Controle Sequencial de Múltiplas Etapas do Tráfego e Função da Mútipla Deficiência no Produto Genético da Sulfatase, SUMF1 por PDI, ERGIC-53 e ERp44.
O fator modificador de sulfatase (SUMF1) codifica para a formilglicina (formila é o radical HCO-; o radical formila –CHO promove a acilação do aminoácido metionina nos polipeptídeos bacterianos, e também é encontrado nas mitocôndrias e cloroplastos eucariotos. Stedman) formando a enzima, que ativa sulfatases pela modificação de um resíduo chave de cisteína dentro de seus domínios catalíticos. A SUMF1 é mutada em pacientes afetados por múltipla deficiência em sulfatase, uma rara desordem recessiva na qual todas as atividades de sulfatase estão diminuídas. A despeito da ausência de sinais canônicos de retenção/recuperação, a SUMF1 é largamente retida no retículo endoplasmático (ER), onde exerce sua atividade enzimática nas sulfatases nascentes. Parte da SUMF1 é secretada e tomada de modo parácrino (seus efeitos são restritos ao ambiente local) e por células distantes. Aqui nós mostramos que a SUMF1 interage com a proteína dissulfeto isomerase (PDI) e ERp44, dois membros da família tiorredoxina (proteína que participa em reações de oxidação-redução associadas à biossíntese de desoxirribonucleotídios) residentes na via secretória primária, e com a ERGIC-53, uma lecitina que oscila entre o retículo endoplasmático e o Golgi. Ensaios funcionais revelam que essas interações são cruciais para o controle do tráfego e da função da SUMF1. A PDI promove a retenção e ativação da SUMF1 no retículo endoplasmático. A ERGIC53 (LMAN1) e a ERp44 atuam depois, favorecendo a exportação da SUMF1 a partir do retículo endoplasmático e sua recuperação pelo RE, respectivamente. O silenciamento da ERGIC-53 causa a degradação proteossômica da SUMF1, enquanto a regulação para menos da ERp44 promove sua secreção. Quando expressadas para mais, cada um dos três inter-agentes favorece a acumulação intracelular. Nossos resultados revelam um controle de múltiplas etapas do tráfego da SUMF1, com interações seqüenciais determinando dinamicamente a localização no retículo endoplasmático, a atividade e a secreção.
PMID: 18508857
REGULAÇÃO DA LISE PELA PERFORINA: IMPLICAÇÕES DAS PROTEÍNAS DISSULFETO ISOMERASES
A Perforina, uma proteína de permeabilização da membrana, é importante para a ação da célula T citotóxica. A Perforina tem um potencial para danificar a célula no retículo endoplasmático (ER), é seqüestrada nos grânulos (são partículas semelhantes a bastões encontradas em vários tipos de células, principalmente nas plaquetas, onde existem em maior quantidade e contém proteínas secretoras, que incluem o fibrinogênio, a fibronectina, a trombospondina, o vWF e outras proteínas. Stedman), e finalmente é exocitada para matar células. No retículo endoplasmático e após a exocitose, o cálcio e o pH favorecem a atividade da perforina . Nós encontramos um novo inibidor da perforina associado com os grânulos das células T citotóxicas e a chamamos de Proteína 2 Regulatória de Citotoxidade (CxRP2). A CxRP2 bloqueou a lise pelos extratos de granulo, pela perforina recombinante e pelas células T. Seus efeitos continuaram por horas. A CxRP2 ficou estável ao cálcio e refratária (imune) aos inibidores das proteases granzima (uma protease que constitui o maior conteúdo dos grânulos das células T citotóxicas) e catepsina. Através de análises de espectrometria de massa de proteínas de 50 a 100 quilo-Dáltons, nós identificamos candidatos a CxRP2. A proteína dissulfeto isomerase A3 foi a mais forte candidata mas não estava disponível para o teste, entretanto, a proteína dissulfeto isomerase A1 tinha atividade CxRP2. Nossos resultados indicam que as proteínas dissulfeto isomerases, no retículo endoplasmático ou outro lugar qualquer, pode proteger a célula T de sua própria perforina.
PMID: 19147124
A PROTEÍNA DISSULFETO ISOMERASE AGR2 É ESSENCIAL PARA A PRODUÇÃO DO MUCO INTESTINAL
As proteínas dissulfeto isomerases (PDIs) ajudam no dobramento das proteínas e reunião pela formação da catálise e da troca de sítio das ligações dissulfeto das cisteínas no retículo endoplasmático (ER). Muitos membros da família PDI são expressados nos mamíferos, mas os papéis das PDIs específicas in vivo são pobremente compreendidos. Uma busca recente por membros adicionais da família das PDI, baseada em homologia, identificaram um gradiente anterior homólogo 2 (AGR2), uma proteína originalmente presumida por ser secretada pelas células do epitélio intestinal. Aqui nós mostramos que a AGR2 está presente dentro do ER das células secretoras do epitélio intestinal e é essencial para a produção da mucina intestinal MUC2 in vivo, uma grande glicoproteína rica em cisteína que forma o gel mucoso protetor que recobre o intestino. Um resíduo de cisteína dentro do domínio similar a tiorredoxina da AGR2 forma ligações dissulfeto mistas com a MUC2, indicando um papel direto da AGR2 no processamento da mucina. Camundongos carentes de AGR2 foram viáveis mas eram altamente suscetíveis à colite, indicando um papel crítico para a AGR2 na proteção contra esta doença. Nós concluímos que a AGR2 é um único membro da família das PDI, com um papel especializado e não redutor na produção do muco intestinal.
PMID: 19359471
terça-feira, 28 de julho de 2009
sábado, 25 de julho de 2009
611099 PROTEIN DISULFIDE ISOMERASE, FAMILY A, MEMBER 6; PDIA6
P5ENDOPLASMIC RETICULUM PROTEIN 5; ERP5
Lócus do gene mapeado 2p25-24
DESCRIÇÃO
As proteínas dissulfeto isomerase (isomerismo é a relação entre duas moléculas que têm a mesma composição percentual, mas que diferem em relação a posição de um ou mais átomos dentro delas), tais como a PDIA6, são proteínas residentes no retículo endoplasmático (ER) que catalisam a formação, redução e isomerização das ligações dissulfeto em proteínas e são consideradas por atuarem num papel no dobramento de proteínas com ligações dissulfeto.
CLONAGEM
Por sondagem de uma biblioteca de cDNA com um fragmento de cDNA de PDI (P4HB; omim 176790), Hayano e Kikuchi (1995) clonaram PDIA6, a qual eles chamaram P5. A proteína deduzida em 440 aminoácidos tem uma massa molecular calculada em 48,1 quilo-dáltons. Ela tem uma sequencia sinal no terminal N, seguida por dois domínios similares a tiorredoxina (TXN; omim 187700) e um sinal de retenção no ER no terminal C (KDEL). [Obs. Tiorredoxina é uma proteína que participa nas reações de oxidação-redução associadas à biossíntese de desoxirribonucleotídios.]
Chaudhuri e outros (1992) descobriram que a P5 do camundongo mostrou a mais alta expressão nos pulmões, com níveis progressivamente mais baixos nos rins, coração, fígado e cérebro.
FUNÇÃO DO GENE
Chaudhuri e outros (1992) mostraram que a P5, Rrm2 (omim 180410), e Odc1 (omim154640) foram co-amplificados nas células dos ramsters resistentes à hidroxiuréia, um potente inibidor da ribonucleotideo redutase. Já que a P5, RRM2, e ODC1 estão intimamente ligadas nos genomas do ramster e humano, Chaudhuri e outros (1992) hipotetizaram que elas podem formar um amplicom (acho que é um fenômeno da duplicação do DNA em que um trecho é copiado mais de uma vez, produzindo sequencias repetidas ou a polimerase II produz um mRNA com a sequencia de dois genes ou mais).
Kikuchi e outros (2002) descobriram que a P5 recombinante humana tinha ambas as atividades de isomerase e de chaperone, mas ambas as atividades eram mais atenuadas do que as da PDI humana. Análises de mutação revelaram que o primeiro motivo da P5 semelhante a tiorredoxina era mais importante do que o segundo para atividade de isomerase, e que a primeira cisteína em cada motivo era necessária para a atividade de isomerase. Os motivos de tiorredoxina mutantes da P5 sem a atividade de isomerase retinham a atividade de chaperone com a citrato sintase (CS, omim 118950) como substrato, indicando que, como a PDI, as atividades de isomerase e de chaperone da P5 são aceitavelmente independentes.
Kaiser e outros (2007) mostraram que na superfície de células tumorais, a MICA [omim 600169 – Os genes do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I codificam tipicamente cadeias polimórficas de ligação a peptídio que são expressadas ubíquamente e mediam o reconhecimento de antígenos intracelulares pelas células T citotóxicas. Motivados pela associação do HLA-B27 com as doenças reumatóides de inflamatórias, Bahram e outros (1994) descobriram uma família de sequencias no MHC humano que são altamente divergentes de todos os genes conhecidos do MHC de classe I e foram provavelmente derivados dos primórdios da evolução do MHC de classe I dos mamíferos. Esses genes MIC (para genes relacionados ao MHC de classe I) envolveram-se em paralelo com os genes humanos de classe I e com aqueles da maioria, senão todas, as ordens de mamíferos. Baharam e outros (1994) clonaram o gene MICA nesta família e estabeleceram que ele era de longe o gene mais divergente do MHC de classe I mamífero conhecido. O gene MICA codifica um polipeptídeo de 383 aminoácidos com uma massa prevista em 43 quilo-dáltons. Isso é melhor distinguido por sua organização éxon-íntron não usual e expressão preferencial em fibroblastos e células epiteliais. Entretanto, a presença de resíduos distintivos na sequência de aminoácidos de MICA traduzidos por um cDNA sugeriram que uma cadeia suposta de MICA dobra-se similarmente às cadeias clássicas de classe I e pode ter a capacidade de ligar-se a peptídeos ou outros pequenos ligantes. Dessa forma, uma segunda linhagem de genes de MHC de classe I evoucionariamente conservados foi definida por estes resultados] associa-se com ERP5, a qual, similarmente à proteína dissulfeto isomerase (omim 176790), usualmente assessora no dobramento de proteínas nascentes dentro das células. A inibição farmacológica da atividade tiorredutase e o silenciamento do gene ERP5 revelaram que a função da ERP5 na superfície celular é requerida para a metamorfose (?) de MICA.
MAPEAMENTO
Através de hibridização em sítio, Yang-Feng e outros (1987) mapearam o gene PDIA6 no cromossomo 2p25-p24.
MODELO ANIMAL
A mutação no peixe zebra “de só um olho cabeça de alfinete’ (oep) é caracterizada por múltiplas deficiências no desenvolvimento da linha média (da simetria?) e uma notocorda morfologicamente normal. Hoshima e outros (2002) descobriram que a P5 era expressada predominantemente no mesoderma axial (superior) da gástrula (fase do embrião que segue a etapa de blástula e na fase inicial consiste em duas camadas de células, o ectoderma e o endoderma; o endoderma se dobra e circunda o arquêntero que, por sua vez, se abre formando o blastóporo) média dos embriões de tipo selvagem e que era significativamente regulada para menos no oep (olho cabeça de alfinete do peixe-zebra) mutantes. Análises funcionais demonstraram que a P5 estava envolvida específicamente no padrão de lateralidade. A depleção da proteína P5 com oligonucleotídeos anti-senso morpholino revelaram que a P5 era requerida para estabelecer a expressão assimétrica do gene na placa lateral do mesoderma e no cérebro e para a regulação da assimetria morfológica no desenvolvimento do coração, fígado e pâncreas. A interferência na função da P5 não atrapalhou outros aspectos do desenvolvimento ou função da linha do meio.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=611099
P5ENDOPLASMIC RETICULUM PROTEIN 5; ERP5
Lócus do gene mapeado 2p25-24
DESCRIÇÃO
As proteínas dissulfeto isomerase (isomerismo é a relação entre duas moléculas que têm a mesma composição percentual, mas que diferem em relação a posição de um ou mais átomos dentro delas), tais como a PDIA6, são proteínas residentes no retículo endoplasmático (ER) que catalisam a formação, redução e isomerização das ligações dissulfeto em proteínas e são consideradas por atuarem num papel no dobramento de proteínas com ligações dissulfeto.
CLONAGEM
Por sondagem de uma biblioteca de cDNA com um fragmento de cDNA de PDI (P4HB; omim 176790), Hayano e Kikuchi (1995) clonaram PDIA6, a qual eles chamaram P5. A proteína deduzida em 440 aminoácidos tem uma massa molecular calculada em 48,1 quilo-dáltons. Ela tem uma sequencia sinal no terminal N, seguida por dois domínios similares a tiorredoxina (TXN; omim 187700) e um sinal de retenção no ER no terminal C (KDEL). [Obs. Tiorredoxina é uma proteína que participa nas reações de oxidação-redução associadas à biossíntese de desoxirribonucleotídios.]
Chaudhuri e outros (1992) descobriram que a P5 do camundongo mostrou a mais alta expressão nos pulmões, com níveis progressivamente mais baixos nos rins, coração, fígado e cérebro.
FUNÇÃO DO GENE
Chaudhuri e outros (1992) mostraram que a P5, Rrm2 (omim 180410), e Odc1 (omim154640) foram co-amplificados nas células dos ramsters resistentes à hidroxiuréia, um potente inibidor da ribonucleotideo redutase. Já que a P5, RRM2, e ODC1 estão intimamente ligadas nos genomas do ramster e humano, Chaudhuri e outros (1992) hipotetizaram que elas podem formar um amplicom (acho que é um fenômeno da duplicação do DNA em que um trecho é copiado mais de uma vez, produzindo sequencias repetidas ou a polimerase II produz um mRNA com a sequencia de dois genes ou mais).
Kikuchi e outros (2002) descobriram que a P5 recombinante humana tinha ambas as atividades de isomerase e de chaperone, mas ambas as atividades eram mais atenuadas do que as da PDI humana. Análises de mutação revelaram que o primeiro motivo da P5 semelhante a tiorredoxina era mais importante do que o segundo para atividade de isomerase, e que a primeira cisteína em cada motivo era necessária para a atividade de isomerase. Os motivos de tiorredoxina mutantes da P5 sem a atividade de isomerase retinham a atividade de chaperone com a citrato sintase (CS, omim 118950) como substrato, indicando que, como a PDI, as atividades de isomerase e de chaperone da P5 são aceitavelmente independentes.
Kaiser e outros (2007) mostraram que na superfície de células tumorais, a MICA [omim 600169 – Os genes do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I codificam tipicamente cadeias polimórficas de ligação a peptídio que são expressadas ubíquamente e mediam o reconhecimento de antígenos intracelulares pelas células T citotóxicas. Motivados pela associação do HLA-B27 com as doenças reumatóides de inflamatórias, Bahram e outros (1994) descobriram uma família de sequencias no MHC humano que são altamente divergentes de todos os genes conhecidos do MHC de classe I e foram provavelmente derivados dos primórdios da evolução do MHC de classe I dos mamíferos. Esses genes MIC (para genes relacionados ao MHC de classe I) envolveram-se em paralelo com os genes humanos de classe I e com aqueles da maioria, senão todas, as ordens de mamíferos. Baharam e outros (1994) clonaram o gene MICA nesta família e estabeleceram que ele era de longe o gene mais divergente do MHC de classe I mamífero conhecido. O gene MICA codifica um polipeptídeo de 383 aminoácidos com uma massa prevista em 43 quilo-dáltons. Isso é melhor distinguido por sua organização éxon-íntron não usual e expressão preferencial em fibroblastos e células epiteliais. Entretanto, a presença de resíduos distintivos na sequência de aminoácidos de MICA traduzidos por um cDNA sugeriram que uma cadeia suposta de MICA dobra-se similarmente às cadeias clássicas de classe I e pode ter a capacidade de ligar-se a peptídeos ou outros pequenos ligantes. Dessa forma, uma segunda linhagem de genes de MHC de classe I evoucionariamente conservados foi definida por estes resultados] associa-se com ERP5, a qual, similarmente à proteína dissulfeto isomerase (omim 176790), usualmente assessora no dobramento de proteínas nascentes dentro das células. A inibição farmacológica da atividade tiorredutase e o silenciamento do gene ERP5 revelaram que a função da ERP5 na superfície celular é requerida para a metamorfose (?) de MICA.
MAPEAMENTO
Através de hibridização em sítio, Yang-Feng e outros (1987) mapearam o gene PDIA6 no cromossomo 2p25-p24.
MODELO ANIMAL
A mutação no peixe zebra “de só um olho cabeça de alfinete’ (oep) é caracterizada por múltiplas deficiências no desenvolvimento da linha média (da simetria?) e uma notocorda morfologicamente normal. Hoshima e outros (2002) descobriram que a P5 era expressada predominantemente no mesoderma axial (superior) da gástrula (fase do embrião que segue a etapa de blástula e na fase inicial consiste em duas camadas de células, o ectoderma e o endoderma; o endoderma se dobra e circunda o arquêntero que, por sua vez, se abre formando o blastóporo) média dos embriões de tipo selvagem e que era significativamente regulada para menos no oep (olho cabeça de alfinete do peixe-zebra) mutantes. Análises funcionais demonstraram que a P5 estava envolvida específicamente no padrão de lateralidade. A depleção da proteína P5 com oligonucleotídeos anti-senso morpholino revelaram que a P5 era requerida para estabelecer a expressão assimétrica do gene na placa lateral do mesoderma e no cérebro e para a regulação da assimetria morfológica no desenvolvimento do coração, fígado e pâncreas. A interferência na função da P5 não atrapalhou outros aspectos do desenvolvimento ou função da linha do meio.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=611099
quinta-feira, 23 de julho de 2009
*107470 RECEPTOR 1 DE INTERFERON GAMA; IFNGR1
Títulos alternatives; símbolos
AVP, TYPE IIANTIVIRAL PROTEIN, TYPE IIIMMUNE INTERFERON RECEPTOR 1CD119 ANTIGEN; CD119
Lócus de mapeamento genético 6q23-q24
DESCRIÇÃO
Os interferons podem ser considerados como hormônios polipeptídicos por seu papel na comunicação de célula para célula de um conjunto específico de instruções que levam a uma ampla variedade de efeitos. As viroses induzem o interferon de tipo I, subdividido em intereron alfa (omim 14760), produzido pelos leucócitos e células linfoblastóides, e interferon beta (omim147640), produzido pelos fibroblastos. Os mitógenos e estímulos antigênicos induzem nos lifócitos o tipo II, imune, ou interferon gama (omim 147570). Os efeitos biológicos dos interferons humanos, incluindo o incremento dos antígenos de histocompatibilidade, são mediados através de receptores específicos nas espécies. Os interferons humanos não são ativos, por exemplo, nas células do camundongo. O receptor do interferon gama é um heterodímero de IFNGR1 e IFNGR2 (omim 147569). O IFNGR1 é a sub-unidade de ligação ao ligante.
CLONAGEM
Branca e Baglioni (1981) concluíram que os interferons de tipos I e II tem diferentes receptors. Celada e outros (1985) demonstraram e caracterizaram parcialmente o receptor do interferon gama nos macrófagos. O interferon gama tem um papel importante na ativação dos macrófagos nas defesas do hospedeiro.
Novick e outros (1987) purificaram e caracterizaram o receptor do interferon gama. Eles aludiram ao seu trabalho (Orchansky e outros, 1996) sugerindo que as células humanas de origem hematopoiética podem ter um receptor de IFNG que é estrutural e funcionalmente diferente do receptor em células de origem não hematopoiética. Retting e outros (1988) relataram resultados com um painel de 22 anticorpos monoclonais reconhecendo 21 antígenos humanos distintos na superfície celular. Os genes responsáveis por eles foram mapeados em múltiplos sítios. De acordo com a nomenclatura do mapeamento genético humano, os genes foram designados pelo nome do laboratório, Sloan-Kettering. Por exemplo, o MSK28 foi mapeado no cromossomo 6, nos mesmos arredores do receptor do interferon imune e pode de fato ser o mesmo antígeno.
Usando um anticorpo polyclonal anti-IFNGR1 para sondar a expressão de cDNA numa biblioteca de célula Raji, Aguet e outros (1988) isolaram um cDNA codificando o IFNGR1. Análises de sequência predisseram que a proteína de 489 aminoácidos contém um peptídio sinal no terminal N, sete sítios de glicosilação em potencia ligados ao N, várias regiões ricas em ser (serina) e thr (triptofano) indicativas de sítios de glicosilação potenciais ligados a O, um domínio transmembrana, e uma porção citoplasmática de aproximadamente 223 resíduos. Análises de Northern blot revelaram a expressão de um transcrito de 2,3 quilobases nos monócitos, linfócitos, placenta e numa linha de células de carcinoma do cólon. Análises de imuno-manchas mostraram a expressão de proteínas de 90 e 50 quilo-dáltons de ligação ao ligante, com a última assemelhada com um produto de degradação proteolítica que carece da região intra-celular.
FUNÇÃO DO GENE
Aguet e outros (1988) descobriram que a expressão do IFNGR1 nas células do camundongo insensitivas ao IFNG humano demonstraram alta afinidade de ligação ao IFNG.
Usando microscopia confocal, Maldonado e outros (2004) descobriram uma distribuição aleatória de Tcrb [omim 186930 receptor beta de célula T: Collins e outros (1984) assinaram o lócus do TCRB na região 7q22-7qter. São pré-requisitos para a expressão do gene da cadeia beta os rearranjos dos elementos das regiões variável (V), de diversidade (D) e de junção (J) dentro de uma unidade transcricional completada pelos éxons codificadores da região constante (C)], Il4r (147781), e Ifngr1 nos linfócitos T auxiliares (helper) naive (novos) de camundongos (Thp) permeabilizados e fixados conjugados com células dendríticas (DCs) maduras do baço. Nas células fixadas e permeabilizadas 30 minutos após a conjugação das Thp e DCs carregadas com antígeno, os autores observaram uma colocalização dependente de cálcio e Ifng do Tcrb e do Ifngr1, mas não do receptor de Il4, na interface entre as Thp e DC. Essa observação foi mais aparente no prono da Th1 da linhagem de camundongo C57B1/6 do que no prono da Th2 da linhagem BALB/c. Na presença da Il4 (omim147780), mas não da Il10 (omim 124092), a migração do Ifngr1 e a co-polarização foi completamente inibida. Em camudongos carecendo da sinalização da molécula Il4r (receptor de Il4 do camundongo), Stat6 [omim 601512: a STAT 6 é um membro da família das proteínas transdutoras de sinal e ativadoras de transcrição (STAT).
Usando um anti-soro específico para STAT6, Quelle e outros (1995) demonstraram que a STAT6 é rapidamente fosforilada na tirosina em seguida à estimulação de linhas celulares apropriadas com IL4 (147480) ou IL3 (147740), mas não é detectável fosforilada após a estimulação com IL2 (147680), IL12 (veja IL12A; 161560), ou eritropoetina (133170). Em contraste, as IL2, IL3 e eritropoetina (uma proteína que promove a eritropoese por estímulo à formação de pré-eritroblastos e liberação de reticulócitos da medula óssea, encontrada em vários tecidos e inclusive no plasma e na urina - Stedman) induziram a fosforilação da tirosina da STAT5 (601511), enquanto a IL12 unicamente induziu a fosforilação da tirosina na STAT4 (600558). A fosforilação indutível da tirosina da STAT6 requereu a região distante da membrana da cadeia alfa do receptor de IL4 (IL4R, 147781). Eles descobriram que esta região do receptor não é requerida para o crescimento da célula, demonstrando que a fosforilação da tirosina na STAT6 não contribui para a mitogênese.
A sobre-regulação de citocinas pró-inflamatórias na artrite reumatóide (RA; 180300) da sinovia e no flúido sinovial é uma característica da doença ativa e de intensa inflamação. Mediadores anti-inflamatórios também estão presentes e ativados na RA mas falham em contra-regular as citocinas pró-inflamatórias. Muller-Ladner e outros (2000) descobriram que a via IL4-STAT está ativada em pacientes com RA de curto prazo (menos de 1 ano) e de longo prazo (mais de dois anos) e pode contribuir para a regulação para menos da atividade imunológica na sinóvia sob RA.] o impedimento da copolarização de Tcrb/Ifngr1 foi abolida. Maldonado e outros (2004) propuseram que uma forte sinalização no TCR leva à acentuada co-polarização do IFNGR e à reunião do sinalossomo da Th1, o qual é estabilizado adicionalmente pela secreção do IFNG, a menos que um sinal inibitório, tal como a secreção da IL4 e a ativação da STAT6, ocorra e leve à reunião do sinalossoma da Th2. Eles concluíram que a sinapse imunológica pode estar envolvida no controle das decisões do destino da célula.
MAPEAMENTO
Através de estudos em células murinas e humanas hibridas, Fellous e outros (1985) sugeriram que o cromossomo 18 carrega o gene do receptor de interferon gama. Eles examinaram a capacidade dos interferons humanos induzirem os antígenos H-2 do camundongo nessas células híbridas. O cromossomo 18 humano foi requerido para a ação do interferon gama humano. Por outro lado, Rashidbaigi e outros (1986) concluíram que o receptor do IFNG ou sua sub-unidade de ligação é codificada por um gene no braço longo do cromossomo 6 (6q). Eles identificaram um complexo com peso molecular de 117.000 dáltons quando o DNA recombinante humano etiquetado com (32)P foi ligado em cruzamento com células humanas com disuccimidyl suberato [uma substância usada para:
- Ligação cruzada química de proteínas intracelulares anterior à lise celular e imunoprecipitação;
- Fixação das interações da proteína para permitir a identificação de interações protéicas fracas ou transitórias;
- ligação cruzada de proteínas para criar bioconjugados por via de reações de uma só etapa;
- Imobilização de proteínas sobre superfícies revestidas com amina.
http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02030236]. A formação do complexo foi inibida quando a ligação foi executada na presença de um excesso de IFNG humano. Células de ovário de camundongo de ramster chinês não apresentaram formação de complexos. Em estudos de células híbridas humanas e de ramster e humanas e de camundongos, eles mostraram que o 6q humano é necessário e suficiente para a formação dos complexos. Fellous (1986) relatou que ele tinha substituído as células somáticas híbridas com Rashidbaigi e concluído que de fato o cromossmo 6 está envolvido no controle genético do receptor do interferon gama humano, mas o cromossomo 18 também era nessessario. Jung e outros (1987) descobriram que a presença do cromossomo 6 nas células híbridas humanas e de camundongo era por si mesmo insuficiente para conferir sensitividade ao interferon imune humano como mensurado pela indução de HLA humano. O cromossomo humano 21 foi considerado o segundo cromossomo essencial para a indutibilidade do HLA. Resultados similares foram encontrados com as células somáticas híbridas de camundongo e humanas. Assim, ao menos duas etapas estão envolvidas na ação do interferon gama: a ligação do interferon gama ao seu receptor codificado pelo cromossomo 6 e o casamento desse evento de ligação através de um fator codificado pelo cromossomo 21 para disparar a ação biológica. Ambas as etapas foram demonstradas como específicas quanto às espécies. O achado de um elemento receptor no cromossomo 18 deve ser considerado inconsistente (Fellous e outros, 1985).
Através de análises de radiação híbrida, Aguet e outros (1988) mapearam o gene IFNGR1 no cromossomo 6q. Análises de Southern blot sugeriram que o IFNGR1 é um gene de cópia única. Le Coniat e outros (1989) confirmaram a assinatura no cromossomo 6 e regionalizaram o gene em 6q23-q24 por hibridização em sítio. Por fluorescência de hibridização em sítio, Papanicolaou e outros (1997) refinaram a assinatura do IFNGR1 em 6q24.1-q24.2.
Mariano e outros (1987) demonstraram que o gene do receptor do interferon imune do camundogo está no cromossomo 10. O cromossomo 10 do camundongo também carrega o gene do interferon gama, o qual, no homem, é codificado pelo cromossomo 12.
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=107470
Títulos alternatives; símbolos
AVP, TYPE IIANTIVIRAL PROTEIN, TYPE IIIMMUNE INTERFERON RECEPTOR 1CD119 ANTIGEN; CD119
Lócus de mapeamento genético 6q23-q24
DESCRIÇÃO
Os interferons podem ser considerados como hormônios polipeptídicos por seu papel na comunicação de célula para célula de um conjunto específico de instruções que levam a uma ampla variedade de efeitos. As viroses induzem o interferon de tipo I, subdividido em intereron alfa (omim 14760), produzido pelos leucócitos e células linfoblastóides, e interferon beta (omim147640), produzido pelos fibroblastos. Os mitógenos e estímulos antigênicos induzem nos lifócitos o tipo II, imune, ou interferon gama (omim 147570). Os efeitos biológicos dos interferons humanos, incluindo o incremento dos antígenos de histocompatibilidade, são mediados através de receptores específicos nas espécies. Os interferons humanos não são ativos, por exemplo, nas células do camundongo. O receptor do interferon gama é um heterodímero de IFNGR1 e IFNGR2 (omim 147569). O IFNGR1 é a sub-unidade de ligação ao ligante.
CLONAGEM
Branca e Baglioni (1981) concluíram que os interferons de tipos I e II tem diferentes receptors. Celada e outros (1985) demonstraram e caracterizaram parcialmente o receptor do interferon gama nos macrófagos. O interferon gama tem um papel importante na ativação dos macrófagos nas defesas do hospedeiro.
Novick e outros (1987) purificaram e caracterizaram o receptor do interferon gama. Eles aludiram ao seu trabalho (Orchansky e outros, 1996) sugerindo que as células humanas de origem hematopoiética podem ter um receptor de IFNG que é estrutural e funcionalmente diferente do receptor em células de origem não hematopoiética. Retting e outros (1988) relataram resultados com um painel de 22 anticorpos monoclonais reconhecendo 21 antígenos humanos distintos na superfície celular. Os genes responsáveis por eles foram mapeados em múltiplos sítios. De acordo com a nomenclatura do mapeamento genético humano, os genes foram designados pelo nome do laboratório, Sloan-Kettering. Por exemplo, o MSK28 foi mapeado no cromossomo 6, nos mesmos arredores do receptor do interferon imune e pode de fato ser o mesmo antígeno.
Usando um anticorpo polyclonal anti-IFNGR1 para sondar a expressão de cDNA numa biblioteca de célula Raji, Aguet e outros (1988) isolaram um cDNA codificando o IFNGR1. Análises de sequência predisseram que a proteína de 489 aminoácidos contém um peptídio sinal no terminal N, sete sítios de glicosilação em potencia ligados ao N, várias regiões ricas em ser (serina) e thr (triptofano) indicativas de sítios de glicosilação potenciais ligados a O, um domínio transmembrana, e uma porção citoplasmática de aproximadamente 223 resíduos. Análises de Northern blot revelaram a expressão de um transcrito de 2,3 quilobases nos monócitos, linfócitos, placenta e numa linha de células de carcinoma do cólon. Análises de imuno-manchas mostraram a expressão de proteínas de 90 e 50 quilo-dáltons de ligação ao ligante, com a última assemelhada com um produto de degradação proteolítica que carece da região intra-celular.
FUNÇÃO DO GENE
Aguet e outros (1988) descobriram que a expressão do IFNGR1 nas células do camundongo insensitivas ao IFNG humano demonstraram alta afinidade de ligação ao IFNG.
Usando microscopia confocal, Maldonado e outros (2004) descobriram uma distribuição aleatória de Tcrb [omim 186930 receptor beta de célula T: Collins e outros (1984) assinaram o lócus do TCRB na região 7q22-7qter. São pré-requisitos para a expressão do gene da cadeia beta os rearranjos dos elementos das regiões variável (V), de diversidade (D) e de junção (J) dentro de uma unidade transcricional completada pelos éxons codificadores da região constante (C)], Il4r (147781), e Ifngr1 nos linfócitos T auxiliares (helper) naive (novos) de camundongos (Thp) permeabilizados e fixados conjugados com células dendríticas (DCs) maduras do baço. Nas células fixadas e permeabilizadas 30 minutos após a conjugação das Thp e DCs carregadas com antígeno, os autores observaram uma colocalização dependente de cálcio e Ifng do Tcrb e do Ifngr1, mas não do receptor de Il4, na interface entre as Thp e DC. Essa observação foi mais aparente no prono da Th1 da linhagem de camundongo C57B1/6 do que no prono da Th2 da linhagem BALB/c. Na presença da Il4 (omim147780), mas não da Il10 (omim 124092), a migração do Ifngr1 e a co-polarização foi completamente inibida. Em camudongos carecendo da sinalização da molécula Il4r (receptor de Il4 do camundongo), Stat6 [omim 601512: a STAT 6 é um membro da família das proteínas transdutoras de sinal e ativadoras de transcrição (STAT).
Usando um anti-soro específico para STAT6, Quelle e outros (1995) demonstraram que a STAT6 é rapidamente fosforilada na tirosina em seguida à estimulação de linhas celulares apropriadas com IL4 (147480) ou IL3 (147740), mas não é detectável fosforilada após a estimulação com IL2 (147680), IL12 (veja IL12A; 161560), ou eritropoetina (133170). Em contraste, as IL2, IL3 e eritropoetina (uma proteína que promove a eritropoese por estímulo à formação de pré-eritroblastos e liberação de reticulócitos da medula óssea, encontrada em vários tecidos e inclusive no plasma e na urina - Stedman) induziram a fosforilação da tirosina da STAT5 (601511), enquanto a IL12 unicamente induziu a fosforilação da tirosina na STAT4 (600558). A fosforilação indutível da tirosina da STAT6 requereu a região distante da membrana da cadeia alfa do receptor de IL4 (IL4R, 147781). Eles descobriram que esta região do receptor não é requerida para o crescimento da célula, demonstrando que a fosforilação da tirosina na STAT6 não contribui para a mitogênese.
A sobre-regulação de citocinas pró-inflamatórias na artrite reumatóide (RA; 180300) da sinovia e no flúido sinovial é uma característica da doença ativa e de intensa inflamação. Mediadores anti-inflamatórios também estão presentes e ativados na RA mas falham em contra-regular as citocinas pró-inflamatórias. Muller-Ladner e outros (2000) descobriram que a via IL4-STAT está ativada em pacientes com RA de curto prazo (menos de 1 ano) e de longo prazo (mais de dois anos) e pode contribuir para a regulação para menos da atividade imunológica na sinóvia sob RA.] o impedimento da copolarização de Tcrb/Ifngr1 foi abolida. Maldonado e outros (2004) propuseram que uma forte sinalização no TCR leva à acentuada co-polarização do IFNGR e à reunião do sinalossomo da Th1, o qual é estabilizado adicionalmente pela secreção do IFNG, a menos que um sinal inibitório, tal como a secreção da IL4 e a ativação da STAT6, ocorra e leve à reunião do sinalossoma da Th2. Eles concluíram que a sinapse imunológica pode estar envolvida no controle das decisões do destino da célula.
MAPEAMENTO
Através de estudos em células murinas e humanas hibridas, Fellous e outros (1985) sugeriram que o cromossomo 18 carrega o gene do receptor de interferon gama. Eles examinaram a capacidade dos interferons humanos induzirem os antígenos H-2 do camundongo nessas células híbridas. O cromossomo 18 humano foi requerido para a ação do interferon gama humano. Por outro lado, Rashidbaigi e outros (1986) concluíram que o receptor do IFNG ou sua sub-unidade de ligação é codificada por um gene no braço longo do cromossomo 6 (6q). Eles identificaram um complexo com peso molecular de 117.000 dáltons quando o DNA recombinante humano etiquetado com (32)P foi ligado em cruzamento com células humanas com disuccimidyl suberato [uma substância usada para:
- Ligação cruzada química de proteínas intracelulares anterior à lise celular e imunoprecipitação;
- Fixação das interações da proteína para permitir a identificação de interações protéicas fracas ou transitórias;
- ligação cruzada de proteínas para criar bioconjugados por via de reações de uma só etapa;
- Imobilização de proteínas sobre superfícies revestidas com amina.
http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02030236]. A formação do complexo foi inibida quando a ligação foi executada na presença de um excesso de IFNG humano. Células de ovário de camundongo de ramster chinês não apresentaram formação de complexos. Em estudos de células híbridas humanas e de ramster e humanas e de camundongos, eles mostraram que o 6q humano é necessário e suficiente para a formação dos complexos. Fellous (1986) relatou que ele tinha substituído as células somáticas híbridas com Rashidbaigi e concluído que de fato o cromossmo 6 está envolvido no controle genético do receptor do interferon gama humano, mas o cromossomo 18 também era nessessario. Jung e outros (1987) descobriram que a presença do cromossomo 6 nas células híbridas humanas e de camundongo era por si mesmo insuficiente para conferir sensitividade ao interferon imune humano como mensurado pela indução de HLA humano. O cromossomo humano 21 foi considerado o segundo cromossomo essencial para a indutibilidade do HLA. Resultados similares foram encontrados com as células somáticas híbridas de camundongo e humanas. Assim, ao menos duas etapas estão envolvidas na ação do interferon gama: a ligação do interferon gama ao seu receptor codificado pelo cromossomo 6 e o casamento desse evento de ligação através de um fator codificado pelo cromossomo 21 para disparar a ação biológica. Ambas as etapas foram demonstradas como específicas quanto às espécies. O achado de um elemento receptor no cromossomo 18 deve ser considerado inconsistente (Fellous e outros, 1985).
Através de análises de radiação híbrida, Aguet e outros (1988) mapearam o gene IFNGR1 no cromossomo 6q. Análises de Southern blot sugeriram que o IFNGR1 é um gene de cópia única. Le Coniat e outros (1989) confirmaram a assinatura no cromossomo 6 e regionalizaram o gene em 6q23-q24 por hibridização em sítio. Por fluorescência de hibridização em sítio, Papanicolaou e outros (1997) refinaram a assinatura do IFNGR1 em 6q24.1-q24.2.
Mariano e outros (1987) demonstraram que o gene do receptor do interferon imune do camundogo está no cromossomo 10. O cromossomo 10 do camundongo também carrega o gene do interferon gama, o qual, no homem, é codificado pelo cromossomo 12.
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=107470
*107470 RECEPTOR 1 DE INTERFERON GAMA; IFNGR1
Títulos alternatives; símbolos
AVP, TYPE IIANTIVIRAL PROTEIN, TYPE IIIMMUNE INTERFERON RECEPTOR 1CD119 ANTIGEN; CD119
Lócus de mapeamento genético 6q23-q24
(continuação)
GENÉTICA MOLECULAR
Levin e outros (1995) descreveram um grupo de crianças aparentadas de uma vila em Malta que pareciam ter um defeito imunológico familial autossômico recessivo os predispondo à infecção com uma amplitude de micobactéria (veja omim 209950). A despeito do tratamento intensivo, três dos quatro pacientes afetados faleceram e o sobrevivente tinha infecção persistente. Estudos imunológicos mostraram que as crianças afetadas tinham diminuída produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF, omim 191160) em resposta à endotoxina e uma falência em sobre-regular esta citocina em resposta ao interferon gama. Newport e outros (1996) desempenharam uma busca em todo o genoma usando marcadores de microssatélite para identificar uma região no 6q na qual as crianças afetadas fossem todas homozigotas para oito marcadores. Esse achado levou à focalização sobre o gene do receptor 1 do interferon gama, o qual é mapeado em 6q23-q24. Análises de sequência do cDNA para o gene revelaram uma mutação pontual no nucleotídeo 395 que introduziu um códon de finalização e resultou numa proteína truncada que carecia dos domínios transmembrana e citoplasmáticos.
A linhagem atenuada da Micobactéria do bacilo bovino Calmette-Guerin (BCG) é a vacina mais amplamente usada em todo o mundo. Jouanguy e outros (1996) notaram que na maioria das crianças, a inoculação da vacina de BCG vivo é fraca, embora ocasionalmente leve a uma adenite (inflamação do linfonodo ou glândula) benigna. Em raros casos, entretanto, a vacinação causa uma disseminada infecção por BCG, que pode ser letal. A maioria dessas crianças teve severa imunodeficiência combinada e algumas tiveram doença granulomatosa crônica. Raros casos de infecção por BCG também têm sido relatados e associação com AIDS. Entretanto, uma imunodeficiência específica pode ser identificada em somente a metade dos casos de infecção por BCG disseminada. Esses casos idiopáticos (refere-se a doença de causa desconhecida – Stedman) têm sido relatados a partir de muitos países com prevalência na Franca com ao menos 0,50 casos por um milhão de crianças vacinadas com BCG. Jouanguy e outros (1996) estabeleceram que uma alta taxa de consangüinidade (30%), formas familiais (17%) e a distribuição sexual equânime sustentam a hipótese de um novo tipo de defeito imune primário com um padrão de hereditariedade autossômico recessivo. As características patológicas e clínicas resultantes sugerem duas formas distintas de infecção por BCG idiopática. Granulomas tuberculóides bem circunscritos e bem diferenciados com poucas hastes de ácido estável visíveis estão associadas com um bom prognostico. Em contraste, na doença definida e pobremente diferenciada, granulomas semelhantes a leproma com muitos bacilos visíveis estão associados a conseqüências fatais, a despeito da terapia anti-micobacteriana. A segunda forma parece representar um defeito afetando uma etapa específica obrigatória e relativa à formação de um granuloma bactericida BCG. Nos camundongos nos quais o gene Ifngr1 ou o fator 1 regulatório do interferon gama (147475) tenha sido deletado, há um fracasso em controlar o crescimento da BCG (Dalton e outros, 1993). Camundongos tratados com anticorpos contra o fator de necrose tumoral alfa são suscetíveis à infecção por BCG, com a estrutura defeituosa do granuloma e um resultado fatal. Jouanguy e outros (1996) examinaram esses genes em uma criança com infecção idiopática por BCG disseminada e encontraram uma mutação no gene IFNGR1. A menina era filha de Tunisianos que eram primos-irmãos (paciente 16 de Casanova e outros, 1995). A paciente foi vacinada com BCG com a idade de um mês e foi saudável até a idade de dois meses e meio. Ela faleceu aos 10 meses de infecção por BCG com falência múltipla dos órgãos. Jouanguy e outros (1996) estabeleceram que a segregação intra-familiar de micro-satélites dos quais presumir-se-ia mostrarem homozigosidade para genes intimamente ligados ao lócus afetado pontuaram para o lócus do IFNGR1 como um provável sítio de mutação. A deleção do nucleotídeo 131 na região codificadora foi encontrada. A deleção da C nesta posição causou uma sequência sem registro (que altera o código do amioácido na tradução para sem sentido) e levou a um códon finalizador prematuro (TAA) nos nucleotídeos de 187 a 189 dessa sequência. Ambas a deleção e o códon de finalização foram localizados na região que codifica para a porção terminal N (amina) do domínio extracelular do receptor.
Jouanguy e outros (1997) descreveram parentes com deficiência parcial no receptor 1 de IFN-gama: uma criança estava angustiada por infecção disseminada de BCG com granulomas tuberculóides, e uma prima, que não tinha sido previamente inoculada com BCG, teve tuberculose clínica. Ambos responderam aos anti-microbianos e permaneceram bem sem terapia profilática. A reduzida resposta ao IFN-gama foi documentada nas células B por transdutor de sinal e translocação nuclear ativador de transcrição 1, nos fibroblastos por indução do HLA de classe II na superfície celular, e nos monócitos pela indução da CD64 na superfície celular e secreção de TNF-alfa. Enquanto as células de crianças saudáveis responderam ao TNF-gama ainda em baixas concentrações, e as células de uma criança com deficiência completa do receptor de IFN-gama não responderam ao IFN-gama ainda que em altas concentrações, as células das duas primas não respoderam às concentrações baixa e média, mas responderam a altas concentrações de IFN-gama. Jouanguy e outros (1997) identificaram uma mutação de sentido trocado no gene do IFNGR1.
Esse papel patogênico foi averiguado por complementação molecular. Assim, enquanto a completa deficiência do receptor nos parentes previamente identificados causava infecção lepromatóide fatal por BCG e infecções micobacterians não tuberculóides disseminada, a deficiência parcial nesses parentes causou infecção tuberculóide por BCG curável e tuberculose clínica. Em sustentação com a observação de que somente uma minoria de indivíduos infectados com M. tuberculosis desenvolvem a doença clínica, é tentador especular que a tuberculose clínica de outra maneira em indivíduos saudáveis na população em geral possa estar associada com uma deficiência parcial no receptor de interferon-gama. Como apontado por Jouanguy e outros (1997), uma amplitude de mutações diferentes no gene IFNGR1 tem sido identificada, causando uma gama de ausência completa de expressão a alterações sutis na função do receptor. A homozigosidade ou hererosigozidade composta para mutações causando redução funcional moderada do receptor pode ser prevalente em diferentes populações étnicas e podem ajudar a explicar a variação na suscetibilidade à tuberculose dentro da população em geral.
Jouanguy e outros (1999) descreveram 18 pacientes com suscetibilidade herdada esporádica ou dominantemente para infecções causadas pela micobactéria fracamente virulenta. Os pacientes, incluindo 9 de 3 famílias não relacionadas e 9 casos esporádicos, era heterozigotos para tanto a deleção de um par de bases (um caso) ou para deleção de quatro pares de base (todos os outros) no nucleotídeo 818 do INFGR1. Existiam 12 eventos mutacionais independentes em um único sítio de mutação. Definindo um pequeno ponto quente de deleção. Análises de sequências vizinhas, as quais apresentam duas repetições diretas na visinhança próxima (808-812 e 817-821) favorecem um pequeno modelo de deleção de eventos de deslize e pareamento errado durante a duplicação. Os alelos mutantes resutaram em mRNA estáveis que codificavam receptores de interferon-gama na superfície celular que carecia do domínio intra-citoplasmático.
Jouanguy e outros (2000) descreveram quarto pacientes de três famílias na relacionadas com mutações patogênicas no gene IFNGR1 que não afeta a expressão do IFNGR1 na superfície celular mas enfraquece sua ligação ao IFNG, resultando na suscetbilidade tanto para a BCG quanto para micobactéria não tuberculosa. Análises de fluxo citométrico demonstraram a ligação anormal a um painel de oito anticorpos monoclonais anti-IFBGR1 em três dos quatro pacientes. A análise de ligação com IFNG radio-etiquetado mostrou uma ausência de ligação pelas células dos pacientes. Análises de EMSA não detectaram nenhuma proteína de ligação ao motivo GAS ou a translocação da STAT1 nas células dos pacientes, ainda com altas concentrações de IFNG. Análises FACS também revelaram uma falta de sobre-regulação da HLA-DR em resposta ao IFNG. Jouanguy e outros (2000) concluíram que os pacientes tinham completa deficiência do IFNGR1 com expressão normal da proteína na superfície.
A doença letal devida à fibrose da periporta (que circunda a veia porta) hepática ocorre em 2 a 10% dos sujeitos infectados por Esquistossoma masoni (trematódeo de 0,6 a 1,4 cm de comprimento que se hospeda em caramujos de água doce) em regiões endêmicas como o Sudão. Os níveis de infecção por Esquistossoma mansoni têm sido mostrados por serem controlados por um lócus (SM1, omim 181460) em 5q21-q33. Para investigar o controle genético da fibrose hepática severa (estimada por exame de ultrassom) causando a hipertensão da veia porta, Dessein e outros (1999) desempenharam uma análise de segregação em 65 linhagens descendentes sudanesas da mesma vila. Os resultados proporcionaram evidência para um gene co-dominante principal, com a freqüência de 0,16 do alelo A predispondo à fibrose periportal avançada. Para homens AA, mulheres AA e homens Aa, uma incidência de 50% foi atingida após, 9, 14 e 19 anos de residência na área, respectivamente, enquanto para outros sujeitos a incidência permaneceu menor do que 0,02 a após 20 anos de exposição. Análises de ligação desempenhadas em quatro regiões candidatas mostraram que esse lócus principal mapeia em 6q22-q23 e que está intimamente ligado ao gene IFNGR1, o qual codifica o receptor da poderosa citocina antifibrogênica, o interferon gama. Os resultados mostraram que os níveis de infecção e a fibrose hepática avançada na esquistossomose são controlados por lócus distintos; eles sugeriram que os polimorfismos dentro do gene IFNGR1 podem determinar a severidade da doença hepática devida à infecção por S.mansoni e que o gene IFNGR1 é um forte candidato para o controle da fibrose anormal observada em outras doenças.
Numa revisão sobre as doenças de imunodeficiência causadas por defeitos nos fagócitos, Kekstrom-Himes e Gallin (2000) apontaram que o estabelecimento tardio da osteomielite está associado com defeitos autossômicos dominantes no receptor de interferon gama.
O Helicobacter pylori é considerado o mais agente infeccioso mais prevalente nos humanos (veja omim 600263), e ele causa inflamação gástrica, úlcera gastroduodenal, e risco de câncer gástrico. Thye e outros (2003) desempenharam análises de ligação do genoma todo de parentes senegaleses fenotipados para a imunoglobulina G no soro reativa a H.pylori. Um lod score (logarítimo das chances a favor da ligação genética) multipontuado de 3,1 foi obtido no IFNGR1. A sequência do IFNGR1 revelou três variantes que foram encontradas em associação com altas concentrações de anticorpos, incluindo uma transição de C para T no nucleotídeo 56. A inclusão dessas variações em análises de ligação elevou o lod score para 4,2. As variantes prevalesciam mais em africanos do que em caucasianos. Os achados indicaram que a sinalização do interferon gama atua num papel essencial na infecção por H.pylori e contribuiu para a explicação da observação sobre a alta prevalência e relativamente baixa patogenicidade do H.pylori na África.
Num estudo de controle de caso de 682 pacientes de tuberculose (TB; veja omim 607948) e 619 controles de três países do leste da África (Gâmbia, Guiné-Bissau e Guiné Francesa), Cooke e outros (2006) descobriram que o genótipo -56CC do promotor do IFNGR1 com o SNP (polimorfismo de um só nucleotídeo) -56C-T estava associado com a proteção à tuberculose. Cooke e outros (2006) concluíram que a variação no promotor do IFNGR1 atua num papel na patogênese da TB.
Storgaard e outros (2006) relataram sobre um homem que eles descreveram antes em 1981 enquanto ainda era um garoto de 10 anos de idade com osteomielite associada a micobactéria intracelular e citotoxidade deprimida de monócitos. Trinta meses de tratamento anti-tuberculose resolviam a condição até os 30 anos, quando foi diagnosticado com abscessos disseminados (no baço e linfonodos) de M. avium. Oito meses de tratamento anti-tuberculose proporcionaram a completa recuperação. O homem era HIV negativo. Análises de citometria de fluxo mostraram que ele tinha sobre-regulado a expressão do IFNGR1 nos linfócitos, monócitos e granulócitos, mas a produção de STAT1 fosforilada após a estimulação com IFNG estava reduzida. Storgaard e outros (2006) identificaram uma mutação pontual heterozígua (794delT) no homem e em sua filha, que desevolveu osteomielite micobacteriana não tuberculosa aos 7 anos de idade. Eles notaram que foi possível fazer o diagnóstico genético 25 anos após o primeiro episódio da doença e um ano antes das manifestações clínicas na filha.
Como um acompanhamento de seus estudos de exame dons níveis de TNF (fator de necrose tumoral) em resposta ao antígeno filtrado em cultura d M. tuberculosis como um modelo fenotípico intermediário para suscetibilidade à TB em uma população de Uganda (veja omim 607948), Stein e outros (2007) estudaram genes relacionados à regulação do TNF por ligação posicional candidata seguida por análises de associação de SNP com base na família. Eles descobriram que os genes da IL10, do IFNGR1 e do TNFR1 (omim 191190) estavam ligados e associados a ambos tuberculose e fator de necrose tumoral. Essas associações eram para TB ativa mais do que para a suscetibilidade à infecção latente.
CORRELAÇÕES GENÓTIPO/FENÓTIPO
Dorman e outros (2004) compararam as características clínicas das deficiências recessiva e dominante do IFNGR1 usando um grupo de pacientes de todas as partes do mundo. Eles avaliaram os pacientes por estudos de histórico médico, genéticos e imunológicos. A deficiência recessiva, a qual Dorman e outros (2004) identificaram em 22 pacientes, resulta na completa perda da resposta celular ao IFNG e na ausência da expressão do IFNGR1. A deficiência dominante, a qual eles identificaram em 38 pacientes, é tipicamente devida a truncamentos no domínio citoplasmático resultando na acumulação de proteínas do IFNGR1 não funcional que podem impedir a função de moléculas codificadas por alelos de tipo selvagem, dessa forma levando à diminuída mas não ausente resposta ao IFNG. Embora os fenótipos clínicos estejam relacionados, Dorman e outros (2004) descobriram que pacientes com a forma recessiva tinham uma idade de estabelecimento mais precoce ( 3 versus 13 anos), mais episódios de doença micobacteriana (19 versus 8 por 100 pessoas em um ano de observação), doença micobacteriana mais severa (envolvendo 4 versus 2 órgãos), intervalos livres de doenças mais curtos (1,6 versus 7,2 anos), e probabilidade de sobrevivência Kaplan-Meier (índice) mais baixa. Os pacientes recessivos também tinham doenças mais freqüentes a partir do rápido crescimento de micobactérias. Dorman e outros (2004) concluíram que existe uma forte correlação entre o genótipo IFNGR1, as características clínicas da doença. E a resposta celular ao IFNG. Eles sugeriram que defeitos sutis na produção do IFNG, sinalização ou vias relacionadas podem predispor a doenças causadas por micobactérias virulentas, incluindo a M. tuberculose.
MODELO ANIMAL
Shankaran e outros (2001) descobriram que camundongos carentes do gene Rag2 específico dos linfócitos, do fator de transcrição do receptor de sinal de Ifn Stat1 (omim 600555), do Ifngr1, ou de ambas Rag2 e Stat1, são significativamente mais suscetíveis à formação de tumor induzida quimicamente do que os camundongos de tipo selvagem, sugerindo que células T, NKT, e/ou B são essenciais para suprimir o desenvolvimento de tumores induzidos quimicamente. Tumores espontaneamente malignos não ocorrem em camundongos de tipo selvagem, ocorreram tarde em metade dos camundongos carentes tanto da Rag2 ou da Stat1, mas ocorreram cedo em 82% dos camundongos carentes dos dois genes. Tumores induzidos quimicamente transplantados de camundongos deficientes em linfócito (Shankaran e outros, 2001) ou de camundongos não respondedores a Ifng (Kaplan e outros, 1998), mas não tumores de hospedeiros imunocompetentes, foram rejeitados pelo camundongo de tipo selvagem, indicando que tumores de camundongos imunodeficientes são mais imunogênicos e que os linfócitos de a via de sinalização IFNG/STAT1 colaboram para formar o fenótipo imunogênico de tumores que eventualmente se formam em hospedeiros imunocompetentes. Shankaran e outros (2001) propuseram que tumores são impressos pelo meio ambiente imunológico no qual eles formam e que a “imuno-edição do câncer” mais do que a “imunovigilância”descreve melhor as ações protetoras e esculturais da resposta imune em tumores em desenvolvimento.
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=107470
Títulos alternatives; símbolos
AVP, TYPE IIANTIVIRAL PROTEIN, TYPE IIIMMUNE INTERFERON RECEPTOR 1CD119 ANTIGEN; CD119
Lócus de mapeamento genético 6q23-q24
(continuação)
GENÉTICA MOLECULAR
Levin e outros (1995) descreveram um grupo de crianças aparentadas de uma vila em Malta que pareciam ter um defeito imunológico familial autossômico recessivo os predispondo à infecção com uma amplitude de micobactéria (veja omim 209950). A despeito do tratamento intensivo, três dos quatro pacientes afetados faleceram e o sobrevivente tinha infecção persistente. Estudos imunológicos mostraram que as crianças afetadas tinham diminuída produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF, omim 191160) em resposta à endotoxina e uma falência em sobre-regular esta citocina em resposta ao interferon gama. Newport e outros (1996) desempenharam uma busca em todo o genoma usando marcadores de microssatélite para identificar uma região no 6q na qual as crianças afetadas fossem todas homozigotas para oito marcadores. Esse achado levou à focalização sobre o gene do receptor 1 do interferon gama, o qual é mapeado em 6q23-q24. Análises de sequência do cDNA para o gene revelaram uma mutação pontual no nucleotídeo 395 que introduziu um códon de finalização e resultou numa proteína truncada que carecia dos domínios transmembrana e citoplasmáticos.
A linhagem atenuada da Micobactéria do bacilo bovino Calmette-Guerin (BCG) é a vacina mais amplamente usada em todo o mundo. Jouanguy e outros (1996) notaram que na maioria das crianças, a inoculação da vacina de BCG vivo é fraca, embora ocasionalmente leve a uma adenite (inflamação do linfonodo ou glândula) benigna. Em raros casos, entretanto, a vacinação causa uma disseminada infecção por BCG, que pode ser letal. A maioria dessas crianças teve severa imunodeficiência combinada e algumas tiveram doença granulomatosa crônica. Raros casos de infecção por BCG também têm sido relatados e associação com AIDS. Entretanto, uma imunodeficiência específica pode ser identificada em somente a metade dos casos de infecção por BCG disseminada. Esses casos idiopáticos (refere-se a doença de causa desconhecida – Stedman) têm sido relatados a partir de muitos países com prevalência na Franca com ao menos 0,50 casos por um milhão de crianças vacinadas com BCG. Jouanguy e outros (1996) estabeleceram que uma alta taxa de consangüinidade (30%), formas familiais (17%) e a distribuição sexual equânime sustentam a hipótese de um novo tipo de defeito imune primário com um padrão de hereditariedade autossômico recessivo. As características patológicas e clínicas resultantes sugerem duas formas distintas de infecção por BCG idiopática. Granulomas tuberculóides bem circunscritos e bem diferenciados com poucas hastes de ácido estável visíveis estão associadas com um bom prognostico. Em contraste, na doença definida e pobremente diferenciada, granulomas semelhantes a leproma com muitos bacilos visíveis estão associados a conseqüências fatais, a despeito da terapia anti-micobacteriana. A segunda forma parece representar um defeito afetando uma etapa específica obrigatória e relativa à formação de um granuloma bactericida BCG. Nos camundongos nos quais o gene Ifngr1 ou o fator 1 regulatório do interferon gama (147475) tenha sido deletado, há um fracasso em controlar o crescimento da BCG (Dalton e outros, 1993). Camundongos tratados com anticorpos contra o fator de necrose tumoral alfa são suscetíveis à infecção por BCG, com a estrutura defeituosa do granuloma e um resultado fatal. Jouanguy e outros (1996) examinaram esses genes em uma criança com infecção idiopática por BCG disseminada e encontraram uma mutação no gene IFNGR1. A menina era filha de Tunisianos que eram primos-irmãos (paciente 16 de Casanova e outros, 1995). A paciente foi vacinada com BCG com a idade de um mês e foi saudável até a idade de dois meses e meio. Ela faleceu aos 10 meses de infecção por BCG com falência múltipla dos órgãos. Jouanguy e outros (1996) estabeleceram que a segregação intra-familiar de micro-satélites dos quais presumir-se-ia mostrarem homozigosidade para genes intimamente ligados ao lócus afetado pontuaram para o lócus do IFNGR1 como um provável sítio de mutação. A deleção do nucleotídeo 131 na região codificadora foi encontrada. A deleção da C nesta posição causou uma sequência sem registro (que altera o código do amioácido na tradução para sem sentido) e levou a um códon finalizador prematuro (TAA) nos nucleotídeos de 187 a 189 dessa sequência. Ambas a deleção e o códon de finalização foram localizados na região que codifica para a porção terminal N (amina) do domínio extracelular do receptor.
Jouanguy e outros (1997) descreveram parentes com deficiência parcial no receptor 1 de IFN-gama: uma criança estava angustiada por infecção disseminada de BCG com granulomas tuberculóides, e uma prima, que não tinha sido previamente inoculada com BCG, teve tuberculose clínica. Ambos responderam aos anti-microbianos e permaneceram bem sem terapia profilática. A reduzida resposta ao IFN-gama foi documentada nas células B por transdutor de sinal e translocação nuclear ativador de transcrição 1, nos fibroblastos por indução do HLA de classe II na superfície celular, e nos monócitos pela indução da CD64 na superfície celular e secreção de TNF-alfa. Enquanto as células de crianças saudáveis responderam ao TNF-gama ainda em baixas concentrações, e as células de uma criança com deficiência completa do receptor de IFN-gama não responderam ao IFN-gama ainda que em altas concentrações, as células das duas primas não respoderam às concentrações baixa e média, mas responderam a altas concentrações de IFN-gama. Jouanguy e outros (1997) identificaram uma mutação de sentido trocado no gene do IFNGR1.
Esse papel patogênico foi averiguado por complementação molecular. Assim, enquanto a completa deficiência do receptor nos parentes previamente identificados causava infecção lepromatóide fatal por BCG e infecções micobacterians não tuberculóides disseminada, a deficiência parcial nesses parentes causou infecção tuberculóide por BCG curável e tuberculose clínica. Em sustentação com a observação de que somente uma minoria de indivíduos infectados com M. tuberculosis desenvolvem a doença clínica, é tentador especular que a tuberculose clínica de outra maneira em indivíduos saudáveis na população em geral possa estar associada com uma deficiência parcial no receptor de interferon-gama. Como apontado por Jouanguy e outros (1997), uma amplitude de mutações diferentes no gene IFNGR1 tem sido identificada, causando uma gama de ausência completa de expressão a alterações sutis na função do receptor. A homozigosidade ou hererosigozidade composta para mutações causando redução funcional moderada do receptor pode ser prevalente em diferentes populações étnicas e podem ajudar a explicar a variação na suscetibilidade à tuberculose dentro da população em geral.
Jouanguy e outros (1999) descreveram 18 pacientes com suscetibilidade herdada esporádica ou dominantemente para infecções causadas pela micobactéria fracamente virulenta. Os pacientes, incluindo 9 de 3 famílias não relacionadas e 9 casos esporádicos, era heterozigotos para tanto a deleção de um par de bases (um caso) ou para deleção de quatro pares de base (todos os outros) no nucleotídeo 818 do INFGR1. Existiam 12 eventos mutacionais independentes em um único sítio de mutação. Definindo um pequeno ponto quente de deleção. Análises de sequências vizinhas, as quais apresentam duas repetições diretas na visinhança próxima (808-812 e 817-821) favorecem um pequeno modelo de deleção de eventos de deslize e pareamento errado durante a duplicação. Os alelos mutantes resutaram em mRNA estáveis que codificavam receptores de interferon-gama na superfície celular que carecia do domínio intra-citoplasmático.
Jouanguy e outros (2000) descreveram quarto pacientes de três famílias na relacionadas com mutações patogênicas no gene IFNGR1 que não afeta a expressão do IFNGR1 na superfície celular mas enfraquece sua ligação ao IFNG, resultando na suscetbilidade tanto para a BCG quanto para micobactéria não tuberculosa. Análises de fluxo citométrico demonstraram a ligação anormal a um painel de oito anticorpos monoclonais anti-IFBGR1 em três dos quatro pacientes. A análise de ligação com IFNG radio-etiquetado mostrou uma ausência de ligação pelas células dos pacientes. Análises de EMSA não detectaram nenhuma proteína de ligação ao motivo GAS ou a translocação da STAT1 nas células dos pacientes, ainda com altas concentrações de IFNG. Análises FACS também revelaram uma falta de sobre-regulação da HLA-DR em resposta ao IFNG. Jouanguy e outros (2000) concluíram que os pacientes tinham completa deficiência do IFNGR1 com expressão normal da proteína na superfície.
A doença letal devida à fibrose da periporta (que circunda a veia porta) hepática ocorre em 2 a 10% dos sujeitos infectados por Esquistossoma masoni (trematódeo de 0,6 a 1,4 cm de comprimento que se hospeda em caramujos de água doce) em regiões endêmicas como o Sudão. Os níveis de infecção por Esquistossoma mansoni têm sido mostrados por serem controlados por um lócus (SM1, omim 181460) em 5q21-q33. Para investigar o controle genético da fibrose hepática severa (estimada por exame de ultrassom) causando a hipertensão da veia porta, Dessein e outros (1999) desempenharam uma análise de segregação em 65 linhagens descendentes sudanesas da mesma vila. Os resultados proporcionaram evidência para um gene co-dominante principal, com a freqüência de 0,16 do alelo A predispondo à fibrose periportal avançada. Para homens AA, mulheres AA e homens Aa, uma incidência de 50% foi atingida após, 9, 14 e 19 anos de residência na área, respectivamente, enquanto para outros sujeitos a incidência permaneceu menor do que 0,02 a após 20 anos de exposição. Análises de ligação desempenhadas em quatro regiões candidatas mostraram que esse lócus principal mapeia em 6q22-q23 e que está intimamente ligado ao gene IFNGR1, o qual codifica o receptor da poderosa citocina antifibrogênica, o interferon gama. Os resultados mostraram que os níveis de infecção e a fibrose hepática avançada na esquistossomose são controlados por lócus distintos; eles sugeriram que os polimorfismos dentro do gene IFNGR1 podem determinar a severidade da doença hepática devida à infecção por S.mansoni e que o gene IFNGR1 é um forte candidato para o controle da fibrose anormal observada em outras doenças.
Numa revisão sobre as doenças de imunodeficiência causadas por defeitos nos fagócitos, Kekstrom-Himes e Gallin (2000) apontaram que o estabelecimento tardio da osteomielite está associado com defeitos autossômicos dominantes no receptor de interferon gama.
O Helicobacter pylori é considerado o mais agente infeccioso mais prevalente nos humanos (veja omim 600263), e ele causa inflamação gástrica, úlcera gastroduodenal, e risco de câncer gástrico. Thye e outros (2003) desempenharam análises de ligação do genoma todo de parentes senegaleses fenotipados para a imunoglobulina G no soro reativa a H.pylori. Um lod score (logarítimo das chances a favor da ligação genética) multipontuado de 3,1 foi obtido no IFNGR1. A sequência do IFNGR1 revelou três variantes que foram encontradas em associação com altas concentrações de anticorpos, incluindo uma transição de C para T no nucleotídeo 56. A inclusão dessas variações em análises de ligação elevou o lod score para 4,2. As variantes prevalesciam mais em africanos do que em caucasianos. Os achados indicaram que a sinalização do interferon gama atua num papel essencial na infecção por H.pylori e contribuiu para a explicação da observação sobre a alta prevalência e relativamente baixa patogenicidade do H.pylori na África.
Num estudo de controle de caso de 682 pacientes de tuberculose (TB; veja omim 607948) e 619 controles de três países do leste da África (Gâmbia, Guiné-Bissau e Guiné Francesa), Cooke e outros (2006) descobriram que o genótipo -56CC do promotor do IFNGR1 com o SNP (polimorfismo de um só nucleotídeo) -56C-T estava associado com a proteção à tuberculose. Cooke e outros (2006) concluíram que a variação no promotor do IFNGR1 atua num papel na patogênese da TB.
Storgaard e outros (2006) relataram sobre um homem que eles descreveram antes em 1981 enquanto ainda era um garoto de 10 anos de idade com osteomielite associada a micobactéria intracelular e citotoxidade deprimida de monócitos. Trinta meses de tratamento anti-tuberculose resolviam a condição até os 30 anos, quando foi diagnosticado com abscessos disseminados (no baço e linfonodos) de M. avium. Oito meses de tratamento anti-tuberculose proporcionaram a completa recuperação. O homem era HIV negativo. Análises de citometria de fluxo mostraram que ele tinha sobre-regulado a expressão do IFNGR1 nos linfócitos, monócitos e granulócitos, mas a produção de STAT1 fosforilada após a estimulação com IFNG estava reduzida. Storgaard e outros (2006) identificaram uma mutação pontual heterozígua (794delT) no homem e em sua filha, que desevolveu osteomielite micobacteriana não tuberculosa aos 7 anos de idade. Eles notaram que foi possível fazer o diagnóstico genético 25 anos após o primeiro episódio da doença e um ano antes das manifestações clínicas na filha.
Como um acompanhamento de seus estudos de exame dons níveis de TNF (fator de necrose tumoral) em resposta ao antígeno filtrado em cultura d M. tuberculosis como um modelo fenotípico intermediário para suscetibilidade à TB em uma população de Uganda (veja omim 607948), Stein e outros (2007) estudaram genes relacionados à regulação do TNF por ligação posicional candidata seguida por análises de associação de SNP com base na família. Eles descobriram que os genes da IL10, do IFNGR1 e do TNFR1 (omim 191190) estavam ligados e associados a ambos tuberculose e fator de necrose tumoral. Essas associações eram para TB ativa mais do que para a suscetibilidade à infecção latente.
CORRELAÇÕES GENÓTIPO/FENÓTIPO
Dorman e outros (2004) compararam as características clínicas das deficiências recessiva e dominante do IFNGR1 usando um grupo de pacientes de todas as partes do mundo. Eles avaliaram os pacientes por estudos de histórico médico, genéticos e imunológicos. A deficiência recessiva, a qual Dorman e outros (2004) identificaram em 22 pacientes, resulta na completa perda da resposta celular ao IFNG e na ausência da expressão do IFNGR1. A deficiência dominante, a qual eles identificaram em 38 pacientes, é tipicamente devida a truncamentos no domínio citoplasmático resultando na acumulação de proteínas do IFNGR1 não funcional que podem impedir a função de moléculas codificadas por alelos de tipo selvagem, dessa forma levando à diminuída mas não ausente resposta ao IFNG. Embora os fenótipos clínicos estejam relacionados, Dorman e outros (2004) descobriram que pacientes com a forma recessiva tinham uma idade de estabelecimento mais precoce ( 3 versus 13 anos), mais episódios de doença micobacteriana (19 versus 8 por 100 pessoas em um ano de observação), doença micobacteriana mais severa (envolvendo 4 versus 2 órgãos), intervalos livres de doenças mais curtos (1,6 versus 7,2 anos), e probabilidade de sobrevivência Kaplan-Meier (índice) mais baixa. Os pacientes recessivos também tinham doenças mais freqüentes a partir do rápido crescimento de micobactérias. Dorman e outros (2004) concluíram que existe uma forte correlação entre o genótipo IFNGR1, as características clínicas da doença. E a resposta celular ao IFNG. Eles sugeriram que defeitos sutis na produção do IFNG, sinalização ou vias relacionadas podem predispor a doenças causadas por micobactérias virulentas, incluindo a M. tuberculose.
MODELO ANIMAL
Shankaran e outros (2001) descobriram que camundongos carentes do gene Rag2 específico dos linfócitos, do fator de transcrição do receptor de sinal de Ifn Stat1 (omim 600555), do Ifngr1, ou de ambas Rag2 e Stat1, são significativamente mais suscetíveis à formação de tumor induzida quimicamente do que os camundongos de tipo selvagem, sugerindo que células T, NKT, e/ou B são essenciais para suprimir o desenvolvimento de tumores induzidos quimicamente. Tumores espontaneamente malignos não ocorrem em camundongos de tipo selvagem, ocorreram tarde em metade dos camundongos carentes tanto da Rag2 ou da Stat1, mas ocorreram cedo em 82% dos camundongos carentes dos dois genes. Tumores induzidos quimicamente transplantados de camundongos deficientes em linfócito (Shankaran e outros, 2001) ou de camundongos não respondedores a Ifng (Kaplan e outros, 1998), mas não tumores de hospedeiros imunocompetentes, foram rejeitados pelo camundongo de tipo selvagem, indicando que tumores de camundongos imunodeficientes são mais imunogênicos e que os linfócitos de a via de sinalização IFNG/STAT1 colaboram para formar o fenótipo imunogênico de tumores que eventualmente se formam em hospedeiros imunocompetentes. Shankaran e outros (2001) propuseram que tumores são impressos pelo meio ambiente imunológico no qual eles formam e que a “imuno-edição do câncer” mais do que a “imunovigilância”descreve melhor as ações protetoras e esculturais da resposta imune em tumores em desenvolvimento.
FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=107470
terça-feira, 21 de julho de 2009
RNA transferidor (tRNA)
O RNA transferidor (abreviado tRNA) é uma pequena molécula de RNA (aproximadamente 74 a 95 nucleotídeos) que transfere um aminoácido ativo específico para uma cadeia polipeptídica em crescimento no sítio de síntese de proteínas do ribossomo. Ele tem um sítio no terminal 3’ para a fixação do aminoácido. Essa ligação covalente é catalisada por uma sintetase de tRNA aminoacil (tRNA com aminoácido). Ele também contam uma região de três bases chamada anticódon que pode parear as bases às três bases correspondentes à região código de três bases no mRNA. Cada tipo de molécula de tRNA pode ser afixada a um tipo de aminoácido, mas por o código genético conter múltiplos códons que especificam o mesmo aminoácido, as moléculas de tRNA carregando diferentes anti-códons também podem carregar o mesmo aminoácido.
ESTRUTURA
O tRNA tem uma estrutura primária, uma estrutura secundária (usualmente visualizada como estrutura de folha de cravo), e a estrutura terciária (todos os tRNAs tem uma estrutura em 3D em forma de L que as permite encaixar para dentro dos sítios P e A do ribossomo).
1. O grupo fosfato no terminal 5’.
2. O braço aceptor é uma haste de 7 pares de base feita pelo pareamento de bases dos nucleotídeos do terminal 5’ com os nucleotídeos do terminal 3’ (o qual contém o grupo terminal CCA 3’ usado para fixar o aminoácido). O braço aceptor pode conter pares de base não tornadas clássicas como as de Watson e Crick.
3. O caule CCA é uma sequência CCA no final 3’ da molécula de tRNA. Esta sequencia é importante para o reconhecimento do tRNA por enzimas críticas para a tradução. Nos procariotos, a sequencia CCA é transcrita. Nos eucariotos, a sequência CCA é adicionada durante o processamento e dessa forma não aparece no gene tRNA.
4. O braço D é uma haste de 4 pares de base finalizando em um laço que frequentemente contém dihidrouridina.
5. O braço anticódon é uma haste de 5 pares de base cujo laço contém o anticódon. Ele também contém um Y que encontra-se com um nucleotídeo de purina modificado.
6. O braço T é uma haste de 5 pares de base contendo a sequência TψC onde ψ é uma pseudouridina.
7. As bases que vão sendo modificadas, especialmente por metilação, ocorrem em diferentes posições fora do anticódon. A primeira base anticódon é algumas vezes modificada em inosina (derivada da adenina) ou pseudouridina (derivada do uracil).
ANTICODON
Um anticódon é uma unidade feita de três nucleotídeos que correspondem a três bases do códon do mRNA. Cada tRNA contém um anticódon específico com uma sequência tripla que pode parear bases com um ou mais anticódons para um aminoácido. Por exemplo, um dos códons para lisina é AAA; o anticódon de um tRNA lisina deverá ser UUU. Alguns anticódons podem parear com mais de um códon devido ao fenômeno conhecido como pareamento bamboleante de bases. Frequentemente, o primeiro nucleotídeo do anti-códon é um dos dois não encontrados no mRNA: uma inosina ou uma pseudouridina, os quais podem fazer pontes de hidrogênio com mais de uma base na posição correspondente do códon. No código genético, é comum para um único aminoácido ser especificado por todas as quatro possibilidades na terceira posição; por exemplo, o aminoácido glicina é codificado pelas sequências códon GGU, GGC, GGA, e GGG.
Para gerar uma correspondência de um para um entre as moléculas de tRNA e códons que especificam aminoácidos, 61 tipos de moléculas de tRNA seriam requeridas por célula. Entretanto, muitas células contêm menos que 61 tipos de tRNA pois a base bamboleante é capaz de ligar-se à várias, embora não necessariamente todos os códons que especificam um aminoácido em particular.
AMINOACILAÇÃO
A aminoacilação é o processo de adição de um grupo aminoacil a um composto. Isso gera as moléculas de tRNA com seus finais 3’ CCA covalentemente ligados a um aminoácido.
Cada tRNA é aminoacilado (ou carregado) com um aminoácido específico por uma sintetase de tRNA aminoacil. Existe normalmente uma única sintetase de tRNA aminoacil para cada aminoácido, a despeito do fato de que elas possam ser para mais de um tRNA e para mais de um anticódon, por aminoácido. O reconhecimento do tRNA apropriado pelas sintetases não é mediado somente pelo anti-códon, o braço aceptor frequentemente atua num papel proeminente.
REAÇÃO
1. Aminoácido + ATP à aminoacil-AMP+PPi
2. Aminoacil-AMP + tRNA à aminoacil-tRNA+AMP
Algumas vezes, certos organismos podem ter uma ou mais sintetases de tRNA aminoacil perdidas. Isso leva a um erro no provisionamento do tRNA com um aminoácido quimicamente aparentado. O aminoácido correto é produzido por enzimas que transformam o aminoácido erradamente carregado no correto.
Por exemplo, o Helicobacter pylori tem uma sintetase de tRNA glutaminil perdida, então, a sintetase de tRNA glutamato carrega erradamente o tRNA glutamina (tRNA-Gln) com glutamato. Uma amidotransferase então converte a cadeia de lado ácido do glutamato por amida, formando o gln-tRNA-Gln corretamente carregado.
LIGAÇÃO AO RIBOSSOMO
O ribossomo tem três sítios de ligação para as moléculas de tRNA: o sítio A (aminoacil), o sítio P, (peptidil) e os sítios E (exit) de saída. Durante a tradução o sítio A liga-se a um tRNA-aminoacil a caminho como direcionado pelo códon subsequentemente ocupando este sítio. Este códon especifica o próximo aminoácido a ser adicionado à cadeia peptídica em crescimento. O sítio só trabalha após o primeiro tRNA aminoacil ter se fixado no sítio P. O códon do sítio P é ocupado por um tRNA-peptidil que é um tRNA com múltiplos aminoácidos fixados como uma longa da cadeia. O sítio P é efetivamente o primeiro a ligar-se ao tRNA aminoacil. Esse tRNA no sítio P carrega a cadeia de aminoácidos que esta sendo sintetizada. O sítio E é ocupado pelo tRNA vazio à sua saída do ribossomo.
Reference "Transfer RNA." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 12 Jun 2009, 10:13 UTC. 12 Jun 2009 <http://www.feedblitz.com/t.asp?/197847/18313577/http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Transfer_RNA&oldid=295950356>.
http://www.bioisolutions.blogspot.com/
O RNA transferidor (abreviado tRNA) é uma pequena molécula de RNA (aproximadamente 74 a 95 nucleotídeos) que transfere um aminoácido ativo específico para uma cadeia polipeptídica em crescimento no sítio de síntese de proteínas do ribossomo. Ele tem um sítio no terminal 3’ para a fixação do aminoácido. Essa ligação covalente é catalisada por uma sintetase de tRNA aminoacil (tRNA com aminoácido). Ele também contam uma região de três bases chamada anticódon que pode parear as bases às três bases correspondentes à região código de três bases no mRNA. Cada tipo de molécula de tRNA pode ser afixada a um tipo de aminoácido, mas por o código genético conter múltiplos códons que especificam o mesmo aminoácido, as moléculas de tRNA carregando diferentes anti-códons também podem carregar o mesmo aminoácido.
ESTRUTURA
O tRNA tem uma estrutura primária, uma estrutura secundária (usualmente visualizada como estrutura de folha de cravo), e a estrutura terciária (todos os tRNAs tem uma estrutura em 3D em forma de L que as permite encaixar para dentro dos sítios P e A do ribossomo).
1. O grupo fosfato no terminal 5’.
2. O braço aceptor é uma haste de 7 pares de base feita pelo pareamento de bases dos nucleotídeos do terminal 5’ com os nucleotídeos do terminal 3’ (o qual contém o grupo terminal CCA 3’ usado para fixar o aminoácido). O braço aceptor pode conter pares de base não tornadas clássicas como as de Watson e Crick.
3. O caule CCA é uma sequência CCA no final 3’ da molécula de tRNA. Esta sequencia é importante para o reconhecimento do tRNA por enzimas críticas para a tradução. Nos procariotos, a sequencia CCA é transcrita. Nos eucariotos, a sequência CCA é adicionada durante o processamento e dessa forma não aparece no gene tRNA.
4. O braço D é uma haste de 4 pares de base finalizando em um laço que frequentemente contém dihidrouridina.
5. O braço anticódon é uma haste de 5 pares de base cujo laço contém o anticódon. Ele também contém um Y que encontra-se com um nucleotídeo de purina modificado.
6. O braço T é uma haste de 5 pares de base contendo a sequência TψC onde ψ é uma pseudouridina.
7. As bases que vão sendo modificadas, especialmente por metilação, ocorrem em diferentes posições fora do anticódon. A primeira base anticódon é algumas vezes modificada em inosina (derivada da adenina) ou pseudouridina (derivada do uracil).
ANTICODON
Um anticódon é uma unidade feita de três nucleotídeos que correspondem a três bases do códon do mRNA. Cada tRNA contém um anticódon específico com uma sequência tripla que pode parear bases com um ou mais anticódons para um aminoácido. Por exemplo, um dos códons para lisina é AAA; o anticódon de um tRNA lisina deverá ser UUU. Alguns anticódons podem parear com mais de um códon devido ao fenômeno conhecido como pareamento bamboleante de bases. Frequentemente, o primeiro nucleotídeo do anti-códon é um dos dois não encontrados no mRNA: uma inosina ou uma pseudouridina, os quais podem fazer pontes de hidrogênio com mais de uma base na posição correspondente do códon. No código genético, é comum para um único aminoácido ser especificado por todas as quatro possibilidades na terceira posição; por exemplo, o aminoácido glicina é codificado pelas sequências códon GGU, GGC, GGA, e GGG.
Para gerar uma correspondência de um para um entre as moléculas de tRNA e códons que especificam aminoácidos, 61 tipos de moléculas de tRNA seriam requeridas por célula. Entretanto, muitas células contêm menos que 61 tipos de tRNA pois a base bamboleante é capaz de ligar-se à várias, embora não necessariamente todos os códons que especificam um aminoácido em particular.
AMINOACILAÇÃO
A aminoacilação é o processo de adição de um grupo aminoacil a um composto. Isso gera as moléculas de tRNA com seus finais 3’ CCA covalentemente ligados a um aminoácido.
Cada tRNA é aminoacilado (ou carregado) com um aminoácido específico por uma sintetase de tRNA aminoacil. Existe normalmente uma única sintetase de tRNA aminoacil para cada aminoácido, a despeito do fato de que elas possam ser para mais de um tRNA e para mais de um anticódon, por aminoácido. O reconhecimento do tRNA apropriado pelas sintetases não é mediado somente pelo anti-códon, o braço aceptor frequentemente atua num papel proeminente.
REAÇÃO
1. Aminoácido + ATP à aminoacil-AMP+PPi
2. Aminoacil-AMP + tRNA à aminoacil-tRNA+AMP
Algumas vezes, certos organismos podem ter uma ou mais sintetases de tRNA aminoacil perdidas. Isso leva a um erro no provisionamento do tRNA com um aminoácido quimicamente aparentado. O aminoácido correto é produzido por enzimas que transformam o aminoácido erradamente carregado no correto.
Por exemplo, o Helicobacter pylori tem uma sintetase de tRNA glutaminil perdida, então, a sintetase de tRNA glutamato carrega erradamente o tRNA glutamina (tRNA-Gln) com glutamato. Uma amidotransferase então converte a cadeia de lado ácido do glutamato por amida, formando o gln-tRNA-Gln corretamente carregado.
LIGAÇÃO AO RIBOSSOMO
O ribossomo tem três sítios de ligação para as moléculas de tRNA: o sítio A (aminoacil), o sítio P, (peptidil) e os sítios E (exit) de saída. Durante a tradução o sítio A liga-se a um tRNA-aminoacil a caminho como direcionado pelo códon subsequentemente ocupando este sítio. Este códon especifica o próximo aminoácido a ser adicionado à cadeia peptídica em crescimento. O sítio só trabalha após o primeiro tRNA aminoacil ter se fixado no sítio P. O códon do sítio P é ocupado por um tRNA-peptidil que é um tRNA com múltiplos aminoácidos fixados como uma longa da cadeia. O sítio P é efetivamente o primeiro a ligar-se ao tRNA aminoacil. Esse tRNA no sítio P carrega a cadeia de aminoácidos que esta sendo sintetizada. O sítio E é ocupado pelo tRNA vazio à sua saída do ribossomo.
Reference "Transfer RNA." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 12 Jun 2009, 10:13 UTC. 12 Jun 2009 <http://www.feedblitz.com/t.asp?/197847/18313577/http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Transfer_RNA&oldid=295950356>.
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quarta-feira, 15 de julho de 2009
In this issue.
[No authors listed]
1- Imagem de Superfície:
A imagem de cobertura retrata o tingimento do Sinal DC e da EEA-1 nas células dendríticas e mostra a co-localização dos ligantes endocitados com marcadores dos compartimentos endossômicos prematuros. A imagem foi tirada de um artigo de Cambi e outros (PP.1923-1929), no qual os autores analisam o papel da lectina de tipo C Sinal DC na entrada do vírus. Os autores mostram que o Sinal DC está envolvido na internalização do HIV-1 dependente de clatrina pelas células dendríticas [omim 603531: A clatrina e seus complexos proteicos heterodiméricos associados (APs) são os principais componentes do revestimento que envolve a face citopasmática das vesículas revestidas. Dois tipos principais de APs, a AP-1 e a AP-2, são encontrados em estruturas revestidas com clatrina localizadas no complexo de Golgi e na membrana citoplasmática das células dos mamíferos, respectivamente. A AP-1 é composta de duas grandes cadeias, a adaptina beta (600157) e a adaptina gama (603533); uma cadeia média (mu), AP47 e uma cadeia pequena (sigma), AP19.
Doray e outros (2002) demonstraram que as proteínas de ligação ao fator de ribosilação contendo adenosina difosfato com asa gama (GGA1, 606004 e GGA3, 606006: os membros da família GGA são proteínas ubíquas de revestimento que facilitam o tráfego de proteínas entre a rede de trabalho trans do Golgi e o lisossomo) e o complexo AP-1 colocalizam-se nos botões revestidos de clatrina das redes de trabalho trans do Golgi de células L do camundno e das células HeLa humanas. Estudos de ligação revelaram uma interação direta entre os domínios de dobradiça das GGAs e do domínio de asa gama da AP-1. Além disso, a AP-1 continha ligação da cinase 2 caseína (veja CSNK2A1,115440), que fosforilou a GGA1 e a GGA3, causando dessa forma a auto-inibição. Doray e outros (2002) demonstraram que essa auto-inibição pode induzir a transferência direta dos receptores de manose com fosfato no carbono 6 ( veja 154540) das GGA3 para a AP-1. Os receptores de manose com 6 fosfatos que eram defeituosos na ligação a GGAs foram pobremente incorporados nas vesículas cobertas com clatrina contendo complexo da proteína adaptadora. Assim, Doray e outros (2002) concluíram que as GGAs e o complexo AP-1 interagem para empacotar os receptores de manose-6-fosfato para dentro das vesículas revestidas contendo AP-1]
2-HUMANOS NEONATOS PROTEGIDOS PELO CONDICIONAMENTO DAS CÉLULAS T GAMA-DELTA INTRA-UTERINAS: PP.1794-1806.
Existe uma evidência emergente nos camundongos de que as células gama-delta adquirem competências funcionais muito excitadas durante o desenvolvimento, em oposição à diferenciação plástica dirigida pelo contexto das células T alfa-beta convencionais. Tais respostas de excitação rígida deverão ser bem apropriadas para encontrar o desafio em precipitação na exposição neonatal ao patógeno.
Além disso por contraste às células T alfa-beta, as células gama-delta neonatais mostraram uma preciosa produção de várias citocinas, sugerindo que, como no camundongo, as células gama-delta fazem fortes contribuições desproporcionadamente à imunidade neonatal. O estudo também mostra que as células gama-delta em bebês prematuros frequentemente têm defeitos funcionais na expressão do TLR3 e do TLR7, possivelmente contribuindo para os problemas bem estabelecidos dos bebês prematuros no tratamento de infecções como Herpes.
3 - AS TREGS DX5+CD4+ PODEM REGULAR A ORIGEM (?) DAS CÉLULAS T CD8+: PP. 1765-1773. Nos anos recentes, muitas populações diferentes de células T como atividades regulatórias tem sido descritas. Um novo sub-conjunto de células T CD4(+), as Tregs DX5(+) cD4(+), têm potente capacidade regulatória nos modelos de doenças auto-imunes tais como diabetes e artrite induzida pelo colágeno. Nesta matéria, Han e outros demonstram um novo papel dessa enigmática população de células T na regulação da preparação das células T CD8+. A vacinação com DCs maduras carregadas com antígeno induz as respostas das células T CD8(+). Surpreendentemente, a depleção das células CD4(+) ou a vacinação dom DCs deficientes em MHC de classe II estimulou a indução das células T CD8(+) consideravelmente. Isso está inversamente correlacionado com a indução e expansão das células T DX5(+) CD4(+). In vitro, as células T DX5(+)CD$(+) foram capazes de inibir a estimulação cãs células T CD8(+). Assim, as DC maduras apresentando antígenos iniciam a resposta das células T CD8(+); entretanto, simultâneamente induzem as células T DX5(+)CD4(+) que podem limitar a magnitude da resposta das células T CD8(+).
Referência: PMID: 19582734
[No authors listed]
1- Imagem de Superfície:
A imagem de cobertura retrata o tingimento do Sinal DC e da EEA-1 nas células dendríticas e mostra a co-localização dos ligantes endocitados com marcadores dos compartimentos endossômicos prematuros. A imagem foi tirada de um artigo de Cambi e outros (PP.1923-1929), no qual os autores analisam o papel da lectina de tipo C Sinal DC na entrada do vírus. Os autores mostram que o Sinal DC está envolvido na internalização do HIV-1 dependente de clatrina pelas células dendríticas [omim 603531: A clatrina e seus complexos proteicos heterodiméricos associados (APs) são os principais componentes do revestimento que envolve a face citopasmática das vesículas revestidas. Dois tipos principais de APs, a AP-1 e a AP-2, são encontrados em estruturas revestidas com clatrina localizadas no complexo de Golgi e na membrana citoplasmática das células dos mamíferos, respectivamente. A AP-1 é composta de duas grandes cadeias, a adaptina beta (600157) e a adaptina gama (603533); uma cadeia média (mu), AP47 e uma cadeia pequena (sigma), AP19.
Doray e outros (2002) demonstraram que as proteínas de ligação ao fator de ribosilação contendo adenosina difosfato com asa gama (GGA1, 606004 e GGA3, 606006: os membros da família GGA são proteínas ubíquas de revestimento que facilitam o tráfego de proteínas entre a rede de trabalho trans do Golgi e o lisossomo) e o complexo AP-1 colocalizam-se nos botões revestidos de clatrina das redes de trabalho trans do Golgi de células L do camundno e das células HeLa humanas. Estudos de ligação revelaram uma interação direta entre os domínios de dobradiça das GGAs e do domínio de asa gama da AP-1. Além disso, a AP-1 continha ligação da cinase 2 caseína (veja CSNK2A1,115440), que fosforilou a GGA1 e a GGA3, causando dessa forma a auto-inibição. Doray e outros (2002) demonstraram que essa auto-inibição pode induzir a transferência direta dos receptores de manose com fosfato no carbono 6 ( veja 154540) das GGA3 para a AP-1. Os receptores de manose com 6 fosfatos que eram defeituosos na ligação a GGAs foram pobremente incorporados nas vesículas cobertas com clatrina contendo complexo da proteína adaptadora. Assim, Doray e outros (2002) concluíram que as GGAs e o complexo AP-1 interagem para empacotar os receptores de manose-6-fosfato para dentro das vesículas revestidas contendo AP-1]
2-HUMANOS NEONATOS PROTEGIDOS PELO CONDICIONAMENTO DAS CÉLULAS T GAMA-DELTA INTRA-UTERINAS: PP.1794-1806.
Existe uma evidência emergente nos camundongos de que as células gama-delta adquirem competências funcionais muito excitadas durante o desenvolvimento, em oposição à diferenciação plástica dirigida pelo contexto das células T alfa-beta convencionais. Tais respostas de excitação rígida deverão ser bem apropriadas para encontrar o desafio em precipitação na exposição neonatal ao patógeno.
Além disso por contraste às células T alfa-beta, as células gama-delta neonatais mostraram uma preciosa produção de várias citocinas, sugerindo que, como no camundongo, as células gama-delta fazem fortes contribuições desproporcionadamente à imunidade neonatal. O estudo também mostra que as células gama-delta em bebês prematuros frequentemente têm defeitos funcionais na expressão do TLR3 e do TLR7, possivelmente contribuindo para os problemas bem estabelecidos dos bebês prematuros no tratamento de infecções como Herpes.
3 - AS TREGS DX5+CD4+ PODEM REGULAR A ORIGEM (?) DAS CÉLULAS T CD8+: PP. 1765-1773. Nos anos recentes, muitas populações diferentes de células T como atividades regulatórias tem sido descritas. Um novo sub-conjunto de células T CD4(+), as Tregs DX5(+) cD4(+), têm potente capacidade regulatória nos modelos de doenças auto-imunes tais como diabetes e artrite induzida pelo colágeno. Nesta matéria, Han e outros demonstram um novo papel dessa enigmática população de células T na regulação da preparação das células T CD8+. A vacinação com DCs maduras carregadas com antígeno induz as respostas das células T CD8(+). Surpreendentemente, a depleção das células CD4(+) ou a vacinação dom DCs deficientes em MHC de classe II estimulou a indução das células T CD8(+) consideravelmente. Isso está inversamente correlacionado com a indução e expansão das células T DX5(+) CD4(+). In vitro, as células T DX5(+)CD$(+) foram capazes de inibir a estimulação cãs células T CD8(+). Assim, as DC maduras apresentando antígenos iniciam a resposta das células T CD8(+); entretanto, simultâneamente induzem as células T DX5(+)CD4(+) que podem limitar a magnitude da resposta das células T CD8(+).
Referência: PMID: 19582734
*137570 FAMÍLIA 20 DO CARREGADOR SOLÚVEL (TRANSPORTADOR DE FOSFATO), MEMBRO 1; SLC20A1
Símbolos Alternativos
RECEPTOR DO VÍRUS DA LEUCEMIA DO SÍMIO GIBÃO; GLVR1TRANSPORTADOR DE FOSFATO 1; PIT1
Lócus de mapeamento genético 2q11-q14
TEXTO
DESCRIÇÃO
Os receptores de retrovírus permitem a infecção de células humanas e murinas por várias retroviroses. Os receptores que tem sido identificados ao nível molecular incluem CD4 (omim186940) para o vírus da imunodeficiência humana, Rec1 para o vírus ectrópico murino, e o GLVR1 para os vírus da leucemia do macaco gibão (veja omim 182090). Essas três proteínas não apresentam homologia de uma para a outra no nível do DNA ou no de proteína. O GLVR é um simportador de fosfato dependente de sódio (simporte é o transporte acoplado de duas moléculas ou íons diferentes através de uma membrana, na mesma direção, por um mecanismo transportador comum (simportador).Stedman).
CLONAGEM
Ohara e outros (1990) transfectaram DNA humano para dentro de células de camundongo e ensaiaram transcritos que conferiram sensitividade à infecção por GALV. Eles clonaram um cDNA que era previsto como uma proteína integral de membrana de 679 aminoácidos contendo múltiplos domínios transmembrana.
FUNÇÃO DO GENE
Pela expressão em oócitos de Xenopus (uma espécie de sapo) e em células de mamíferos, Kavanaugh e outros (1994) determinaram que o GLVR é um simporter de fosfato dependente de sódio. Análises de gancho de voltagem indicaram uma rede de influxo de cátions, sugerindo que o fosfato é transportado com excesso de íons de sódio.
ESTRUTURA DO GENE
Palmer e outros (1999) mostraram que o gene GLVR1 consiste em 11 éxons estendendo-se por aproximadamente 18 quilobases de DNA genômico. O éxon 1 não é codificado.
Usando um ensaio com gene repórter de luciferase (uma enzima que oxida luciferinas em organismos luminosos produzindo bioluminescência) em condrócitos (os condrócitos são as únicas células encontradas na cartilagem. Elas produzem e mantém a matriz cartilaginosa, a qual consiste principalmente de colágeno e proteoglicanos.) e osteoblastos transitoriamente transfectados, Palmer e outros (2001) determinaram que a atividade do promotor de SLC20A1, o qual eles chamaram PIT1, requer uma sequência parecida com TATA e um único sítio SP1(189906). Eles descobriram que este sítio SP1 podia ligar SP1 e SP3 (601804). A despeito da conservação de sequencia entre os promotores do homem e do camundongo, o promotor da Pit1 do camundongo depende de uma combinação de vários elementos atuando em cis.
MAPEAMENTO
Por hibridização em sítio e análises de células somáticas híbridas, Kaelbling e outros (1991) mapearam o gene GLVR1 em 2q11-q14. O Glvr-1 foi mapeado no camundongo no cromossomo 2 em uma região de lócus em conservação em relação ao cromossomo humano 2 . Esse cromossomo do camundongo carrega a Rec2, que é aceitavelmente o receptor para o M813, um retrovírus derivado de um camundongo asiático selvagem. Os achados emergem a interessante possibilidade de que a Rec2 e a Glvr1 estejam estruturalmente relacionadas.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=137570
Símbolos Alternativos
RECEPTOR DO VÍRUS DA LEUCEMIA DO SÍMIO GIBÃO; GLVR1TRANSPORTADOR DE FOSFATO 1; PIT1
Lócus de mapeamento genético 2q11-q14
TEXTO
DESCRIÇÃO
Os receptores de retrovírus permitem a infecção de células humanas e murinas por várias retroviroses. Os receptores que tem sido identificados ao nível molecular incluem CD4 (omim186940) para o vírus da imunodeficiência humana, Rec1 para o vírus ectrópico murino, e o GLVR1 para os vírus da leucemia do macaco gibão (veja omim 182090). Essas três proteínas não apresentam homologia de uma para a outra no nível do DNA ou no de proteína. O GLVR é um simportador de fosfato dependente de sódio (simporte é o transporte acoplado de duas moléculas ou íons diferentes através de uma membrana, na mesma direção, por um mecanismo transportador comum (simportador).Stedman).
CLONAGEM
Ohara e outros (1990) transfectaram DNA humano para dentro de células de camundongo e ensaiaram transcritos que conferiram sensitividade à infecção por GALV. Eles clonaram um cDNA que era previsto como uma proteína integral de membrana de 679 aminoácidos contendo múltiplos domínios transmembrana.
FUNÇÃO DO GENE
Pela expressão em oócitos de Xenopus (uma espécie de sapo) e em células de mamíferos, Kavanaugh e outros (1994) determinaram que o GLVR é um simporter de fosfato dependente de sódio. Análises de gancho de voltagem indicaram uma rede de influxo de cátions, sugerindo que o fosfato é transportado com excesso de íons de sódio.
ESTRUTURA DO GENE
Palmer e outros (1999) mostraram que o gene GLVR1 consiste em 11 éxons estendendo-se por aproximadamente 18 quilobases de DNA genômico. O éxon 1 não é codificado.
Usando um ensaio com gene repórter de luciferase (uma enzima que oxida luciferinas em organismos luminosos produzindo bioluminescência) em condrócitos (os condrócitos são as únicas células encontradas na cartilagem. Elas produzem e mantém a matriz cartilaginosa, a qual consiste principalmente de colágeno e proteoglicanos.) e osteoblastos transitoriamente transfectados, Palmer e outros (2001) determinaram que a atividade do promotor de SLC20A1, o qual eles chamaram PIT1, requer uma sequência parecida com TATA e um único sítio SP1(189906). Eles descobriram que este sítio SP1 podia ligar SP1 e SP3 (601804). A despeito da conservação de sequencia entre os promotores do homem e do camundongo, o promotor da Pit1 do camundongo depende de uma combinação de vários elementos atuando em cis.
MAPEAMENTO
Por hibridização em sítio e análises de células somáticas híbridas, Kaelbling e outros (1991) mapearam o gene GLVR1 em 2q11-q14. O Glvr-1 foi mapeado no camundongo no cromossomo 2 em uma região de lócus em conservação em relação ao cromossomo humano 2 . Esse cromossomo do camundongo carrega a Rec2, que é aceitavelmente o receptor para o M813, um retrovírus derivado de um camundongo asiático selvagem. Os achados emergem a interessante possibilidade de que a Rec2 e a Glvr1 estejam estruturalmente relacionadas.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=137570
terça-feira, 14 de julho de 2009
O TRANSPORTE NA MEMBRANA
O transporte pela membrana é o movimento de bioquímicos e outras substâncias atômicas ou moleculares através das membranas biológicas. Usualmente, dois tipos são distinguidos: o transporte ativo requer energia, enquanto o transporte passivo não.
O transporte pela membrana refere-se ao carreamento de substâncias que atravessam a membrana celular. Ele pode ser dividido em dois tipos : o transporte de proteínas atravessando a membrana
1. Contra um gradiente de concentração e requerendo energia para o transporte – o chamado transporte ativo.
2. Junto ao gradiente de concentração e não requer energia para o transporte – chamado transporte passivo.
O transporte passivo pode ser de dois tipos:
1. Difusão simples – travessia de íons e outras substâncias químicas através da membrana celular que é dependente do gradiente de concentração – as substâncias difundem-se através da membrana celular da concentração mais alta para a mais baixa.
2. Transporte facilitado – usualmente usando um carreador que se liga a uma substância e a carrega através da membrana celular sem envolver gasto de energia. Por exemplo, o transporte de ferro pela transferrina através da membrana celular.
Com base em sua especificidade para carregar substâncias, um número de transportadores tem sido identificados como o transportador cassete de ligação a ATP, o transportador de Glutamato, o transportador Neurotransmissor, o transportador de Glucose, os transportadores de dopamina entre outros. Esses transportadores podem ser agrupados em dois grupos: 1) Transportadores Cassete de ligação a ATP (Transportadores ABC) e 2) A família dos carregadores solúveis.
Os trasportadores são proteínas que podem ser situadas na superfície da membrana ou podem estar presentes no citoplasma da célula. Os últimos são ativados pela ligação de ligantes a seus receptores para alcançar a superfície da membrana para ligarem-se a substância a ser transportada. São os transportadores de Glucose.
http://bioisolutions.blogspot.com/2009/07/membrane-transport-lecture.html
O transporte pela membrana é o movimento de bioquímicos e outras substâncias atômicas ou moleculares através das membranas biológicas. Usualmente, dois tipos são distinguidos: o transporte ativo requer energia, enquanto o transporte passivo não.
O transporte pela membrana refere-se ao carreamento de substâncias que atravessam a membrana celular. Ele pode ser dividido em dois tipos : o transporte de proteínas atravessando a membrana
1. Contra um gradiente de concentração e requerendo energia para o transporte – o chamado transporte ativo.
2. Junto ao gradiente de concentração e não requer energia para o transporte – chamado transporte passivo.
O transporte passivo pode ser de dois tipos:
1. Difusão simples – travessia de íons e outras substâncias químicas através da membrana celular que é dependente do gradiente de concentração – as substâncias difundem-se através da membrana celular da concentração mais alta para a mais baixa.
2. Transporte facilitado – usualmente usando um carreador que se liga a uma substância e a carrega através da membrana celular sem envolver gasto de energia. Por exemplo, o transporte de ferro pela transferrina através da membrana celular.
Com base em sua especificidade para carregar substâncias, um número de transportadores tem sido identificados como o transportador cassete de ligação a ATP, o transportador de Glutamato, o transportador Neurotransmissor, o transportador de Glucose, os transportadores de dopamina entre outros. Esses transportadores podem ser agrupados em dois grupos: 1) Transportadores Cassete de ligação a ATP (Transportadores ABC) e 2) A família dos carregadores solúveis.
Os trasportadores são proteínas que podem ser situadas na superfície da membrana ou podem estar presentes no citoplasma da célula. Os últimos são ativados pela ligação de ligantes a seus receptores para alcançar a superfície da membrana para ligarem-se a substância a ser transportada. São os transportadores de Glucose.
http://bioisolutions.blogspot.com/2009/07/membrane-transport-lecture.html
sábado, 11 de julho de 2009
Eficiente Transferência Lentiviral de Genes para as Células do Estroma Córneo usando um Laser "Femtosecond"
A-P Bemelmans, Y Arsenijevic and F Majo
Nós investigamos um novo procedimento para transferência de genes para o estroma (o arcabouço, geralmente tecido conjuntivo de um órgão) da córnea do porco para a entrega de fatores terapêuticos. Um espaço delimitado foi criado em 110 μm de profundidade com um laser LDV nas córneas do porco, e um vetor lentiviral derivado do HIV-1 expressando proteína verde fluorescente (GFP) (LV-CMV-GFP) foi injetado dentro desse espaço. As córneas foram subsequentemente dissecadas e colocadas em cultura como transplante para um meio artificial. Após 5 dias, as análises histológicas dos transplantes revelaram que o espaço da cavidade nas córneas tinha fechado e que o procedimento de transferência do gene foi eficiente sobre toda a área da cavidade. Quase todos os ceratócitos (célula fibroblástica do estroma da córnea) foram convertidos nessa área. A difusão do vetor no ângulo certo do plano da cavidade abrange de quatro camadas de ceratócitos (do lado do endotélio) a dez (do lado do epitélio). Após 21 dias, o nível de transdução foi similar aos resultados obtidos após 5 dias. A técnica de laser femtosecond permite uma injeção exeqüível e difusão de vetores lentivirais para converter eficientemente as células do estroma em áreas delimitadas. A apresentação da eficácia desse procedimento “in vitro” pode representar uma etapa importante na direção do tratamento ou da prevenção de angiogêses recorrentes do estroma córneo.
Fonte:
http://www.nature.com/gt/journal/v16/n7/abs/gt200941a.html
A-P Bemelmans, Y Arsenijevic and F Majo
Nós investigamos um novo procedimento para transferência de genes para o estroma (o arcabouço, geralmente tecido conjuntivo de um órgão) da córnea do porco para a entrega de fatores terapêuticos. Um espaço delimitado foi criado em 110 μm de profundidade com um laser LDV nas córneas do porco, e um vetor lentiviral derivado do HIV-1 expressando proteína verde fluorescente (GFP) (LV-CMV-GFP) foi injetado dentro desse espaço. As córneas foram subsequentemente dissecadas e colocadas em cultura como transplante para um meio artificial. Após 5 dias, as análises histológicas dos transplantes revelaram que o espaço da cavidade nas córneas tinha fechado e que o procedimento de transferência do gene foi eficiente sobre toda a área da cavidade. Quase todos os ceratócitos (célula fibroblástica do estroma da córnea) foram convertidos nessa área. A difusão do vetor no ângulo certo do plano da cavidade abrange de quatro camadas de ceratócitos (do lado do endotélio) a dez (do lado do epitélio). Após 21 dias, o nível de transdução foi similar aos resultados obtidos após 5 dias. A técnica de laser femtosecond permite uma injeção exeqüível e difusão de vetores lentivirais para converter eficientemente as células do estroma em áreas delimitadas. A apresentação da eficácia desse procedimento “in vitro” pode representar uma etapa importante na direção do tratamento ou da prevenção de angiogêses recorrentes do estroma córneo.
Fonte:
http://www.nature.com/gt/journal/v16/n7/abs/gt200941a.html
quarta-feira, 8 de julho de 2009
Receptores Toll-like (TLRs)
Os receptores Toll-like (TLRs) são uma classe de proteínas que atuam num papel chave no sistema imune inato. Elas são receptores não catalíticos de expansão em uma membrana singular que reconhecem moléculas estruturalmente conservadas derivadas dos micróbios. Uma vez que esses micróbios tenham ultrapassado as barreiras físicas como da mucosa do trato intestinal ou a pele, eles são reconhecidos pelos TLRs os quais ativam as respostas imunes celulares.
Eles receberam seu nome de sua similaridade com a proteína codificada pelo gene Toll identificado na Drosophila em 1985 por Christiane Nüsslein-Volhard.
Diversidade
Os TLRs são um tipo de receptor de reconhecimento padrão (PRR) e reconhecem molélulas que são geralmente compartilhadas entre os patógenos porém distintas das moléculas do hospedeiro, coletivamente referidas como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Os TLRs juntos com a os receptores de Interleucina 1 formam uma super-família de receptores, conhecida como Superfamília “Receptor de Interleucina-1/Receptor Toll-Like”; todos os membros dessa família têm em comum um domínio também chamado TIR (receptor Toll-IL-1).
Três subgrupos de domínios TIR existem. Proteínas com domínio do subgrupo TIR 1 são receptores para interleucinas que são produzidos por macrófagos, monócitos e células dendríticas e todos tem domínios extracelulares de Imunoglobulinas (Ig). Proteínas com domínios do subgrupo TIR 2 são TLRs clássicas, e ligam-se diretamente ou indiretamente a moléculas de origem microbiana. Um terceiro subgrupo de proteínas contendo domínios TIR consiste de proteínas adaptadoras que são exclusivamente citosólicas e mediam a sinalização a partir das proteínas com os subgrupos 1 e 2.
Os TLRs estão presentes nos vetebrados, bem como nos invertebrados. Blocos moleculares de construção dos TLRs são representados nas bactérias e nas plantas e em outros reinos, são conhecidos por serem requeridos pela defesa do hospedeiro contra a infecção. Os TLRs assim parecem ser um dos mais antigos componentes conservados do sistema imune.
Quando os micróbios foram primeiro reconhecidos como a causa das doenças infecciosas, ficou imediatamente claro que organismos multicelulares deviam ser capazes de reconhecê-los quando infectados, e consequentemente, capazes de reconhecer moléculas únicas aos micróbios. Uma grande literatura, expandindo-se principalmente no século passado, atesta a busca por moléculas chave e seus receptores. Há mais de 100 anos atrás, Richard Pfeiffer, um estudante de Robert Koch, cunhou o termo “endotoxina” para descrever uma substância produzida pelas bactérias Gram-negativas que podia provocar a febre e o choque em experimentos com animais. Nas décadas que se seguiram, a endotoxina foi quimicamente caracterizada e identificada como um lipopolissacarídeo (LPS) produzido pela maioria das bactérias Gran-negativas. Outras moléculas (lipopeptídeos bacterianos, flagelina, e DNA não metilado) foram mostradas por sua vez por provocarem respostas do hospedeiro que são normalmente protetoras. Entretanto, essas respostas podem ser prejudiciais se elas forem excessivamente prolongadas ou intensas. Sucedeu-se logicamente que deve haver receptores para tais moléculas, capazes de alertar ao hospedeiro a presença de infecção, mas isso permaneceu elusivo (evasivo) por muitos anos.
Os receptores Toll-like são agora contado entre as moléculas chave que alertam o sistema imune para a presença de infecções microbianas. Eles são chamados assim por sua similaridade com Toll, um receptor identificado primeiro na mosca da fruta a Drosophila melanogaster, e originalmente conhecido por sua função no desenvolvimento do organismo. Em 1996, o Toll foi encontrado por Jules A.Hoffmann e seus colegas por ter um papel essencial na imunidade da mosca à infecção por fungos, o que foi alcançado pela ativação da síntese de peptídeos anti-microbianos.
O primeiro receptor Toll-like humano relatado foi descrito por Nomura e seus colegas em 1994, mapeado no cromossomo por Taguchi e seus colegas em 1996. Devido à função imune do Toll na Drosófila não ser então conhecido, assumiu-se que o TIL (agora conhecido como TLR1) deveria participar no desenvolvimento dos mamíferos. Enretanto, em 1991 (antes da descoberta do TIL) observou-se que uma molécula com um claro papel na função imune nos mamíferos, o receptor de interleucina-1 (IL-1), também tinha homologia com o Toll da Drosófila; as porções citoplasmáticas das duas moléculas eram similares.
Em 1997, Charles Janeway e Ruslan Medzhitov mostraram que o receptor Toll-like agora conhecido como TLR4 podia, quando artificialmente ligado usando-se anticorpos, induzir a ativação de certos genes necessários para a iniciação da resposta imune adaptativa. Entretanto a função dos TLRs permaneceu desconhecida no despertar desse trabalho, e em particular, nenhum ligante foi identificado para nenhum TLR dos mamíferos.
A função dos TLR foi descoberta por Bruce A. Beutler e seus colegas. Esses pesquisadores usaram clones posicionais para provar que camundongos que não podiam responder aos LPS tinham mutações que aboliam a função do TLR4. Isso identificou o TLR4 como um componente chave dos receptores de LPS, e a sugeriu fortemente que outros receptores Toll-like deveriam detectar outras moléculas assinaladoras dos micróbios, tais como as mencionadas acima.
Por outro lado, os outros genes de TLR foram selecionados nos camundongos por alvejamento de gene, fartamente no laboratório de Shizuo Akira e seus colegas. Cada TLR é considerado agora por detectar uma discreta coleção de moléculas de origem microbiana, e por sinalizar a presença de infecções.
LIGANTES
Devido à especificidade dos receptores Toll-like (e outros receptores do sistema imune inato) não pode ser facilmente alterada no curso da evolução, esses receptores reconhecem moléculas que estão constantemente associadas com ameaças (isto é, patógenos ou estresse celular) e são altamente específicos para essas ameaças (isto é, não podem ser trocados/confundidos com moléculas próprias). As moléculas associadas a patógenos que se encontram neste requisito são usualmente críticas para a função dos patógenos e não podem ser eliminadas ou trocadas através de mutações, elas são ditas por evolucionariamente conservadas. Características bem conservadas nos patógenos incluem lipopolissacarídeos (LPS) de superfície celular da bactéria , lipoproteínas, lipopepídeos e lipoarabionomanana; proteínas tais como a flagelina do flagelo da bactéria; fita dupla de RNA de viroses e ilhas CpG não metiladas de DNA viral e bacteriano; e certos outros RNA e DNA. Para a maioria dos TLRs, a especificidade de reconhecimento do ligante tem sido agora estabelecida por alvejamento do gene (também conhecido como “Knockout do gene”): uma técnica pela qual os genes podem ser individualmente apagados nos camundongos.
LIGANTES ENDÓGENOS
A resposta inflamatória estereotípica (continuada) provocada pela ativação do TLR tem provocado a especulação de que ativadores endógenos dos TLRs devem participar nas doenças auto-imunes. Os TLRs tem sido suspeitos de ligarem-se a moléculas do hospedeiro inclusive o fbrinogênio (envolvido na coagulação sanguínea) e às proteínas de choque de calor (HSPs) e ao DNA do hospedeiro.
SINALIZAÇÃO
Os TLRs são creditados por funcionarem como dímeros. Embora a maioria dos TLRs pareça funcionar como homodímeros, o TLR2 forma heterodímeros com o TLR1 ou o TLR6, cada dímero tendo uma especificidade diferente para o ligante. Os TLRs também podem depender de outros co-receptores para total sensibilidade da ligação, tais como no caso do reconhecimento dos LPS pelos TLR4, os quais requerem a molécula MD-2. A CD14 e a Proteína de ligação a LPS (LBP) são conhecidas por facilitarem a apresentação dos LPS à MD-2.
As proteínas adapatadoras e as cinases que mediam a sinalização do TLR também têm sido alvejadas. Em adição a mutagênese aleatória da linha germinativa com ENU tem sido usada para decifrar as vias de sinalização do TLR. Quando ativados, os TLRs recrutam moléculas adaptadoras para dentro do citoplasma das células de modo a propagar o sinal. Quatro moléculas adaptadoras são conhecidas por estarem envolvidas na sinalização. Essas proteínas são conhecidas como MyD88, Tirap (também chamada MAL), Trif e Tram. As adaptadoras ativam outras moléculas dentro da célula, incluindo certas proteínas cinases (IRAK1, IRAK4, TBK1 e IKKi) que amplificam o sinal, e por último levam à indução ou supressão de genes que orquestram a resposta inflamatória. Em todos, centenas de genes são ativados pela sinalização do TLR, e coletivamente, os TLRs constituem uma das principais vias de acesso para a modulação pleiotrópica (pleiotropia é a capacidade de um gene produzir produtos mutantes diversos e de vários efeitos diferentes em nível clínico e fenotípico.) dos genes já reguladas disciplinadamente.
ATIVAÇÃO E EFEITOS
Seguindo a ativação por ligantes de origem microbiana, várias reações são possíveis. As células imunes podem produzir fatores de sinalização chamados citocinas os quais disparam a inflamação. No caso do fator bacteriano, os patógenos devem ser fagocitados e digeridos, e seus antígenos apresentados às células CD4+. Em caso d fator viral, a célula infectada pode obstruir a síntese de sua proteína (viral) e submeter-se à morte celular programada (apoptose). As células imunes que detectaram um vírus também podem liberar fatores anti-virais tais como interferons.
A descoberta dos receptores Toll-like finalmente identificou os receptores da imunidade inata que eram responsáveis por muitas das funções imunes inatas que tem sido estudadas por muitos anos. Interessantemente, os TLRs parecem somente estar envolvidos na produção de citocinas e ativação celular em resposta aos micróbios, e não atuarem num papel significativo na adesão de fagocitose de microorganismos.
Toll-like receptor. (2009, May 4). In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 13:36, May 12, 2009, from http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Toll-like_receptor&oldid=287743888
Fonte : http://bioisolutions.blogspot.com/2009/05/toll-like-receptor.html
RECEPTORES DE RECONHECIMENTO DE PATÓGENOS
As células no sistema imune como as células dendríticas e macrófagos são a primeira linha de defesa no reconhecimento de vários tipos de patógenos. Essas células tem vários tipos de receptores desenvolvidos para reconhecer diferentes tipos de padrões moleculares associados a patógenos conhecidos como PAMPs.
Existem diferentes classes dessas proteínas, elas reconhecem diferentes tipos de PAMPs, o receptor Toll-like (TLR) é composto de múltiplas repetições ricas em leucina que são úteis para o reconhecimento de vários PAMPs. Cada membro da família TLR reconhece diferentes tipos de PAMPs. Por exemplo o TKR5 reconhece a flagelina, a qual é um constituinte altamente conservado do flagelo bacteriano. Os genomas das bactérias contém motivos de oligonucleotídeo CpG metilados que são reconhecidos pelos TLR9, uma vez que o genoma seja degradado no lisossomo.
O TLR6 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos diacil (provavelmente lipopeptídeos com duas porções acil esterificadas). O TLR1 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos triacil (o 1,2-diacilglicerol é um intermediário na síntese de triacil-gliceróis e de lecitina. Stedman) e o TLR4 reconhece lipopolissacarídeos (LPS) um componente das bactérias Gram Negativas.
Os similares TLR9, TLR3 e TLR7 estão localizados nas vesículas endocíticas e reconhecem RNA de fita dupla e de uma fita só respectivamente. Quando quaisquer TLRs são ativados, ele manda o sinal para o núcleo pela ativação de fatores de transcrição.
Alguns patógenos tais como os vírus existem e se replicam no citosol. Existem ao menos duas classes de receptores que podem detectar patógenos no citosol e sinalizar sua presença ao sistema imune. Uma classe desses receptores são os membros da família de domínio de oligomerização nuclear ou proteínas NOD.
Por exemplo a proteína NOD2, a qual é localizada no citosol, pode detectar bacterioproteoglicanos de bactérias intracelulares. Quando a proteína NOD2 reconhece seus ligantes os dipeptídeos muramil (mureínas são peptidoglicanos que cobrem as bactérias e que consistem em polissacarídeos lineares de unidades alternadas de N-acetil-D-glucosamina e ácido N-acetilmurâmico, a cujas cadeias laterais lactato estão ligados oligopeptídeos.Stedman), ela envia o sinal para o núcleo para ativar a transcrição.
Finalmente, existe uma protein receptora de classe intracelular que pode conter um domínio de helicase de RNA e dois domínios de recrutamento de caspase, um membro dessa famíla, a RIG-1, reconhece RNAs de fitas duplas que são componentes do ciclo de vida de muitas viroses.
Essa classe de proteínas também envia o sinal para o núcleo, mas diferente dos TLRs ela ativa a produção de interferons de tipo 1. Em todos esses receptores Toll Like, as proteínas NOR e as proteínas da família de domínio de helicase de RNA provêem o sistema imune inato com a capacidade de detectar ambos os patógenos extracelulares e intracelulares e de ativar as respostas imunes.
Fonte : http://bioisolutions.blogspot.com/2009/07/pathogen-recognition-receptors.html
As células no sistema imune como as células dendríticas e macrófagos são a primeira linha de defesa no reconhecimento de vários tipos de patógenos. Essas células tem vários tipos de receptores desenvolvidos para reconhecer diferentes tipos de padrões moleculares associados a patógenos conhecidos como PAMPs.
Existem diferentes classes dessas proteínas, elas reconhecem diferentes tipos de PAMPs, o receptor Toll-like (TLR) é composto de múltiplas repetições ricas em leucina que são úteis para o reconhecimento de vários PAMPs. Cada membro da família TLR reconhece diferentes tipos de PAMPs. Por exemplo o TKR5 reconhece a flagelina, a qual é um constituinte altamente conservado do flagelo bacteriano. Os genomas das bactérias contém motivos de oligonucleotídeo CpG metilados que são reconhecidos pelos TLR9, uma vez que o genoma seja degradado no lisossomo.
O TLR6 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos diacil (provavelmente lipopeptídeos com duas porções acil esterificadas). O TLR1 e o TLR2 são dímeros que reconhecem lipopeptídeos triacil (o 1,2-diacilglicerol é um intermediário na síntese de triacil-gliceróis e de lecitina. Stedman) e o TLR4 reconhece lipopolissacarídeos (LPS) um componente das bactérias Gram Negativas.
Os similares TLR9, TLR3 e TLR7 estão localizados nas vesículas endocíticas e reconhecem RNA de fita dupla e de uma fita só respectivamente. Quando quaisquer TLRs são ativados, ele manda o sinal para o núcleo pela ativação de fatores de transcrição.
Alguns patógenos tais como os vírus existem e se replicam no citosol. Existem ao menos duas classes de receptores que podem detectar patógenos no citosol e sinalizar sua presença ao sistema imune. Uma classe desses receptores são os membros da família de domínio de oligomerização nuclear ou proteínas NOD.
Por exemplo a proteína NOD2, a qual é localizada no citosol, pode detectar bacterioproteoglicanos de bactérias intracelulares. Quando a proteína NOD2 reconhece seus ligantes os dipeptídeos muramil (mureínas são peptidoglicanos que cobrem as bactérias e que consistem em polissacarídeos lineares de unidades alternadas de N-acetil-D-glucosamina e ácido N-acetilmurâmico, a cujas cadeias laterais lactato estão ligados oligopeptídeos.Stedman), ela envia o sinal para o núcleo para ativar a transcrição.
Finalmente, existe uma protein receptora de classe intracelular que pode conter um domínio de helicase de RNA e dois domínios de recrutamento de caspase, um membro dessa famíla, a RIG-1, reconhece RNAs de fitas duplas que são componentes do ciclo de vida de muitas viroses.
Essa classe de proteínas também envia o sinal para o núcleo, mas diferente dos TLRs ela ativa a produção de interferons de tipo 1. Em todos esses receptores Toll Like, as proteínas NOR e as proteínas da família de domínio de helicase de RNA provêem o sistema imune inato com a capacidade de detectar ambos os patógenos extracelulares e intracelulares e de ativar as respostas imunes.
Fonte : http://bioisolutions.blogspot.com/2009/07/pathogen-recognition-receptors.html
terça-feira, 7 de julho de 2009
A Identificação da ERGIC-53 (LMAN1) como um receptor de transporte intracellular de α1-antitripsina
Beat Nyfeler,1 Veronika Reiterer,1 Markus W. Wendeler,1 Eduard Stefan,2 Bin Zhang,3 Stephen W. Michnick,2 and Hans-Peter Hauri1
RESUMO
As proteínas secretadas são exportadas a partir do retículo endoplasmático (ER) pelo fluxo de carga e/ou transporte mediado por receptor. Nosso entendimento desse processo é limitado devido ao pequeno número de receptores de transporte identificados e as correspondentes proteínas carregadas. Nas células dos mamíferos, a proteína lectina de 53 quilo-dáltons do compartimento intermediário entre o Golgi e o ER (ERGIC-53 ou LMAN1) representa o receptor de carga melhor caracterizado. Ela ajuda na exportação de um sub-conjunto de glicoproteínas pelo Retículo Endoplasmático, incluindo os fatores de coagulação V e VIII e as catepsinas C e Z. Aqui, nós relatamos uma nova estratégia de sondagem para identificar interações de proteínas na luz da via secretória usando um ensaio de complementação de proteína baseado na proteína fluorescente amarela. Por sondagem de uma biblioteca de DNA complementar do fígado humano, nós identificamos a alfa1-antitripsina (α1-AT) como uma carga da ERGIC-53 previamente não identificada e mostramos que a captura da carga é dependente da conformação e do carbo-hidrato. As células com ERGIC-53 eliminada ou reduzida exibem um defeito específico na secreção da α1-AT que é corrigido pela reintrodução da ERGIC-53. Os resultados revelam que a ERGIC-53 é um receptor de transporte da α1-AT e proporcionam evidência direta da exportação de proteínas solúveis secretadas do ER mediada por receptor ativo nos eucariotos superiores.
INTRODUÇÃO
O lúmen (luz) do ER (Retículo Endoplasmático) proporciona um ambiente oxidativo único para o dobramento e modificação das proteínas. Uma terço de todas as proteínas recém sintetizadas são translocatadas para dentro do ER e processadas por múltiplas enimas residentes no ER. Um sistema de controle de qualidade elaborado monitora o estado conformacional das proteínas nascentes e as retém no ER durante o processo de dobramento (Ellgaard e Helenius, 2003). Quando ocorre o dobramento correto, as proteínas são exportadas do ER em vesículas de proteínas de revestimento II (COPII) (Lee e outros, 2004). Embora as proteínas transmembrana possam interagir diretamente com a malha de COPII citosólica (Barlowe, 2003), algumas proteínas solúveis do lúmen requerem receptores de carga para seu recrutamento seletivo dentro das vesículas COPII (Belden e Barlowe, 2001; Baines e Zhang, 2007). O receptor de carga melhor caracterizado é a oligomérica lectina de membrana de tipo I ERGIC-53 (Schweizer e outros, 1988). A ERGIC-53 faz ciclos entre o ER e o compartimento intermediário do Golgi e do ER (ERGIC), captura glicoproteínas solúveis no lúmen do ER, e liga-se a COPII por meio de um motivo dihidrofóbico de exportação do ER em seu caule citosólico (Hauri e outros,2000; Appenzeller-Herzog e Hauri, 2006). Como um receptor de carga, a ERGIC-53 media a exportação pelo E dos fatores de coagulação V e VIII e das catepsinas C e Z (Nichols e outros, 1998; Vollenweider e outros. 1998; Appenzeller e outros, 1999). Além disso, a ERGIC-53 foi recentemente apresentada por assistir à reunião dos polímeros da IgM no ER (Agnelli e outros, 2007).Com somente algumas proteínas carregadas pela ERGIC-53 identificadas, não se sabe, entretanto, se a exportação do ER mediada por receptor é o mecanismo de transporte predominante para o transporte de proteínas solúveis. O principal problema na identficação de complexos receptores de carga é sua natureza transitória em um ambiente iônico e oxidativo único. Além disso, as técnicas existentes em proteômica para identificação de interações proteína-proteína (ou seja, a purificação da afinidade/ espectrometria de massa ou o sistema de duas leveduras híbridas) não são facilmente aplicáveis ou não são apropriados ao estudo de proteínas de membrana. Entretanto, os ensaios de complementação de fragmento de proteína (PCAs) realmente permitem a detecção de ambas as interações transitória e dinâmica entre proteínas em células vivas intactas, incluindo aquelas para proteínas de membrana (Remy e outros, 1999; Michnick e outros, 2007). Um ensaio de complementação de fragmento de proteína (PCA) baseado em uma YFP (proteína fluorescente amarela) variante (citrina) tem-se demonstrado aplicável para interações proteína-proteína da via secretória dentro do lúmen (Nyfeler e outros, 2005). No PCAYFP, os fragmentos nos terminais N- e C- não fluoresscentes da YFP (YFP1 e YFP2) são individualmente fundidos às sequências codificadoras de duas proteínas separadas e expressados nas células mamíferas. Se as duas proteínas fundidas interagirem, os fragmentos das YFP serão trazidos à proximidade (um do outro), permitindo a dobradura e reconstituição da YFP fluorescente in vivo. Usando este ensaio específico e sensitivo, nós demosntramos que a oligomerização da ERIC-53 e suas interações com múltiplas proteínas 2 de deficiência de fator de coagulação (MCDF2) e com as catepsinas C e Z são logo visíveis nas células vivas. Aqui n´s descrevemos uma estratéia de sondagem de biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA para identificação de novas proteínas carregadas pela ERGIC-53. A verificação de uma bilbioteca de cDNA de fígado humano adulto identificou a α1-antitripssina (α1-AT) como uma nova parceira de interação da ERGIC-53 e a validação de nossos estudos estabeleceu a ERGIC-53 como um receptor de transporte para a α1-AT.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Baseados em uma estratégia de sondagem de biblioteca de cDNA de PCA em geral (Remy e Michnick, 2004a,b), nós desevolvemos uma abordagem de verificação desenhada para identificar proteínas que se ligam a receptores de carga no lúmen do ER. A ERGIC-53 foi usada como isca e foi etiquetada no N terminal com YFP2 (yellow fluorescent protein 2= proteína fluorescente amarela 2), o que localiza a YFP2 no lado luminal da membrana e permite a verificação de interações proteína-proteína dentro do lúmen do ER. Proteínas presas foram etiquetadas com YFP1 no terminal C e expressadas a partir de uma fusão de cDNA-YFP1 de uma biblioteca. Essa orientação na fusão assegura que proteínas de membrana e secretadas codificadas pela biblioteca não sejam perturbadas. Entretanto, nós não contamos com identificar os padrões de interação já conhecidos da ERGIC-53 com essa bibioteca de cDNA-YFP1 devido às características específicas dessas proteínas ou devido à orientação específica da TFP1 presa junto ao citosol. Por exemplo, o etiquetamento das catepsinas Z e C no terminal C impede a interação com ERGIC-53 (Nyfeler e outros, 2005), enquanto a MCDF2-YFP1 é improvavelmente identificada devido a suas interações com a ERGIC-5 serem estritamente dependentes da lente total da proteína MCDF2 (Nyfler e outros 2008).
Além disso, a interação da ERGIC-53 com si mesma não pode ser detectada pois a oligomerização da ERGIC-53 requer seu domínio transmembrana (Nufer e outros,2003), o qual localiza a YFP1 de todas as proteínas YFP1-ERGIC-53 competentes na oligomerização e presas ao citosol. Esse requerimento topológico específico do compartimento é uma característic única da abordagem de PCA, proporcionando informação sobre a orientação de proteínas presas associadas à membrana. Nossa estratégia de etiquetamento do terminal C requer que as inserções à biblioteca careçam de seu códon finalizador para evitar o término da tradução antes da sequencia da YFP1. Para este fim, nós usamos cDNAs gerados por transcrição reversa de mRNA iniciada aleatóriamente, o que enriquece as extremidades 5’. Os cDNA intercalados foram sub-clonados de uma biblioteca de cDNA de fígado adulto humano dentro de vetores de expressão pcDNA3 contendo a YFP1 em todas as três sequências de leitura. A biblioteca de cDNA-YFP1 resultante continha aproximadamente 106 clones e os inseridos alternavam de 1 a 2,5 quilobases de tamanho aproximadamente. Como de se esperar para uma biblioteca gerada a partir de um tecido de secreção como o fígado, os cDNA codificadores de proteínas secretadas foram bem representados.
A sondagem da biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA foi desempenhada em células COS-1 (de rins de macaco verde africano), as quais expressam o grande antígeno T e replicam plasmídios contendo a origem de replicação do SV40 eucariótico.
[OBS.: O virus símio 40 (SV40) e o Vírus Polioma do camundongo (PY) são viroses de tumor de pequeno DNA que têm sido extensivamente usadas para estudar a transformação celular. A primeira região do SV40 codifica três antígenos de tumor, o grande T (LT), o pequeno T (ST) e o 17KT que contribuem para a transformação celular. Enquanto o PY também codifica o LT e o ST, o médio T (MT) sozinho gera a maior parte da atividade de transformação. A transformação mediada pelo LT do SV40 requer a ligação a proteínas de supressão tumoral Rb e p53 no núcleo e a ligação do ST à proteína fosfatase PP2A no citoplasma. O LT do SV40 também se liga a várias proteínas celulares adicionais incluindo p300, CBP, Cul7, IRS1, Bub1, Nbs1 e Fbxw7 que contribuem para a transformação pelo vírus. A transformação pelo MT do PY é dpendente da ligação à PP2a e às proteínas da família das cinases de tirosina Src (PTK) e da reunião de um complexo de sinalização nas membranas da célula que leva à transforação de modo similar a Her2/neu. A fosforilação dos resíduos de tirosina da MT ativa moléculas de sinalização chaves incluindo Shc/Grb2, PI3K e PLCgama1. As contribuições únicas do LT e ST do SV40 e do MT do PY para a transformação celular tem proporcionado significativos esclarecimentos para nossa compreensão dos supressores de tumor, oncogenes e processos de oncogênese. PMID: 19505649 ]
Devido à essa característica, os plasmídios de bibliotecas de cDNA-YFP1 serão replicados na transfecção, o que assegura a expressão suficiente de proteínas roubadas (as proteínas do plasmídio) individuais e simplifica a recondução e análise de clones positivos. A co-expressão de YFP2-ERGIC-53 e da biblioteca de cDNA-YFP1 resultou na detecção de 1,63% de células COS-1 fluorescentes amarelas, e a YFP PCA pode fartamente contabilizar para o sinal detectado pois poucas células positivas foram obtidas na expressão de YFP2-ERGIC-53 ou da biblioteca de cDNA-YFP1 sozinhas. Na seleção, a YFP2-ERGIC-5 e o cDNA-YFP1da biblioteca foram transfectadas em uma razão de 10:1 para reduzir o número de plasmídios da biblioteca transfectados por célula. Isso baixou a porcentagem de células positivas para o,12% (dados não publicados). Várias centenas de células YFP positivas foram coletadas por FACS e clones presas foram reconduzidos, 48 dos quais foram individualmente reanalizados por YFP PCA em células COS-1. A co-expressão com YFP2-ERGIC-53 resultou em sinais YFP positivos para os plasmídios presas numerados com 17, 32, 33 e 44. A recondução de somente 4 positivos fora dos 48 plasmídios presa reanalidados não foi devida ao inespecificidade de nosso ensaio porém mais à captura de vários plasmídios presas por célula transfectada. Uma célula YFP positiva contém o plasmídio presa positivo tanto como muitos plasmídios negativos co-transfectados, os quais serão subsequentmente reconduzidos também.
Análises de sequência de DNA identificaram a α1-AT como o cDNA correspondente inserido nos plasmídios presa 17, 32, 33 e 44. Dois tipos de α1-AT inseridos foram encontrados, um de 1294 pares de base e uma variante de 1297 pares de base. Ambos os inseridos estava em sequencia e cobriram a sequencia codificadora completa da α1-AT com a exceção dos dois últimos aminoácidos do terminal C. A interação da ERGIC-53 com a α1-AT foi validade pelo YFP PCA nas células HeLa usando a lente total da α1-AT etiquetada no terminal N com YFP2.
A α1-AT é uma glicoproteína do fígado de 52 quilo-dáltons carregando três glicanos ligados na ponta N. Após sua síntese nos hepatócitos, a α1-AT é secretada no sangue, onde atua como uma protease inibidora de serina, principalmente contra a elastase do neutrófilo. Como uma doas maiores proteínas sintetizadas no fígado, a α1-AT é aceitavelmente altamente abundante em nossa biblioteca não normalizada. Quando a YFP-ERGIC-52 e o cDNA-YFP1 da biblioteca foram expressados nas células COS-1 após o silenciamento da α1-AT mediado por siRNA, uma redução de 30 a 50% das células YFP positivas foi observada (dados não publicados). Assim, a α1-AT parece ser responsável por mais da metade de todas as células YFP positivas em nossa verificação (Gross e outros 1982) e foi sugerido que os glicanos em N- podem servir como sítios de reconhecimento para um receptor de transporte do ER para o Golgi (Lodish e Kong, 1984). Será a ERGIC-53 um receptor de transporte para a α1-AT? Primeiro nós analisamos a especificidade do carbohidrato da interação ERGIC-53- α1-AT através da execução de um YFP PCA com a ERGIC-53 mutante em N156A e um triplo mutante de N10,107,171Q. A ERGIC-53N156A é incapaz de ligar-se aos oligossacarídeos ligados em N- nas glicoproteínas (Appenzeller e outros,1999) e a α1-ATn70,107,271Q permanece não glicosilada devido à mutagênese direcionada ao sítio dos três sítios de consenso de glicosilação do N-. Em comparação a suas equivalentes de tipo selvagem, a ERGIC-53N156A e a α1-AT N70,107,271Q mostraram uma marcada redução no sinal de YFP PCA. Esses achados sugerem que a ERGIC-53 liga-se a α1-AT de um modo dependente de carbohidrato. Nós também analisamos singularmente os mutantes N70Q, N107Q e N271Q de α1-AT e achamos que a mutagênese do segundo sítio de glicosilação em N- (N107Q) tem o efeito mais forte na interação entre a ERGIC-53 e a α1-AT [obs.: deve ser a mutação que mais prejudica a interação dessas proteínas.] Esse resultado está em total acordo com um estudo prévio mostrando que a α1-AT mutante N107Q tem um tempo de retenção intracelular significativamente mais longo do que outras mutações (Samandari e Brown, 1993). Interessantemente, todos os três sítios de glicosilação singular em N- mutantes tem taxas de degradação similares e solubilidade (Samandari e Brown, 1993). Consequentemente, o carbohidrato fixado na N107 (asparagina107) é particularmente importante para a exportação pelo ER.
Depois nós endereçamos a especificidade da conformação da interação ERGIC-53- α1-AT pela análise de duas versões da α1-AT dobradas erradamente conhecidas como as mutantes (α1-ATZ) e Hong Kong (α1-ATHK) (Stoller e Aboussouan,2005). Embora a α1-ATHK seja solúvel e degradada pela degradação associada ao ER envolvendo o proteassomo [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).], a α1-ATZ se agrega no ER e é submetida à deradação pelo proteossoma e pelo lisossomo (Cabral e outros, 2000; Teckman e outros, 2001).Notavelmente, em nosso YFP PCA, nem a α1-ATHK nem α1-ATZ ligaram-se à ERGIC-53. A α1-ATZ foi expressada em níveis intracelulares similares à YFP2- α1-ATWT e não foi afetada pelos dois inibidores de degradação proteassômica [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).] a Lactacistina (lactacystin) e a cifunensina (Kifunensine). Nós não pudemos descartar a possibilidade de que a agregação diminua o volume da ERGIC-53 solúvel ligando-se a α1-ATZ competente, dessa forma reduzindo o sinal YFP PCA. No caso da α1-ATHK, a inibição da degradação proteassômica pela lactacistina e cifunensina claramente aumentaram os níveis de YFP- α1-ATHK. Embora a quantidade de YFP2- α1-ATHK fosse desse modo restaurada àquela do manipulado de tipo selvagem, o sinal YFP PCA não foi aumentado. Esses dados sugerem que a interação ERGIC- α1-AT é dependente da conformação e sustenta uma função da ERGIC-53 de controle secundário de qualidade pela captura apenas das proteínas nativas de carga para exportação pelo ER (Ellgaard e Helenius,2003; Appenzeller-Herzog e outros, 2005).
Para confirmar que a ERGIC-53 captura a α1-AT para exportação pelo ER, nós analisamos o transporte da α1-AT endógenos em células HepG2 nas quais a ERGIC-53 foi derrubada por siRNA. O silenciamento da ERGIC-53 por 96 horas reduziu os níveis totais da proteína ERGIC-53 para menos de 20%. Intrigantemente, a derrubada da ERGIC-53 levou a uma acumulação de α1-AT em estabilidade dentro da célula. Esse efeito foi analisado além pelo estudo de transporte e secreção da α1-AT em experimentos de pulso de perseguição usando [S] metionina. A α1-AT é sintetizada como uma glicoproteína com muita manose, é submentida a complexa glicosilação no Goli, e é subsequentemente secretada no meio de cultura. Nas células HepG2 transfectadas com siRNA de controle, a α1-AT de alta manose foi rapidamente convertida nessa forma de complexo glicosilado e aproximadamente metade das proteínas foi secretada após 30 minutos de perseguição. Em contraste, nas células com a ERGIC-53 silenciadas, a α1-AT permaneceu consideravelmente mais tempo em sua forma de muita manose e somente aproximadamente 15% da proteína foi secretada após 30 minutos. A secreção ineficiente da α1-AT não é causada por um defeito geral na secreção porque a secreção da albumina endógena não foi alterada. Além disso, estudos prévios nas células HeLa tem realmente mostrado que nem a depleção nem a localização errada da ERGIC-53 mudam a morfologia da via secretora ou afetam a secreção de toda a proteína. Consequentemente, níveis reduzidos de ERGIC-53 retardam significativamente a secreção da α1-AT de maneira específica.
Para determinar se a secreção remanescente da α1-AT é causada por uma ERGIC-53, nós estudamos o transporte da α1-AT transfectada para dentro de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) derivados de camundongos sem ERGIC-53 (-/-) e camundongos de tipo selvagem (+/+). Os experimentos de pulso de perseguição revelaram um intervalo de secreção de aproximadamente 60 minutos nas células MEFs. As células MEFs sem ERGIC-53 secretaram no mesmo tempo somente aproximadamente 25% das α1-AT recém sintetizadas e mostraram uma conversão significativamente mais lenta da forma de muita manose para complexo glicosilado da α1-AT. O defeito da secreção em geral pode ser excluído novamente por as MEFs sem ERGIC secretaram fibronectina endógena como as MEFs de tipo selvagem. Esses resultados demonstram que a secreção de α1-AT é significativamente atrasada sem a ERGIC-53 mas que uma alternativa menos eficiente na via de exportação do ER existe.
Se a ERGIC-53 é um receptor de transporte para a α1-AT, a reintrodução da ERGIC-53 certamente corrigirá a secreção defeituosa da α1-AT nas células sem ERGIC-53. De fato, quando a ERGIC-53 humana foi co-expressada com a α1-AT, a α1-AT intracelular foi consideravelmente reduzida nas células MEFs -/- num estado estável. Além disso, a ERGIC-53 aumentou a secreção da α1-AT nas MEFs -/- para o nível das MEFs +/+ após uma hora de perseguição. Consequentemente, a sobre-expressão da ERIC-53 nas MEFs sem ERGIC-53 podem restaurar a secreção de α1-AT completamente. Estudos prévios sobre a função da ERGIC-53 foram baseados principalmente em análises genéticas (Nichols e outros; 1998), estudos de transporte com uma ERGIC-53 mutante retida no ER dominante-negativa (Vollenweider e outros, 1998; Appenzeller e outros, 1999 ), ou a caracterização das interações da ERGIC-53 com as cargas (Appenzeller e outros 1999; Appenzeller-Herzog e outros, 2005; Nyfeler e outros,2005; Zhang e outros, 2005). Os estudos correntes proporcionam agora a evidência direta para uma exportação pelo ER mediada por receptor ativo de proteínas secretadas nas células dos mamíferos. Além disso, nossos dados indicam que os receptores de transporte dão ao transporte de carga mais rapidez e eficiência, mas o transporte de carga não é inteiramente bloqueado na sua ausência. A α1-AT pode possuir um Segundo receptor de transporte ou pode sair do ER por um fluxo volumoso de certa extensão. A abordagem de seleção que nós descrevemos aqui pode ser igualmente aplicada usando-se a α1-AT como uma isca para identificar novos receptores de carga. Com a α1-AT, nós agora identificamos um atrativo modelo de proteína secretada para estudar o mecanismo de exportação de proteína do ER mediado por receptor, em detalhes.
Em conclusão, esse estudo não somente identifica um receptor de transporte intracelular de α1-AT mas também abre uma avenida sem precedentes para a sondagem do genoma em sua amplitude nas interações proteína-proteína na via de secreção. A identificação profícua de uma nova proteína de carga da ERGIC-53 por sondagem de uma fusão do complexo de cDNA-YFP1 com biblioteca baseada em YFP PCA proporciona uma estratégia geral para identificar novos complexos protéicos no lúmen. Com bibliotecas normalizadas e condições ótimas de transfecção, a seleção por saturação e amplo genoma será executável no futuro próximo. Adicionalmente, a YFP PCA tem um potencial promitente para sondagen de alta produtividade de chaperones (proteínas acompanhantes) químicas e moleculares (Burrows e outros,2000) que pode resgatar defeitos de conformação (dobramento) de α1-AT mutantes e fornecer-lhes a secreção competente pela promoção de sua interação com ERGIC-53.
NOTAS
Abbreviations used in this paper: α1-AT, α1-antitrypsin; COPII, coat protein II; ERGIC, ER Golgi intermediate compartment; MCFD2, multiple coagulation factor deficiency protein 2; MEF, mouse embryonic fibroblast; PCA, protein fragment complementation assay.
FONTE:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=18283111
Beat Nyfeler,1 Veronika Reiterer,1 Markus W. Wendeler,1 Eduard Stefan,2 Bin Zhang,3 Stephen W. Michnick,2 and Hans-Peter Hauri1
RESUMO
As proteínas secretadas são exportadas a partir do retículo endoplasmático (ER) pelo fluxo de carga e/ou transporte mediado por receptor. Nosso entendimento desse processo é limitado devido ao pequeno número de receptores de transporte identificados e as correspondentes proteínas carregadas. Nas células dos mamíferos, a proteína lectina de 53 quilo-dáltons do compartimento intermediário entre o Golgi e o ER (ERGIC-53 ou LMAN1) representa o receptor de carga melhor caracterizado. Ela ajuda na exportação de um sub-conjunto de glicoproteínas pelo Retículo Endoplasmático, incluindo os fatores de coagulação V e VIII e as catepsinas C e Z. Aqui, nós relatamos uma nova estratégia de sondagem para identificar interações de proteínas na luz da via secretória usando um ensaio de complementação de proteína baseado na proteína fluorescente amarela. Por sondagem de uma biblioteca de DNA complementar do fígado humano, nós identificamos a alfa1-antitripsina (α1-AT) como uma carga da ERGIC-53 previamente não identificada e mostramos que a captura da carga é dependente da conformação e do carbo-hidrato. As células com ERGIC-53 eliminada ou reduzida exibem um defeito específico na secreção da α1-AT que é corrigido pela reintrodução da ERGIC-53. Os resultados revelam que a ERGIC-53 é um receptor de transporte da α1-AT e proporcionam evidência direta da exportação de proteínas solúveis secretadas do ER mediada por receptor ativo nos eucariotos superiores.
INTRODUÇÃO
O lúmen (luz) do ER (Retículo Endoplasmático) proporciona um ambiente oxidativo único para o dobramento e modificação das proteínas. Uma terço de todas as proteínas recém sintetizadas são translocatadas para dentro do ER e processadas por múltiplas enimas residentes no ER. Um sistema de controle de qualidade elaborado monitora o estado conformacional das proteínas nascentes e as retém no ER durante o processo de dobramento (Ellgaard e Helenius, 2003). Quando ocorre o dobramento correto, as proteínas são exportadas do ER em vesículas de proteínas de revestimento II (COPII) (Lee e outros, 2004). Embora as proteínas transmembrana possam interagir diretamente com a malha de COPII citosólica (Barlowe, 2003), algumas proteínas solúveis do lúmen requerem receptores de carga para seu recrutamento seletivo dentro das vesículas COPII (Belden e Barlowe, 2001; Baines e Zhang, 2007). O receptor de carga melhor caracterizado é a oligomérica lectina de membrana de tipo I ERGIC-53 (Schweizer e outros, 1988). A ERGIC-53 faz ciclos entre o ER e o compartimento intermediário do Golgi e do ER (ERGIC), captura glicoproteínas solúveis no lúmen do ER, e liga-se a COPII por meio de um motivo dihidrofóbico de exportação do ER em seu caule citosólico (Hauri e outros,2000; Appenzeller-Herzog e Hauri, 2006). Como um receptor de carga, a ERGIC-53 media a exportação pelo E dos fatores de coagulação V e VIII e das catepsinas C e Z (Nichols e outros, 1998; Vollenweider e outros. 1998; Appenzeller e outros, 1999). Além disso, a ERGIC-53 foi recentemente apresentada por assistir à reunião dos polímeros da IgM no ER (Agnelli e outros, 2007).Com somente algumas proteínas carregadas pela ERGIC-53 identificadas, não se sabe, entretanto, se a exportação do ER mediada por receptor é o mecanismo de transporte predominante para o transporte de proteínas solúveis. O principal problema na identficação de complexos receptores de carga é sua natureza transitória em um ambiente iônico e oxidativo único. Além disso, as técnicas existentes em proteômica para identificação de interações proteína-proteína (ou seja, a purificação da afinidade/ espectrometria de massa ou o sistema de duas leveduras híbridas) não são facilmente aplicáveis ou não são apropriados ao estudo de proteínas de membrana. Entretanto, os ensaios de complementação de fragmento de proteína (PCAs) realmente permitem a detecção de ambas as interações transitória e dinâmica entre proteínas em células vivas intactas, incluindo aquelas para proteínas de membrana (Remy e outros, 1999; Michnick e outros, 2007). Um ensaio de complementação de fragmento de proteína (PCA) baseado em uma YFP (proteína fluorescente amarela) variante (citrina) tem-se demonstrado aplicável para interações proteína-proteína da via secretória dentro do lúmen (Nyfeler e outros, 2005). No PCAYFP, os fragmentos nos terminais N- e C- não fluoresscentes da YFP (YFP1 e YFP2) são individualmente fundidos às sequências codificadoras de duas proteínas separadas e expressados nas células mamíferas. Se as duas proteínas fundidas interagirem, os fragmentos das YFP serão trazidos à proximidade (um do outro), permitindo a dobradura e reconstituição da YFP fluorescente in vivo. Usando este ensaio específico e sensitivo, nós demosntramos que a oligomerização da ERIC-53 e suas interações com múltiplas proteínas 2 de deficiência de fator de coagulação (MCDF2) e com as catepsinas C e Z são logo visíveis nas células vivas. Aqui n´s descrevemos uma estratéia de sondagem de biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA para identificação de novas proteínas carregadas pela ERGIC-53. A verificação de uma bilbioteca de cDNA de fígado humano adulto identificou a α1-antitripssina (α1-AT) como uma nova parceira de interação da ERGIC-53 e a validação de nossos estudos estabeleceu a ERGIC-53 como um receptor de transporte para a α1-AT.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Baseados em uma estratégia de sondagem de biblioteca de cDNA de PCA em geral (Remy e Michnick, 2004a,b), nós desevolvemos uma abordagem de verificação desenhada para identificar proteínas que se ligam a receptores de carga no lúmen do ER. A ERGIC-53 foi usada como isca e foi etiquetada no N terminal com YFP2 (yellow fluorescent protein 2= proteína fluorescente amarela 2), o que localiza a YFP2 no lado luminal da membrana e permite a verificação de interações proteína-proteína dentro do lúmen do ER. Proteínas presas foram etiquetadas com YFP1 no terminal C e expressadas a partir de uma fusão de cDNA-YFP1 de uma biblioteca. Essa orientação na fusão assegura que proteínas de membrana e secretadas codificadas pela biblioteca não sejam perturbadas. Entretanto, nós não contamos com identificar os padrões de interação já conhecidos da ERGIC-53 com essa bibioteca de cDNA-YFP1 devido às características específicas dessas proteínas ou devido à orientação específica da TFP1 presa junto ao citosol. Por exemplo, o etiquetamento das catepsinas Z e C no terminal C impede a interação com ERGIC-53 (Nyfeler e outros, 2005), enquanto a MCDF2-YFP1 é improvavelmente identificada devido a suas interações com a ERGIC-5 serem estritamente dependentes da lente total da proteína MCDF2 (Nyfler e outros 2008).
Além disso, a interação da ERGIC-53 com si mesma não pode ser detectada pois a oligomerização da ERGIC-53 requer seu domínio transmembrana (Nufer e outros,2003), o qual localiza a YFP1 de todas as proteínas YFP1-ERGIC-53 competentes na oligomerização e presas ao citosol. Esse requerimento topológico específico do compartimento é uma característic única da abordagem de PCA, proporcionando informação sobre a orientação de proteínas presas associadas à membrana. Nossa estratégia de etiquetamento do terminal C requer que as inserções à biblioteca careçam de seu códon finalizador para evitar o término da tradução antes da sequencia da YFP1. Para este fim, nós usamos cDNAs gerados por transcrição reversa de mRNA iniciada aleatóriamente, o que enriquece as extremidades 5’. Os cDNA intercalados foram sub-clonados de uma biblioteca de cDNA de fígado adulto humano dentro de vetores de expressão pcDNA3 contendo a YFP1 em todas as três sequências de leitura. A biblioteca de cDNA-YFP1 resultante continha aproximadamente 106 clones e os inseridos alternavam de 1 a 2,5 quilobases de tamanho aproximadamente. Como de se esperar para uma biblioteca gerada a partir de um tecido de secreção como o fígado, os cDNA codificadores de proteínas secretadas foram bem representados.
A sondagem da biblioteca de cDNA baseada em YFP PCA foi desempenhada em células COS-1 (de rins de macaco verde africano), as quais expressam o grande antígeno T e replicam plasmídios contendo a origem de replicação do SV40 eucariótico.
[OBS.: O virus símio 40 (SV40) e o Vírus Polioma do camundongo (PY) são viroses de tumor de pequeno DNA que têm sido extensivamente usadas para estudar a transformação celular. A primeira região do SV40 codifica três antígenos de tumor, o grande T (LT), o pequeno T (ST) e o 17KT que contribuem para a transformação celular. Enquanto o PY também codifica o LT e o ST, o médio T (MT) sozinho gera a maior parte da atividade de transformação. A transformação mediada pelo LT do SV40 requer a ligação a proteínas de supressão tumoral Rb e p53 no núcleo e a ligação do ST à proteína fosfatase PP2A no citoplasma. O LT do SV40 também se liga a várias proteínas celulares adicionais incluindo p300, CBP, Cul7, IRS1, Bub1, Nbs1 e Fbxw7 que contribuem para a transformação pelo vírus. A transformação pelo MT do PY é dpendente da ligação à PP2a e às proteínas da família das cinases de tirosina Src (PTK) e da reunião de um complexo de sinalização nas membranas da célula que leva à transforação de modo similar a Her2/neu. A fosforilação dos resíduos de tirosina da MT ativa moléculas de sinalização chaves incluindo Shc/Grb2, PI3K e PLCgama1. As contribuições únicas do LT e ST do SV40 e do MT do PY para a transformação celular tem proporcionado significativos esclarecimentos para nossa compreensão dos supressores de tumor, oncogenes e processos de oncogênese. PMID: 19505649 ]
Devido à essa característica, os plasmídios de bibliotecas de cDNA-YFP1 serão replicados na transfecção, o que assegura a expressão suficiente de proteínas roubadas (as proteínas do plasmídio) individuais e simplifica a recondução e análise de clones positivos. A co-expressão de YFP2-ERGIC-53 e da biblioteca de cDNA-YFP1 resultou na detecção de 1,63% de células COS-1 fluorescentes amarelas, e a YFP PCA pode fartamente contabilizar para o sinal detectado pois poucas células positivas foram obtidas na expressão de YFP2-ERGIC-53 ou da biblioteca de cDNA-YFP1 sozinhas. Na seleção, a YFP2-ERGIC-5 e o cDNA-YFP1da biblioteca foram transfectadas em uma razão de 10:1 para reduzir o número de plasmídios da biblioteca transfectados por célula. Isso baixou a porcentagem de células positivas para o,12% (dados não publicados). Várias centenas de células YFP positivas foram coletadas por FACS e clones presas foram reconduzidos, 48 dos quais foram individualmente reanalizados por YFP PCA em células COS-1. A co-expressão com YFP2-ERGIC-53 resultou em sinais YFP positivos para os plasmídios presas numerados com 17, 32, 33 e 44. A recondução de somente 4 positivos fora dos 48 plasmídios presa reanalidados não foi devida ao inespecificidade de nosso ensaio porém mais à captura de vários plasmídios presas por célula transfectada. Uma célula YFP positiva contém o plasmídio presa positivo tanto como muitos plasmídios negativos co-transfectados, os quais serão subsequentmente reconduzidos também.
Análises de sequência de DNA identificaram a α1-AT como o cDNA correspondente inserido nos plasmídios presa 17, 32, 33 e 44. Dois tipos de α1-AT inseridos foram encontrados, um de 1294 pares de base e uma variante de 1297 pares de base. Ambos os inseridos estava em sequencia e cobriram a sequencia codificadora completa da α1-AT com a exceção dos dois últimos aminoácidos do terminal C. A interação da ERGIC-53 com a α1-AT foi validade pelo YFP PCA nas células HeLa usando a lente total da α1-AT etiquetada no terminal N com YFP2.
A α1-AT é uma glicoproteína do fígado de 52 quilo-dáltons carregando três glicanos ligados na ponta N. Após sua síntese nos hepatócitos, a α1-AT é secretada no sangue, onde atua como uma protease inibidora de serina, principalmente contra a elastase do neutrófilo. Como uma doas maiores proteínas sintetizadas no fígado, a α1-AT é aceitavelmente altamente abundante em nossa biblioteca não normalizada. Quando a YFP-ERGIC-52 e o cDNA-YFP1 da biblioteca foram expressados nas células COS-1 após o silenciamento da α1-AT mediado por siRNA, uma redução de 30 a 50% das células YFP positivas foi observada (dados não publicados). Assim, a α1-AT parece ser responsável por mais da metade de todas as células YFP positivas em nossa verificação (Gross e outros 1982) e foi sugerido que os glicanos em N- podem servir como sítios de reconhecimento para um receptor de transporte do ER para o Golgi (Lodish e Kong, 1984). Será a ERGIC-53 um receptor de transporte para a α1-AT? Primeiro nós analisamos a especificidade do carbohidrato da interação ERGIC-53- α1-AT através da execução de um YFP PCA com a ERGIC-53 mutante em N156A e um triplo mutante de N10,107,171Q. A ERGIC-53N156A é incapaz de ligar-se aos oligossacarídeos ligados em N- nas glicoproteínas (Appenzeller e outros,1999) e a α1-ATn70,107,271Q permanece não glicosilada devido à mutagênese direcionada ao sítio dos três sítios de consenso de glicosilação do N-. Em comparação a suas equivalentes de tipo selvagem, a ERGIC-53N156A e a α1-AT N70,107,271Q mostraram uma marcada redução no sinal de YFP PCA. Esses achados sugerem que a ERGIC-53 liga-se a α1-AT de um modo dependente de carbohidrato. Nós também analisamos singularmente os mutantes N70Q, N107Q e N271Q de α1-AT e achamos que a mutagênese do segundo sítio de glicosilação em N- (N107Q) tem o efeito mais forte na interação entre a ERGIC-53 e a α1-AT [obs.: deve ser a mutação que mais prejudica a interação dessas proteínas.] Esse resultado está em total acordo com um estudo prévio mostrando que a α1-AT mutante N107Q tem um tempo de retenção intracelular significativamente mais longo do que outras mutações (Samandari e Brown, 1993). Interessantemente, todos os três sítios de glicosilação singular em N- mutantes tem taxas de degradação similares e solubilidade (Samandari e Brown, 1993). Consequentemente, o carbohidrato fixado na N107 (asparagina107) é particularmente importante para a exportação pelo ER.
Depois nós endereçamos a especificidade da conformação da interação ERGIC-53- α1-AT pela análise de duas versões da α1-AT dobradas erradamente conhecidas como as mutantes (α1-ATZ) e Hong Kong (α1-ATHK) (Stoller e Aboussouan,2005). Embora a α1-ATHK seja solúvel e degradada pela degradação associada ao ER envolvendo o proteassomo [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).], a α1-ATZ se agrega no ER e é submetida à deradação pelo proteossoma e pelo lisossomo (Cabral e outros, 2000; Teckman e outros, 2001).Notavelmente, em nosso YFP PCA, nem a α1-ATHK nem α1-ATZ ligaram-se à ERGIC-53. A α1-ATZ foi expressada em níveis intracelulares similares à YFP2- α1-ATWT e não foi afetada pelos dois inibidores de degradação proteassômica [omim 600306: proteassomas são complexos proteolíticos responsáveis pela apresentação de antígenos restritos pelo complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Akiyama e outros,1994).] a Lactacistina (lactacystin) e a cifunensina (Kifunensine). Nós não pudemos descartar a possibilidade de que a agregação diminua o volume da ERGIC-53 solúvel ligando-se a α1-ATZ competente, dessa forma reduzindo o sinal YFP PCA. No caso da α1-ATHK, a inibição da degradação proteassômica pela lactacistina e cifunensina claramente aumentaram os níveis de YFP- α1-ATHK. Embora a quantidade de YFP2- α1-ATHK fosse desse modo restaurada àquela do manipulado de tipo selvagem, o sinal YFP PCA não foi aumentado. Esses dados sugerem que a interação ERGIC- α1-AT é dependente da conformação e sustenta uma função da ERGIC-53 de controle secundário de qualidade pela captura apenas das proteínas nativas de carga para exportação pelo ER (Ellgaard e Helenius,2003; Appenzeller-Herzog e outros, 2005).
Para confirmar que a ERGIC-53 captura a α1-AT para exportação pelo ER, nós analisamos o transporte da α1-AT endógenos em células HepG2 nas quais a ERGIC-53 foi derrubada por siRNA. O silenciamento da ERGIC-53 por 96 horas reduziu os níveis totais da proteína ERGIC-53 para menos de 20%. Intrigantemente, a derrubada da ERGIC-53 levou a uma acumulação de α1-AT em estabilidade dentro da célula. Esse efeito foi analisado além pelo estudo de transporte e secreção da α1-AT em experimentos de pulso de perseguição usando [S] metionina. A α1-AT é sintetizada como uma glicoproteína com muita manose, é submentida a complexa glicosilação no Goli, e é subsequentemente secretada no meio de cultura. Nas células HepG2 transfectadas com siRNA de controle, a α1-AT de alta manose foi rapidamente convertida nessa forma de complexo glicosilado e aproximadamente metade das proteínas foi secretada após 30 minutos de perseguição. Em contraste, nas células com a ERGIC-53 silenciadas, a α1-AT permaneceu consideravelmente mais tempo em sua forma de muita manose e somente aproximadamente 15% da proteína foi secretada após 30 minutos. A secreção ineficiente da α1-AT não é causada por um defeito geral na secreção porque a secreção da albumina endógena não foi alterada. Além disso, estudos prévios nas células HeLa tem realmente mostrado que nem a depleção nem a localização errada da ERGIC-53 mudam a morfologia da via secretora ou afetam a secreção de toda a proteína. Consequentemente, níveis reduzidos de ERGIC-53 retardam significativamente a secreção da α1-AT de maneira específica.
Para determinar se a secreção remanescente da α1-AT é causada por uma ERGIC-53, nós estudamos o transporte da α1-AT transfectada para dentro de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) derivados de camundongos sem ERGIC-53 (-/-) e camundongos de tipo selvagem (+/+). Os experimentos de pulso de perseguição revelaram um intervalo de secreção de aproximadamente 60 minutos nas células MEFs. As células MEFs sem ERGIC-53 secretaram no mesmo tempo somente aproximadamente 25% das α1-AT recém sintetizadas e mostraram uma conversão significativamente mais lenta da forma de muita manose para complexo glicosilado da α1-AT. O defeito da secreção em geral pode ser excluído novamente por as MEFs sem ERGIC secretaram fibronectina endógena como as MEFs de tipo selvagem. Esses resultados demonstram que a secreção de α1-AT é significativamente atrasada sem a ERGIC-53 mas que uma alternativa menos eficiente na via de exportação do ER existe.
Se a ERGIC-53 é um receptor de transporte para a α1-AT, a reintrodução da ERGIC-53 certamente corrigirá a secreção defeituosa da α1-AT nas células sem ERGIC-53. De fato, quando a ERGIC-53 humana foi co-expressada com a α1-AT, a α1-AT intracelular foi consideravelmente reduzida nas células MEFs -/- num estado estável. Além disso, a ERGIC-53 aumentou a secreção da α1-AT nas MEFs -/- para o nível das MEFs +/+ após uma hora de perseguição. Consequentemente, a sobre-expressão da ERIC-53 nas MEFs sem ERGIC-53 podem restaurar a secreção de α1-AT completamente. Estudos prévios sobre a função da ERGIC-53 foram baseados principalmente em análises genéticas (Nichols e outros; 1998), estudos de transporte com uma ERGIC-53 mutante retida no ER dominante-negativa (Vollenweider e outros, 1998; Appenzeller e outros, 1999 ), ou a caracterização das interações da ERGIC-53 com as cargas (Appenzeller e outros 1999; Appenzeller-Herzog e outros, 2005; Nyfeler e outros,2005; Zhang e outros, 2005). Os estudos correntes proporcionam agora a evidência direta para uma exportação pelo ER mediada por receptor ativo de proteínas secretadas nas células dos mamíferos. Além disso, nossos dados indicam que os receptores de transporte dão ao transporte de carga mais rapidez e eficiência, mas o transporte de carga não é inteiramente bloqueado na sua ausência. A α1-AT pode possuir um Segundo receptor de transporte ou pode sair do ER por um fluxo volumoso de certa extensão. A abordagem de seleção que nós descrevemos aqui pode ser igualmente aplicada usando-se a α1-AT como uma isca para identificar novos receptores de carga. Com a α1-AT, nós agora identificamos um atrativo modelo de proteína secretada para estudar o mecanismo de exportação de proteína do ER mediado por receptor, em detalhes.
Em conclusão, esse estudo não somente identifica um receptor de transporte intracelular de α1-AT mas também abre uma avenida sem precedentes para a sondagem do genoma em sua amplitude nas interações proteína-proteína na via de secreção. A identificação profícua de uma nova proteína de carga da ERGIC-53 por sondagem de uma fusão do complexo de cDNA-YFP1 com biblioteca baseada em YFP PCA proporciona uma estratégia geral para identificar novos complexos protéicos no lúmen. Com bibliotecas normalizadas e condições ótimas de transfecção, a seleção por saturação e amplo genoma será executável no futuro próximo. Adicionalmente, a YFP PCA tem um potencial promitente para sondagen de alta produtividade de chaperones (proteínas acompanhantes) químicas e moleculares (Burrows e outros,2000) que pode resgatar defeitos de conformação (dobramento) de α1-AT mutantes e fornecer-lhes a secreção competente pela promoção de sua interação com ERGIC-53.
NOTAS
Abbreviations used in this paper: α1-AT, α1-antitrypsin; COPII, coat protein II; ERGIC, ER Golgi intermediate compartment; MCFD2, multiple coagulation factor deficiency protein 2; MEF, mouse embryonic fibroblast; PCA, protein fragment complementation assay.
FONTE:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=18283111
domingo, 5 de julho de 2009
A lectina ligante de manose (MBL) e sua interação com imunoglobulinas na saúde e na doença.
Arnold JN, Dwek RA, Rudd PM, Sim RB.Oxford Glycobiology Institute, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford OX1 3QU, United Kingdom.
Nos humanos há cinco classes de imunolobulinas (Igs) : IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, todas as quais são glicoproteínas. As Igs são o principal produto secretado do sistema imune adaptativo, e elas se ligam a antígenos por via de suas sequencias variáveis em suas regiões Fab. A ligação ao antígeno resulta na neutralização ou aglutinação do material ligado e também inicia as funções efetoras por meio das regiões Fc, tais como opsonização e ativação da via clássica do complemento através da ligação ao C1q [O C1q é um dos sub-componentes do Complemento 1: omim 120550: O primeiro componente do complemento é um complexo dependente de cálcio de 3 subcomponentes C1q, C1r e C1s. O subcomponente C1q liga-se a complexos de imunoglobulinas resultando na ativação em série do C1r (enzima), e C1s (pró-enzima), e dos outros oito componentes do sistema complemento. O sub-componente C1q é composto de três diferentes espécies de cadeias, chamadas A, B (C1QB) e C (C1QC).] A lectina ligante de manose (MBL), a molécula de reconhecimento da via de ativação do complemento por lectina, é homóloga ao C1q, em sua estrutura, e se liga de modo dependente de cálcio à manose terminal e aos resíduos de GlcNAc (N-acetilglucosaminil) que tenham sido identificados nos oligossacarídeos ligados na ponta N das Igs. A MBL liga-se aglicoformas não galactosiladas das IgGs (IgG-GO), a formas poliméricas de IgA e a certas glicoformas de IgM que tenham uma alta incidência de glicanos terminando em GlcNAc. Essa interação proporciona uma rota de remoção dos complexos imunes do soro, e um mecanismo de ativação do complemento para patógenos cobertos com Ig. Na doença, a MBL contribui para a inflamação na Artrite Reumatóide, uma condição na qual as concentrações de IgG-GO podem aumentar significativamente em comparação com indivíduos saudáveis. A MBL tem demonstrado recentemente ligar-se a Ig no complexo receptor de célula B, o qual expressa glicosilação anormal da região variável no linfoma folicular.
PMID: 16814399
Arnold JN, Dwek RA, Rudd PM, Sim RB.Oxford Glycobiology Institute, Department of Biochemistry, University of Oxford, South Parks Road, Oxford OX1 3QU, United Kingdom.
Nos humanos há cinco classes de imunolobulinas (Igs) : IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, todas as quais são glicoproteínas. As Igs são o principal produto secretado do sistema imune adaptativo, e elas se ligam a antígenos por via de suas sequencias variáveis em suas regiões Fab. A ligação ao antígeno resulta na neutralização ou aglutinação do material ligado e também inicia as funções efetoras por meio das regiões Fc, tais como opsonização e ativação da via clássica do complemento através da ligação ao C1q [O C1q é um dos sub-componentes do Complemento 1: omim 120550: O primeiro componente do complemento é um complexo dependente de cálcio de 3 subcomponentes C1q, C1r e C1s. O subcomponente C1q liga-se a complexos de imunoglobulinas resultando na ativação em série do C1r (enzima), e C1s (pró-enzima), e dos outros oito componentes do sistema complemento. O sub-componente C1q é composto de três diferentes espécies de cadeias, chamadas A, B (C1QB) e C (C1QC).] A lectina ligante de manose (MBL), a molécula de reconhecimento da via de ativação do complemento por lectina, é homóloga ao C1q, em sua estrutura, e se liga de modo dependente de cálcio à manose terminal e aos resíduos de GlcNAc (N-acetilglucosaminil) que tenham sido identificados nos oligossacarídeos ligados na ponta N das Igs. A MBL liga-se aglicoformas não galactosiladas das IgGs (IgG-GO), a formas poliméricas de IgA e a certas glicoformas de IgM que tenham uma alta incidência de glicanos terminando em GlcNAc. Essa interação proporciona uma rota de remoção dos complexos imunes do soro, e um mecanismo de ativação do complemento para patógenos cobertos com Ig. Na doença, a MBL contribui para a inflamação na Artrite Reumatóide, uma condição na qual as concentrações de IgG-GO podem aumentar significativamente em comparação com indivíduos saudáveis. A MBL tem demonstrado recentemente ligar-se a Ig no complexo receptor de célula B, o qual expressa glicosilação anormal da região variável no linfoma folicular.
PMID: 16814399
sábado, 4 de julho de 2009
A DIMERIZAÇÃO TRANSITÓRIA E A INTERAÇÃO COM ERGIC-53 (LMAN1) OCORREM NO RECEPTOR DE FATOR 3 DE CRESCIMENTO DO FIBROBLASTO NAS VIAS SECRETÓRIAS PRIMÁRIAS.
Lievens PM, De Servi B, Garofalo S, Lunstrum GP, Horton WA, Liboi E.
A VIA DE SECREÇÃO DO RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO DO FIBROBLASTO 3 (FGFR3) INCLUI A GLICOSILAÇÃO LIGADA EM NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO, ONDE UM SISTEMA DE CONTROLE RIGOROSO ASSEGURA QUE SOMENTE OS RECEPTORES CORRETAMENTE DOBRADOS CHEGUEM À SUPERFÍCIE CELULAR DE ONDE O FGFR3 FUNCIONAL MADURO SINALIZA SOBRE A DIMERIZAÇÃO MEDIADA PELO LIGANTE. NÓS MOSTRAMOS PREVIAMENTE QUE A AUMENTADA ATIVIDADE DE CINASE ASSOCIADA AO FGFR3 PRODUZINDO A MUTAÇÃO NA DISPLASIA DE TIPO II TANATOFÓRICA (QUE LEVA À MORTE) (TDII) EMBARAÇA SUA (DO FGFR3) MATURAÇÃO, CAPACITANDO O RECEPTOR A SINALIZAR A PARTIR DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. AQUI NÓS INVESTIGAMOS SE ESSE DISTÚRBIO BIOSINTÉTICO PODERIA SER EXPLICADO PELA DIMERIZAÇÃO PREMATURA DO RECEPTOR. NOSSAS OBSERVAÇÕES MOSTRAM QUE UMA FRAÇÃO LIMITADA DO RECEPTOR MUTANTE IMATURO COM MUITA MANOSE DIMERIZA NAS VIAS SECRETÓRIAS PRIMÁRIAS, COMO O FGFR3 IMATURO DE TIPO SELVAGEM. EM CONTRASTE, O RECEPTOR DE TIPO SELVAGEM MADURO E FARTAMENTE GLICOSILADO ATINGE A SUPERFÍCIE CELULAR COMO MONÔMERO SUGERINDO QUE A DIMERIZAÇAO É UM EVENTO TRANSITÓRIO. A ATIVIDADE DE CINASE DO FGFR3 MUTANTE NÃO É REQUERIDA PARA QUE OCORRA A DIMERIZAÇÃO, EMBORA AUMENTE A EFICIÊNCIA DA DIMERIZAÇÃO. ALÉM DISSO, O FGFR3 MUTANTE TRANSFOSFORILA O RECEPTOR IMATURO DE TIPO SELVAGEM INDICANDO QUE A DIMERIZAÇÃO OCORRE NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. A VISUALIZAÇÃO DA INTERAÇÃO PROTÉICA DENTRO DA VIA SECRETÓRIA CONFIRMA A DIMERIZAÇÃO DO RECEPTOR. EM ADIÇÃO, ISSO MOSTRA QUE AMBOS O TIPO SELVAGEM E O FGFR3 TDII INTERAGEM COM A LECTINA DE MANOSE ESPECÍFICA ERGIC53. NÓS CONCLUÍMOS QUE UMA DIMERIZAÇÃO TRANSITÓRIA É UMA ETAPA OBRIGATÓRIA NA BIOSÍNTESE DO FGFR3 AGINDO COM UM MECANISMO DE CONTROLE DE QUALIDADE DA PRÉ-REUNIÃO. ALÉM DISSO, A FORMAÇÃO DO COMPLEXO TDII/ERGIC-53 PODE FUNCIONAR COMO UM PONTO DE CONTROLE PARA A FONTE DE FGFR3 A SEGUIR NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. ESSES ACHADOS TÊM IMPLICAÇÕES NO ENTENDIMENTO DA PATOÊNESE DAS DESORDENS RELACIONADAS COM O FGFR3.
PMID: 18577465
Lievens PM, De Servi B, Garofalo S, Lunstrum GP, Horton WA, Liboi E.
A VIA DE SECREÇÃO DO RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO DO FIBROBLASTO 3 (FGFR3) INCLUI A GLICOSILAÇÃO LIGADA EM NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO, ONDE UM SISTEMA DE CONTROLE RIGOROSO ASSEGURA QUE SOMENTE OS RECEPTORES CORRETAMENTE DOBRADOS CHEGUEM À SUPERFÍCIE CELULAR DE ONDE O FGFR3 FUNCIONAL MADURO SINALIZA SOBRE A DIMERIZAÇÃO MEDIADA PELO LIGANTE. NÓS MOSTRAMOS PREVIAMENTE QUE A AUMENTADA ATIVIDADE DE CINASE ASSOCIADA AO FGFR3 PRODUZINDO A MUTAÇÃO NA DISPLASIA DE TIPO II TANATOFÓRICA (QUE LEVA À MORTE) (TDII) EMBARAÇA SUA (DO FGFR3) MATURAÇÃO, CAPACITANDO O RECEPTOR A SINALIZAR A PARTIR DO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. AQUI NÓS INVESTIGAMOS SE ESSE DISTÚRBIO BIOSINTÉTICO PODERIA SER EXPLICADO PELA DIMERIZAÇÃO PREMATURA DO RECEPTOR. NOSSAS OBSERVAÇÕES MOSTRAM QUE UMA FRAÇÃO LIMITADA DO RECEPTOR MUTANTE IMATURO COM MUITA MANOSE DIMERIZA NAS VIAS SECRETÓRIAS PRIMÁRIAS, COMO O FGFR3 IMATURO DE TIPO SELVAGEM. EM CONTRASTE, O RECEPTOR DE TIPO SELVAGEM MADURO E FARTAMENTE GLICOSILADO ATINGE A SUPERFÍCIE CELULAR COMO MONÔMERO SUGERINDO QUE A DIMERIZAÇAO É UM EVENTO TRANSITÓRIO. A ATIVIDADE DE CINASE DO FGFR3 MUTANTE NÃO É REQUERIDA PARA QUE OCORRA A DIMERIZAÇÃO, EMBORA AUMENTE A EFICIÊNCIA DA DIMERIZAÇÃO. ALÉM DISSO, O FGFR3 MUTANTE TRANSFOSFORILA O RECEPTOR IMATURO DE TIPO SELVAGEM INDICANDO QUE A DIMERIZAÇÃO OCORRE NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. A VISUALIZAÇÃO DA INTERAÇÃO PROTÉICA DENTRO DA VIA SECRETÓRIA CONFIRMA A DIMERIZAÇÃO DO RECEPTOR. EM ADIÇÃO, ISSO MOSTRA QUE AMBOS O TIPO SELVAGEM E O FGFR3 TDII INTERAGEM COM A LECTINA DE MANOSE ESPECÍFICA ERGIC53. NÓS CONCLUÍMOS QUE UMA DIMERIZAÇÃO TRANSITÓRIA É UMA ETAPA OBRIGATÓRIA NA BIOSÍNTESE DO FGFR3 AGINDO COM UM MECANISMO DE CONTROLE DE QUALIDADE DA PRÉ-REUNIÃO. ALÉM DISSO, A FORMAÇÃO DO COMPLEXO TDII/ERGIC-53 PODE FUNCIONAR COMO UM PONTO DE CONTROLE PARA A FONTE DE FGFR3 A SEGUIR NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO. ESSES ACHADOS TÊM IMPLICAÇÕES NO ENTENDIMENTO DA PATOÊNESE DAS DESORDENS RELACIONADAS COM O FGFR3.
PMID: 18577465
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