A Expressão do cDNA do Fator VIII da Coagulação é Reprimida por um Silenciador Transcricional Localizado em sua Região Codificadora. (Continuação)

Por Rob C. Hoeben, Frits J. Fallaux, Steve J. Cramer, Diana J.M. van den Wollenberg, Hans van Ormondt, Ernest Briët e Alex J. van der Eb


DISCUSSÃO

Este relatório descreve a identificação de sequências na região codificadora do cDNA do fVIII humano que reprime a expressão ao nível da transcrição. Esse repressor modula para menos a expressão de vetores retro-virais contendo o gene fVIII, o que resulta na síntese inferior da proteína fVIII e reduz a produção de retro-viroses recombinantes em ao menos duas ordens de magnitude. A escassez do mRNA específico do vetor nas linhagens de empacotamento (células) pode explicar completamente os baixos títulos de vetores retro-virais do fVIII. Isso está de acordo com a observação de que a amplificação do vetor do fVIII nas linhas de células de empacotamento aumenta a produção viral. Além disso, a quantidade de transcritos neoR nas células alvo pode ser muito baixa para permitir a célula sobreviver à seleção por G418, baixando o título viral aparente. Nossas observações confirmam e estendem a descrição por Lynch e outros sobre a inibição da acumulação do mRNA por sequencias do cDNA do fVIII (nucleotídeos de 1681 a 2277, seguidos dos nucleotídeos de 5002 a 5582). Entretanto, nós encontramos a repressão em dependência da presença do fragmento Xmn I-BglII (do nucleotídeo 135 ao 1680), o qual está localizado fora da região identificada por estes investigadores. A causa dessa discrepância não está clara. Enquanto o estudo mencionado acima consistia na produção do vírus como um parâmetro para a repressão, nós exploramos um ensaio mais direto baseado na expressão transitória do gene CAT, dessa forma circunscrevendo os problemas com a instabilidade (deleção de sequências do fVIII) dos vetores virais.

Kaufman e outros estudaram os níveis de RNA em células de ovário de ramster (CHO) contendo múltiplos (mais de 100) vetores de expressão de cDNA de fVIII e de cDNA de vWF e observaram quantidades 40 vezes mais baixas de RNA de fVIII do que de RNA de vWF quando corrigidos para número de cópias de vetor de expressão. As taxas de transcrição de ambos os genes foram encontradas similares em análises de busca nuclear, o que sugeriu que a causa da repressão seria pós-transcricional. Em contraste, nosso estudo sugere que a inibição é causada por um mecanismo de transcrição. Nossa conclusão está baseada em várias linhas de evidência. Primeira: a diferença na quantidade de RNA específico para o vetor em estado estável observada em células infectadas com o vetor M5neo e seu derivado M5F8dB2.6 reflete as taxas de transcrição como medidas em ensaio de busca nuclear. Segundo: o RNA neoR sub-genômico, o qual não contém nenhuma sequência de fVIII, é reprimido em células que contém o vetor de fVIII, sugerindo um mecanismo que opera antes da ocorrência do splicing. Terceiro: a estabilidade relativa do mRNA do fVIII nas linhagens de empacotamento exclui a estabilidade citoplasmática como um mecanismo. Isso é sustentado ainda mais pela observação de que a inserção do fragmento SX para dentro da unidade de transcrição do repórter CAT não altera a estabilidade do transcrito. Também, a observação de que o tratamento das células com sódio butirato, um conhecido estimulador da transcrição, aumenta os níveis de RNA de fVIII muitas vezes, argúi contra um mecanismo que opera no nível da estabilidade do RNA. Além disso, o elemento repressor suspeito nesse estudo funciona independentemente de sua orientação em uma unidade de transcrição, sustentando um mecanismo que opera no nível do DNA mais do que no do RNA. Finalmente o fragmento AH, codificador do domínio A2, também reprime marcadamente a expressão quando colocado a montante do LTR do MuLV que dirige o gene marcador CAT. Coletivamente, esses dados sugerem que as sequências repressoras atuam como silenciadoras transcricionais da expressão.

Ainda não está claro se a repressão observada é de alguma relevância fisiológica para a regulação da expressão do fVIII endógeno ‘in vivo’. Nós não podemos excluir a possibilidade de que elementos seqüenciais que são normalmente separados por íntrons e, assim, estão há muitas quilobases de distância são adjacentes no cDNA e por coincidência ganham tal função. O fragmento de 305 pares de bases Xmn-BglII é derivado dos éxons de nove a onze do gene fVIII e compreende mais de nove quilobases de DNA genômico.

O mecanismo detalhado pelo qual o repressor atua ainda está obscuro. A falta de transcrição do domínio A1 como foi observada pela ausência de sinal de hibridização com a prova fVIII-A1 exclui a atenuação transcricional no domínio A2 como um mecanismo. Tal mecanismo tem sido encontrado por regular a expressão do gene c-myc. A observação de que a repressão pode ser aliviada pela co-transfecção de quantidades excessivas de DNA competidor implica que a repressão não é causada pela sequência de DNA em si (ou seja, uma conformação do DNA que seja desfavorável à transcrição), mas além disso sugere que componentes celulares atuam num papel de repressão. A inspeção da sequência do fragmento de 305 pares de bases que está envolvido na repressão não revela imediatamente quaisquer sítios de consenso deliberado para ligação de candidatos a repressor. Até o momento, entretanto, somente poucos sistemas repressores nos eucariotos superiores foram caracterizados com detalhes. No fragmento de 305 pares de bases, nós notamos duas sequências com uma razão de 10/11 com o consenso WTTTAYRTTTW (W é triptofano, T é Treonina, A é Alanina, Y é Tirosina, R é Arginina) observado em sequências de replicação autônoma (ARS) das leveduras. Os elementos ARS permitem a manutenção de plasmídios extra-cromossômicos nas leveduras e têm sido implicados em funcionar na origem da replicação do cromossomo e como regiões de fixação à matriz nuclear (MARs), bem como moduladores da atividade de estimuladores e silenciadores transcricionais. Nas MARs dos eucariotos superiores, sequências consenso similares tem sido encontradas. Assim, uma MAR ou ARS no cDNA do fVIII poderia explicar os efeitos repressores do cDNA do fVIII na transcrição. Em adição, a observação de que a deleção do Xmn I-Bgl II (XmnI-Bgl II, de 1375 ao 1680) alivia a repressão enquanto o fragmento por si só não é suficiente para diminuir a expressão concorda plenamente com a estrutura modular dos elementos MARs e bem como de ARS. A remoção ou mutação de alguns elementos ARS diminuem sua função, mas não a abole completamente. Nós temos evidência de que os elementos WTTTAYRTTTW derivados do fVIII podem reprimir a expressão de genes heterólogos se inseridos na unidade de transcrição, mostrando o potencial desses elementos no cDNA do fVIII em reprimir a expressão. Se a expressão do fVIII está inibida pela fortuita presença de ARS ou MARs no cDNA do fVIII, múltiplas mutações serão requeridas para abolir completamente o repressor. A retirada do fragmento XmnI-Bgl II de 305 pares de bases dos vetores de expressão não é uma opção. Essa região da molécula é essencial para a função do fVIII, já que oito mutações de sentido trocado foram identificadas nessa região que resultam na hemofilia A. Correntemente, nós estamos tentando elucidar o mecanismo preciso da repressão e definir as sequências envolvidas, por exemplo, pela identificação de elementos de ligação a proteína no fragmento Xmn I-Bgl II de 305 pares de bases. A identificação de elementos responsáveis permitirá a eliminação dos sítios de ligação pela introdução de mutações não codificadoras. Como uma abordagem alternativa, os íntrons poderiam ser introduzidos para separar e inativar potencialmente vários elementos repressores. A geração de cDNAs de fVIII mutado que são expressados mais eficientemente aumentará a quantidade da proteína fVIII produzida nas células e melhorará o título de estoques de vírus de fVIII. Isso, é claro, não somente melhorará a executividade da terapia genética para hemofilia A, mas também será de considerável importância para a produção de fVIII derivado de DNA recombinante para transfusão.

Obs.: Enzimas de Restrição Que Cortam a Fita Dupla de DNA e Respectivos Sítios de Atuação
Acc I : GTATAC ou GTCGAC (?);
Bgl II : AGATCT;
Xho I : CTCGAG;
Sal I: GTCGAC;
Spe I ACTAGT;
Xmn I: GAANNNNTTC (produz final cego);
BamH I: GGATCC;
Hind II: 5’ AAGCTT 3’

Fonte:
PMID: 7727775 - http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/85/9/2447