Nós investigamos aqui o mecanismo de cito-proteção do óxido nítrico (NO) nas células endoteliais da aorta bovina tratadas com H2O2 (peróxido de hidrogênio). NONOatos foram usados como doadores de NO que liberaram o NO lentamente em uma taxa bem definida nos ambientes extracelular e intracelular. A fluorescência de diclorofluoresceína intracelular mediada por H2O2 e a apoptose foram aumentadas pela captura de ferro mediada pelo receptor de transferrina (TfR). A NO inibiu a captura de ferro mediada pelo TfR, a fluorescência da diclorofluoresceína e a apoptose nas células tratadas com H2O2. A NO aumentou a atividade proteossômica e a degradação de TfR nitrados por via da ubiquitinação. O metil éster Nω-nitro-L-arginina, um inibidor não específico da biossíntese endógena de NO, diminuiu a atividade típica de tripsina da unidade 26S do proteossomo. O NO, pela ativação da proteólise, alivia a captura de ferro dependente de TfR, a oxidação da diclorohidrofluoresceína e a apoptose das células endoteliais de aorta bovina tratadas com H2O2. A relevância da nitração biológica na sinalização redox é discutida. [Redox é a contração oxidação-redução.Sinônimo: oxidorredução. Stedman]
[Obs.: A maioria dos NONOatos são estáveis em solução alcalina em torno de pH 8.0 (exemplo 10 mM de NaOH) e podem ser estocados a menos 20oC dessa forma por curto prazo. Para gerar NO a partir de NONOatos, o pH é rebaixado de acordo. Tipicamente, uma diluição da reserva da solução de NONOatos é feita em um tampão de fosfato (pH 7.4) e incubada na temperatura ambiente pelo tempo desejado para permitir ao NO acumular-se na solução. http://en.wikipedia.org/wiki/NONOate]
TEXTO
Embora numerosos estudos tenham focalizado na interação celular entre o óxido nítrico (NO) e no ânion de superóxido (O2-), sabe-se relativamente pouco sobre os efeitos celulares induzidos pelo NO e o H2O2. Esses efeitos celulares incluem a homeostase do ferro, estresse oxidativo, nitrativo e nitrosativo (nitroso é um composto nitrogenado com menos um átomo de oxigênio do que os compostos nítricos e em que o nitrogênio está presente em sua forma trivalente. Stedman), proliferação celular e apoptose. O efeito citoprotetor do NO contra a toxidade celular mediada pelo H2O2 tem sido atribuído à quelação do ferro, reciclagem de radicais, e restauração da respiração mitocondrial. Recentemente nós relatamos que a apoptose endotelial induzida por H2O2 era mediada pela captura de ferro celular dependente do receptor de transferrina (TfR), pois o bloqueio da captura de ferro por um anticorpo anti-TfR (de classe IgA) aboliu completamente o estresse e a apoptose oxidativa induzida pelo H2O2. A liberação de NO por suas moléculas doadoras inibiu a apoptose induzida por hidroperóxido nas células endoteliais. Dessa forma, o efeito anti-apoptótico do NO pode estar relacionado à regulação da sinalização celular do ferro.As células endoteliais adquirem ferro através dos TfRs localizados na superfície celular. Células expostas ao hidroperóxidos (H2O2) aumentam a expressão de mRNA de TfR resultante da indução da proteína 1 regulatória do ferro (IRP-1), citosólica e com 98 quilo-dáltons. Sob essas condições, a síntese de ferritina, um proteína intracelular de estocagem do ferro, diminui. As sínteses de TfR e de ferritina são reguladas pelo ferro no nível da tradução do mRNA pela interação das IRPs citoplasmáticas com os seus respectivos mRNAs. Tióis nitrosos têm sido mostrados por ativarem as IRPs através da nitrosação de cisteínas presentes nas IRPs. O objetivo desse estudo foi investigar o efeito do NO na sinalização do ferro mediada pelo TfR e a apoptose nas células endoteliais expostas a H2O2.
Células revestidas com a acumulação de proteínas oxidizadas, nitradas e nitrosadas aumentaram a proteólise. A degradação proteolítica celular envolve a ubiquitinação pós-tradução de proteínas modificadas. Este estudo testou duas hipóteses: 1) o efeito cito-protetor do NO é devido à estimulação da via do proteossomo pela ubiquitina (Ub), e 2) o NO regula a sinalização do ferro induzida por oxidante, a homeostase intracelular do ferro e o estresse oxidativo através da ativação proteolítica aumentada. Os resultados mostram que o NO, tanto exógeno quanto endógeno, aumenta a atividade proteossômica nas células endoteliais, e os inibidores do proteossomo abolem a cito-proteção mediada pelo NO.
RESULTADOS
Efeito do NO na Oxidação Intracelular de DCFH (2’,7’-diclorodihidrofluoresceína) Induzida por H2O2 e Apoptose.
As células BAECs (células endoteliais da aorta bovina) foram tratadas com H2O2 (1μM/min) geradas de glucose/GO (glucose oxidase). Antes da adição do DCFH-DA (2’,7’-diclorodihidrofluoresceína diacetato), as células foram lavadas livres de glucose/GO. A oxidação intracelular da prova ativa carboxi-DCFH para diclorofluoresceína (DCF), um agente fluorescente, produto da oxidação de dois elétrons, foi medida. A intensidade da fluorescência de DCF estava perto de 1000 vezes maior nas células endoteliais da aorta bovina do que no controle após um trataento com glucose/GO por quatro horas. A fluorescência da DCf intracelular induzida pelo H2O2 quase totalmente abolida pela DETA/NO (NONOato dietilenetriamina) que lentamente liberou NO (7,2 nM/min). As BAECs tratadas com H2O2 e DETA/NO foram extensivamente lavadas antes da adição da DCFH-DA. A figura 1C mostra que o tratamento com DETA/NO inibe a liberação do citocromo c da mitocôndria para dentro do citosol nas BAECs tratadas com glucose/glocose oxidase por oito horas. Após o tratamento das BAECs com H2O2 por oito horas, a atividade proteolítica da caspase 3 aumentou perto de cinco vezes em comparação com o controle. A DETA/NO diminui grandiosamente a ativação da caspase 3 de células tratadas com H2O2 , o que está consistente com a interpretação de que a liberação do citocromo c no citosol é um pré-requisito para a ativação da caspase 3. A apoptose foi adicionalmente confirmada pelo uso da técnica de etiquetamento do final dUTP (desóxi uridina trifosfato?) mediado pela desoxinucleotidiltransferase terminal (TUNEL). Os resultados mostraram que a incubação com DETA/NO (50 a 100 µM) diminuiu substancialmente a fração das BAECs positivas do TUNEL após o tratamento com glucose/glucose oxidase por oito horas.
A adição de DETA/NO (dietilenotriamina/NONOato) não afetou o H2O2 liberado pela glucose/glucose oxidade. Evidência adicional para o efeito inibidor do NO em danos oxidativos dependentes de H2O2 foi obtida pelo uso de doador de NO intracelular. Porque o NO extracelular é predominantemente oxidizado a NO2-/NO3-, concentrações relativamente mais altas (50 a 100 μM) de DETA/NO foram requeridas. Em contraste, o pró doador de NO específico de célula permeável a esterase AcOM-PYRRO/NO libera NO intracelularmente. [Obs.: esterase é um termo genérico para enzima. Stedman.] Assim, baixas concentrações (1 µM) de AcOM-PYRRO/NO inibiram o estresse oxidative induzido pelo H2O2. Esses resultados mostram que o NO mitiga (alivia) a formação de oxidantes intracelulares dependentes de H2O2 e a apoptose nas células endoteliais.
Efeito do NO em Alterações Induzidas por H2O2 em GSH (glutationa), Aconitase e Atividades de IRP-1
[OBS.: Aconitase citoplasmática – omim 100880 – 9p22-p13 – A ACO1, ou IRP1 (Proteína 1 Regulatória de Ferro), é uma proteína bifuncional com funções mutuamente exclusivas enquanto uma proteína de ligação a elemento responsivo a ferro (IRE) envolvida no controle do metabolismo do ferro ou como a isoforma citoplasmática da aconitase. As aconitases são proteínas e ferro e enxofre que requerem o conjunto de 4Fe-4S (quatro ferros e quatro enxofres) para sua atividade enzimática, no qual elas catalisam a conversão de citrato a isocitrato.
A aconitase-1 funciona como uma proteína de ligação a IRE (IREBP). Os IREs são sequências regulatórias da tradução na extremidade 5 da UTR (região não traduzida) do mRNA da ferritina (veja omim 143790) e na extremidade 3 da UTR do mRNA do receptor de transferrina (omim 190010). A IREBP citoplasmática interage com os IREs desses mRNAs. O estatus do ferro na célula determina a habilidade da IREBP em ligar-se a um IRE através da redução-oxidação reversível dos grupos sulfidril que são críticos para a alta afinidade da interação proteína-RNA. Assim, a IREBP atua num papel central na homeostase celular do ferro regulando a tradução do mRNA de ferritina e a estabilidade do mRNA de TFRC.
Obs.: Aconitase miticondrial (omim 100850 - 22q11.21-q13.31 – Mirel e outros (1998) clonaram e caracterizaram a essencial enzima metabólica dependente de ferro ACO2. Eles mostraram que o mRNA da ACO2 tem 2,7 quilobases de comprimento e é expressado ubiquamente. Eles detectaram múltiplas isoformas da proteína ACO2.
Em ensaios da proteína purificada da mitocôndria no coração bovino, Bota e Davies (2002) encontraram que a protease Lon seletivamente reconhecia e degradava a forma hidrofóbica oxidada da aconitase após modificações oxidativas moderadas. A oxidação severa resultava em uma agregação da aconitase, tornando-a um substrato pobre para a Lon {LON omim 605490 - 12p13.2 – Nos eucariotos, a proteólise dependente de ATP é concluída através da conjugação à ubiquitina (omim 191339) e pela protease 26S (veja PSMD5; omim 604452). As proteases Lon e Clp mediam a proteólise dependente de ATP nos procariotos e parecem quase distintas da protease 26S. Organelas eucariotas, entretanto, podem ter sistemas proteolíticos independentes.}.
Bulteau e outros (2004) descobriram que a atividade de aconitase pode passar por modulação dependente de citrato em resposta a pró-oxidantes. A Frataxina (omim 606829 – 9q13 – a frataxina é uma chaperone mitocondrial de ferro codificada no núcleo celular envolvida na biogênese de enxofre e ferro e na biossíntese de heme. Alguns estudos também sugeriram que a Frataxina funciona como uma molécula de estoque de ferro, um anti-oxidante e um supressor de tumor.) interagiu com aconitase de modo dependente de citrato e converteu a enzima inativa [3Fe-4S]1+ para a forma ativa da proteína [4Fe-4S]2+. Bulteau e outros (2004) concluíram que a frataxina é uma proteína chaperone de ferro que protege o conjunto aconitase [4Fe-4S]2+ da desagregação e promove a reativação da enzima.]Porque o NO inibiu fortemente o estresse oxidante induzido por H2O2, nós avaliamos o papel do NO nos níveis intracelulares de GSH e atividade total da aconitase. [Obs.: GSH é glutationa – um tripeptídeo da glicina, da Lcisteína e do L-glutamato com o L-glutamato que possui uma ligação isopeptídica com o radical amino da L-cisteína; é o tiol não-protéico mais prevalente. O dissulfeto de glutationa consiste em duas glutationas ligadas por uma ponte disulfeto. A deficiência de glutationa pode causar hemólise com estresse oxidativo. Também é utilizada no curso do metabolismo intermediário como uma doadora de grupamentos tiol (SH). A glutationa oxidada age nas células como um receptor de hidrogênio; é reduzida pela glutationa redutase; é o dissulfeto de glutationa e o termo dissulfeto já inclui sulfonas e sulfóxidos que já são oxidados. A glutationa peroxidase é uma enzima que catalisa a reação de duas glutationas com peróxido de hidrogênio (H2O2 ) formando dissulfeto de glutationa e duas moléculas de água; uma enzima fundamental na detoxificação do peróxido de hidrogênio.Stedman] As BAECs foram tratadas com glucose/glucose oxidase por quatro horas com e sem DETA/NO (dietilenotriamiamina/NONOato). A figura 2 A mostra que os níveis de GSH foram diminuídos em mais de 50% após as quatro horas de tratamento com H2O2. Entretanto, a adição de DETA/NO (50 e 100 μM) aumentou os níveis de GSH de 2,3 nmol/mg de proteína para 4 e 5 nmol/mg de proteína em células tratadas com H2O2. A DETA/NO sozinha não afeta os níveis de GSH significativamente. A atividade de aconitase foi medida no citosol e na mitocôndria das células BAECs tratadas com glucose/glucose oxidase na presença e na ausência de DETA/NO. O NO inibiu marcadamente a inativação, induzida por H2O2 , da atividade da aconitase mitocondrial mas não da atividade da aconitase citosólica
Resultados prévios indicam que a oxidação das DCFH (diclorodihidrofluoresceínas) dependente de H2O2 é devida a um aumento dos níveis de expressão dos TfR e da captura de ferro dependente dos TfR. A figura 2D mostra que a expressão dos TfR aumenta significativamente nas BAECs tratadas com glucose/glucose oxidase, enquanto na presença de DETA/NO (NONOato dietilenotriamina), a expressão dos TfRs é inibida. Sendo a síntese de TfR regulada pela ligação da IRP (Proteína Regulatória do Ferro) ao IRE (Elemento Responsivo à Ferro) e a atividade da IRP-1 estimulada pelo H2O2, nós avaliamos os efeitos da DETA/NO (dietilenotriamina/NONOato) na atividade da IRP-1 nas células BAEC tratadas com glucose/glucose oxidase. Para determinar se o aumento na atividade da IRP-1 com tratamento com H2O2 e DETA/NO era devido a um aumento na IRP-1 total, os lisados foram tratados com 1% de 2-mercaptoetanol [mercapto é um prefixo que indica a presença de um grupamento tiol (SH). Stedman] , o qual ativa a IRP-1 em sua forma de ligação a RNA com alta afinidade. Sob essas condições, as principais diferenças na ligação da IRP-1 ao IRE não foram observadas entre os controles e outros grupos de tratamento. A falta de inibição do NO sobre a ligação IRP-1/IRE nas células tratadas com H2O2 confunde, porque o NO diminuiu marcadamente a expressão do TfR nas células BAECs tratadas com H2O2. Uma explicação aceitável é que a diminuição na expressão do TfR (nas células) em DETA/NO- H2O2 é devida ao aumento da degradação dos TfR pelo sistema do proteossomo. Por isso, as células foram pré-incubadas com Lac, um inibidor de protease específico do proteossomo que modifica covalentemente duas sub-unidades beta do proteossomo. Na presença de Lac, a expressão do TfR nas células tratadas com H2O2 e DETA/NO aumentou. O aumento na expressão do TfR pelo inibidor de protease, Lac, sugere que o TfR provavelmente sofre degradação proteolítica na presença de NO e de H2O2. Esses resultados sugerem que o NO possivelmente modula a sinalização do ferro mediada por H2O2 e o estresse oxidativo pela estimulação da atividade do proteossomo.
O Efeito dos Inibidores de Proteossomo no Decréscimo do Estresse Oxidativo Celular Mediado pelo NO.
A próxima etapa foi identificar se os inibidores de proteossomo poderiam aumentar a captura de ferro e a oxidação de DCFH (diclorodihidrofluoresceína) nas células tratadas com H2O2. As células endoteliais foram pré-tratadas com vários inibidores de proteossomo (10 µM de Lac, 10 μM de MG-132, e 2 µM de epoxomicina). Os inibidores de proteossomo sozinhos, nas concentrações usadas não induzem nenhum estresse oxidativo ou apoptose nas BAECs. A oxidação da diclorohidrofluoresceína aumentou nas células pré-tratadas com inibidores de proteossomo por duas horas e expostas à glucose/glucose oxidase e DETA/NO. Entretanto, a fluorescência da diclorofluoresceína foi eliminada completamente nas células tratadas com o anticorpo anti-TfR (de classe IgA) que se liga especificamente ao domínio extracelular do TfR e inibe a endocitose do receptor.
Para provar o envolvimento do ferro, a captura do ferro etiquetado (55Fe) na presença da Lac foi medida. A captura do 55Fe foi perto de 2,3 vezes maior nas células tratadas com H2O2 do que nas células de controle. Não havia aumento na captura do 55Fe com DETA/NO. Esse achado é consistente com o decréscimo nos níveis de TfR observado nas células endoteliais da aorta bovina (BAECs) tratadas com H2O2 do que nas células de controle. O tratamento com Lac contrabalançou o efeito da DETA/NO, como evidenciado pelo aumento na captura de 55Fe nas células tratadas com Lac. A inibição do proteossomo com Lac também reverteu o efeito anti-apoptótico do NO. A figura 3C mostra que a Lac causou um aumento na atividade da caspase 3 nas células tratadas com H2O2 e com NO. Esses resultados sugerem que o efeito cito-protetor e anti-oxidativo da DETA/NO provavelmente é devido à estimulação do proteossomo.
Então nós presumimos que o NO protege contra o estresse oxidativo nas células tratadas com H2O2 através da ativação da proteólise intra-celular, a acumulação celular de proteína oxidada poderia ser inibida. Os níveis de proteínas com carbonila [grupamento CO das cetonas, aldeídos e ácidos orgânicos. Stedman] eram significamente maiores nas células tratadas com glucose/glucose oxidase do que nas células não tratadas. Entretanto, os níveis de proteínas carbonila eram diminuídos drasticamente na presença de DETA/NO. Na presença de Lac, as proteínas carbonilas foram aumentadas. Coletivamente, esses resultados indicam um papel anti-oxidante descaracterizado previamente para o NO como um estimulador da função do proteossomo.
Recentemente, um aumento na nitração das proteínas foi detectado em presença de NO, H2O2 e Ferro. O decréscimo nos níveis de TfR casou com o aumento da atividade do proteossomo nas células tratadas com DETA/NO e H2O2 e nos prontificou a examinar se o TfR é modificado pela nitração. A nitração do TfR foi avaliada por imunoprecipitação do TfR e pela prova deste com um anti-corpo monoclonal anti-nitro-tirosina. A nitração do TfR aumentou nas BAECs tratadas com H2O2 e Deta/NO por quarto horas. Os níveis de TfR nitrados, entretanto, decresceram durante um tempo prolongado de incubação (mais de seis horas). Isso provavelmente é devido à estimulação da atividade do proteossomo pelo NO.
Efeito do NO nas Atividades das Sub-Unidades 20S e 26S do Proteossomo: Degradação de TfR Nitrado por Ubiquitinação.
A degradação de proteínas, modificadas por oxidação ou nitradas, pelo proteossomo poderia ocorrer por um mecanismo dependente de ubiquitina ou independente. Por isso as atividades de peptidase das sub-unidades 26S e 20S do proteossomo em células tratadas com DETA/NO somente e na presença de H2O2 foram medidas. O tratamento das BAECs por seis horas com glucose/ glucose oxidase anulou quase totalmente ambas as atividades típicas de quimiotripsina e de tripsina da sub-unidade 26S do proteossomo. A DETA/NO sozinha aumentou significativamente a atividade típica de quimiotripsina nas células. As atividades da enzima permaneceram elevadas nas células durante o tratamento combinado de H2O2 e DETA/NO, sugerindo que o NO aumenta as atividades proteolíticas nas células endoteliais tratadas com H2O2. As atividades das sub-unidades 26S e 20S do proteossomo foram medidas na presença ou ausência da Lac e MG-132. Ambas a Lac e a MG-132 inibiram as atividades do proteossomo estimuladas pelo NO. Esses resultados indicam que o NO ativa a atividade do proteossomo nas células endoteliais tratadas com H2O2.
A ubiquitinação total das proteínas celulares e sua degradação na presença do H2O2 e da DETA/NO foi então investigada. As BAECs foram tratadas com glucose/glucose oxidase e sem DETA/NO por seis horas. A figura 4D mostra que o tratamento com glucose/glucose oxidase não altera as proteínas ubiquinadas em comparação com as células de controle, sugerindo que a ubiquitinação por si só não é afetada pelo H2O2 quando as células são tratadas por seis horas sob essas condições experimentais. A ubiquitinação das proteínas estava drasticamente mais baixa nas células tratadas com glucose/glucose oxidase e DETA/NO, o que é consistente com um aumento na atividade da sub-unidade 26S do proteossomo, levando a uma taxa aumentada da degradação de proteínas ubiquinadas.
Depois nós investigamos se a degradação do TfR depende da ubiquitinação dessa proteína. As células foram tratadas com glucose/glucose oxidase por seis horas e sem DETA/NO, e os extratos de células foram imunoprecipitados com um anticorpo monoclonal anti-TfR, dissipadas em um SDS/5% PAGE, e provadas com um anticorpo policlonal anti-ubiquitina. A Figura 4F mostra que o TfR submete-se à degradação dependente de ubiquitina, e que o TfR ubiquitinado (Ub-TfR) aumenta em células tratadas com H2O2 e diminui em células tratadas com H2O2 e DETA/NO. Isso está em consistência com as atividades aumentadas do proteossomo na presença de H2O2 e DETA/NO. Finalmente, nós investigamos os efeitos da Nω-nitro-L-arginina metil Ester (L-NAME) e sua análoga estrutural inativa (Nω-nitro-D-arginina metil Ester) na atividade da sub-unidade 26S do proteossomo. A L-NAME, um inibidor não específico da atividade da NO sintase (NOS), diminuiu a atividade típica de tripsina de modo dependente da dose. Isso sugere que o NO endógeno gerado pela NOS endotelial é essencial para a manutenção da atividade inerente ao proteossomo.
DISCUSSÃO
Esse estudo encontrou que o NO liberado lentamente por doadores de NO inibe a sinalização do ferro mediada pelo recpetor de transferrina (TfR), a oxidação intracelular da dioclorodihidrofluoresceína, e a apoptose nas células endoteliais tratadas com H2O2. O NO aumentou a nitração do TfR e a atividade proteossômica. A inibição da NO sintase diminuiu a atividade do proteossomo. Nós sugerimos que, pela estimulação da proteólise, o NO inibe a captura do ferro mediada pelo TfR, o estresse oxidativo, e a sinalização apoptótica em células endoteliais tratadas com H2O2.
O Envolvimento do TfR na Sinalização do Ferro Induzida por Peróxido de Hidrogênio, Estresse Oxidativo e Apoptose.
Relatos indicam que o dano celular causado por espécies de oxigênio reativo e nitrogênio é criticamente controlado pela homeostase intracelular do ferro. A exposição dos fibroblastos murinos ao H2O2 aumenta a expressão do mRNA de TfR e a fluorescência da diclorofluoresceína, implicando num elo em potencial entre o estresse oxidativo e a captura de ferro mediada pelo TfR. Recentemente nós mostramos que a adição exógena de um bolo [uma quantidade única, relativamente grande, de uma substância, geralmente aquela destinada a uso terapêutico, como uma dose maciça de um medicamento injetado por via intravenosa. Stedman] ou de H2O2 gerado continuamente para as células endoteliais causa uma oxidação aumentada da diclorodihidrofluoresceína a diclorofluoresceína que é regulada pela captura do ferro da transferrina mediada pelo TfR. O bloqueio da captura do ferro pelo anticorpo anti-TfR (de classe IgA) que se liga especificamente ao domínio extracelular do TfR abple a fluorescência da diclorofluoresceína induzida pelo H2O2. Esse achado intrigante sugere que a oxidação intracelular da diclorodihidrofluoresceína é catalisada por ambos o H2O2 e o ferro transportado pelo TfR. Aqui nós mostramos que o NO gerado pela DETA/NO regula para menos a expressão do TfR em células tratadas com H2O2 e inibe a captura de ferro mediada pelo TfR. Consequentemente, a oxidação da diclorodihidrofluoresceína intracelular diminui. Em células tratadas com Lac, os níveis de TfR fora regulados para mais, o que levou a uma aumentada captura de ferro e oxidação da diclorodihidrofluoresceína.
Nossos resultados demonstram que a ativação da caspase induzida pelo H2O2 é acompanhada por um aumento na captura de ferro mediada pelo TfR. A liberação do NO a partir da DETA/NO inibe a apoptose induzida pelo H2O2 e a captura de ferro mediada pelo TfR. Assim, o TfR atua como um efetivo “portão de entrada” e modulador da apopose endotelial induzida pelo H2O2. O NO alivia o estresse oxidativo induzido pelo H2O2 e a apoptose endotelial pela inibição da sinalização do ferro.
Degradação das Proteínas pelo Efeito do NO Modulador da Rota da Ubiquitina-Proteossomo.
A via da Ubiquitina-Proteossomo atua num papel principal na quebra das proteínas modificadas oxidativamente que por outro lado romperiam a função normal da célula. A proteína mirada para degradação é fixada covalentemente a várias moléculas de ubiquitina, uma proteína de 76 aminoácidos. A nitração mira tipicamente as proteínas modificadas para ubiquitinação e rápida degradação pelas sub-unidades 26S dos proteossomos. A proteína ubiquinada é subsequentemente escoltada à sub-unidade 26S do proteossomo onde se submete à degradação por meio de uma via envolvendo uma série de enzimas chamadas E1, E2 e E3. O cerne proteolítico do complexo 26S, a sub-unidade 20S do proteossomo, contém múltiplas atividades de peptidase incluindo a atividade de tipo quimiotripsina (uma endopeptidade de serina que hidrolisa as ligações peptídicas presentes no grupo carboxila de aminoácidos hidrofóbicos como a fenilalanina). A atividade de tipo quimiotripsina foi considerada crucial para a remoção de proteínas nitradas no plasma. As proteínas nitradas (ex. gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foram mostradas enquanto indutoras da via ubiquitina-proteossomo.
Os doadores de NO induziram a nitração de proteínas por meio de um mecanismo envolvendo ferro ativo em redox e H2O2. Similarmente, a proteína TfR foi nitrada na presença de ferro, H2O2 e NO. O TfR nitrado foi subsequentemente mirado para a degradação proteossômica. Trabalhos prévios mostraram que a atividade de enzimas conjugando-se a ubiquitina (E1 e E2) é reversivelmente inibida durante o estresse oxidativo, Os dados presentes mostram que ambos os sistemas 20S e 26S do proteossomo são inativados pela glucose/glucose oxidase, a qual efetivamente comprometeu a remoção de proteínas oxidizadas. Como um resultado, as proteínas com carbonilas eram em maior número nas células tratadas com H2O2. Entretanto, as proteínas com carbonilas estavam consideravelmente diminuídas na presença de DETA/NO. Embora uma reportagem recente sugira que a conjugação à ubiquitina não seja requerida para a degradação de proteínas oxidizadas pelo proteossomo, os dados aqui indicam que ambos as sub-unidades 20S e 26S dos proteossomos estão envolvidas na degradação de proteínas nitradas e oxidadas, pois ambas as atividades 20S e 26S do proteossomo fora reguladas para menos com o H2O2 e reguladas para mais no tratamento com H2O2 e DETA/NO.
Nitração de Proteínas Receptoras e Sinalização Redox.
A nitração de proteínas com radical tirosil (A tirosina (Tyr) é, sem dúvida, o sítio de formação de radicais livres nas proteínas mais frequentemente mencionado. Alguns radicais tirosil estão associados com atividade enzimática. Em: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=MImg&_imagekey=B9...8f0b435&ie=/sdarticle.pdf - 584 KB) tem sido relatadas modificando a função do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) causando alterações na sinalização celular. A nitração de sub-unidades do receptor de NMDA induzida por hipóxia aumentou o influxo de Ca2+ no cérebro de leitão recém nascido. A sintase de óxido nítrico neuronal que é co-localizada com os receptores de NMDA é ativada pelo influxo de Ca2+, levando ao aumento da produção de NO. A inibição da sintase de óxido nítrico impede ambas a nitração do receptor de NMDA e o influxo de Ca2+ mediado pelo receptor. Por isso a nitração é um mecanismo viável pelo qual o receptor sensível a redox pode adquirir um ganho ou perda de função. Nesse estudo nós postulamos que a nitração do TfR pode alterar a captura de ferro dependente de TfR. A estrutura cristalina do domínio externo homodimérico do TfR tem um domínio helicoidal (resíduos 607 a 760) que se liga à transferrina. Existem seis tirosinas (resíduos 611, 614, 628, 643, 683 e 689) no domínio de ligação à transferrina. A nitração das tirosinas presentes no domínio helicoidal provavelmente inibirá a ligação da transferrina devido ao bloqueio estérico [bloqueio da reação porque os sítios ativos não conseguem aproximação suficiente devido] e mudanças conformacionais. Essa proposta experimental explica como a nitração do TfR pode inibir a captura do ferro induzida pelo H2O2.
Conclusão
Esse estudo descreveu o papel do NO, gerado lentamente em taxas definidas a partir de NONOatos, na sinalização do ferro induzida por oxidante. Os NONOatos inibem a oxidação da diclorodihidrofluoresceína, a sinalização do ferro no TfR, e a apoptose de células endoteliais sob estresse oxidativo. Admitidamente, a resposta aos doadores de NO nas células é variada e frequentemente paradoxal. Duas fontes diferentes de doadores de NO elicitam efeitos opostos na mesma função celular. Se o NO aumenta ou suprime a atividade do proteossomo parece depender do status proliferativo de uma célula. A sinalização mediada pelo NO e a ativação dos proteossomo pode atuar num papel regulatório crítico na apoptose e sobrevivência da célula pela modulação da sinalização do ferro dependente de TfR nas células endoteliais submetidas à modificação oxidativa e nitrativa. A maioria das patologias vasculares (diabetes, hiperglicemia e aterosclerose) são caracterizadas por um decréscimo na produção endotelial de NO. Sob essas condições, os radicais de oxigênio e a degradação da proteína estão usualmente aumentados. Assim, o papel do NO (isto é, mantendo a função do proteossomo) é altamente significativa numa perspectiva patofisiológica.
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC196859/?tool=pubmed
terça-feira, 9 de fevereiro de 2010
Receptores Ativados de Proliferador de Peroxissomo
Em biologia celular, os receptores ativados de proliferador de peroxissomo (PPARs) são um grupo de receptores nucleares isoformes que existe ao longo da biologia. Eles são intimamente conectados com o metabolismo celular (carbohidratos, lipídios e proteínas) e diferenciação celular. Eles são fatores de transcrição.
NOMENCLATURA
Três tipos de PPARs foram identificados: alfa, gama e delta (beta).
- α (alfa): é expressado no fígado, rins, coração, músculo, tecido adiposo e outros;
- ƴ (gama): embora transcrito pelo mesmo gene, esse PPAR existe em três formas:
1) ƴ1: expressado em virtualmente todos os tecidos, incluindo coração, músculo, cólon, rins, pâncreas e baço;
2) ƴ2: expressado principalmente no tecido adiposo (30 aminoácidos mais longo);
3) ƴ3: expressado nos macrófagos, intestino grosso, tecido adiposo branco;
- δ (delta): expressado em muitos tecidos mas marcadamente no cérebro, tecido adiposo e na pele.
HISTÓRIA
Os PPARs foram originariamente identificados em rãs Xenopus (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e3/Xenopus_laevis.jpg) como receptores que induzem a proliferação dos peroxissomos nas células. O primeiro PPAR (PPARα) foi descoberto durante a pesquisa de um alvo molecular para um grupo de agentes então denominados como “proliferadores de peroxissomo”, já que eles aumentavam os peroxissomos no tecido do fígado de roedores, aparte ao aumento da sensibilidade à insulina. Esses agentes, farmacologicamente relacionados aos fibratos (ácidos fíbricos) foram descobertos no início dos anos 1980. Quando descobriu-se que os PPARs atuavam num papel muito mais versátil na biologia, os agentes foram, por sua vez, chamados “ligantes de PPAR”. Os ligantes de PPAR mais conhecidos são os tiazolidinedionas.
O QUÊ ACONTECEU AO PPARβ
Após ter sido identificado o PPARδ (delta) em humanos em 1992, ele revelou-se estar intimamente relacionado ao PPARβ (beta) previamente descrito durante o mesmo ano em outros animais (Xenopus). O nome PPARδ é usado geralmente nos US enquanto o uso da denominação PPARβ (beta) permanesceu na Europa onde esse receptor foi descoberto inicialmente no Xenopus.
FUNÇÃO FISIOLÓGICA
Todos os PPARs dimerizam-se com o receptor X de retinóide (RXR) e se ligam a regiões específicas no DNA de genes alvo. Essas sequências são chamadas PPREs (elementos de resposta a proliferador de peroxissomo). A sequência consenso de DNA é AGGTCAXAGGTCA onde X pode ser qualquer nucleotídeo. Geralmente, essa sequência ocorre na região do promotor do gene. E quando o PPAR se liga a seu ligante, a transcrição dos genes alvo é aumentada ou diminuída, dependendo do gene. O RXR também forma um heterodímero com um número de outros receptores: o receptor de vitamina D e o receptor de hormônio da tireóide.
A ATIVAÇÃO DO PPAR GAMA NA CÉLULA DE GORDURA
A função dos PPARs é modificada pela forma exata de seus domínios de ligação ao ligante (veja a seguir) e por um número de co-ativadores e co-repressores,cuja presença pode estimular ou inibir a função do receptor.
Os ligantes para os PPARs são os ácidos graxos livres e os eicosanóides [substâncias fisiologicamente ativas derivadas do ácido araquidônico, isto é, as prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos, sintetizadas por uma via em cascata. Stedman]. O PPAR gama é ativado pela PGJ2 (uma prostaglandina). Em contraste, o PPAR alfa é ativado pelo leucotrieno B4.
A ATIVAÇÃO DO PPAR DELTA NA CÉLULA DO MÚSCULO
As três principais formas são transcritas a partir de genes diferentes:
- PPARα - cromossomo 22q12-13.1 (OMIM 170998);
- PPARγ - cromossomo 3p25 (OMIM 601487);
- PPARδ - cromossomo 6p21.2-21.1 (OMIM 600409).
Desordens hereditárias de todos os PPARs foram descritas, geralmente levando à perda de função e concomitante lipodistrofia, resistência à insulina e/ou acantose nigricans [erupção de lesões aveludadas e verrucosas associada a hiperpigmentação que ocorre na pele das axilas, do pescoço, da área anogenital e da virilha que nos adultos pode estar associada a processos malignos internos, distúrbios endócrinos ou obesidade; um tipo benigno hereditário ocorre em crianças. Stedman]. A respeito do PPAR gama, uma mutação de ganho de função foi descrita e estudada (de prolina 12 para alanina) a qual diminuiu o risco de resistência à insulina; esta mutação é quase prevalente (a freqüência do alelo é de 0,03 a 0,12 em algumas populações). Em contraste, a mutação prolina 115 para ácido glutâmico está associada com a obesidade. Alguns outros polimorfismos tem alta incidência em populações com elevados índices de massa corporal.
ESTRUTURA
Todos os PPARs têm uma estrutura básica nos domínios funcionais. Os mais importantes são o DBD (domínio de ligação a DNA) e LBD (domínio de ligação ao ligante); Os DBD contém dois padrões de dedos de zinco, que se ligam à região reguladora do DNA quando o receptor está ativado. O LBD tem uma estrutura extensiva secundária de várias hélices alfa (treze) e lâminas beta. Os ligantes naturais e sintéticos se ligam ao LBD, ativando o receptor.
FARMACOLOGIA E MODULADORES DE PPAR
Os PPAR alfa e gama são os alvos de um número de medicações conhecidas e estão sob continuada investigação para outras formas de modulação farmacêutica. O Muraglitazar e o Tesaglitazar, ambos compostos experimentais, ligam-se a ambos os PPARs alfa e gama.
MODULADORES DE PPAR ALFA
O PPAR alfa é o principal alvo de drogas de fibrato, uma classe de ácidos carboxílicos amfipáticos [que contém propriedades opostas] (clofibrato, gemfibrozil, ciprofibrato, bezafibrato e fenofibrato). Eles são usados em desordens do colesterol (geralmente como um adjuntivo às estatinas) e desordens que caracterizam altos triglicerídios;
MODULADORES DE PPAR GAMA
O PPAR gama é o alvo principal da classe de drogas dos tiazolidinedionas (TZDs), usados no diabetes mellitus e outras doenças que caracterizam a resistência à insulina. Também é medianamente ativado por certos NSAIDs (tais como ibuprofeno [analgésico e anti-inflamatório não esteróide derivado do ácido propiônico. Stedman]) e indoles [ou indol, é a base de muitas substâncias biologicamente ativas como serotonina e triptofano; é formado na degradação do triptofano. Stedman]. Inibidores conhecidos incluem o gente experimental GW-9662.
http://www.biosolutions.info/2007/08/peroxisome-proliferator-activated.html
Em biologia celular, os receptores ativados de proliferador de peroxissomo (PPARs) são um grupo de receptores nucleares isoformes que existe ao longo da biologia. Eles são intimamente conectados com o metabolismo celular (carbohidratos, lipídios e proteínas) e diferenciação celular. Eles são fatores de transcrição.
NOMENCLATURA
Três tipos de PPARs foram identificados: alfa, gama e delta (beta).
- α (alfa): é expressado no fígado, rins, coração, músculo, tecido adiposo e outros;
- ƴ (gama): embora transcrito pelo mesmo gene, esse PPAR existe em três formas:
1) ƴ1: expressado em virtualmente todos os tecidos, incluindo coração, músculo, cólon, rins, pâncreas e baço;
2) ƴ2: expressado principalmente no tecido adiposo (30 aminoácidos mais longo);
3) ƴ3: expressado nos macrófagos, intestino grosso, tecido adiposo branco;
- δ (delta): expressado em muitos tecidos mas marcadamente no cérebro, tecido adiposo e na pele.
HISTÓRIA
Os PPARs foram originariamente identificados em rãs Xenopus (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e3/Xenopus_laevis.jpg) como receptores que induzem a proliferação dos peroxissomos nas células. O primeiro PPAR (PPARα) foi descoberto durante a pesquisa de um alvo molecular para um grupo de agentes então denominados como “proliferadores de peroxissomo”, já que eles aumentavam os peroxissomos no tecido do fígado de roedores, aparte ao aumento da sensibilidade à insulina. Esses agentes, farmacologicamente relacionados aos fibratos (ácidos fíbricos) foram descobertos no início dos anos 1980. Quando descobriu-se que os PPARs atuavam num papel muito mais versátil na biologia, os agentes foram, por sua vez, chamados “ligantes de PPAR”. Os ligantes de PPAR mais conhecidos são os tiazolidinedionas.
O QUÊ ACONTECEU AO PPARβ
Após ter sido identificado o PPARδ (delta) em humanos em 1992, ele revelou-se estar intimamente relacionado ao PPARβ (beta) previamente descrito durante o mesmo ano em outros animais (Xenopus). O nome PPARδ é usado geralmente nos US enquanto o uso da denominação PPARβ (beta) permanesceu na Europa onde esse receptor foi descoberto inicialmente no Xenopus.
FUNÇÃO FISIOLÓGICA
Todos os PPARs dimerizam-se com o receptor X de retinóide (RXR) e se ligam a regiões específicas no DNA de genes alvo. Essas sequências são chamadas PPREs (elementos de resposta a proliferador de peroxissomo). A sequência consenso de DNA é AGGTCAXAGGTCA onde X pode ser qualquer nucleotídeo. Geralmente, essa sequência ocorre na região do promotor do gene. E quando o PPAR se liga a seu ligante, a transcrição dos genes alvo é aumentada ou diminuída, dependendo do gene. O RXR também forma um heterodímero com um número de outros receptores: o receptor de vitamina D e o receptor de hormônio da tireóide.
A ATIVAÇÃO DO PPAR GAMA NA CÉLULA DE GORDURA
A função dos PPARs é modificada pela forma exata de seus domínios de ligação ao ligante (veja a seguir) e por um número de co-ativadores e co-repressores,cuja presença pode estimular ou inibir a função do receptor.
Os ligantes para os PPARs são os ácidos graxos livres e os eicosanóides [substâncias fisiologicamente ativas derivadas do ácido araquidônico, isto é, as prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos, sintetizadas por uma via em cascata. Stedman]. O PPAR gama é ativado pela PGJ2 (uma prostaglandina). Em contraste, o PPAR alfa é ativado pelo leucotrieno B4.
A ATIVAÇÃO DO PPAR DELTA NA CÉLULA DO MÚSCULO
As três principais formas são transcritas a partir de genes diferentes:
- PPARα - cromossomo 22q12-13.1 (OMIM 170998);
- PPARγ - cromossomo 3p25 (OMIM 601487);
- PPARδ - cromossomo 6p21.2-21.1 (OMIM 600409).
Desordens hereditárias de todos os PPARs foram descritas, geralmente levando à perda de função e concomitante lipodistrofia, resistência à insulina e/ou acantose nigricans [erupção de lesões aveludadas e verrucosas associada a hiperpigmentação que ocorre na pele das axilas, do pescoço, da área anogenital e da virilha que nos adultos pode estar associada a processos malignos internos, distúrbios endócrinos ou obesidade; um tipo benigno hereditário ocorre em crianças. Stedman]. A respeito do PPAR gama, uma mutação de ganho de função foi descrita e estudada (de prolina 12 para alanina) a qual diminuiu o risco de resistência à insulina; esta mutação é quase prevalente (a freqüência do alelo é de 0,03 a 0,12 em algumas populações). Em contraste, a mutação prolina 115 para ácido glutâmico está associada com a obesidade. Alguns outros polimorfismos tem alta incidência em populações com elevados índices de massa corporal.
ESTRUTURA
Todos os PPARs têm uma estrutura básica nos domínios funcionais. Os mais importantes são o DBD (domínio de ligação a DNA) e LBD (domínio de ligação ao ligante); Os DBD contém dois padrões de dedos de zinco, que se ligam à região reguladora do DNA quando o receptor está ativado. O LBD tem uma estrutura extensiva secundária de várias hélices alfa (treze) e lâminas beta. Os ligantes naturais e sintéticos se ligam ao LBD, ativando o receptor.
FARMACOLOGIA E MODULADORES DE PPAR
Os PPAR alfa e gama são os alvos de um número de medicações conhecidas e estão sob continuada investigação para outras formas de modulação farmacêutica. O Muraglitazar e o Tesaglitazar, ambos compostos experimentais, ligam-se a ambos os PPARs alfa e gama.
MODULADORES DE PPAR ALFA
O PPAR alfa é o principal alvo de drogas de fibrato, uma classe de ácidos carboxílicos amfipáticos [que contém propriedades opostas] (clofibrato, gemfibrozil, ciprofibrato, bezafibrato e fenofibrato). Eles são usados em desordens do colesterol (geralmente como um adjuntivo às estatinas) e desordens que caracterizam altos triglicerídios;
MODULADORES DE PPAR GAMA
O PPAR gama é o alvo principal da classe de drogas dos tiazolidinedionas (TZDs), usados no diabetes mellitus e outras doenças que caracterizam a resistência à insulina. Também é medianamente ativado por certos NSAIDs (tais como ibuprofeno [analgésico e anti-inflamatório não esteróide derivado do ácido propiônico. Stedman]) e indoles [ou indol, é a base de muitas substâncias biologicamente ativas como serotonina e triptofano; é formado na degradação do triptofano. Stedman]. Inibidores conhecidos incluem o gente experimental GW-9662.
http://www.biosolutions.info/2007/08/peroxisome-proliferator-activated.html
domingo, 7 de fevereiro de 2010
Heparina Aumenta a Acessibilidade pela Ligação aos Resíduos Básicos Sensíveis à Tripsina nas Histonas.
B Villeponteau
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1131979/?tool=pubmed
RESUMO
Evidência recente indica que a acessibilidade da cromatina aos fatores de transcrição é de significância regulatória. Sabe-se que o poli-ânion heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à DNAase I e estimula a síntese de RNA e DNA. No presente estudo, a estrutura da cromatina e sua modificação por poli-ânions foram examinados pelo uso da tripsina e nuclease de micrococccus como provas. Ambos a heparina e o poli-ácido glutâmico foram encontrados como equivalentes à tripsina na digestão de histonas em sua habilidade de aumentar a acessibilidade de nucleases à cromatina. Entretanto, nenhum aumento da acessibilidade de nucleases foi observado quando a cromatina digerida por tripsina foi tratada suplementarmente com heparina, indicando que os poli-ânions e a tripsina não são aditivos em seus efeitos na acessibilidade à cromatina. Além disso, análises de gradiente de sacarose demonstraram que a heparina liga-se disciplinadamente a nucleossomos intactos, mas não a nucleossomos digeridos pela tripsina. Esses dados sugerem que os poli-ânions interagem predominantemente com resíduos de lisina e arginina sensíveis à tripsina na histona 1 e nos segmentos com teminais amina do cerne das histonas. A possível relevância desses resultados para a estrutura da cromatina das regiões ativamente transcritas é discutida.
INTRODUÇÃO
Para caber dentro do núcleo, DNA eucariótico é condensado pelas histonas, as quais compactam o DNA em nucleossomos e os 30 nanômetros da fibra de cromatina. Estudos prévios mostraram que a estrutura da cromatina ao redor de genes ativos está perturbada onde a cromatina ativamente transcrita é digerida preferencialmente por DNAase I ou nuclease de micrococcus (M Nase), sugerindo que o empacotamento da cromatina precisa ser alterado de acordo para que ocorra a transcrição. Sustentando essa noção, dados recentes indicam fortemente que o DNA empacotado dentro da cromatina frequentemente não está acessível aos fatores de transcrição e que as histonas podem impedir ambas a iniciação da polimerase e seu alongamento. Assim, uma questão básica não respondida é como a cromatina é modificada de modo que a transcrição ocorra.
Os poliânions ácidos heparina e poli-ácido glutâmico foram relatados enquanto alteradores da cromatina por termo-desnaturação e estimuladores da sensibilidade à DNAase I, transcrição e replicação do DNA ‘in vitro’. Essas mudanças no molde da cromatina não foram acompanhadas pelas maiores rupturas na estrutura da cromatina. No presente estudo eu tentei elucidar o mecanismo específico pelo qual esses poli-ânions atuam focalizando o papel dos domínios da histona sensitivos à tripsina.
Para examinar mudanças na estrutura da cromatina ou tratamento com heparina, a MNase foi usada como prova para acessibilidade da nuclease, enquanto a tripsina foi usada para determinar os domínios da histona sensitivos à tripsina. A MNase foi escolhida com uma prova da estrutura da cromatina pois um característico limite de 50% de digestão na solubilização do DNA é atingido em digestão prolongada do núcleo ou da cromatina. Essa digestão limitada reflete aparentemente a natureza das interações histona-DNA dentro do nucleossomo. Se a cromatina é digerida primeiro com tripsina para remover preferencialmente a histona H1 e os caules terminais em N das histonas H2A, H3B, H3 e H4, existe um aumento significativo na suscetibilidade ao ataque da MNase. Como meus experimentos iniciais indicaram que o tratamento da cromatina com poli-ânion leva a um aumento similar na suscetibilidade à digestão por MNase, eu comparei diretamente os efeitos dos tratamentos da cromatina com poli-ânions com os efeitos da digestão por tripsina. Os dados indicam que os poli-ânions interagem preferencialmente com regiões da histona sensitivas à tripsina, sugerindo que a estimulação da síntese de RNA e DNA endógenos induzida por poli-ânions é melhor explicada pelo mascaramento eletrostático dos resíduos de lisina e arginina sensitivos à tripsina nas histonas.
RESULTADOS
A Cromatina Tratada com Poli-ânions ou Tripsina Tem Limites de Assimilação Quase Idênticos aos de MNase.
Em torno de metade do DNA dentro da cromatina é normalmente resistente ao ataque da MNase ( Clack & Felsenfeld, 1974). A figura I mostra que o tratamento da cromatina com o poli-ânion heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à MNase. Para determinar a dose da resposta para esse efeito dos poli-ânions na cromatina, várias concentrações de heparina, ou poli-ácido glutâmico foram adicionadas a uma quantidade fixada da cromatina seguida pela digestão com MNase (5μg/ml). A suscetibilidade máxima da cromatina à MNase foi alcançada a uma razão de 0,2 para 0,4 entre o poliânion e o DNA. Acima dessa razão o poli-ácido glutâmico tem pouco efeito a mais, enquanto a heparina exibe uma forte inibição da nuclease (veja a seguir). A adição de uma proteína neutra como a BSA não tem efeito na acessibilidade da cromatina ao ataque da nuclease (resultados não mostrados).
A digestão da cromatina com tripsina gera os bem caracterizados fragmentos restritos da histona P1-P5, os quais contém os domínios terminais em C (carboxila) globulares do cerne das histonas (veja Bohm & Crane-Robinson, 1984; Weintraub & van Lente, 1974; e a figura 2a). A cromatina digerida pela tripsina tem uma suscetibilidade aumentada da cromatina ao ataque da MNase. A Figura 2 mostra que a disponibilidade aumentada da cromatina digerida pela tripsina ao ataque da nuclease paraleliza estritamente aquele encontrado para a cromatina tratada com poli-ânion. Além disso, a distribuição do tamanho dos fragmentos restritos em limites resistentes à MNase de cromatina tratada com heparina e digerida com tripsina também são similares, sustentando ainda mais a ligação entre a digestão pela tripsina e o tratamento com heparina.
Para verificar se a heparina ou o poli-ácido glutâmico tem um efeito direto na atividade de MNase, o DNA nú do timo de vitelo foi digerido com MNase (5 µg/ml) na presença de várias concentrações de poli-ânion. A Figura 2(b) mostra que a heparina inibe a atividade de MNase, enquanto o poli-ácido glutâmico não teve nenhum efeito. O mesmo resultado foi obtido quando a taxa de digestão do DNA nú pela MNase foi monitorada por hipercromicidade [aumento da absorção de luz. Stedman] usando-se um gravador de espectrômetro (resultados não mostrados). Assim, a explicação mais aceitável para a curva bifásica da heparina na figura 2(b) é que a heparina em baixas concentrações liga-se às histonas e aumenta a disponibilidade do DNA para a digestão, mas em altas concentrações o excesso de heparina livre a torna disponível para a inibição direta da MNase. Esses dados sugerem que a heparina e o poli-ácido glutâmico atuam similarmente na alteração da estrutura da cromatina.
A Extração das Histonas da Cromatina Induzida por Poli-ânions não é a Causa Primária do Aumento da Suscetibilidade à MNase.
Para determinar a extensão em que os poliânions extraem as histonas da cromatina, a cromatina de timo de vitelo foi incubada com várias concentrações de heparina ou poli-ácido glutâmico e então depositada na ultra-cientrífuga. Análises das histonas nos depósitos e nas frações sobrenadantes foram concluídas usando-se PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida). A figura 3 mostra que há alguma extração de H2A (histona 2 A) e de H2B sob concentrações moderadas de heparina. Varreduras densiométricas desses geles indicam que houve menos de 15% de perda de H2A e H2B sob o nível 0,3 de heparina. Além disso, ainda em altas concentrações, o poli-ácido glutâmico remove quantidades negligenciáveis de cerne de histona da cromatina do timo de vitelo, embora a H1 seja removida nas mais altas concentrações testadas.
Comparando os dados de digestão pela MNase na cromatina tratada com heparina na figura 2 com a extração de histona induzida por heparina mostrada na figura 3, é aparente que a suscetibilidade próxima ao máximo para a digestão pela MNase seja alcançada no valor da razão de heparina/DNA de 0,2 sob o qual se leva à substancial extração de H2A e H2B. Para o poli-ácido glutâmico, dificilmente qualquer dos cernes de histona parece ser extraído em razões de poli-ácido glutâmico/DNA acima daquelas que deram vez à máxima suscetibilidade da cromatina à digestão por MNase. Assim, a suscetibilidade aumentada para o ataque da MNase à cromatina tratada com poliânion não parece correlacionar-se com a extração da histona.
Os Efeitos da Tripsina e da Heparina Não São Aditivos.
A similaridade dos limites da digestão por MNase com a digestão por tripsina ou tratamento com heparina sugere que a heparina interage com as mesmas regiões das histonas que a tripsina o faz, na cromatina. Para comparar diretamente a cromatina tratada com tripsina e com heparina , a cromatina digerida com tripsina foi tratada adicionalmente com heparina antes da digestão pela MNase. A Tabela 1 demonstra que a sujeição da cromatina a digestão por tripsina e a tratamento com heparina têm o mesmo efeito na acessibilidade da cromatina à MNase como ocorre com o tratamento com tripsina ou heparina isoladamente. Essa completa falta de aditividade entre a tripsina e a heparina sustenta a noção de que a heparina interage com os mesmos domínios de histona que a tripsina, denominados H1 e caule terminal em N do cerne das histonas.
Análises dos Nucleossomos Tratados com Heparina no Gradiente de Sacarose.
Porque a heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à MNase e à DNAse I, a heparina deve funcionar pelo relaxamento da ligação de histona e desdobramento parcial do nucleossomo. Para examinar ainda mais essas possibilidades, monômenos de nuclossomo livres de de histona H1 lavados de sais foram tratados com várias concentrações de heparina contendo rastreadores tritiados [que contém átomos de trítio, o hidrogênio 3.Stedman] e foram centrifugados através de um gradiente de sacarose de 5 a 25% -(w/v). A figura 4 demonstra que os nucleossomos tratados com heparina sedimentam-se mais lentamente e geram um pico mais nítido do que os nucleossomos não tratados. A heparina tritiada é encontrada nos nucleossomos sedimentando-se lentamente, marcando a heparina ligada aos nucleossomos. Além disso, a heparina tritiada que se liga aos nucleossomos parece sofrer pouca ou nenhuma troca com a heparina livre, já que os padrões de sedimentação da heparina tritiada e dos nucleossomos não são mudados quando a heparina não etiquetada está presente em todo o gradiente de sacarose. Algumas etiquetas, parte das quais pode representar a heparina tritiada degradada, permanecem no topo do gradiente junto com quantidades menores de histonas H2A e H2B livres, enquanto nenhuma histona ou heparina é encontrada no fundo do tubo.
Para verificar que o efeito da heparina no aumento da disponibilidade do DNA nucleossômico ao ataque da MNase é fartamente independente da habilidade de extração das histonas H2A e H2B, os nucleossomos tratados com heparina do segundo gradiente mostrados na figura 4 foram caracterizados segundo seus conteúdos de histona e acessibilidade à digestão por MNase do pico das frações da região do monossomo . A figura 5 e varreduras densiométricas demonstram que esses nucleossomos sedimentados contém quantidades normais de quatro histonas do cerne, ligam-se a heparina, e exibem máxima suscetibilidade à digestão por MNase. Tomados juntos, esses dados indicam que a heparina liga-se fortemente aos nucleossomos e os desdobra parcialmente.
A Heparina não se Liga aos Nucleossomos Digeridos pela Tripsina.
A Tabela 1 mostra que a heparina não tem efeitos na acessibilidade da MNase à cromatina digerida quando a cromatina é digerida por tripsina, indicando que a heparina se liga aos domínios das histonas sensíveis à tripsina. Para testar a ligação da heparina em regiões do cerne de histonas sensíveis à tripsina definitivamente, nucleossomos digeridos por tripsina foram tratados com heparina tritiada e então centrifugados em um gradiente de 5 a 25% de sacarose como anteriormente. A figura 6 demonstra claramente que a heparina não se liga a nucleossomos digeridos pela tripsina. Análises PAGE do pico das frações no gradiente revelaram o padrão típico de digestão limitada pela tripsina das histonas. Esses resultados indicam fortemente que a heparina se liga às regiões das histonas sensíveis a tripsina no cerne do nucleossomo.
DISCUSSÃO
A Heparina Desdobra a Cromatina e Aumenta a Acessibilidade à Cromatina.
As figuras 1 e 2 demonstram que, quando a cromatina é tratada com poliânions heparina ou poli-ácido glutâmico, o DNA contido dentro da cromatina torna-se marcadamente mais acessível à digestão por MNase. O limite de digestão por MNase é conhecido por depender das interações da histona com DNA, tanto que a heparina provavelmente rompe as ligações do DNA com a histona. Embora a heparina e o poli-ácido glutâmico hajam de extrair certas espécies de histona da cromatina em concentrações suficientemente altas, a acessibilidade máxima da cromatina à MNase é observada em baixas concentrações de poli-ânions, onde pouca histona é removida pela heparina e nenhuma por poli-ácido glutâmico. Assim as características alteradas da digestão por MNase da cromatina tratada tratada com poli-ânions não é devida à extensiva extração de histona, mas sim a uma perturbação nas interações das ligações da histona com o DNA de nucleossomos por outro lado intactos.
Em adição à aumentada sensibilidade à MNase, o tratamento dos nucleossomos com a heparina leva à sedimentação mais lenta nos gradientes de sacarose, sugerindo que os nucleossomos são desdobrados pela heparina. Esse resultado é consistente com os relatos de que a cromatina tratada com heparina teve a sensibilidade aumentada para DNAase I, estabilidade térmica diminuída, e um espectro c.d. mais parecido com o do DNA livre. Tomados juntos, esses dados indicam que a heparina aumenta a transcrição e a replicação pelo desdobramento da cromatina e aumento da acessibilidade à cromatina.
A Heparina Interage com a Histona H1 Sensível à Tripsina e com os Caules Terminais em Amina dos Cernes das Histonas.
A digestão da cromatina ou nucleossomos pela tripsina gera um padrão similar de fragmentos de digestão, P1-P5, os quais consistem principalmente de domínios terminais em carboxila globulares dos cernes das histonas H2A, H2B, H3, e H4. No núcleo, o cerne globular central da H1 também está protegido da tripsina. Na cromatina, acredita-se que a histona H1 e os caules terminais em amina básicos de 20 a 30 resíduos são preferencialmente degradados, devido a sua acessibilidade à tripsina mais do que à especificidade da enzima, já que a digestão da cromatina pela quimio-tripsina fornece o mesmo padrão de limite de digestão. Além disso, os caules altamente básicos no terminal amina da histona H1 removidos pela tripsina têm sido identificados carecendo de acetilação da estrutura secundária da histona e são conhecidos como sítios de acetilação e fosforilação de histona ‘in vivo’. Em contraste, os domínios globulares dos terminais carboxila dos cernes de histonas falham em ligarem-se a anticorpos anti-histona (Goldblatt & Bustin, 1975) e são responsáveis pelas interações entre as histonas no cerne do octâmero de histona [obs.: octâmero de histona se compõe de [(H3-H4)2(H2A-H2B)2], sendo (H3-H4)2 um tetrâmero e H2A-H2B um dímero PMID: 19914933].
Várias linhas de evidência indicam que a heparina interage principalmente com os domínios da histona sensíveis a tripsina. Primeiro, a cromatina tratada com tripsina foi descrita aumentado a sensitividade a DNAase I, reduzindo a estabilidade térmica e como um transformadorador do espectro c.d. rumo ao DNA livre que relembra estritamente mudanças similares encontradas na cromatina tratada com heparina. Em segundo lugar, a cromatina tratada com heparina ou com tripsina tem níveis equivalentes de sensibilidade a MNase. Em terceiro, após a cromatina ser digerida com tripsina, a adição de poli-ânions não tem efeito adicional na acessibilidade do DNA cromossômico à MNase. Finalmente, os nucleossomos digeridos pela tripsina não se ligam mais a heparina. Tomados juntos com esses dados mostrando que os caules do terminal em amina e da H1 do cerne das histonas são preferencialmente acessíveis às acetilases, fosfatases, anticorpos anti-histonas e proteinases, os resultados descritos aqui proporcionam evidência convincente de que a heparina interage preferencialmente com a H1 e com os caules do terminal N do cerne das histonas. Dados os padrões de ligação da heparina às histonas, a heparina pode ser postulada por aumentar a acessibilidade da cromatina por mascarar as cargas eletrostáticas dos resíduos de lisina e arginina na histona H1 e os caules terminais em amina do cerne das histonas.
Já que a histona H1 é a principal histona envolvida na ordem superior de dobramento da cromatina, as interações da heparina com a H1 poderiam contribuir para todos os efeitos da heparina sobre a acessibilidade da nuclease na cromatina. Entretanto, os dados na figura 5 argúem contra a possibilidade de que os efeitos da heparina na cromatina dependam somente das interações com a H1. Enquanto a sensibilidade dos nucleossomos à MNase é marcadamente aumentada pela remoção da H1, nucleossomos livres de H1 tornam-se ainda mais acessíveis à digestão pela MNase após o tratamento com heparina. Esses resultados sugerem fortemente que os aumentos na acessibilidade à cromatina induzidos por heparina envolvem interações dos poli-ânions com ambos a H1 e o cerne das histonas.
O Desdobramento Induzido pela Heparina Proporciona um Modelo para as Alterações na Estrutura da Cromatina Requerida para a Transcrição?
Genes ativos são preferencialmente acessíveis à DNAase I, DNAase II e MNase. A sensibilidade preferencial de genes ativos à DNAase I é reduzida pela digestão pela tripsina, tanto que os domínios de histona disponíveis à tripsina e aos poli-ânions são aceitáveis por atuarem num papel proeminente na cromatina ativa. As proteínas do grupo de alta mobilidade, as quais tem um grande conteúdo de resíduos de aminoácidos ácidos em um domínio, representam uma classe de não-histonas ocorrendo naturalmente que podem funcionar de um modo imitado pela heparina ou poli-ácido glutâmico. As proteínas do grupo de alta mobilidade têm sido localizadas em regiões ativamente transcritas e têm sido relatadas por promoverem a sensibilidade à DNAase I.
Experimentos genéticos recentes têm demonstrado que o cerne de histonas ou a região terminal em amina da histona H4 pode reprimir a iniciação da transcrição de vários genes. Por outro lado, muitos fatores de transcrição podem contrariar a repressão mediada pela histona. Os domínios de ativação de muitos fatores de transcrição contém resíduos ácidos que podem formar uma hélice alfa anfipática [qualidade de uma molécula que tem características opostas, por exemplo: propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas. Stedman. A ceruloplasmina pode ser oxidativa e redutora.] com resíduos negativamente carregados enfileirados ao longo de uma superfície. Enquanto os fatores de transcrição são considerados por ligarem-se uns aos outros, a ativação ácida dos domínios também pode contrariar a repressão mediada pelas histonas pela ligação aos resíduos de arginina e lisina sensíveis à tripsina na H1 e nos caules terminais em amina do cerne de histonas com postulado pela heparina no presente papel.
Fonte: FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1131979/?tool=pubmed
B Villeponteau
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1131979/?tool=pubmed
RESUMO
Evidência recente indica que a acessibilidade da cromatina aos fatores de transcrição é de significância regulatória. Sabe-se que o poli-ânion heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à DNAase I e estimula a síntese de RNA e DNA. No presente estudo, a estrutura da cromatina e sua modificação por poli-ânions foram examinados pelo uso da tripsina e nuclease de micrococccus como provas. Ambos a heparina e o poli-ácido glutâmico foram encontrados como equivalentes à tripsina na digestão de histonas em sua habilidade de aumentar a acessibilidade de nucleases à cromatina. Entretanto, nenhum aumento da acessibilidade de nucleases foi observado quando a cromatina digerida por tripsina foi tratada suplementarmente com heparina, indicando que os poli-ânions e a tripsina não são aditivos em seus efeitos na acessibilidade à cromatina. Além disso, análises de gradiente de sacarose demonstraram que a heparina liga-se disciplinadamente a nucleossomos intactos, mas não a nucleossomos digeridos pela tripsina. Esses dados sugerem que os poli-ânions interagem predominantemente com resíduos de lisina e arginina sensíveis à tripsina na histona 1 e nos segmentos com teminais amina do cerne das histonas. A possível relevância desses resultados para a estrutura da cromatina das regiões ativamente transcritas é discutida.
INTRODUÇÃO
Para caber dentro do núcleo, DNA eucariótico é condensado pelas histonas, as quais compactam o DNA em nucleossomos e os 30 nanômetros da fibra de cromatina. Estudos prévios mostraram que a estrutura da cromatina ao redor de genes ativos está perturbada onde a cromatina ativamente transcrita é digerida preferencialmente por DNAase I ou nuclease de micrococcus (M Nase), sugerindo que o empacotamento da cromatina precisa ser alterado de acordo para que ocorra a transcrição. Sustentando essa noção, dados recentes indicam fortemente que o DNA empacotado dentro da cromatina frequentemente não está acessível aos fatores de transcrição e que as histonas podem impedir ambas a iniciação da polimerase e seu alongamento. Assim, uma questão básica não respondida é como a cromatina é modificada de modo que a transcrição ocorra.
Os poliânions ácidos heparina e poli-ácido glutâmico foram relatados enquanto alteradores da cromatina por termo-desnaturação e estimuladores da sensibilidade à DNAase I, transcrição e replicação do DNA ‘in vitro’. Essas mudanças no molde da cromatina não foram acompanhadas pelas maiores rupturas na estrutura da cromatina. No presente estudo eu tentei elucidar o mecanismo específico pelo qual esses poli-ânions atuam focalizando o papel dos domínios da histona sensitivos à tripsina.
Para examinar mudanças na estrutura da cromatina ou tratamento com heparina, a MNase foi usada como prova para acessibilidade da nuclease, enquanto a tripsina foi usada para determinar os domínios da histona sensitivos à tripsina. A MNase foi escolhida com uma prova da estrutura da cromatina pois um característico limite de 50% de digestão na solubilização do DNA é atingido em digestão prolongada do núcleo ou da cromatina. Essa digestão limitada reflete aparentemente a natureza das interações histona-DNA dentro do nucleossomo. Se a cromatina é digerida primeiro com tripsina para remover preferencialmente a histona H1 e os caules terminais em N das histonas H2A, H3B, H3 e H4, existe um aumento significativo na suscetibilidade ao ataque da MNase. Como meus experimentos iniciais indicaram que o tratamento da cromatina com poli-ânion leva a um aumento similar na suscetibilidade à digestão por MNase, eu comparei diretamente os efeitos dos tratamentos da cromatina com poli-ânions com os efeitos da digestão por tripsina. Os dados indicam que os poli-ânions interagem preferencialmente com regiões da histona sensitivas à tripsina, sugerindo que a estimulação da síntese de RNA e DNA endógenos induzida por poli-ânions é melhor explicada pelo mascaramento eletrostático dos resíduos de lisina e arginina sensitivos à tripsina nas histonas.
RESULTADOS
A Cromatina Tratada com Poli-ânions ou Tripsina Tem Limites de Assimilação Quase Idênticos aos de MNase.
Em torno de metade do DNA dentro da cromatina é normalmente resistente ao ataque da MNase ( Clack & Felsenfeld, 1974). A figura I mostra que o tratamento da cromatina com o poli-ânion heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à MNase. Para determinar a dose da resposta para esse efeito dos poli-ânions na cromatina, várias concentrações de heparina, ou poli-ácido glutâmico foram adicionadas a uma quantidade fixada da cromatina seguida pela digestão com MNase (5μg/ml). A suscetibilidade máxima da cromatina à MNase foi alcançada a uma razão de 0,2 para 0,4 entre o poliânion e o DNA. Acima dessa razão o poli-ácido glutâmico tem pouco efeito a mais, enquanto a heparina exibe uma forte inibição da nuclease (veja a seguir). A adição de uma proteína neutra como a BSA não tem efeito na acessibilidade da cromatina ao ataque da nuclease (resultados não mostrados).
A digestão da cromatina com tripsina gera os bem caracterizados fragmentos restritos da histona P1-P5, os quais contém os domínios terminais em C (carboxila) globulares do cerne das histonas (veja Bohm & Crane-Robinson, 1984; Weintraub & van Lente, 1974; e a figura 2a). A cromatina digerida pela tripsina tem uma suscetibilidade aumentada da cromatina ao ataque da MNase. A Figura 2 mostra que a disponibilidade aumentada da cromatina digerida pela tripsina ao ataque da nuclease paraleliza estritamente aquele encontrado para a cromatina tratada com poli-ânion. Além disso, a distribuição do tamanho dos fragmentos restritos em limites resistentes à MNase de cromatina tratada com heparina e digerida com tripsina também são similares, sustentando ainda mais a ligação entre a digestão pela tripsina e o tratamento com heparina.
Para verificar se a heparina ou o poli-ácido glutâmico tem um efeito direto na atividade de MNase, o DNA nú do timo de vitelo foi digerido com MNase (5 µg/ml) na presença de várias concentrações de poli-ânion. A Figura 2(b) mostra que a heparina inibe a atividade de MNase, enquanto o poli-ácido glutâmico não teve nenhum efeito. O mesmo resultado foi obtido quando a taxa de digestão do DNA nú pela MNase foi monitorada por hipercromicidade [aumento da absorção de luz. Stedman] usando-se um gravador de espectrômetro (resultados não mostrados). Assim, a explicação mais aceitável para a curva bifásica da heparina na figura 2(b) é que a heparina em baixas concentrações liga-se às histonas e aumenta a disponibilidade do DNA para a digestão, mas em altas concentrações o excesso de heparina livre a torna disponível para a inibição direta da MNase. Esses dados sugerem que a heparina e o poli-ácido glutâmico atuam similarmente na alteração da estrutura da cromatina.
A Extração das Histonas da Cromatina Induzida por Poli-ânions não é a Causa Primária do Aumento da Suscetibilidade à MNase.
Para determinar a extensão em que os poliânions extraem as histonas da cromatina, a cromatina de timo de vitelo foi incubada com várias concentrações de heparina ou poli-ácido glutâmico e então depositada na ultra-cientrífuga. Análises das histonas nos depósitos e nas frações sobrenadantes foram concluídas usando-se PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida). A figura 3 mostra que há alguma extração de H2A (histona 2 A) e de H2B sob concentrações moderadas de heparina. Varreduras densiométricas desses geles indicam que houve menos de 15% de perda de H2A e H2B sob o nível 0,3 de heparina. Além disso, ainda em altas concentrações, o poli-ácido glutâmico remove quantidades negligenciáveis de cerne de histona da cromatina do timo de vitelo, embora a H1 seja removida nas mais altas concentrações testadas.
Comparando os dados de digestão pela MNase na cromatina tratada com heparina na figura 2 com a extração de histona induzida por heparina mostrada na figura 3, é aparente que a suscetibilidade próxima ao máximo para a digestão pela MNase seja alcançada no valor da razão de heparina/DNA de 0,2 sob o qual se leva à substancial extração de H2A e H2B. Para o poli-ácido glutâmico, dificilmente qualquer dos cernes de histona parece ser extraído em razões de poli-ácido glutâmico/DNA acima daquelas que deram vez à máxima suscetibilidade da cromatina à digestão por MNase. Assim, a suscetibilidade aumentada para o ataque da MNase à cromatina tratada com poliânion não parece correlacionar-se com a extração da histona.
Os Efeitos da Tripsina e da Heparina Não São Aditivos.
A similaridade dos limites da digestão por MNase com a digestão por tripsina ou tratamento com heparina sugere que a heparina interage com as mesmas regiões das histonas que a tripsina o faz, na cromatina. Para comparar diretamente a cromatina tratada com tripsina e com heparina , a cromatina digerida com tripsina foi tratada adicionalmente com heparina antes da digestão pela MNase. A Tabela 1 demonstra que a sujeição da cromatina a digestão por tripsina e a tratamento com heparina têm o mesmo efeito na acessibilidade da cromatina à MNase como ocorre com o tratamento com tripsina ou heparina isoladamente. Essa completa falta de aditividade entre a tripsina e a heparina sustenta a noção de que a heparina interage com os mesmos domínios de histona que a tripsina, denominados H1 e caule terminal em N do cerne das histonas.
Análises dos Nucleossomos Tratados com Heparina no Gradiente de Sacarose.
Porque a heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à MNase e à DNAse I, a heparina deve funcionar pelo relaxamento da ligação de histona e desdobramento parcial do nucleossomo. Para examinar ainda mais essas possibilidades, monômenos de nuclossomo livres de de histona H1 lavados de sais foram tratados com várias concentrações de heparina contendo rastreadores tritiados [que contém átomos de trítio, o hidrogênio 3.Stedman] e foram centrifugados através de um gradiente de sacarose de 5 a 25% -(w/v). A figura 4 demonstra que os nucleossomos tratados com heparina sedimentam-se mais lentamente e geram um pico mais nítido do que os nucleossomos não tratados. A heparina tritiada é encontrada nos nucleossomos sedimentando-se lentamente, marcando a heparina ligada aos nucleossomos. Além disso, a heparina tritiada que se liga aos nucleossomos parece sofrer pouca ou nenhuma troca com a heparina livre, já que os padrões de sedimentação da heparina tritiada e dos nucleossomos não são mudados quando a heparina não etiquetada está presente em todo o gradiente de sacarose. Algumas etiquetas, parte das quais pode representar a heparina tritiada degradada, permanecem no topo do gradiente junto com quantidades menores de histonas H2A e H2B livres, enquanto nenhuma histona ou heparina é encontrada no fundo do tubo.
Para verificar que o efeito da heparina no aumento da disponibilidade do DNA nucleossômico ao ataque da MNase é fartamente independente da habilidade de extração das histonas H2A e H2B, os nucleossomos tratados com heparina do segundo gradiente mostrados na figura 4 foram caracterizados segundo seus conteúdos de histona e acessibilidade à digestão por MNase do pico das frações da região do monossomo . A figura 5 e varreduras densiométricas demonstram que esses nucleossomos sedimentados contém quantidades normais de quatro histonas do cerne, ligam-se a heparina, e exibem máxima suscetibilidade à digestão por MNase. Tomados juntos, esses dados indicam que a heparina liga-se fortemente aos nucleossomos e os desdobra parcialmente.
A Heparina não se Liga aos Nucleossomos Digeridos pela Tripsina.
A Tabela 1 mostra que a heparina não tem efeitos na acessibilidade da MNase à cromatina digerida quando a cromatina é digerida por tripsina, indicando que a heparina se liga aos domínios das histonas sensíveis à tripsina. Para testar a ligação da heparina em regiões do cerne de histonas sensíveis à tripsina definitivamente, nucleossomos digeridos por tripsina foram tratados com heparina tritiada e então centrifugados em um gradiente de 5 a 25% de sacarose como anteriormente. A figura 6 demonstra claramente que a heparina não se liga a nucleossomos digeridos pela tripsina. Análises PAGE do pico das frações no gradiente revelaram o padrão típico de digestão limitada pela tripsina das histonas. Esses resultados indicam fortemente que a heparina se liga às regiões das histonas sensíveis a tripsina no cerne do nucleossomo.
DISCUSSÃO
A Heparina Desdobra a Cromatina e Aumenta a Acessibilidade à Cromatina.
As figuras 1 e 2 demonstram que, quando a cromatina é tratada com poliânions heparina ou poli-ácido glutâmico, o DNA contido dentro da cromatina torna-se marcadamente mais acessível à digestão por MNase. O limite de digestão por MNase é conhecido por depender das interações da histona com DNA, tanto que a heparina provavelmente rompe as ligações do DNA com a histona. Embora a heparina e o poli-ácido glutâmico hajam de extrair certas espécies de histona da cromatina em concentrações suficientemente altas, a acessibilidade máxima da cromatina à MNase é observada em baixas concentrações de poli-ânions, onde pouca histona é removida pela heparina e nenhuma por poli-ácido glutâmico. Assim as características alteradas da digestão por MNase da cromatina tratada tratada com poli-ânions não é devida à extensiva extração de histona, mas sim a uma perturbação nas interações das ligações da histona com o DNA de nucleossomos por outro lado intactos.
Em adição à aumentada sensibilidade à MNase, o tratamento dos nucleossomos com a heparina leva à sedimentação mais lenta nos gradientes de sacarose, sugerindo que os nucleossomos são desdobrados pela heparina. Esse resultado é consistente com os relatos de que a cromatina tratada com heparina teve a sensibilidade aumentada para DNAase I, estabilidade térmica diminuída, e um espectro c.d. mais parecido com o do DNA livre. Tomados juntos, esses dados indicam que a heparina aumenta a transcrição e a replicação pelo desdobramento da cromatina e aumento da acessibilidade à cromatina.
A Heparina Interage com a Histona H1 Sensível à Tripsina e com os Caules Terminais em Amina dos Cernes das Histonas.
A digestão da cromatina ou nucleossomos pela tripsina gera um padrão similar de fragmentos de digestão, P1-P5, os quais consistem principalmente de domínios terminais em carboxila globulares dos cernes das histonas H2A, H2B, H3, e H4. No núcleo, o cerne globular central da H1 também está protegido da tripsina. Na cromatina, acredita-se que a histona H1 e os caules terminais em amina básicos de 20 a 30 resíduos são preferencialmente degradados, devido a sua acessibilidade à tripsina mais do que à especificidade da enzima, já que a digestão da cromatina pela quimio-tripsina fornece o mesmo padrão de limite de digestão. Além disso, os caules altamente básicos no terminal amina da histona H1 removidos pela tripsina têm sido identificados carecendo de acetilação da estrutura secundária da histona e são conhecidos como sítios de acetilação e fosforilação de histona ‘in vivo’. Em contraste, os domínios globulares dos terminais carboxila dos cernes de histonas falham em ligarem-se a anticorpos anti-histona (Goldblatt & Bustin, 1975) e são responsáveis pelas interações entre as histonas no cerne do octâmero de histona [obs.: octâmero de histona se compõe de [(H3-H4)2(H2A-H2B)2], sendo (H3-H4)2 um tetrâmero e H2A-H2B um dímero PMID: 19914933].
Várias linhas de evidência indicam que a heparina interage principalmente com os domínios da histona sensíveis a tripsina. Primeiro, a cromatina tratada com tripsina foi descrita aumentado a sensitividade a DNAase I, reduzindo a estabilidade térmica e como um transformadorador do espectro c.d. rumo ao DNA livre que relembra estritamente mudanças similares encontradas na cromatina tratada com heparina. Em segundo lugar, a cromatina tratada com heparina ou com tripsina tem níveis equivalentes de sensibilidade a MNase. Em terceiro, após a cromatina ser digerida com tripsina, a adição de poli-ânions não tem efeito adicional na acessibilidade do DNA cromossômico à MNase. Finalmente, os nucleossomos digeridos pela tripsina não se ligam mais a heparina. Tomados juntos com esses dados mostrando que os caules do terminal em amina e da H1 do cerne das histonas são preferencialmente acessíveis às acetilases, fosfatases, anticorpos anti-histonas e proteinases, os resultados descritos aqui proporcionam evidência convincente de que a heparina interage preferencialmente com a H1 e com os caules do terminal N do cerne das histonas. Dados os padrões de ligação da heparina às histonas, a heparina pode ser postulada por aumentar a acessibilidade da cromatina por mascarar as cargas eletrostáticas dos resíduos de lisina e arginina na histona H1 e os caules terminais em amina do cerne das histonas.
Já que a histona H1 é a principal histona envolvida na ordem superior de dobramento da cromatina, as interações da heparina com a H1 poderiam contribuir para todos os efeitos da heparina sobre a acessibilidade da nuclease na cromatina. Entretanto, os dados na figura 5 argúem contra a possibilidade de que os efeitos da heparina na cromatina dependam somente das interações com a H1. Enquanto a sensibilidade dos nucleossomos à MNase é marcadamente aumentada pela remoção da H1, nucleossomos livres de H1 tornam-se ainda mais acessíveis à digestão pela MNase após o tratamento com heparina. Esses resultados sugerem fortemente que os aumentos na acessibilidade à cromatina induzidos por heparina envolvem interações dos poli-ânions com ambos a H1 e o cerne das histonas.
O Desdobramento Induzido pela Heparina Proporciona um Modelo para as Alterações na Estrutura da Cromatina Requerida para a Transcrição?
Genes ativos são preferencialmente acessíveis à DNAase I, DNAase II e MNase. A sensibilidade preferencial de genes ativos à DNAase I é reduzida pela digestão pela tripsina, tanto que os domínios de histona disponíveis à tripsina e aos poli-ânions são aceitáveis por atuarem num papel proeminente na cromatina ativa. As proteínas do grupo de alta mobilidade, as quais tem um grande conteúdo de resíduos de aminoácidos ácidos em um domínio, representam uma classe de não-histonas ocorrendo naturalmente que podem funcionar de um modo imitado pela heparina ou poli-ácido glutâmico. As proteínas do grupo de alta mobilidade têm sido localizadas em regiões ativamente transcritas e têm sido relatadas por promoverem a sensibilidade à DNAase I.
Experimentos genéticos recentes têm demonstrado que o cerne de histonas ou a região terminal em amina da histona H4 pode reprimir a iniciação da transcrição de vários genes. Por outro lado, muitos fatores de transcrição podem contrariar a repressão mediada pela histona. Os domínios de ativação de muitos fatores de transcrição contém resíduos ácidos que podem formar uma hélice alfa anfipática [qualidade de uma molécula que tem características opostas, por exemplo: propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas. Stedman. A ceruloplasmina pode ser oxidativa e redutora.] com resíduos negativamente carregados enfileirados ao longo de uma superfície. Enquanto os fatores de transcrição são considerados por ligarem-se uns aos outros, a ativação ácida dos domínios também pode contrariar a repressão mediada pelas histonas pela ligação aos resíduos de arginina e lisina sensíveis à tripsina na H1 e nos caules terminais em amina do cerne de histonas com postulado pela heparina no presente papel.
Fonte: FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1131979/?tool=pubmed
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