A ATIVIDADE DE LECTINA DO COMPLEXO FATOR VIII DA COAGULAÇÃO/von WILLEBRAND

Francisca Santizo, Edgar Zenteno, Socorro Pina-Canseco, Pedro Hernandez-Cruz, Margarito Martínez Cruz, Laura Perez-Campos Mayoral, Eduardo Pérez-Campos e Ruth Martínez Cruz – México



RESULTADOS

Purificação do Complexo FVIII/VWF

A purificação do FVIII/VWF após a precipitação de acetona foi desempenhada por cromatografia de afinidade em uma coluna de sefarose 4B de concanavalina A, e o complexo FVIII/VWF foi separado com 200 mM de manosídeo [glicosídeos da manose. Stedman] alfa metil. O complexo FVIII/VWF purificado consiste de uma banda como determinado por eletroforede se gel não desnaturada (não modificada).

Atividade de Hemaglutinação e Especificidade do Complexo FVIII/VWF para Açúcar

O complexo FVIII/VWF purificado mostrou atividade de hemaglutinação na presença de eritrócitos de coelho e bovinos às concentrações respectivas de 6,0 e 12 μg/ml. Os eritrócitos de outras espécies animais, tais como porco e cabra, bem como dos tipos sanguíneos humanos A, B e O, não foram aglutinados. Após os eritrócitos serem tratados por trinta minutos com tripsina ou com sialidase de C. perfringens [Os ácidos siálicos são ésteres e outros derivados do acil ligado em N ou O do ácido neuramínico. A sialidase cliva resíduos acetilneuramínicos terminais de oligossacaídeos, glicoproteías ou glicopídeos. Sin. neuraminidase. Stedman], a atividade de hamaglutinação do complexo aumentou em quatro vezes; além disso , o complexo FVIII/VWF mostrou atividade de hamaglutinação na presença dos eritrócitos dos grupos sanguíneos A e B humanos em concentrações de 1,5 e 3 µg/ml, respectivamente; entretanto, em concentrações similales, os eritrócitos de cabra, boi, porco e humano de tipo sanguíneo O não foram reconhecidos ainda que depois do tratamento com as enzimas.

A partir dos carboidratos testados, somente a GlcNAc e a fucose inibiram a atividade de hemaglutinação do complexo. A concentração mínima necessária para a GlcNAc e a fucose inibirem quatro doses hemaglutinantes de complexo FVIII/VWF foi de 10 mM cada; uma capacidade inibidora similar da fucose e da GlcNAC foi observada quando testes de hemaglutinação foram desempenhados na presença de eritrócitos humanos A e B ou de boi e de coelho.

Ensaio de Agregação de Plaquetas na Presença de FVIII/VWF e sua Inibição com Carboidrato

Quando o PRP (plasma rico em plaquetas com 200.000 plaquetas/μL) foi estimulado com 15 µl de 25 μM ADP (adenosina difosfato), cem por cento das células foram agregadas; quando 3,5 µg/ml de FVIII/VWF foram adicionados, a agregação das plaquetas foi inibida em 40% após seis minutos. Quando 2,5 mM de fucose ou de GlcNAc foram incubados previamente com o complexo FVIII/VWF, a agregação reverteu a inibição a uma média de 90 e 95%, respectivamente, enquanto outros carboidratos, tais como galactose e GalNAc, ainda que a 200 mM cada, reverteram a inibição somente a uma média de 58 e 48%, respectivamente (P,0,001). Como controles negativos, foram usadas glicina-NaCl, GlcNac, GalNAc, galactose, e fucose (todos a 15 mM).

Ensaios de Ligação de FVIII/VWF com Derivados de Dextan Glicosilados e Inibição com Carboidratos

FVIII/VWF, a 20 μg/ml, ligaram-se a GlcNAc ou fucose derivados de dextran com biotina (molécula etiquetadora para visualização) a concentrações de 1,8 µg a 30 μg, enquanto 30 µg de GalNAc derivados de dextran biotinilados mostraram pouca interação, e galactoses derivadas de dextran não mostraram ligação. A interação da fucose e da GlcNAc derivadas de dextran foi inibida com a adição de 25 mM de monossacarídeos de fucose ou GlcNAc respectivamente.

DISCUSSÃO

Os fatores VIII e von Willebrand são glicoproteínas do plasma que circulam em um complexo não covalente e atuam num papel crítico no processo da coagulação do sangue. A maior parte do FVIII liga-se a vWF, formando um complexo firme e estável que o protege da degradação proteolítica precoce e impede sua captura pela célula (Fay e outros,1991). O FVIII é um co-fator essencial para a ativação do fator X mediada pelo fator IX. O VWF media a adesão e ativação das plaquetas; entretanto, nenhum papel tem sido atribuído ao complexo FVIII/vWF (Lilicrap,2008). Neste trabalho, nós identificamos a potencial atividade de lectina do complexo FVIII/VWF purificado do plasma humano.

O complexo FVIII/VWF purificado com concanavalina A [a concanavalina A é uma lectina da semente vegetal, que liga manose http://mcdb-webarchive.mcdb.ucsb.edu/sears/biochemistry/] mostrou atividade hemaglutinante na presença de eritrócitos bovinos e de coelho. O complexo FVIII/VWF purificado não mostrou atividade de aglutinação na presença dos eritrócitos dos grupos sanguíneos humanos A, B e O. Após tratamento com sialidase ou tripsina, o reconhecimento para eritrócitos bovinos e de coelho aumentou quatro vezes; interessantemente, os eritrócitos humanos de tipo A e B foram reconhecidos pelo complexo FVIII/VWF, e os eritrócitos humanos de tipo O não fora aglutinizados ainda após o tratamento com as enzimas. O fato de que o FVIII/VWF tem alta esoecificidade anti-A e anti-B sugere a relevância dos carboidratos relacionados ao grupo sanguíneo determinantes na interação com o complexo FVIII/VWF. A fucose e aGlcNAc inibiram a atividade de hemaglutinação mostrada pelo complexo FVIII/VWF na presença de qualquer dos eritrócitos aglutinados. A galactose e a GalNAc não mostraram nenhum efeito na atividade de hemaglutinação do complexo. A eliminação do ácido siálico ou sialoglicopeptídeos dos eritrócitos por tratamento com C. perfingens ou tripsina, respectivamente, aumentou a atividade de aglutinação do complexo para eritrócitos de coelho e bovinos e favoreceu a aglutinação de eritrócitos A e B. Isso sugere que o ácido siálico torna inefetiva a interação desses fatores com oligossacarídeos da membrana e também indica a natureza enigmática do receptor para a atividade de lectina. Esses dados sugerem fortemente a participação ativa do complexo na discrasia [estado geral mórbido resultante da presença de material anormal no sangue, geralmente aplicado a doenças que afetam as células do sangue ou as plaquetas. Stedman] da coagulação associada com infecções por espécies bacterianas que produzem sialidase, tais como Streptococcus pneumoniae, o qual tem estado associado à patogênese do processo trombótico (Myers e Marrie, 1993).

Foi mostrado que a polimerização do VWF aumenta a afinidade de ligação a receptores de superfície nas plaquetas GPIbα e αIIbβ3, através de interações eletrostáticas (Huizinga e outros 2002; Denis e outros, 2008), sugerindo que a interação com plaquetas não é devida à interação com receptores de lectina. A partir de um ponto de vista biológico, a característica mais importante do complexo FVIII/VWF é mostrar especificidade por carboidratos diferentes e mostrar certa flexibilidade de ligação a sítios que permitiriam o reconhecimento de uma parcela de carboidratos estruturalmente aparentados como um mecanismo de regulação similar ao das outras lectinas relatadas (Vasta e outros, 1994; Hernández e outros, 2004). As lectinas dos vertebrados estão em inúmeras famílias estruturalmente distintas e participam em diferentes funções intracelulares, tais como tráfego, origem e alvo de glicoproteínas em maturação, (Dodd e Drickamer, 2001) bem como nas funções extracelulares, tais como interações de adesão (Zalensky e Gready, 2005), pela mediação da interação com a matriz extracelular ou fluidos do corpo, ou pela mediação de adesão celular, sinalização celular, indução de transcrição de genes [Obs.: É por isso que a MBL2 fica no 10q21 e tem outra cópia depois do gene da Egr2?], modifcações pós-tradução, remoção de glicoproteínas e reconhecimento de patógenos (Britten e outros; 1998 van Liemp e outros, 2006).

Sabe-se que a ativação do fator X a fator Xa é catalizada pelo fator IXa e seu co-fator VIIa na via intrínseca. A relevância do papel funcional dos resíduos de carboidrato nos fatores de coagulação tem sido demonstrada usando-se lectinas de aglutinina de Galanthus nivalis [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/23/Galanthus_nivalis.jpg], Sambucus nigra [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/61/Sambucus_nigra_004.jpg], Maackiaamurensis[http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c7/Maackia_amurensis.jpg], amendoim (galactose), Datura stramonium (GlcNAc) [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d6/Koeh-051.jpg], aglutinina de Phaseoluscoccineus[http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1e/Phaseolus_coccineus_flores.jpg] Var. Alubia [A eritroaglutinina de Alubia inibe a geração de trombina, muito provavelmente protegendo a protrombina da clivagem proteolítica. http://www.laboratorio.com.mx/jagrichm.html], bem como através do tratamento com glicosidase ativando tanto a via extrínseca quanto a intrínseca (Sinha e Wolf, 1993).

Com respeito à agregação das plaquetas em presença do FVIII/VWF, a inibição da agregação plaquetária foi eliminada quando carboidratos foram adicionados ao complexo FVIII/VWF. Esse efeito inibidor na agregação das plaquetas e sua correção com carboidratos tem mostrado que o complexo possui atividade de lectina com melhor afinidade para GlcNAc e fucose. Por outro lado, o FVIII pode atuar como um regulador positivo da função da plaqueta em plaquetas co-estimuladas com TRAP (Obergfell e outros, 2006), sugerindo que esse processo PE mediado pela interação com receptores fucosilados, já que tem sido mostrado que a alfa-2-L-fucosiltransferase é altamente expressada em plaquetas ativadas (Skacel e Watkins, 1987).

Nós propusemos que o complexo FVIII/VWF interage com oligossacarídeos específicos, os quais também regulam o papel biológico. Pode-se inferir que o FVIII poderia possivelmente interagir com fucose, a partir de oligossacarídeos em FIXa, para a ativação do FX. Esses carboidratos são encontrados em domínios de fator de crescimento da epiderme do fator IXa humano e poderiam interagir também com carboidratos do fator X quando ativados (Morita, 1993). Além disso, a possibilidade de que a atividade de lectina do complexo FVIII/VWF induz o efeito inibitório na agregação das plaquetas (através de resíduos de GlcNac e de fucose) não poderia ser descartado.

Fonte: http://www.jstage.jst.go.jp/article/tjem/217/3/217_209/_article
PMID: 19282656