O Gene Resposta Primária de Crescimento 2, Um Fator de Transcrição com Dedos de Zinco, é Requerido para a Indução Completa da Anergia Clonal nas Células T CD4+

RESUMO

A tolerância imune a um antígeno específico resulta da indução de mecanismos celulares que limitam as respostas de célula T a antígenos seletivos. Um desses mecanismos é caracterizado pela atenuada proliferação e decréscimo na produção de IL-2 em células Th CD4+ fartamente estimuladas e é denotado pela anergia da célula T. Nós relatamos a identificação do gene reposta primária de crescimento (Egr-2;Krox-20), um fator de transcrição com dedos de zinco, como uma proteína-chave requerida para a indução da anergia em células T em cultura. A sondagem do gene em série revelou que a alta expressão da Egr-2 persiste em células T A.E7 murinas anergizadas mas sem proliferação. Em contraste, a Egr-1, um membro parental da família induzida na co-estimulação, exibe pouca ou nenhuma expressão no estado de anergia. A anulação da anergia mediada pela IL-2 causa rápida depleção da proteína Egr-2. A farta estimulação de células T A.E7 falha em aumentar a IL-2 e a expressão da Egr-1, enquanto a expressão da Egr-2 é gradiosamente aumentada. O silenciamento da expressão do gene Er-2 pelo tratamento de células T A.E7 com pequenos RNA de interferência antes da incubação com anti-CD3 sozinha impede a indução completa da anergia. Entretanto, a depleção da Egr-2 mediada pelo pequeno RNA de interferência cinco dias após a indução da anergia não parece abolir a hipo-responsividade à estimulação. Esses dados indicam que a expressão sustentada da Egr-2 é necessária para induzir um completo estado anérgico através de ações de genes regulados por este fator de transcrição.

INTRODUÇÃO

A estimulação dos linfócitos T pelo antígeno através do TCR (receptor de célula T) na ausência da co-estimulação através de receptores acessórios resulta na produção deficiente de IL-2 e falta de proliferação. A conseqüência dessa sinalização parcial é a hipo-responsividade de longo prazo à co-estimulação subseqüente, um estado conhecido como anergia clonal da célula T. A indução ‘in vitro’ da anergia clonal é atingível pelo tratamento de linfócitos T A.E7 cultivados com anticorpos monoclonais anti-TCR imobilizados (anti-CD3) somente, enquanto uma robusta produção de IL-2 e proliferação são conseguidas se for incluído anticorpo monoclonal anti-CD8. Em contraste, a remoção da IL-2 lavando-se as células ou com adição de anticorpos neutralizantes de IL-2 resulta em anergia, ainda que em um ambiente co-estimulador. Em adição. A administração da IL-2 é suficiente para recuperar as células T de seu fenótipo anérgico.

Análises farmacológicas comparativas foram usadas para caracterizar a contribuição da sinalização do IL-2R (receptor de IL-2) para a evasão da anergia. O impedimento à proliferação da célula T com rapamicina, uma droga que bloqueia a transição do ciclo celular da fase G1 para a fase S através da interação com a sinalização intermediária da IL-2 nos mamíferos alvo da rapamicina, induz anergia em células T completamente estimuladas. Em contraste, a hidroxiuréia, uma droga que retém o crescimento celular na fase S mas permita a sinalização da IL-2, não promove o estado anérgico. Foi proposto que a anergia da célula T resulta da sobre-regulação de fatores específicos de anergia subseqüentes ao encaixe do TCR, mas esses fatores são diluídos ou degradados a seguir à sinalização da IL-2. Em contraste, células anérgicas, as quais não recebem estimulação de IL-2, parecem manter altos níveis desses fatores. Células anérgicas expostas a IL-2 exógena proliferam, provavelmente diluindo ou sub-regulando esses fatores, e escapam ao fenótipo hiporesponsivo. Não estão claros quais eventos são responsáveis pela indução da anergia em seguida à estimulação do TCR e quais eventos a seguir à sinalização no IL-2R podem impedir tanto a indução da anergia quanto abolir o estado de anergia em clones não respondedores.

A estimulação produtiva das células T resulta na produção de IL-2, um processo que requer a iniciação de múltiplas vias de sinalização paralelas, incluindo a ativação da NFAT (fator nuclear de células T ativadas); os membros JNK da família MAPK [Omim 601158 – As proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPKs) são uma família de proteínas cinases de treonina-serina que participam em um sistema maior de sinalização através do qual as células transformam estímulos extracelulares em respostas intracelulares. Dentro deste grupo estavam as cinases extracelularmente reguladas, ou ERKs (Omim 176948 – As ERKs também são conhecidas como proteínas cinases ativadas por maturação ou mitógeno.Na ativação, ela se movimenta para o núcleo da célula estimulada, onde fosforila alvos nucleares.), bem como outra sub-família, chamada proteínas cinases ativadas por estresse (SAPKs). Derijard e outros (1994) clonaram e caracterizaram uma cinase assim, chamada por eles de JNK1, de uma biblioteca de cérebro fetal humano. A sequência prevista da proteína apresenta 64,5% de homologia com ERK1(omim 601795) e 67,6% de homologia com ERK2. Os autores demonstraram que a expressão da JNK1 é induzida por luz ultravioleta e que ela se liga ao domínio terminal em amina (NH2) de transativação de c-JUN (cuja atividade de ativação de transcrição é aumentada ), fosforilando este domínio na serina 63 e na serina 73.], ERK e p38 (uma SAPK); e NF-KB [Omim 164011 – O NFKB1 foi primeiramente descrito como agente de interação com uma sequência de 11 pares de base atuando em cis (cis em oposto a trans, ou seja do mesmo lado da fita) no intensificador da cadeia leve de imunoglobulina. O complexo NFKB tem duas sub-unidades alternativas de ligação a DNA, a p105 e a p52/p100.]. A contribuição individual de cada via para a produção de IL-2 é complexa e correntemente é objeto de estudo intenso. Muitos componentes dessas vias são conhecidos, e têm sido comparados com populaçãoes de células T completamente responsivas e com populações anérgicas. Por exemplo, a ativação da NFAT requer um influxo primário de cálcio ao citoplasma, um evento que ocorre comparavelmente em populações normais e anérgicas e resulta na mobilização da NFAT para o núcleo. Entretanto, a produção e localização nuclear dos constituintes da AP-1 fos e jun são defeituosos nas células anérgicas. [O fator de transcrição AP-1 media a expressão de genes primários imediata em resposta à exposição das células a estímulo extracelular. A AP-1 é composta de complexos diméricos formados por membros dos grupos de fatores de transcrição Jun e Fos. A ativação da AP-1 é causada por: 1) aumento da expressão das proteínas Fos e Jun e 2) modificação da Fos e da Jun por fosforilação após a tradução. As atividades de proteína cinase que fosforilam e ativam a Jun (JNK) e a Fos (FRK) foram descritas. Equanto a cinase de c-Fos FRK é pouco compreendida, a cinase de c-Jun foi estudada em detalhes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC450211/?tool=pubmed] em adição, as diminuições na ativação de membros da via MAPK como Ras, JNK e EPK foram descritas em células T anérgicas, sugerindo numerosos pontos de regulação para a atividade da AP-1.

Vários grupos têm usado agora métodos de sondagem para provar a identidade de fatores de anergia que podem mediar o fenótipo anérgico descrito, usando exposição diferencial e técnicas de micro-arranjo (microarray) em modelos de anergia tanto ‘in vitro’ quanto ‘in vivo’. Um número de proteínas prováveis por contribuírem para a indução da anergia foi descrito, incluindo membros da família de ligase de ubiquitina [uma pequena proteína encontrada em todas as células e que modifica histonas e degrada proteínas intracelulares. Stedman] E3. A presença dessas prováveis leva à degradação de proteínas de sinalização necessárias para a entrada dentro do ciclo celular, impedindo assim uma etapa de proliferação necessária para escapar-se à anergia.

Nós usamos uma sondagem genômica para identificar genes seletivamente expressados nas célula T A.E7 anérgicas mas não em populações de células de controle imitando a simulação ou completamente estimuladas. Nós relatamos que a expressão do gene 2 da resposta primária de crescimento (Egr) persiste nas populações de células anérgicas, embora sua expressão seja muito mais transitória na presença da sinalização de CD28. A família dos genes Egr consiste de quatro membros (de Egr-1 a Egr-4) que são expressados rapidamente em seguida à estimulação. Uma característica marcante da família Egr é o domínio de ligação a DNA que consiste de três motivos de dedos de zinco. Esse domínio é conhecido por ligar-se à sequência GCGGGGGCG e sua presença em regiões de promotores do gene tem sido mostrada como um facilitador da trans-ativação de genes alvo. A Egr-2 tem sido a mais amplamente estudada no contexto do sistema nervoso, e seu alvejamento em camundongos nocauteados (sem a Egr-2) resulta na letalidade precoce concorrente aos defeitos na padronização da parte de trás do cérebro, mielinação dos nervos periféricos e formação dos ossos. A habiliade da Egr-2 para sobre-regular genes alvo têm-se mostrado regulada por co-repressores tais como membros da família de ligação NGFI-A e Ddx20. O papel da Egr-2 no compartimento imune não está descrito extensivamente, embora tenha sido mostrado que a trans-ativaçao da Egr-2 é dependente de membros da família NFAT nos linfócitos T, e a Egr-2 pode atuar num papel na regulação do ligante de Fas dependente da NFAT. Nós mostramos que a Egr-2 é sub-regulada aproximadamente dois dias após a estimulação total, quando ocorre a proliferação ativa a seguir a sinalização do receptor de IL-2. Em contraste, as células anérgicas mantém níveis elevados da proteína durante dez dias após a estimulação inicial. A exposição de células anérgicas à IL-2 resulta na diluição ou deradação da Egr-2 aproximadamente de 3 a 5 dias após a adição da IL-2, quando a proliferação está mais ativa. A depleção da Egr-2 através do silenciamento do gene mediado por pequeno RNA de interferência (siRNA) rompe a anergia demostrada pela ativação restaurada da ERK, produção de IL-2, e proliferação ainda que o siRNA de controle não tenha efeito significativo. Esses dados sugerem que a expressão da Egr-2 é requerida para a indução completa da anergia nas células T.

RESULTADOS

A Estimulação de Clones das Células T A.E7 Através do TCR na Ausência de Co-estimulação Resulta em Anergia

Um método para indução de anergia em linfócitos T é a entrega do sinal através do TCR na ausência de co-estimulação através da CD28. Para otimizar condições para a identificação de genes com perfil de expressão única em células T anérgicas, nós anergizamos as células T A.E7 cultivadas com anticorpo monoclonal anti CD3 e comparamos sua responsividade com células que tinham sido fingidamente estimuladas (anticorpo IgG imobilizado de controle) ou com células totalmente ativadas (com anticorpo monoclonal anti-CD3 mais anti-CD28 solúvel [o anticorpo pega as duas CDs?]). Nós determinamos que cinco dias de cultura após a remoção do anti-CD3 era o tempo mais inicial no qual as células anérgicas poderiam ser identificadas como fenotípicamente distintas das células totalmente estimuladas. As células anergizadas incorporaram menos [3H] timidina no DNA em resposta ao desafio subseqüente com anticorpo para PCC (Pigeon cytochrome c; citocromo c de pombo) e esplenócitos singênicos (geneticamente idênticos) irradiados comparados com células que tinham sido totalmente ativadas inicialmente. Dados similares foram obtidos quando a produção de IL-2 foi medida. Nos primeiros períodos (ou seja, três dias após a estimulação inicial), ambas as células tratadas com somente anti-CD3 e aquelas tratadas com anti-CD3 mais anti-CD28 (primeiro e segundo sinais PMID: 17277121) não responderam ao desafio subsequente com anticorpo.

Células T Anérgicas Sobre-regulam e Mantém a Expressão da Egr-2 por Longo Prazo

Os perfis de transcrição de mRNA foram comparados entre as células A.E7 anergizadas, completamente estimuladas e não tratadas usando-se Fragmentos de Genes Affymetrix. As células foram processadas para isolamento de mRNA e síntese de cRNA em três pontos de tempo: imediatamente após a remoção de um estímulo de 12 horas, dois dias após a remoção do estímulo, e cinco dias após a remoção do estímulo. A réplica dos experimentos foi desempenhada para cada condição e tempo, e uma porção de cada grupo de células foi estimulado novamente com anticorpo para verificar a presença de seus fenótipos pretendidos respectivos. Análises dos dados obtidos das séries de expressão mostraram que a Egr-2 estava mais altamente expressada nas células anérgicas em comparação com os controles nos dias 2 e 5. Em contraste, nas horas iniciais (12 horas) a Egr-2 foi altamente expressada em ambas as células anérgicas e completamente ativadas.

Para comparação, a expressão dos transcritos da IL-2 e e da Egr-1 estão mostrados (Figura 2, B e C). Como esperado, a expressão da IL-2 é significativa somente nas células T ativadas nas primeiras 12 horas. A expressão da IL-2 em células anérgicas é induzida em alguma extensão em comparação com as células simuladamente estimuladas, mas significaticamente menos ainda (5 vezes) do que nas células completamente ativadas. Em contraste a Egr-1, um gene conhecido pelo envolvimento na ativação inicial da célula T e na indução da IL-2, está igualmente induzido em ambas as células T anérgica e completamente ativada nas 12 horas mas não mantém sua expressão passado esse estágio inicial. Análises quantitativas de RT-PCR do RNA de Egr-2 com experimentos representativos de fragmentos de gene confirmaram os resultados dos fragmentos de genes.



A Expressão da Proteína Egr-2 é Diminuída em Células em Proliferação a Seguir a Ativação Completa ou em Seguida ao Tratamento das Células Anérgicas com IL-2

A proteína Egr-2 foi examinada por Pigmentação Western em células anergizada, simuladamente estimuladas e completamente estimuladas. A proteína foi isolada imediatamente após a remoção das células do estímulo de 12 horas, e todos os dias por nove dias desde então. Após 12 horas de estimulação, as células tratadas tanto com anti-CD3 sozinho ou com ambos anti-CD3 e anti-CD28 exibiram alta expressão da proteína Egr-2. De importância é que as células que foram completamente ativadas mostraram rápida perda da Egr-2 tal que pelo quinto dia pouca ou nenhuma pôde ser detectada. Em contraste, as células anergizadas mostraram marcadamente uma diminuição inicial procrastinada na expressão de Egr-2, e essas células retiveram significativa expressão do fator de transcrição em todo o período de nove dias. Assim, a expressão da Erg-2 correlaciona-se inversamente com a responsividade de cada população de células estudada. Nós também avaliamos a proliferação da célula T pela contagem do número de células vivas todos os dias por nove dias após a remoção do estímulo. A viabilidade foi determinada por exclusão de azul de tripano. Como foi mostrado, a expressão da Egr-2 é diminuída em células completamente ativadas durante a proliferação.

Porque o fenótipo hipo-responsivo é abolido quando as células T anérgicas são expostas à IL-2 durante o período de descanso, nós examinamos os níveis da proteína Egr-2 em células estimuladas simuladamente e em células anérgicas A.E7 subsequentemente tratadas com IL-2. As células foram anergizadas com anti-CD3 imobilizadas ou simuladamente estimuladas com anticorpo IgG de controle imobilizado. A porção de cada população celular foi processada por Pigmentação Western imediatamente após a remoção do estímulo de 12 horas, enquanto as células remanescentes foram cada divididas em duas sub-populações e incubadas com ou sem 10U/ml rmIL-2. As células foram extraídas após os dias 1, 3, 5, 7 e 10 para serem avaliados os níveis de proteína e de Egr-2 por Western blot. Esses dados mostram que a proteína Egr-2 é rapidamente diminuída nas células anérgicas após a exposição à IL-2 exógena, e isso é mais evidente entre o primeiro e o quinto dia. Que a IL-2 abole a anergia foi confirmado pela medição da responsividade dessas células ao desafio com o antígeno, avaliado pela incorporação de [3H] timidina no décimo dia. Tomados juntos, os dados nas figuras 2 e 3 revelam que a expressão da Egr-2 correlaciona-se inversamente com a responsividade das células T ao estímulo do antígeno, e que as células anérgicas retêm comparativamente níveis elevados desse fator de transcrição.

Em Comparação com as Células Respondedoras, a Erg-2 é Expressada Maximamente em Células Anérgicas Após o Desafio Enquanto a Expressão de Erg-1 é Reprimida

As células anérgicas ou simuladamente estimuladas previamente foram a desafiadas novamente por zero, três e seis horas com APCs apartadas de células T que tinham sido carregadas com alta (10μM) ou baixa (0,3 μM) concentração de PCC. As células foram recolhidas ao gelo, permeabilizada, e tingidas para Egr-2 ou Egr-1 para análises de citometria de fluxo. Como previamente mostrado por Western blot, antes da estimulação (zero hora) a Erg-2 é mais altamente expressada nas células anérgicas enquanto a Egr-1 não é expressada em nenhuma população.

A Egr-2 é induzida aos níveis máximos em células previamente estimuladas simuladamente por três horas e permanece em altos níveis por ao menos seis horas. Nas células anérgias, a Egr-2 começa em níveis aumentados mas foi induzida além para os níveis máximos com a estimulação após três horas. A máxima expressão da Er-2 após a re-estimulação foi igual em ambas as células simuladamente estimuladas e anérgicas. A estimulação com ambas as doses de antígeno incutiu o mesmo padrão de expressão de proteínas, entretanto uma alta dose de antígeno resultou em aumento da expressão da Erg-2 em ambas as populações.

A Egr-1 foi sobre-regulada aos níveis máximos nas células previamente simuladamente estimuladas por três horas, porém começou a retornar aos níveis baixos após seis horas. Isso é verdade para as duas dosagens de antígeno. As células anérgicas falharam em sobre-regular a Egr-1 para os níveis das células simuladamente estimuladas quando foram estimuladas com ambas as concentrações alta ou baixa de antígeno, Também em contraste com células previamente estimuladas com simulação, os níveis expressados de Egr-1 nas células anérgicas foram quase reduzidos aos baixos níveis após o pico de expressão.

Para confirmar esses dados, os níveis das proteínas foram avaliados por análises de Western blot. Os níveis de Egr-2 foram sobre-regulados em ambas as populações na incubação com anti-CD3 e anti-CD28, e persistiram todo o tempo, enquanto os níveis da proteína Egr-1 aumentaram inicialmente na população anérgica e foi subsequentemente sub-regulado durante o curso de oito horas. Isso ficou em contraste com a população estimulada simuladamente, na qual a expressão da Egr-1 persistiu.

A Proliferação e a Produção de IL-2 Foi Parcialmente Restabelecida nas Células Anérgicas
Carentes de Egr-2 nos Primeiros Estágios, Mas Não nos Últimos Estágios da Anergia

Nós testamos se a Egr-2 é necessária para a indução do fenótipo anérgico pela atenuação da expressão da Egr-2 através do silenciamento do gene mediado por siRNA. As células A.E7 foram eletroporadas com siRNA construídos específicamente para Egr-2, com siRNA de controle, ou sem siRNA, levada em conta a retomada por 4 a 6 horas, e então incubadas por doze horas com anticorpo monoclonal imobilizado anti-CD3 para induzir a anergia (só o primeiro sinal). Outra amostra de células foi eletroporada sem siRNA e restou não estimulada para servir como células T de controle não anergizadas. Para ensaiar a eficiência da transfecção. Nós transfectamos uma amostra de células com siRNA etiquetado com FITC. Através de citometria de fluxo, nós determinamos a eficiência da transfecção consistentemente na amplitude de 90 a 99%. Usando microscopia de fluorescência, nós descartamos a possibilidade de que o siRNA fosse simplesmente aderente ao sito externo da célula. Cinco dias após a remoção das células T ao estímulo anergizante (somente com anti-CD3), os níveis da proteína Egr-2 estavam significativamente mais baixos na presença de ambos os siRNAs direcionados contra diferentes regiões do mensageiro de Egr-2. Células anérgicas eletroporadas com siRNA de controle ou com nenhum siRNA retiveram altos níveis da proteína Egr-2. Notavelmente, as células anérgicas tratadas com siRNA com diminuída expressão da proteína Egr-2 foram mais responsivas do que as anérgicas de controle ao desafio com antígeno. A aumentada resposta proliferativa das células com baixos níveis da proteína Egr-2 foi avaliada por ambas a incorporação de [3H] timidina no DNA e pela diluição com CFSE. Através deste último ensaio, 97% das células em descanso dividiram-se ao menos uma vez, enquanto somente 50% das células anérgicas eletroporadas com controle ou com siRNA nenhum dividiram-se ao menos uma vez. Em contraste, 73% das células anérgicas depletadas de Egr-2 dividiram-se ao menos uma vez. Adicionalmente, o defeito na produção de IL-2 nas células T anérgicas é parcialmente restabelecido com a depleção da Egr-2 mediada pelo siRNA. Esses dados confirmam uma correlação inversa entre a expressão de Egr-2 e a responsividade das células T, e sugerem uma relação de causa entre a alta expressão de Egr-2 e o estado de anergia.

Para avaliar se os efeitos da Egr-2 estão presentes nas horas mais tardias, células T A.E7 foram anergizadas, descansadas por cinco dias, e então eletroporadas com siRNA de fita dupla específicos para Egr-2, com siRNA, ou sem siRNA. As células foram então descansadas por mais dois dias, então re-estimuladas com antígeno mais esplenócitos singênicos irradiados. Embora a proteína Egr-2 estivesse reduzida nas células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2 sob essas condições, elas permaneceram não respondedoras à estimulação do antígeno como avaliado pela incorporação da [3H] timidina e pela produção de IL-2.

Porque alguma proteína Egr-2 é expressada as células estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28, a responsividade dessas células foi comparada com a das células anérgicas, e as células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2. Na estimulação antigênica, as células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2 manifestam uma resposta que é intermediária à da população anérgica de controle e à da população completamente estimulada.

A Fosforilação da ERK é Restaurada nas Células Anérgicas que Carecem de Egr-2

Com base a restauração da resposta proliferativa e da produção de IL-2 nas células T A.E7 anergizadas com a atenuação da expressão da Egr-2 durante a indução da anergia, nós avaliamos a integridade da via de sinalização da MAPK nessas células. A fosforilação deficiente, e a ativação da ERK-1 e da ERK-2 nas células T anérgicas em resposta a estimulação completa tem sido bem documentada. Nós pudemos confirmar o decréscimo na fosforilação da ERK na estimulação das células T anergizadas. Esse defeito observado na fosforilação da ERK na estimulação das células T anérgicas com anti-CD3 mais anti-CD28 foi revertido quando a expressão da EGR-2 foi reduzida através do silenciamento do gene mediado por siRNA. Assim a depleção da Egr-2 em células T a.E7 impede a indução das três propriedades chaves das células anérgicas mediadas pelo TCR: a falência na proliferação, a falha na produção de IL-2 e a sub-regulação da cascata MAPK.

A Depleção dos Níveis da Proteína Egr-2 em Células Estimuladas com CD3+CD28 Aumenta sua Responsividade à Estimulação

Como é mostrado na figura 5G, é possível detectar baixos níveis de Egr-2 em células completamente estimuladas, ainda que em momentos tardios. Para determinar o efeito que isso deve ter na responsividade celular, nós tratamos as células A.E7 com siRNA de Egr-2 e as estimulamos com anti-CD3 e anti-CD28 imobilizadas. Após a remoção do estímulo, as células foram deixadas em descanso por cinco dias, e então, re-estimuladas com esplenócitos singênicos irradiados pulsados com antígeno PCC. Nas células tratadas com siRNA de Egr-2, a responsividade estava aumentada em comparação àquelas tratadas com um siRNA de controle, demonstrando adicionalmente que a presença de Egr-2 abate a capacidade das células T para responder à estimulação completa.

DISCUSSÃO

Foi bem documentado que a estimulação das células T através do TCR na ausência da co-estimulação pode resultar em hipo-responsividade de longo prazo à uma estimulação subseqüente, chamada anergia. Embora o fenótipo anérgico tenha sido bem estudado, os eventos moleculares responsáveis pela indução e manutenção da anergia não são plenamente conhecidos. A anergia é muito provavelmente um processo complexo envolvendo um número de genes que servem para mediar a resistência à co-estimulação. Os dados apresentados neste relato indicam fortemente que o fator de transcrição Egr-2 funciona no estabelecimento do estado anérgico nas células T A.E7. O perfil de expressão da Egr-2 está consistente com as características de uma fator que confere anergia como previsto por Powell e outros em que: 1) é inicialmente sobre-regulada em ambas as células T anergizadas e plenamente ativadas antes de sua proliferação e sua expressão é impedida pela ciclosporina A; 2) sua expressão decresce mais rapidamente em células proliferativas do que nas célula anergizadas; e 3) altos níveis de expressão da Egr-2 na anergia são abolidos pela IL-2, a qual reverte concorrentemente o estado de anergia.

Interessantemente, a alta expressão da Egr-2 foi encontrada em outros estudos enquanto associada com a anergia, mas os achados iniciais não foram extendidos. Lechner e outros sondaram genes expressados em células T primárias anergizadas ‘in vivo’, e relataram a indução da expressão da Egr-2 na população de células T anergizada. Entretanto, nesses estudos a comparação foi feita com células T primárias purificadas estimuladas com uma dose mitogênica de anti-CD3 por 16 horas, um ponto de tempo anterior à sub-regulação da Egr-2. De fato essas células de controle estimuladas também mostraram alta expressão de Egr-2. Em um segundo estudo de perfil de expressão, Macian e outros também observaram a sobre-regulação da Egr-2 a seguir ao estímulo de anergização mas avaliaram somente os momentos iniciais após a indução da anergia na célula T, antes da proliferação nessa população de controle ativada. Outro estudo usando micro-seriação (microarray) para analisar linfócitos B em tolerância mostrou alta expressão da Egr-2 em comparação com células de controle não estimuladas. Todos estes estudos estão consistentes com os dados apresentados neste relato, e com a conclusão de que a Egr-2 atua num papel em conferir o estado anérgico.

Nossa observação de que a Egr-1 ativadora da IL-2 está reprimida nas células anérgicas estimuladas é uma novidade, e paraleliza com a repressão dos componentes da AP-1 fos e jun. Esse efeito pode ser ainda outro mecanismo de hipo-responsividade nas células anérgicas. O fato de que a sobre-regulação da Egr-2 ocorre normalmente em células anérgicas estimuladas pode explicar por que as células anérgicas requerem a exposição seus antígenos para manter a hipo-responsividade. Tanchot e outros descrevem um sistema de indução de anergia para um peptídeo ‘in vivo’ no qual as células T sobrevivem e permanecem tolerantes ‘in vivo’ enquanto o antígeno estiver presente. Se as células anérgicas são transferidas para um novo hospedeiro que não expressa este peptídeo, as células recuperam a responsividade. Se são transferidas para outro novo hospedeiro que expressa o antígeno, elas são induzidas a um nível ainda mais profundo de anergia. Em outro sistema descrito por Pape e outros, no qual a anergia é induzida em células com TCR transgênico em hospedeiro normal com injeção de peptídeo na ausência de adjuvante, as células anérgicas perdem a não responsividade após um período de tempo. Essa perda da responsividade é precedida pela remoção do antígeno no hospedeiro. Se o antígeno tolerado é repetidamente introduzido as células anérgicas permanecem hipo-respondedoras por mais tempo do que com uma única injeção.

Ao longo do tempo, nós observamos essa dissipação de anergia na linha de células A.E7 coincidente com uma perda da expressão de Egr-2. É possível que a Egr-2 mantenha a transcrição de moléculas efetoras da anergia por longo prazo, e que a perda da expressão da Egr-2 ao longo do tempo contribua para a não permanência da anergia. Devido à estimulação completa das células anérgicas ser capaz de revigorar a expressão da Egr-2 aos níveis máximos sem indução da transcrição de IL-2 ou de proliferação, é possível que a presença do antígeno em modelos ‘in vivo’ discutido anteriormente mantenha a hipo-responsividade por sucessiva sobre-regulação da Egr-2. Embora não não sejamos capazes de observar a abolição da anergia pelo silenciamento da Egr-2 no quinto dia após a indução da anergia, é possível que alvos transcricionais chave da Egr-2 estejam presentes neste ponto de tempo e não sejam abatidos rápido o suficiente para restaurar a responsividade nos nossos experimentos.

Dada sua natureza de fator de transcrição, a Egr-2 pode ser responsável pela ativação em uma rede de genes cujas proteínas mediam os muito diferentes aspectos do fenótipo anérgico observado, incluindo a hipo-responsividade, direcionamento diferenciado, e produção de citocina. O fato de outros estudos terem observado a indução da Egr-2 em linfócitos tolerantes ambos in vitro e in vivo sugere que a Egr-2 pode funcionar na anergia induzida por uma variedade de mecanismos. Baseados nesses dados apresentados nesta reportagem, a identificação de fatores sob regulação pela Egr-2 nesses modelos deverá proporcionar esclarecimentos importantes sobre os mecanismos envolvidos na manutenção da tolerância imune. Um número de artigos recentes tem demonstrado a importância das ligases de ubiquitina E3 na indução da anergia. Os mecanismos pelos quais elas induzem a anergia não foram fartamente demonstrados, mas têm-se especulado que elas induzem a anergia através da degradação de importantes moléculas de sinalização tais como as proteínas cinases C e fosfolipase C ƴ-1. É possível que a sobre-regulação das ligases de ubiquitina E3 também impeçam a produção de IL-2 pela degradação de proteínas necessárias para a mensagem de transcrição da IL-2. Será interessante determinar em estudos futuros se os mecanismos relacionados com a função da Egr-2 nas células T convergem com aqueles iniciados pelas ligases de ubiquitina E3.

FONTE

http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/173/12/7331