A ATIVIDADE DE LECTINA DO COMPLEXO FATOR VIII DA COAGULAÇÃO/von WILLEBRAND
Francisca Santizo, Edgar Zenteno, Socorro Pina-Canseco, Pedro Hernandez-Cruz, Margarito Martínez Cruz, Laura Perez-Campos Mayoral, Eduardo Pérez-Campos e Ruth Martínez Cruz – México
RESUMO
O fator VIII da coagulação (FVIII) é essencial na rota intrínseca da coagulação e circula principalmente como um complexo ligado não covalentemente com o fator vonWillebrand (vWF). Esse complexo (FVIII/vWF) protege o FVIII da degradação e captura celular, embora nenhum papel biológico tenha sido observado para este complexo. O complexo FVIII/vWF foi purificado do plasma de doadores saudáveis por afinidade cromatográfica em coluna de sefarose de 4B-concanavalina A e foi usado para determinar sua capacidade de interagir com eritrócitos e plaquetas. O complexo FVIII/VWF purificado a 6,0 12 μg/ml aglutinou os eritrócitos de coelho e bovinos, e mostrou aglutinação negativa com eritrócitos de outras espécies incluindo os humanos ABO. O tratamento dos eritrócitos com sialidase de Clostridium perfringens ou tripsina aumentou em quatro vezes a atividade com respeito aos eritrócitos de coelhos e a aglutinação positiva para os eritrócitos humanos A e B, sugerindo a presença de receptores enigmáticos para FVIII/VWF nesses eritrócitos. Os eritrócitos de cabra, porco ou humanos tipo O não foram aglutinados ainda após o tratamento enzimático. A fucose ou a N-acetil-glucosamina (GlcNAc), a 10mM, inibiram a atividade de aglutinação do complexo com os eritrócitos do coelho, e humanos de tipo A e B, enquanto a galactose e a N-acetil-galactosamina, ainda que a 200 mM, não mostraram nenhum efeito na atividade do complexo. O complexo FVIII/VWF, a 1,5 µg/200.000 plaquetas, diminuiu significativamente a agregação das plaquetas (p<0,001) color="#003333">Obs.1: Omim 603609 –A L-fucose é um açúcar chave nas glicoproteínas e outros complexos de carboidratos pois ela pode ser envolvida em muitos dos papéis funcionais dessas macromoléculas, tais como reconhecimento célula-célula. O doador de fucosil para esses oligossacarídeos fucosilados é a GDP-beta-L-fucose. A maior via para biossíntese da GDP-fucose converte a GDP-alfa-D-manose em GDP-beta-L-fucose. Veja omim 602884. Uma via alternativa está presente em alguns tecidos de mamíferos como fígado e rins, e parece funcionar como uma via de recuperação para reutilizar a L-fucose que chega da reviravolta de licoproteínas e glicolipídeos. Essa via envolve a fosforilação da L-fucose para formar beta-L-fucose-1-fosfato, e então a condensação da beta-L-fucose-1-fosfato com GTP por uma GDP-L-fucose pirofosforilase (GFPP) para formar GDP-beta-L-fucose.]
[Obs.2: GlcNAc - Outros nomes: 2-acetamido-2-desoxiglucose, Acetilglucosamina, Glucosamina, Glucosamina-6-fosfato, Glucosamina N-Acetil, N-Acetil D-Glucosamina, NAG, N-A-G, Poli-NAG.
A GlcNAc é um monossacarídeos derivativo da glucose. Ele é um amido entre glucosamina e ácido acético. Ele é parte de um bio-polímero na parede celular da bactéria, construído a partir de unidades alternantes de GlcNAc e ácido N-acetilmurâmico (MurNAc), ligado em cruzamento com oligopeptídeos no resíduo de ácido láctico do MurNAc. Sua estrutura é chamada peptidoglicano. A GlcNAc é a unidade monomérica da quitina, a qual forma a cobertura externa de insetos e crustáceos. http://en.wikipedia.org/wiki/N-Acetylglucosamine]
INTRODUÇÃO
O Fator VIII da coagulação humana (FVIII) é um co-fator essencial para a ativação proteolítica do Fator X. O FVIII é ativado pela trombina e pelo Fator Xa da coagulação; o Fator IXa (FIXa) ativa o Fator X (FXa), requerendo Ca2+, fosfolipídeos, e Fator VIII ativado (FVIIIa) (Schmidt e outros 2005). O FVIII e o fator von Willebrand (vWF) formam um complexo não covalentemente ligado. Esse complexo circula no plasma humano, é fundamental para a homeostase, e normalmente existe em forma inativa. A ligação do FVIII ao vWF é essencial para a sobrevivência do FVIII ‘in vivo’ (Kaufman e Pipe, 1999). Deficiências ou defeitos estruturais no FVIII são responsáveis pelas mais comuns das desordens que causam sangramento, tais como a hemofilia e a doença de von Willebrand (Lilicrap 2008).
O FVIII é um polipeptídeo de 2332 aminoácidos, sintetizado no fígado pelas células parenquimais e células endoteliais do seio hepático (células dos vasos sanuíneos do fígado?), bem como pelo endotélio pulmonar. O FVIII tem vários sítios de glicosilação que parecem importantes na cinética de sua circulação. Esse fator possui glicanas (polissacarídeo) ligadas por glicose em sua ponta N (nitrogênio), que são caracterizadas por um cerne interno de asparagina com N-acetil-glucosamina (GlcNAc) [asparagina com glucosamina ligada no nitrogênio) e são relevantes para o dobramento e secreção produtiva do FVIII, e glicanas glicosidicamente ligadas em O (oxigênio), que são caracterizadas por N-acetil-galactosamina de serina/treonina e estão envolvidas na determinação da conformação e interação da proteína com outras glicoproteínas. O FVIII possui dois sítios manosilados incomuns que podem ser reconhecidos por receptores de manose nas células Kupffer (Dasgupta e outros 2007). [Obs.: N-acetilglucosamina ligada em O é uma abundante modificação pós-tradução de resíduos serina ou treonina de proteínas nucleares e citoplasmáticas. PMID 9550544]
[Obs.: A glicosilação é o processo enzimático que liga sacarídeos para produzir glicanas, presas a proteínas, lipídios, ou outras moléculas orgânicas. Esse processo enzimático produz um dos biopolímeros fundamentais encontrados em células (ao longo do DNA, RNA e proteínas). A glicosilação é a forma de modificação durante e depois da tradução. As glicanas servem a uma variedade de papéis estruturais e funcionais na membrana e em proteínas secretadas. A maioria das proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso submetem-se à glicosilação. Este é um processo de sítio específico direcionado por enzima, em oposição à reação química de glicação não enzimática. A glicosilação também está presente no citoplasma e no núcleo como modificação por O-GlcNAc. Cinco classes de glicanas são produzidas: glicanas ligadas ao N (nitrogênio) presas em um nitrogênio da cadeia lateral da asparagina ou arginina, glicanas ligadas em O (oxigênio) presas ao oxigênio hidroxi (da hidroxila?) da serina, treonina, tirosina, hidroxilisina ou hidroxiprolina das cadeias laterais, ou a oxigênios em lipídios tais como a ceramida; fosfo-glicanas ligadas através do fosfato de uma fosfo-serina; glicanas ligadas a C (carbono), uma forma rara de glicosilação onde um açúcar é adicionado a um carbono em uma cadeia lateral do triptofano, e a glipiação que é a adição de uma âncora GPI (glicosilfosfatidilinositol) que liga proteínas a lipídeos através de elos de glicanas.
A O-GlcNAc é adicionada a serinas ou treoninas pela O-GlcNAc transferase. A O-GlcNAc parece ocorrer na maioria das serinas e treoninas que poderiam ser de outro modo fosforiladas por cinases serina/treonina. Assim, se a fosforilação ocorre, a O-GlcNAc não ocorre e vice-versa. Esse é um inacreditável achado pois a fosforilação/desfosforilação tem-se tornado um paradigma científico para a regulação da sinalização dentro das células. Uma quantidade massiva de pesquisas em câncer está focalizada na fosforilação. A ignorância do envolvimento dessa forma de glicosilação, a qual claramente parece agir em harmonia com a fosforilação, importa em que muitas pesquisas correntes perdem ao menos metade da paisagem. A adição e remoção da O-GlcNAc também parece ser uma chave na regulação das vias que são rompidas no diabetes mellitus. O gene codificador da enzima O-GlaNAcase tem sido ligado ao diabetes mellitus não dependente de insulina. Ela é a etapa terminal em uma via de sinalização de hexosaminas (amina derivada de hexose, um açúcar com seis carbonos) sensíveis a nutrientes http://en.wikipedia.org/wiki/Glycosylated]
O FVIII se liga às plaquetas de modo saturável e específico. (Nescheim e outros 1988; Ahmad e outros.2000). O VWF é sintetizado através de um processo de múltiplas etapas em megacariócitos e células endoteliais, ele é estocado nos grânulos alfa das plaquetas, no corpo de Weibel-Paladedas células endoteliais, e está presente no plasma e no sub-endotélio vascular. [Obs.: Corpos de Weibel-Palade são organelas encontradas em células endoteliais, uma única camada de células que se alinham nos vasos sanguíneos e no coração. Eles atuam num duplo papel na hemostasia da coagulação sanguínea e na inflamação. A outra molécula estocada nos corpos de Weibel-Palade é a selectina P (das plaquetas) que atua num papel central na capacidade das células endoteliais inflamadas recrutares leucócitos em trânsito, permitindo a eles saírem do vaso sanguíneo e entrarem no tecido circunscrito, onde eles podem migrar para o sítio de infecção ou lesão. Outros componentes do corpo de Weibel-Palade são quimiocinas como interleucina 8 e eotaxina-3, endotelina-1, angiopoietina-1, osteoprotegerina e tetraspanina CD63/lam3 e alfa-1,3-fuscosiltransferase VI. http://en.wikipedia.org/wiki/Weibel-Palade_body] Essa grande proteína com uma única estrutura multimérica atua num papel central em ambas a hemostasia (coagulação) do sangue e na trombose intravascular patológica pois ela media a adesão da plaqueta à parede injuriada do vaso, e ela carrega e protege o Fator VIII. A VWF, a qual é composta de idênticas sub-unidades de 250 quilo-dáltons ligadas por dissulfeto (pontes?) media a coagulação através de suas múltiplas funções adesivas para receptores de membrana de plaquetas, complexo de glicoproteínas Ib-IX-V, integrina alfa-IIb-beta 3, heparina, vários tipos de colágeno, selectinaP (CD62P), e FVIII, e é expressada exclusivamente em plaquetas ativadas (Denis 2002; Sugimoto e Miyata 2002).
Sugeriu-se que o complexo FVIII/VWF possui atividade de lectina, já que o complexo interage com amino-açúcares, tais como galactosamina e manosamina, e alguns aminoácidos como arginina (Booth e outros, 1984; Lillicrap, 2008). Entretanto, um papel biológico para o complexo FVIII/VWF não foi determinado até o presente. Uma lectina é uma proteína de ligação a açúcar de origem não imune que aglutina células ou precipita glico-conjugados (Goldstein e outros.1980). As lectinas podem ser solúveis ou ligadas a membranas e ocorrem em muitos tipos de organismos (Debray e outros, 1981; Sharon e Lis, 2004). Neste estudo, nós analisamos a atividade da lectina e a especificidade do açúcar do complexo FVIII/VWF por ensaios de determinação de atividade de hemaglutinação, seus efeitos na agregação plaquetária e sua especificidade para carboidrato com carboidratos derivados de dextran.
Continua.
Fonte: http://www.jstage.jst.go.jp/article/tjem/217/3/217_209/_article
PMID: 19282656
terça-feira, 29 de dezembro de 2009
A ATIVIDADE DE LECTINA DO COMPLEXO FATOR VIII DA COAGULAÇÃO/von WILLEBRAND
Francisca Santizo, Edgar Zenteno, Socorro Pina-Canseco, Pedro Hernandez-Cruz, Margarito Martínez Cruz, Laura Perez-Campos Mayoral, Eduardo Pérez-Campos e Ruth Martínez Cruz – México
RESULTADOS
Purificação do Complexo FVIII/VWF
A purificação do FVIII/VWF após a precipitação de acetona foi desempenhada por cromatografia de afinidade em uma coluna de sefarose 4B de concanavalina A, e o complexo FVIII/VWF foi separado com 200 mM de manosídeo [glicosídeos da manose. Stedman] alfa metil. O complexo FVIII/VWF purificado consiste de uma banda como determinado por eletroforede se gel não desnaturada (não modificada).
Atividade de Hemaglutinação e Especificidade do Complexo FVIII/VWF para Açúcar
O complexo FVIII/VWF purificado mostrou atividade de hemaglutinação na presença de eritrócitos de coelho e bovinos às concentrações respectivas de 6,0 e 12 μg/ml. Os eritrócitos de outras espécies animais, tais como porco e cabra, bem como dos tipos sanguíneos humanos A, B e O, não foram aglutinados. Após os eritrócitos serem tratados por trinta minutos com tripsina ou com sialidase de C. perfringens [Os ácidos siálicos são ésteres e outros derivados do acil ligado em N ou O do ácido neuramínico. A sialidase cliva resíduos acetilneuramínicos terminais de oligossacaídeos, glicoproteías ou glicopídeos. Sin. neuraminidase. Stedman], a atividade de hamaglutinação do complexo aumentou em quatro vezes; além disso , o complexo FVIII/VWF mostrou atividade de hamaglutinação na presença dos eritrócitos dos grupos sanguíneos A e B humanos em concentrações de 1,5 e 3 µg/ml, respectivamente; entretanto, em concentrações similales, os eritrócitos de cabra, boi, porco e humano de tipo sanguíneo O não foram reconhecidos ainda que depois do tratamento com as enzimas.
A partir dos carboidratos testados, somente a GlcNAc e a fucose inibiram a atividade de hemaglutinação do complexo. A concentração mínima necessária para a GlcNAc e a fucose inibirem quatro doses hemaglutinantes de complexo FVIII/VWF foi de 10 mM cada; uma capacidade inibidora similar da fucose e da GlcNAC foi observada quando testes de hemaglutinação foram desempenhados na presença de eritrócitos humanos A e B ou de boi e de coelho.
Ensaio de Agregação de Plaquetas na Presença de FVIII/VWF e sua Inibição com Carboidrato
Quando o PRP (plasma rico em plaquetas com 200.000 plaquetas/μL) foi estimulado com 15 µl de 25 μM ADP (adenosina difosfato), cem por cento das células foram agregadas; quando 3,5 µg/ml de FVIII/VWF foram adicionados, a agregação das plaquetas foi inibida em 40% após seis minutos. Quando 2,5 mM de fucose ou de GlcNAc foram incubados previamente com o complexo FVIII/VWF, a agregação reverteu a inibição a uma média de 90 e 95%, respectivamente, enquanto outros carboidratos, tais como galactose e GalNAc, ainda que a 200 mM cada, reverteram a inibição somente a uma média de 58 e 48%, respectivamente (P,0,001). Como controles negativos, foram usadas glicina-NaCl, GlcNac, GalNAc, galactose, e fucose (todos a 15 mM).
Ensaios de Ligação de FVIII/VWF com Derivados de Dextan Glicosilados e Inibição com Carboidratos
FVIII/VWF, a 20 μg/ml, ligaram-se a GlcNAc ou fucose derivados de dextran com biotina (molécula etiquetadora para visualização) a concentrações de 1,8 µg a 30 μg, enquanto 30 µg de GalNAc derivados de dextran biotinilados mostraram pouca interação, e galactoses derivadas de dextran não mostraram ligação. A interação da fucose e da GlcNAc derivadas de dextran foi inibida com a adição de 25 mM de monossacarídeos de fucose ou GlcNAc respectivamente.
DISCUSSÃO
Os fatores VIII e von Willebrand são glicoproteínas do plasma que circulam em um complexo não covalente e atuam num papel crítico no processo da coagulação do sangue. A maior parte do FVIII liga-se a vWF, formando um complexo firme e estável que o protege da degradação proteolítica precoce e impede sua captura pela célula (Fay e outros,1991). O FVIII é um co-fator essencial para a ativação do fator X mediada pelo fator IX. O VWF media a adesão e ativação das plaquetas; entretanto, nenhum papel tem sido atribuído ao complexo FVIII/vWF (Lilicrap,2008). Neste trabalho, nós identificamos a potencial atividade de lectina do complexo FVIII/VWF purificado do plasma humano.
O complexo FVIII/VWF purificado com concanavalina A [a concanavalina A é uma lectina da semente vegetal, que liga manose http://mcdb-webarchive.mcdb.ucsb.edu/sears/biochemistry/] mostrou atividade hemaglutinante na presença de eritrócitos bovinos e de coelho. O complexo FVIII/VWF purificado não mostrou atividade de aglutinação na presença dos eritrócitos dos grupos sanguíneos humanos A, B e O. Após tratamento com sialidase ou tripsina, o reconhecimento para eritrócitos bovinos e de coelho aumentou quatro vezes; interessantemente, os eritrócitos humanos de tipo A e B foram reconhecidos pelo complexo FVIII/VWF, e os eritrócitos humanos de tipo O não fora aglutinizados ainda após o tratamento com as enzimas. O fato de que o FVIII/VWF tem alta esoecificidade anti-A e anti-B sugere a relevância dos carboidratos relacionados ao grupo sanguíneo determinantes na interação com o complexo FVIII/VWF. A fucose e aGlcNAc inibiram a atividade de hemaglutinação mostrada pelo complexo FVIII/VWF na presença de qualquer dos eritrócitos aglutinados. A galactose e a GalNAc não mostraram nenhum efeito na atividade de hemaglutinação do complexo. A eliminação do ácido siálico ou sialoglicopeptídeos dos eritrócitos por tratamento com C. perfingens ou tripsina, respectivamente, aumentou a atividade de aglutinação do complexo para eritrócitos de coelho e bovinos e favoreceu a aglutinação de eritrócitos A e B. Isso sugere que o ácido siálico torna inefetiva a interação desses fatores com oligossacarídeos da membrana e também indica a natureza enigmática do receptor para a atividade de lectina. Esses dados sugerem fortemente a participação ativa do complexo na discrasia [estado geral mórbido resultante da presença de material anormal no sangue, geralmente aplicado a doenças que afetam as células do sangue ou as plaquetas. Stedman] da coagulação associada com infecções por espécies bacterianas que produzem sialidase, tais como Streptococcus pneumoniae, o qual tem estado associado à patogênese do processo trombótico (Myers e Marrie, 1993).
Foi mostrado que a polimerização do VWF aumenta a afinidade de ligação a receptores de superfície nas plaquetas GPIbα e αIIbβ3, através de interações eletrostáticas (Huizinga e outros 2002; Denis e outros, 2008), sugerindo que a interação com plaquetas não é devida à interação com receptores de lectina. A partir de um ponto de vista biológico, a característica mais importante do complexo FVIII/VWF é mostrar especificidade por carboidratos diferentes e mostrar certa flexibilidade de ligação a sítios que permitiriam o reconhecimento de uma parcela de carboidratos estruturalmente aparentados como um mecanismo de regulação similar ao das outras lectinas relatadas (Vasta e outros, 1994; Hernández e outros, 2004). As lectinas dos vertebrados estão em inúmeras famílias estruturalmente distintas e participam em diferentes funções intracelulares, tais como tráfego, origem e alvo de glicoproteínas em maturação, (Dodd e Drickamer, 2001) bem como nas funções extracelulares, tais como interações de adesão (Zalensky e Gready, 2005), pela mediação da interação com a matriz extracelular ou fluidos do corpo, ou pela mediação de adesão celular, sinalização celular, indução de transcrição de genes [Obs.: É por isso que a MBL2 fica no 10q21 e tem outra cópia depois do gene da Egr2?], modifcações pós-tradução, remoção de glicoproteínas e reconhecimento de patógenos (Britten e outros; 1998 van Liemp e outros, 2006).
Sabe-se que a ativação do fator X a fator Xa é catalizada pelo fator IXa e seu co-fator VIIa na via intrínseca. A relevância do papel funcional dos resíduos de carboidrato nos fatores de coagulação tem sido demonstrada usando-se lectinas de aglutinina de Galanthus nivalis [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/23/Galanthus_nivalis.jpg], Sambucus nigra [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/61/Sambucus_nigra_004.jpg], Maackiaamurensis[http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c7/Maackia_amurensis.jpg], amendoim (galactose), Datura stramonium (GlcNAc) [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d6/Koeh-051.jpg], aglutinina de Phaseoluscoccineus[http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1e/Phaseolus_coccineus_flores.jpg] Var. Alubia [A eritroaglutinina de Alubia inibe a geração de trombina, muito provavelmente protegendo a protrombina da clivagem proteolítica. http://www.laboratorio.com.mx/jagrichm.html], bem como através do tratamento com glicosidase ativando tanto a via extrínseca quanto a intrínseca (Sinha e Wolf, 1993).
Com respeito à agregação das plaquetas em presença do FVIII/VWF, a inibição da agregação plaquetária foi eliminada quando carboidratos foram adicionados ao complexo FVIII/VWF. Esse efeito inibidor na agregação das plaquetas e sua correção com carboidratos tem mostrado que o complexo possui atividade de lectina com melhor afinidade para GlcNAc e fucose. Por outro lado, o FVIII pode atuar como um regulador positivo da função da plaqueta em plaquetas co-estimuladas com TRAP (Obergfell e outros, 2006), sugerindo que esse processo PE mediado pela interação com receptores fucosilados, já que tem sido mostrado que a alfa-2-L-fucosiltransferase é altamente expressada em plaquetas ativadas (Skacel e Watkins, 1987).
Nós propusemos que o complexo FVIII/VWF interage com oligossacarídeos específicos, os quais também regulam o papel biológico. Pode-se inferir que o FVIII poderia possivelmente interagir com fucose, a partir de oligossacarídeos em FIXa, para a ativação do FX. Esses carboidratos são encontrados em domínios de fator de crescimento da epiderme do fator IXa humano e poderiam interagir também com carboidratos do fator X quando ativados (Morita, 1993). Além disso, a possibilidade de que a atividade de lectina do complexo FVIII/VWF induz o efeito inibitório na agregação das plaquetas (através de resíduos de GlcNac e de fucose) não poderia ser descartado.
Fonte: http://www.jstage.jst.go.jp/article/tjem/217/3/217_209/_article
PMID: 19282656
Francisca Santizo, Edgar Zenteno, Socorro Pina-Canseco, Pedro Hernandez-Cruz, Margarito Martínez Cruz, Laura Perez-Campos Mayoral, Eduardo Pérez-Campos e Ruth Martínez Cruz – México
RESULTADOS
Purificação do Complexo FVIII/VWF
A purificação do FVIII/VWF após a precipitação de acetona foi desempenhada por cromatografia de afinidade em uma coluna de sefarose 4B de concanavalina A, e o complexo FVIII/VWF foi separado com 200 mM de manosídeo [glicosídeos da manose. Stedman] alfa metil. O complexo FVIII/VWF purificado consiste de uma banda como determinado por eletroforede se gel não desnaturada (não modificada).
Atividade de Hemaglutinação e Especificidade do Complexo FVIII/VWF para Açúcar
O complexo FVIII/VWF purificado mostrou atividade de hemaglutinação na presença de eritrócitos de coelho e bovinos às concentrações respectivas de 6,0 e 12 μg/ml. Os eritrócitos de outras espécies animais, tais como porco e cabra, bem como dos tipos sanguíneos humanos A, B e O, não foram aglutinados. Após os eritrócitos serem tratados por trinta minutos com tripsina ou com sialidase de C. perfringens [Os ácidos siálicos são ésteres e outros derivados do acil ligado em N ou O do ácido neuramínico. A sialidase cliva resíduos acetilneuramínicos terminais de oligossacaídeos, glicoproteías ou glicopídeos. Sin. neuraminidase. Stedman], a atividade de hamaglutinação do complexo aumentou em quatro vezes; além disso , o complexo FVIII/VWF mostrou atividade de hamaglutinação na presença dos eritrócitos dos grupos sanguíneos A e B humanos em concentrações de 1,5 e 3 µg/ml, respectivamente; entretanto, em concentrações similales, os eritrócitos de cabra, boi, porco e humano de tipo sanguíneo O não foram reconhecidos ainda que depois do tratamento com as enzimas.
A partir dos carboidratos testados, somente a GlcNAc e a fucose inibiram a atividade de hemaglutinação do complexo. A concentração mínima necessária para a GlcNAc e a fucose inibirem quatro doses hemaglutinantes de complexo FVIII/VWF foi de 10 mM cada; uma capacidade inibidora similar da fucose e da GlcNAC foi observada quando testes de hemaglutinação foram desempenhados na presença de eritrócitos humanos A e B ou de boi e de coelho.
Ensaio de Agregação de Plaquetas na Presença de FVIII/VWF e sua Inibição com Carboidrato
Quando o PRP (plasma rico em plaquetas com 200.000 plaquetas/μL) foi estimulado com 15 µl de 25 μM ADP (adenosina difosfato), cem por cento das células foram agregadas; quando 3,5 µg/ml de FVIII/VWF foram adicionados, a agregação das plaquetas foi inibida em 40% após seis minutos. Quando 2,5 mM de fucose ou de GlcNAc foram incubados previamente com o complexo FVIII/VWF, a agregação reverteu a inibição a uma média de 90 e 95%, respectivamente, enquanto outros carboidratos, tais como galactose e GalNAc, ainda que a 200 mM cada, reverteram a inibição somente a uma média de 58 e 48%, respectivamente (P,0,001). Como controles negativos, foram usadas glicina-NaCl, GlcNac, GalNAc, galactose, e fucose (todos a 15 mM).
Ensaios de Ligação de FVIII/VWF com Derivados de Dextan Glicosilados e Inibição com Carboidratos
FVIII/VWF, a 20 μg/ml, ligaram-se a GlcNAc ou fucose derivados de dextran com biotina (molécula etiquetadora para visualização) a concentrações de 1,8 µg a 30 μg, enquanto 30 µg de GalNAc derivados de dextran biotinilados mostraram pouca interação, e galactoses derivadas de dextran não mostraram ligação. A interação da fucose e da GlcNAc derivadas de dextran foi inibida com a adição de 25 mM de monossacarídeos de fucose ou GlcNAc respectivamente.
DISCUSSÃO
Os fatores VIII e von Willebrand são glicoproteínas do plasma que circulam em um complexo não covalente e atuam num papel crítico no processo da coagulação do sangue. A maior parte do FVIII liga-se a vWF, formando um complexo firme e estável que o protege da degradação proteolítica precoce e impede sua captura pela célula (Fay e outros,1991). O FVIII é um co-fator essencial para a ativação do fator X mediada pelo fator IX. O VWF media a adesão e ativação das plaquetas; entretanto, nenhum papel tem sido atribuído ao complexo FVIII/vWF (Lilicrap,2008). Neste trabalho, nós identificamos a potencial atividade de lectina do complexo FVIII/VWF purificado do plasma humano.
O complexo FVIII/VWF purificado com concanavalina A [a concanavalina A é uma lectina da semente vegetal, que liga manose http://mcdb-webarchive.mcdb.ucsb.edu/sears/biochemistry/] mostrou atividade hemaglutinante na presença de eritrócitos bovinos e de coelho. O complexo FVIII/VWF purificado não mostrou atividade de aglutinação na presença dos eritrócitos dos grupos sanguíneos humanos A, B e O. Após tratamento com sialidase ou tripsina, o reconhecimento para eritrócitos bovinos e de coelho aumentou quatro vezes; interessantemente, os eritrócitos humanos de tipo A e B foram reconhecidos pelo complexo FVIII/VWF, e os eritrócitos humanos de tipo O não fora aglutinizados ainda após o tratamento com as enzimas. O fato de que o FVIII/VWF tem alta esoecificidade anti-A e anti-B sugere a relevância dos carboidratos relacionados ao grupo sanguíneo determinantes na interação com o complexo FVIII/VWF. A fucose e aGlcNAc inibiram a atividade de hemaglutinação mostrada pelo complexo FVIII/VWF na presença de qualquer dos eritrócitos aglutinados. A galactose e a GalNAc não mostraram nenhum efeito na atividade de hemaglutinação do complexo. A eliminação do ácido siálico ou sialoglicopeptídeos dos eritrócitos por tratamento com C. perfingens ou tripsina, respectivamente, aumentou a atividade de aglutinação do complexo para eritrócitos de coelho e bovinos e favoreceu a aglutinação de eritrócitos A e B. Isso sugere que o ácido siálico torna inefetiva a interação desses fatores com oligossacarídeos da membrana e também indica a natureza enigmática do receptor para a atividade de lectina. Esses dados sugerem fortemente a participação ativa do complexo na discrasia [estado geral mórbido resultante da presença de material anormal no sangue, geralmente aplicado a doenças que afetam as células do sangue ou as plaquetas. Stedman] da coagulação associada com infecções por espécies bacterianas que produzem sialidase, tais como Streptococcus pneumoniae, o qual tem estado associado à patogênese do processo trombótico (Myers e Marrie, 1993).
Foi mostrado que a polimerização do VWF aumenta a afinidade de ligação a receptores de superfície nas plaquetas GPIbα e αIIbβ3, através de interações eletrostáticas (Huizinga e outros 2002; Denis e outros, 2008), sugerindo que a interação com plaquetas não é devida à interação com receptores de lectina. A partir de um ponto de vista biológico, a característica mais importante do complexo FVIII/VWF é mostrar especificidade por carboidratos diferentes e mostrar certa flexibilidade de ligação a sítios que permitiriam o reconhecimento de uma parcela de carboidratos estruturalmente aparentados como um mecanismo de regulação similar ao das outras lectinas relatadas (Vasta e outros, 1994; Hernández e outros, 2004). As lectinas dos vertebrados estão em inúmeras famílias estruturalmente distintas e participam em diferentes funções intracelulares, tais como tráfego, origem e alvo de glicoproteínas em maturação, (Dodd e Drickamer, 2001) bem como nas funções extracelulares, tais como interações de adesão (Zalensky e Gready, 2005), pela mediação da interação com a matriz extracelular ou fluidos do corpo, ou pela mediação de adesão celular, sinalização celular, indução de transcrição de genes [Obs.: É por isso que a MBL2 fica no 10q21 e tem outra cópia depois do gene da Egr2?], modifcações pós-tradução, remoção de glicoproteínas e reconhecimento de patógenos (Britten e outros; 1998 van Liemp e outros, 2006).
Sabe-se que a ativação do fator X a fator Xa é catalizada pelo fator IXa e seu co-fator VIIa na via intrínseca. A relevância do papel funcional dos resíduos de carboidrato nos fatores de coagulação tem sido demonstrada usando-se lectinas de aglutinina de Galanthus nivalis [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/23/Galanthus_nivalis.jpg], Sambucus nigra [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/61/Sambucus_nigra_004.jpg], Maackiaamurensis[http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/c7/Maackia_amurensis.jpg], amendoim (galactose), Datura stramonium (GlcNAc) [http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d6/Koeh-051.jpg], aglutinina de Phaseoluscoccineus[http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1e/Phaseolus_coccineus_flores.jpg] Var. Alubia [A eritroaglutinina de Alubia inibe a geração de trombina, muito provavelmente protegendo a protrombina da clivagem proteolítica. http://www.laboratorio.com.mx/jagrichm.html], bem como através do tratamento com glicosidase ativando tanto a via extrínseca quanto a intrínseca (Sinha e Wolf, 1993).
Com respeito à agregação das plaquetas em presença do FVIII/VWF, a inibição da agregação plaquetária foi eliminada quando carboidratos foram adicionados ao complexo FVIII/VWF. Esse efeito inibidor na agregação das plaquetas e sua correção com carboidratos tem mostrado que o complexo possui atividade de lectina com melhor afinidade para GlcNAc e fucose. Por outro lado, o FVIII pode atuar como um regulador positivo da função da plaqueta em plaquetas co-estimuladas com TRAP (Obergfell e outros, 2006), sugerindo que esse processo PE mediado pela interação com receptores fucosilados, já que tem sido mostrado que a alfa-2-L-fucosiltransferase é altamente expressada em plaquetas ativadas (Skacel e Watkins, 1987).
Nós propusemos que o complexo FVIII/VWF interage com oligossacarídeos específicos, os quais também regulam o papel biológico. Pode-se inferir que o FVIII poderia possivelmente interagir com fucose, a partir de oligossacarídeos em FIXa, para a ativação do FX. Esses carboidratos são encontrados em domínios de fator de crescimento da epiderme do fator IXa humano e poderiam interagir também com carboidratos do fator X quando ativados (Morita, 1993). Além disso, a possibilidade de que a atividade de lectina do complexo FVIII/VWF induz o efeito inibitório na agregação das plaquetas (através de resíduos de GlcNac e de fucose) não poderia ser descartado.
Fonte: http://www.jstage.jst.go.jp/article/tjem/217/3/217_209/_article
PMID: 19282656
sexta-feira, 25 de dezembro de 2009
A Expressão do cDNA do Fator VIII da Coagulação é Reprimida por um Silenciador Transcricional Localizado em sua Região Codificadora.
Por Rob C. Hoeben, Frits J. Fallaux, Steve J. Cramer, Diana J.M. van den Wollenberg, Hans van Ormondt, Ernest Briët e Alex J. van der Eb
PMID: 7727775 - http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/85/9/2447
RESUMO
A hemofilia A é causada por uma deficiência da atividade pró-coagulante do fator VIII (fVIII). O tratamento corrente por infusões freqüentes de concentrados de fVIII derivado do plasma é muito efetiva, mas tem o risco de transmissão de viroses naturais no sangue (vírus da imunodeficiência humana (HIV) e viroses da hepatite). O uso de fVIII derivado de DNA recombinante bem como a terapia genética poderia tornar o tratamento da hemofilia independente dos produtos derivados de sangue. Até agora, a problemática produção da proteína fVIII e os baixos títulos da provisão de fVIII em retrovírus têm impedido testes pré-clínicos de terapia genética para a hemofilia A em muitos modelos animais. Nós iniciamos um estudo dos mecanismos que se opõem à síntese eficiente do fVIII. Nós estabelecemos que o cDNA do fVIII contém sequências que inibem de modo dominante sua própria expressão a partir dos vetores retro-virais e de plasmídios. A inibição não é causada pela instabilidade do mRNA do fVIII, porém, mais do que isso, pela repressão ao nível da transcrição. Um fragmento de 305 pares de bases é identificado como envolvido nisso, mas não é suficiente para a repressão. Esse fragmento não se sobrepõe à região recentemente identificada por Lynch e outros (Hum Gene Ther 4:259, 1993) como um inibidor dominante da acumulação de RNA. A repressão é mediada por uma fator celular (ou fatores) e é independente da orientação do elemento na unidade de transcrição, dando ao elemento repressor a marca de ouro de silenciador transcricional.
INTRODUÇÃO
A hemofilia A é uma desordem de sangramento que afeta aproximadamente 8,5 em 100.000 pessoas e é causada por uma deficiência funcional do fator VIII da coagulação (fVIII). A hemofilia é tratada com infusões regulares (profilática ou à demanda) de concentrados derivados do plasma humano enriquecidos de FVIII. Essa terapia de reposição da proteína tem sido muito efetiva e tem resultado num dramático aumento na expectativa e qualidade de vida. Apesar disso, mesmo o paciente tratado está propenso a hemorragias espontâneas associadas com o risco da danificação crônica da(s) junta(s). Em adição, a terapia com fVIII derivado do plasma tem resultado na transmissão de várias viroses humanas, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus das hepatites. A terapia ideal, por esse motivo, estaria independente de produtos derivados do plasma. A admissão recente de fVIII derivado de DNA recombinante para o tratamento da hemofilia A é uma grande etapa nessa direção, embora seu uso extensivo seja ainda problemático devido ao seu alto custo, o que resulta da dificuldade da produção. A terapia gênica somática [Terapia em que são introduzidas sequências funcionais de DNA em células que carecem de um gene específico ou que possuem uma versão defeituosa dele. Os vetores incluem vírus de replicação deficiente, lipossomas e plasmídios. Para transferência de material genético por infecção viral (transdução), os vírus são particularmente apropriados como vetores, visto que o RNA, convertido em DNA pela transcriptase reversa, torna-se parte do genoma de uma célula infectada. Stedman. Obs. da trad: Essa RT deve ser bem competente prá não copiar o RNA com os erros que costumam-se atribuir a ela.] é, por isso, aprofundada para uma alternativa bem vinda ao tratamento da hemofilia. A implantação de células autólogas, geneticamente modificadas para produzir fVIII, permitiria uma produção contínua do fVIII no paciente, impedindo, dessa forma, os episódios de sangramento espontâneo.
A terapia gênica somática para a hemofilia A não está necessariamente restrita às células que normalmente produzem o fVIII. Pesquisas têm sido direcionadas à modificação genética de células de tipos de tecido que são mais acessíveis à manipulação, tais como os da pele, endotélio, medula óssea e músculo. No presente, a transferência de genes mediada por retrovírus é o sistema mais testado em testes clínicos de terapia genética. Para acomodar o cDNA do fator VIII para dentro dos vetores retro-virais, nós e outros usamos clones de cDNA encurtados dos quais a região codificadora do domínio B interno, não essencial à atividade da coagulação, foi deletada. Tais vetores foram usados com sucesso para produzir fVIII funcional em células humanas primárias. Entretanto, o título relativamente baixo de retro-viroses de fVIII e produção desapontadoramente pequena da proteína embaraçaram a iniciação de testes pré-clínicos em modelos animais grandes. Vários mecanismos foram identificados que frustram a produção do fVIII. A acumulação do mRNA do fVIII é inibida, dando a entender-se como resultado de algum evento pós-transcricional, o transporte intracelular do fVIII é muito ineficiente, e, uma vez secretada, a proteína é extremamente suscetível à degradação proteolítca e precisa ser estabilizada pela proteína fator von Willebrand (vWf).
Nós relatamos a evidência da presença de um elemento silenciador transcricional dominante no cDNA do fVIII e mapeamos as sequências do cDNA do FVIII envolvidas. A caracterização desse elemento ajudará o desenvolvimento de clones de cDNA de fVIII expressados mais eficientemente. A expressão aumentada não somente avançaria o desenvolvimento dos protocolos da terapia genética mas também poderia aumentar a produção de fVIII derivado de DNA recombinante e, assim, reduziria o alto preço atual desse produto.
RESULTADOS
A proteína fVII consiste de três tipos de domínios estruturais que estão arranjados nessa ordem: A1; A2; B; C1; C2. O único domínio B, delimitado pelos aminoácidos 740 e 1648, é removido durante o processamento proteolítico e de ativação e é dispensável para a atividade da coagulação in vivo e in vitro. Para acomodar o cDNA do fVIII dentro de um vetor retroviral sem exceder a capacidade de empacotamento do vetor, nós usamos o cDNA do fVIII do qual nós retiramos virtualmente todos códons para o domínio B. Nós mostramos previamente que o fVIII com domínio B retirado resultante é plenamente funcional. O vetor usado conta com um splicing diferencial para a expressão do cDNA do fVIII e do gene neoR (gene resistente a neomicina, um antibiótico). Os títulos dos vetores de fVIII [G418 é um antibiótico similar à gentamicina B, usado para selecionar células geneticamente engenheiradas em laboratório, pois o neo gene Tn5, codificador da aminoglicosídeo – 3’ – fosfotransferase, confere resistência ao G418, que, por sua vez, inibe a síntese de polipeptídeos. http://en.wikipedia.org/wiki/G418
Quando os pesquisadores querem focalizar um gene de interesse, o uso de genes resistentes a antibiótico é extremamente efetivo. Genes resistentes a antibiótico são usados como marcadores para identificar a transferência de material genético (DNA) de um organismo para o outro. Um gene resistente a antibiótico, quando usado como marcador, produz uma proteína que protege plantas e organismos de um antibiótico específico. Quando as células transformadas (com o gene resistente) e células não transformadas são expostas ao antibiótico, tais como G-418, somente as células transformadas sobrevivem e crescem. Os pesquisadores podem, então confiar em que as células sobreviventes contém o gene de seu interesse principal. http://www.g418.com/] , como quantidade da proteína fVIII secretada. Por exemplo, a quantidade da proteína fVIII é ao menos 200 vezes menor em bases molares do que a do fator IX de células infectadas com um vetor retro-viral carregando o cDNA do fator IX. Nossa tentativa em aumentar o título com uso de outros vetores e por inclusão de um sinal estendendo o empacotamento dentro do vetor M5neo não proporcionou um vírus produtor de altos títulos. Em contraste, os vetores perdem invariavelmente (partes de) cDNA do fVIII.
Sequências no cDNA do fVIII reprimem a acumulação de seu RNA. Foi noticiado que sequências no cDNA do fVIII impedem a acumulação do mRNA do fVIII, supostamente pela desestabilização dos fVIII transcritos. Isso poderia explicar ambas a baixa produção do vírus pelas células de empacotamento e a baixa quantidade da proteína fVIII secretada pelas células infectadas pelo vírus. Uma análise de Northern de uma população G418 de fibroblastos Rat2 que contêm o vetor M5F8dB2.6 confirmou a pouca abundância do RNA específico do vetor em comparação com células infectadas com o vetor parental M5neo, no qual ambos os mRNAs submetidos e não submetidos a splicing são distintos. Isso não é devido à inserção do cDNA do FVIII de tamanho grande, como é mostrado pelas quantidades do cDNA de EGRr (receptor de fator de crescimento da epiderme) de 8,3 a 7,8 quilobases em células que abrigam um vetor que carrega o cDNA do gene EGFr humano, o qual é similar em tamanho ao cDNA do fVIII com o domínio B retirado. A ausência de recombinações no vetor MrF8dB2.6 foi confirmada por um ensaio de Southern blot (para DNA) no DNA extraído da população de células infectadas Rat2. A integridade do vetor foi evidenciada mais ainda pelo surgimento do RNA do fVIII de tamanho esperado após o tratamento das células com butirato (sal ou éster de ácido butírico; tem efeito estimulador na expressão do cDNA do FVIII – PMID 8754827) de sódio. A repressão da acumulação do mRNA do fVIII não ocorreu somente nas células Rat2, mas foi encontrada em todas as linhas celulares testadas; ou seja, células Swiss3T3, Psi-2, células de endotelioma murino e fibroblastos da pele humana.
O mRNA do fator VIII é estável nas células de empacotamento. Para estudar a estabilidade dos transcritos do fVIII em linhas celulares de empacotamento Psi:M5F8dB2.6, a transcrição foi bloqueada com ActD, um inibidor da RNA polimerase II (polimerase que transcreve em RNA). Em vários momentos, o RNA foi extraído das células em cultura e analisado por pigmentação de Northern (para RNA). Nenhum decréscimo significativo foi observado em mais de seis horas após a adição de ActD, sugerindo que os transcritos do fVIII são bastante estáveis nessas células.
A re-hibridização desse material de análise (do blot, no texto original) com uma prova específica de c-myc (o gene MYC ativa a telomerase induzindo a expressão de sua sub-unidade catalítica transcriptase reversa da telomerase, TERT; e também se liga ao fator B de transcrição da polimerase III, enzima que transcreve em RNA; omim 190080) mostrou a rápida queda esperada dos transcritos c-myc (meia-vida de aproximadamente 15 minutos), confirmando a efetividade do bloqueio por ActD. A quantidade de RNA carregado foi verificada provando-se novamente o material (o blot) com uma prova específica de GAPDH (gene co-ativador de OCT1 na fase S; omim 138400), um mRNA conhecido por ter uma longa meia-vida. A partir desses dados nós concluímos que o estado constante do mRNA do fVIII é estável (tempo médio maior que seis horas). O fato de que não só a acumulação do mensageiro não submetido a splicing é inibida em células infectadas com M5F8dB2.6, mas também naquelas em que o mensageiro com neoR submetido a splicing foi inibido, que não contém nenhum fVIII, sugere que a repressão ocorre antes do processo de splicing, possivelmente ao nível da transcrição. As viroses fVIII produzidas pela linha de células Psi2:M5f8dB2.6 têm sido usadas para gerar linhas celulares de roedores produtoras de fVIII descritas aqui, excluindo a possibilidade de o vetor nessa linha celular conter mutações de estabilização do RNA.
A Expressão é reprimida ao nível da transcrição. Uma análise de busca nuclear foi desempenhada para medir a taxa de transcrição do pró-vírus de fVIII integrado em ambas as células G418Rat2:M5F8dB2.6 e G418 Rat2:M5neo. Como mostrado na figura 3 a prova neoR detecta um sinal somente no RNA isolado de células infectadas com M5neo. Nas células Rat2:M5F8B2.6, nem a prova neoR, nem a prova específica do fVIII mostra qualquer transcrição do pró-vírus. A ausência de sinal com prova anti-senso de neoR confirma a especificidade da hibridização. A equidade da eficiência do etiquetamento foi verificada por uma prova específica para os transcritos de GAPDH celular. Assim, a inserção do cDNA do fVIII para dentro de vetores M5neo reduz a transcrição do pró-vírus integrado a níveis muito baixos.
Fragmentos de cDNA do Fator VIII Reprimem a Expressão de um Gene Heterólogo. Para estudar se sequências do cDNA do fVIII podem reprimir a expressão de um gene heterólogo, fragmentos de cDNA de fVIII foram clonados no vetor de expressão pMuLV-CAT. Nesse vetor, a expressão do gene repórter CAT é dirigida pelo LTR do Mo-MuLV. Para imitar ao máximo a configuração natural dos elementos repressores, fragmentos do cDNA do fVIII foram introduzidos dentro do sítio único de Hpa1 [ obs.: o sítio para a endonuclease de restrição Hpa I é GTCAAC, que por mutação para GTTAAC passou a apresentar seis padrões diferentes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC348856/] de expressão do plasmídio [obs.: o sítio está na fita de DNA e serve para integração do vírus carregando os genes de interesse]. Este sítio está localizado dentro da unidade de transcrição, porém, na extremidade 3’[no final] da sequência aberta de leitura codificadora do gene CAT, para não influenciar a tradução do mensageiro (mRNA) de CAT. Dois fragmentos foram testados: SX, compreendendo os domínios A1 e A2 (cadeia pesada), e o XS, que codifica os domínios A3, C1 e C2 (cadeia leve). Inicialmente, ambos os fragmentos foram testados na orientação que tinham no vetor retro-viral. A inserção do fragmentos XS não causou uma atividade de CAT mais baixa do que o vetor parental pMuLV-CAT, enquanto a inserção do fragmento SX diminuiu dramaticamente a atividade de CAT. Uma redução similar da atividade de CAT foi observada quando o fragmento SX foi testado na orientação reversa. Em culturas celulares poli-clonais transfectadas também, os fragmentos SX reprimiram a expressão do gene repórter CAT dirigidos pelo vetor MuLV. Análises de Northern blot do RNA extraído dessas culturas mostraram uma quantidade muito reduzida de mRNA de CAT em células carregando o plasmídio pMuLV-CAT/SX, o que confirma que a reduzida atividade de CAT na população de células contendo o fragmento SX está refletindo a reduzida quantidade do mRNA de CAT. A partir desses dados, nós concluímos que o elemento repressor que reside no cDNA do fVIII inibe a expressão dos genes heterólogos integrados bem como dos genes heterólogos não integrados (que não entraram na fita de DNA, mas estão no vírus) e que essa repressão é independente da orientação da inserção do cDNA do fVIII.
Para mapear as sequências responsáveis por essa repressão em mais detalhes, vários sub-fragmentos foram testados por sua capacidade de reduzir a atividade de CAT. O fragmento AH (Acc I-HindIII, do nucleotídeo 1033 ao 2277) foi de longe um repressor mais potente do que o fragmento SA (Sal I-Xho I, de 30 a 2294) . O menor fragmento que poderia promover a repressão seria o fragmento PP (Pvu II-Pvu II, do nucleotídeo 1038 ao 1850). Fragmentos menores derivados do fragmento AH (Acc, I-HindIII, do nucleotídeio 1033 a 2277), por exemplo, HB (HindIII-Bgl II, do nucleotídeo 1019 ao 1680), BH (Bgl II-HindIII, do nucleotídeo 1680 ao 2277), XmB (XmnI-Bgl II, de 1375 ao 1680) e XmBm (Xmn I-BamHI, do 1375 ao 1869) não diminuem a atividade de CAT. Entretanto, quando o fragmento de 305 pares de base do fragmento XmB, o qual por si só não reprime a expressão, foi retirado do fragmento AH, o clone resultante AHdXmB ficou incapaz de reprimir a expressão. A retirada do fragmento XmB do fragmento SX, também, rompeu o repressor, como atestado pela queda na atividade de CAT após a expressão transitória e em populações de células poli-clonais estáveis transfectadas. A partir desses dados, nós concluímos que sequências no fragmento XmB de 305 pares de bases são parte do elemento repressor, mas não são o suficiente para mediar a repressão.
A Repressão Pode ser Aliviada por DNA Competidor. Num experimento de competição, as repressões induzidas pelos fragmentos SX e SXdXmB (Sal I- Xmn I, do nucleotídeo 30 ao 1375 em fusão com Bgl II-Xho I, do nucleotídeo 1680 ao 2294) foram comparadas em ausência e em presença de um plasmídio competidor em 40 vezes de excesso, o PUC-AH. O fragmento SX reprime a expressão do gene CAT, em contraste à construção SXdXmB. Entretanto, embora a co-transfecção da construção PUC-AH não aumente a expressão do gene repórter com o fragmento SXdXmB inserido, a repressão induzida pelo fragmento SX foi aliviada, e o nível de CAT ficou similar ao do fragmento SXdXmB. Esses dados indicam que a repressão não é causada por propriedades intrínsecas do DNA (isto é, uma conformação desfavorável), mas que a repressão é mediada por um fator celular (ou fatores) que podem ser titulados fora.
Obs.: Enzimas de Restrição Que Cortam a Fita Dupla de DNA e Respectivos Sítios de Atuação
Acc I : GTATAC ou GTCGAC (?);
Bgl II : AGATCT;
Xho I : CTCGAG;
Sal I: GTCGAC;
Spe I ACTAGT;
Xmn I: GAANNNNTTC (produz final cego);
BamH I: GGATCC;
Hind II: 5’ AAGCTT 3’.
Fonte:
PMID: 7727775 - http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/85/9/2447
Por Rob C. Hoeben, Frits J. Fallaux, Steve J. Cramer, Diana J.M. van den Wollenberg, Hans van Ormondt, Ernest Briët e Alex J. van der Eb
PMID: 7727775 - http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/85/9/2447
RESUMO
A hemofilia A é causada por uma deficiência da atividade pró-coagulante do fator VIII (fVIII). O tratamento corrente por infusões freqüentes de concentrados de fVIII derivado do plasma é muito efetiva, mas tem o risco de transmissão de viroses naturais no sangue (vírus da imunodeficiência humana (HIV) e viroses da hepatite). O uso de fVIII derivado de DNA recombinante bem como a terapia genética poderia tornar o tratamento da hemofilia independente dos produtos derivados de sangue. Até agora, a problemática produção da proteína fVIII e os baixos títulos da provisão de fVIII em retrovírus têm impedido testes pré-clínicos de terapia genética para a hemofilia A em muitos modelos animais. Nós iniciamos um estudo dos mecanismos que se opõem à síntese eficiente do fVIII. Nós estabelecemos que o cDNA do fVIII contém sequências que inibem de modo dominante sua própria expressão a partir dos vetores retro-virais e de plasmídios. A inibição não é causada pela instabilidade do mRNA do fVIII, porém, mais do que isso, pela repressão ao nível da transcrição. Um fragmento de 305 pares de bases é identificado como envolvido nisso, mas não é suficiente para a repressão. Esse fragmento não se sobrepõe à região recentemente identificada por Lynch e outros (Hum Gene Ther 4:259, 1993) como um inibidor dominante da acumulação de RNA. A repressão é mediada por uma fator celular (ou fatores) e é independente da orientação do elemento na unidade de transcrição, dando ao elemento repressor a marca de ouro de silenciador transcricional.
INTRODUÇÃO
A hemofilia A é uma desordem de sangramento que afeta aproximadamente 8,5 em 100.000 pessoas e é causada por uma deficiência funcional do fator VIII da coagulação (fVIII). A hemofilia é tratada com infusões regulares (profilática ou à demanda) de concentrados derivados do plasma humano enriquecidos de FVIII. Essa terapia de reposição da proteína tem sido muito efetiva e tem resultado num dramático aumento na expectativa e qualidade de vida. Apesar disso, mesmo o paciente tratado está propenso a hemorragias espontâneas associadas com o risco da danificação crônica da(s) junta(s). Em adição, a terapia com fVIII derivado do plasma tem resultado na transmissão de várias viroses humanas, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus das hepatites. A terapia ideal, por esse motivo, estaria independente de produtos derivados do plasma. A admissão recente de fVIII derivado de DNA recombinante para o tratamento da hemofilia A é uma grande etapa nessa direção, embora seu uso extensivo seja ainda problemático devido ao seu alto custo, o que resulta da dificuldade da produção. A terapia gênica somática [Terapia em que são introduzidas sequências funcionais de DNA em células que carecem de um gene específico ou que possuem uma versão defeituosa dele. Os vetores incluem vírus de replicação deficiente, lipossomas e plasmídios. Para transferência de material genético por infecção viral (transdução), os vírus são particularmente apropriados como vetores, visto que o RNA, convertido em DNA pela transcriptase reversa, torna-se parte do genoma de uma célula infectada. Stedman. Obs. da trad: Essa RT deve ser bem competente prá não copiar o RNA com os erros que costumam-se atribuir a ela.] é, por isso, aprofundada para uma alternativa bem vinda ao tratamento da hemofilia. A implantação de células autólogas, geneticamente modificadas para produzir fVIII, permitiria uma produção contínua do fVIII no paciente, impedindo, dessa forma, os episódios de sangramento espontâneo.
A terapia gênica somática para a hemofilia A não está necessariamente restrita às células que normalmente produzem o fVIII. Pesquisas têm sido direcionadas à modificação genética de células de tipos de tecido que são mais acessíveis à manipulação, tais como os da pele, endotélio, medula óssea e músculo. No presente, a transferência de genes mediada por retrovírus é o sistema mais testado em testes clínicos de terapia genética. Para acomodar o cDNA do fator VIII para dentro dos vetores retro-virais, nós e outros usamos clones de cDNA encurtados dos quais a região codificadora do domínio B interno, não essencial à atividade da coagulação, foi deletada. Tais vetores foram usados com sucesso para produzir fVIII funcional em células humanas primárias. Entretanto, o título relativamente baixo de retro-viroses de fVIII e produção desapontadoramente pequena da proteína embaraçaram a iniciação de testes pré-clínicos em modelos animais grandes. Vários mecanismos foram identificados que frustram a produção do fVIII. A acumulação do mRNA do fVIII é inibida, dando a entender-se como resultado de algum evento pós-transcricional, o transporte intracelular do fVIII é muito ineficiente, e, uma vez secretada, a proteína é extremamente suscetível à degradação proteolítca e precisa ser estabilizada pela proteína fator von Willebrand (vWf).
Nós relatamos a evidência da presença de um elemento silenciador transcricional dominante no cDNA do fVIII e mapeamos as sequências do cDNA do FVIII envolvidas. A caracterização desse elemento ajudará o desenvolvimento de clones de cDNA de fVIII expressados mais eficientemente. A expressão aumentada não somente avançaria o desenvolvimento dos protocolos da terapia genética mas também poderia aumentar a produção de fVIII derivado de DNA recombinante e, assim, reduziria o alto preço atual desse produto.
RESULTADOS
A proteína fVII consiste de três tipos de domínios estruturais que estão arranjados nessa ordem: A1; A2; B; C1; C2. O único domínio B, delimitado pelos aminoácidos 740 e 1648, é removido durante o processamento proteolítico e de ativação e é dispensável para a atividade da coagulação in vivo e in vitro. Para acomodar o cDNA do fVIII dentro de um vetor retroviral sem exceder a capacidade de empacotamento do vetor, nós usamos o cDNA do fVIII do qual nós retiramos virtualmente todos códons para o domínio B. Nós mostramos previamente que o fVIII com domínio B retirado resultante é plenamente funcional. O vetor usado conta com um splicing diferencial para a expressão do cDNA do fVIII e do gene neoR (gene resistente a neomicina, um antibiótico). Os títulos dos vetores de fVIII [G418 é um antibiótico similar à gentamicina B, usado para selecionar células geneticamente engenheiradas em laboratório, pois o neo gene Tn5, codificador da aminoglicosídeo – 3’ – fosfotransferase, confere resistência ao G418, que, por sua vez, inibe a síntese de polipeptídeos. http://en.wikipedia.org/wiki/G418
Quando os pesquisadores querem focalizar um gene de interesse, o uso de genes resistentes a antibiótico é extremamente efetivo. Genes resistentes a antibiótico são usados como marcadores para identificar a transferência de material genético (DNA) de um organismo para o outro. Um gene resistente a antibiótico, quando usado como marcador, produz uma proteína que protege plantas e organismos de um antibiótico específico. Quando as células transformadas (com o gene resistente) e células não transformadas são expostas ao antibiótico, tais como G-418, somente as células transformadas sobrevivem e crescem. Os pesquisadores podem, então confiar em que as células sobreviventes contém o gene de seu interesse principal. http://www.g418.com/] , como quantidade da proteína fVIII secretada. Por exemplo, a quantidade da proteína fVIII é ao menos 200 vezes menor em bases molares do que a do fator IX de células infectadas com um vetor retro-viral carregando o cDNA do fator IX. Nossa tentativa em aumentar o título com uso de outros vetores e por inclusão de um sinal estendendo o empacotamento dentro do vetor M5neo não proporcionou um vírus produtor de altos títulos. Em contraste, os vetores perdem invariavelmente (partes de) cDNA do fVIII.
Sequências no cDNA do fVIII reprimem a acumulação de seu RNA. Foi noticiado que sequências no cDNA do fVIII impedem a acumulação do mRNA do fVIII, supostamente pela desestabilização dos fVIII transcritos. Isso poderia explicar ambas a baixa produção do vírus pelas células de empacotamento e a baixa quantidade da proteína fVIII secretada pelas células infectadas pelo vírus. Uma análise de Northern de uma população G418 de fibroblastos Rat2 que contêm o vetor M5F8dB2.6 confirmou a pouca abundância do RNA específico do vetor em comparação com células infectadas com o vetor parental M5neo, no qual ambos os mRNAs submetidos e não submetidos a splicing são distintos. Isso não é devido à inserção do cDNA do FVIII de tamanho grande, como é mostrado pelas quantidades do cDNA de EGRr (receptor de fator de crescimento da epiderme) de 8,3 a 7,8 quilobases em células que abrigam um vetor que carrega o cDNA do gene EGFr humano, o qual é similar em tamanho ao cDNA do fVIII com o domínio B retirado. A ausência de recombinações no vetor MrF8dB2.6 foi confirmada por um ensaio de Southern blot (para DNA) no DNA extraído da população de células infectadas Rat2. A integridade do vetor foi evidenciada mais ainda pelo surgimento do RNA do fVIII de tamanho esperado após o tratamento das células com butirato (sal ou éster de ácido butírico; tem efeito estimulador na expressão do cDNA do FVIII – PMID 8754827) de sódio. A repressão da acumulação do mRNA do fVIII não ocorreu somente nas células Rat2, mas foi encontrada em todas as linhas celulares testadas; ou seja, células Swiss3T3, Psi-2, células de endotelioma murino e fibroblastos da pele humana.
O mRNA do fator VIII é estável nas células de empacotamento. Para estudar a estabilidade dos transcritos do fVIII em linhas celulares de empacotamento Psi:M5F8dB2.6, a transcrição foi bloqueada com ActD, um inibidor da RNA polimerase II (polimerase que transcreve em RNA). Em vários momentos, o RNA foi extraído das células em cultura e analisado por pigmentação de Northern (para RNA). Nenhum decréscimo significativo foi observado em mais de seis horas após a adição de ActD, sugerindo que os transcritos do fVIII são bastante estáveis nessas células.
A re-hibridização desse material de análise (do blot, no texto original) com uma prova específica de c-myc (o gene MYC ativa a telomerase induzindo a expressão de sua sub-unidade catalítica transcriptase reversa da telomerase, TERT; e também se liga ao fator B de transcrição da polimerase III, enzima que transcreve em RNA; omim 190080) mostrou a rápida queda esperada dos transcritos c-myc (meia-vida de aproximadamente 15 minutos), confirmando a efetividade do bloqueio por ActD. A quantidade de RNA carregado foi verificada provando-se novamente o material (o blot) com uma prova específica de GAPDH (gene co-ativador de OCT1 na fase S; omim 138400), um mRNA conhecido por ter uma longa meia-vida. A partir desses dados nós concluímos que o estado constante do mRNA do fVIII é estável (tempo médio maior que seis horas). O fato de que não só a acumulação do mensageiro não submetido a splicing é inibida em células infectadas com M5F8dB2.6, mas também naquelas em que o mensageiro com neoR submetido a splicing foi inibido, que não contém nenhum fVIII, sugere que a repressão ocorre antes do processo de splicing, possivelmente ao nível da transcrição. As viroses fVIII produzidas pela linha de células Psi2:M5f8dB2.6 têm sido usadas para gerar linhas celulares de roedores produtoras de fVIII descritas aqui, excluindo a possibilidade de o vetor nessa linha celular conter mutações de estabilização do RNA.
A Expressão é reprimida ao nível da transcrição. Uma análise de busca nuclear foi desempenhada para medir a taxa de transcrição do pró-vírus de fVIII integrado em ambas as células G418Rat2:M5F8dB2.6 e G418 Rat2:M5neo. Como mostrado na figura 3 a prova neoR detecta um sinal somente no RNA isolado de células infectadas com M5neo. Nas células Rat2:M5F8B2.6, nem a prova neoR, nem a prova específica do fVIII mostra qualquer transcrição do pró-vírus. A ausência de sinal com prova anti-senso de neoR confirma a especificidade da hibridização. A equidade da eficiência do etiquetamento foi verificada por uma prova específica para os transcritos de GAPDH celular. Assim, a inserção do cDNA do fVIII para dentro de vetores M5neo reduz a transcrição do pró-vírus integrado a níveis muito baixos.
Fragmentos de cDNA do Fator VIII Reprimem a Expressão de um Gene Heterólogo. Para estudar se sequências do cDNA do fVIII podem reprimir a expressão de um gene heterólogo, fragmentos de cDNA de fVIII foram clonados no vetor de expressão pMuLV-CAT. Nesse vetor, a expressão do gene repórter CAT é dirigida pelo LTR do Mo-MuLV. Para imitar ao máximo a configuração natural dos elementos repressores, fragmentos do cDNA do fVIII foram introduzidos dentro do sítio único de Hpa1 [ obs.: o sítio para a endonuclease de restrição Hpa I é GTCAAC, que por mutação para GTTAAC passou a apresentar seis padrões diferentes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC348856/] de expressão do plasmídio [obs.: o sítio está na fita de DNA e serve para integração do vírus carregando os genes de interesse]. Este sítio está localizado dentro da unidade de transcrição, porém, na extremidade 3’[no final] da sequência aberta de leitura codificadora do gene CAT, para não influenciar a tradução do mensageiro (mRNA) de CAT. Dois fragmentos foram testados: SX, compreendendo os domínios A1 e A2 (cadeia pesada), e o XS, que codifica os domínios A3, C1 e C2 (cadeia leve). Inicialmente, ambos os fragmentos foram testados na orientação que tinham no vetor retro-viral. A inserção do fragmentos XS não causou uma atividade de CAT mais baixa do que o vetor parental pMuLV-CAT, enquanto a inserção do fragmento SX diminuiu dramaticamente a atividade de CAT. Uma redução similar da atividade de CAT foi observada quando o fragmento SX foi testado na orientação reversa. Em culturas celulares poli-clonais transfectadas também, os fragmentos SX reprimiram a expressão do gene repórter CAT dirigidos pelo vetor MuLV. Análises de Northern blot do RNA extraído dessas culturas mostraram uma quantidade muito reduzida de mRNA de CAT em células carregando o plasmídio pMuLV-CAT/SX, o que confirma que a reduzida atividade de CAT na população de células contendo o fragmento SX está refletindo a reduzida quantidade do mRNA de CAT. A partir desses dados, nós concluímos que o elemento repressor que reside no cDNA do fVIII inibe a expressão dos genes heterólogos integrados bem como dos genes heterólogos não integrados (que não entraram na fita de DNA, mas estão no vírus) e que essa repressão é independente da orientação da inserção do cDNA do fVIII.
Para mapear as sequências responsáveis por essa repressão em mais detalhes, vários sub-fragmentos foram testados por sua capacidade de reduzir a atividade de CAT. O fragmento AH (Acc I-HindIII, do nucleotídeo 1033 ao 2277) foi de longe um repressor mais potente do que o fragmento SA (Sal I-Xho I, de 30 a 2294) . O menor fragmento que poderia promover a repressão seria o fragmento PP (Pvu II-Pvu II, do nucleotídeo 1038 ao 1850). Fragmentos menores derivados do fragmento AH (Acc, I-HindIII, do nucleotídeio 1033 a 2277), por exemplo, HB (HindIII-Bgl II, do nucleotídeo 1019 ao 1680), BH (Bgl II-HindIII, do nucleotídeo 1680 ao 2277), XmB (XmnI-Bgl II, de 1375 ao 1680) e XmBm (Xmn I-BamHI, do 1375 ao 1869) não diminuem a atividade de CAT. Entretanto, quando o fragmento de 305 pares de base do fragmento XmB, o qual por si só não reprime a expressão, foi retirado do fragmento AH, o clone resultante AHdXmB ficou incapaz de reprimir a expressão. A retirada do fragmento XmB do fragmento SX, também, rompeu o repressor, como atestado pela queda na atividade de CAT após a expressão transitória e em populações de células poli-clonais estáveis transfectadas. A partir desses dados, nós concluímos que sequências no fragmento XmB de 305 pares de bases são parte do elemento repressor, mas não são o suficiente para mediar a repressão.
A Repressão Pode ser Aliviada por DNA Competidor. Num experimento de competição, as repressões induzidas pelos fragmentos SX e SXdXmB (Sal I- Xmn I, do nucleotídeo 30 ao 1375 em fusão com Bgl II-Xho I, do nucleotídeo 1680 ao 2294) foram comparadas em ausência e em presença de um plasmídio competidor em 40 vezes de excesso, o PUC-AH. O fragmento SX reprime a expressão do gene CAT, em contraste à construção SXdXmB. Entretanto, embora a co-transfecção da construção PUC-AH não aumente a expressão do gene repórter com o fragmento SXdXmB inserido, a repressão induzida pelo fragmento SX foi aliviada, e o nível de CAT ficou similar ao do fragmento SXdXmB. Esses dados indicam que a repressão não é causada por propriedades intrínsecas do DNA (isto é, uma conformação desfavorável), mas que a repressão é mediada por um fator celular (ou fatores) que podem ser titulados fora.
Obs.: Enzimas de Restrição Que Cortam a Fita Dupla de DNA e Respectivos Sítios de Atuação
Acc I : GTATAC ou GTCGAC (?);
Bgl II : AGATCT;
Xho I : CTCGAG;
Sal I: GTCGAC;
Spe I ACTAGT;
Xmn I: GAANNNNTTC (produz final cego);
BamH I: GGATCC;
Hind II: 5’ AAGCTT 3’.
Fonte:
PMID: 7727775 - http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/85/9/2447
A Expressão do cDNA do Fator VIII da Coagulação é Reprimida por um Silenciador Transcricional Localizado em sua Região Codificadora. (Continuação)
Por Rob C. Hoeben, Frits J. Fallaux, Steve J. Cramer, Diana J.M. van den Wollenberg, Hans van Ormondt, Ernest Briët e Alex J. van der Eb
DISCUSSÃO
Este relatório descreve a identificação de sequências na região codificadora do cDNA do fVIII humano que reprime a expressão ao nível da transcrição. Esse repressor modula para menos a expressão de vetores retro-virais contendo o gene fVIII, o que resulta na síntese inferior da proteína fVIII e reduz a produção de retro-viroses recombinantes em ao menos duas ordens de magnitude. A escassez do mRNA específico do vetor nas linhagens de empacotamento (células) pode explicar completamente os baixos títulos de vetores retro-virais do fVIII. Isso está de acordo com a observação de que a amplificação do vetor do fVIII nas linhas de células de empacotamento aumenta a produção viral. Além disso, a quantidade de transcritos neoR nas células alvo pode ser muito baixa para permitir a célula sobreviver à seleção por G418, baixando o título viral aparente. Nossas observações confirmam e estendem a descrição por Lynch e outros sobre a inibição da acumulação do mRNA por sequencias do cDNA do fVIII (nucleotídeos de 1681 a 2277, seguidos dos nucleotídeos de 5002 a 5582). Entretanto, nós encontramos a repressão em dependência da presença do fragmento Xmn I-BglII (do nucleotídeo 135 ao 1680), o qual está localizado fora da região identificada por estes investigadores. A causa dessa discrepância não está clara. Enquanto o estudo mencionado acima consistia na produção do vírus como um parâmetro para a repressão, nós exploramos um ensaio mais direto baseado na expressão transitória do gene CAT, dessa forma circunscrevendo os problemas com a instabilidade (deleção de sequências do fVIII) dos vetores virais.
Kaufman e outros estudaram os níveis de RNA em células de ovário de ramster (CHO) contendo múltiplos (mais de 100) vetores de expressão de cDNA de fVIII e de cDNA de vWF e observaram quantidades 40 vezes mais baixas de RNA de fVIII do que de RNA de vWF quando corrigidos para número de cópias de vetor de expressão. As taxas de transcrição de ambos os genes foram encontradas similares em análises de busca nuclear, o que sugeriu que a causa da repressão seria pós-transcricional. Em contraste, nosso estudo sugere que a inibição é causada por um mecanismo de transcrição. Nossa conclusão está baseada em várias linhas de evidência. Primeira: a diferença na quantidade de RNA específico para o vetor em estado estável observada em células infectadas com o vetor M5neo e seu derivado M5F8dB2.6 reflete as taxas de transcrição como medidas em ensaio de busca nuclear. Segundo: o RNA neoR sub-genômico, o qual não contém nenhuma sequência de fVIII, é reprimido em células que contém o vetor de fVIII, sugerindo um mecanismo que opera antes da ocorrência do splicing. Terceiro: a estabilidade relativa do mRNA do fVIII nas linhagens de empacotamento exclui a estabilidade citoplasmática como um mecanismo. Isso é sustentado ainda mais pela observação de que a inserção do fragmento SX para dentro da unidade de transcrição do repórter CAT não altera a estabilidade do transcrito. Também, a observação de que o tratamento das células com sódio butirato, um conhecido estimulador da transcrição, aumenta os níveis de RNA de fVIII muitas vezes, argúi contra um mecanismo que opera no nível da estabilidade do RNA. Além disso, o elemento repressor suspeito nesse estudo funciona independentemente de sua orientação em uma unidade de transcrição, sustentando um mecanismo que opera no nível do DNA mais do que no do RNA. Finalmente o fragmento AH, codificador do domínio A2, também reprime marcadamente a expressão quando colocado a montante do LTR do MuLV que dirige o gene marcador CAT. Coletivamente, esses dados sugerem que as sequências repressoras atuam como silenciadoras transcricionais da expressão.
Ainda não está claro se a repressão observada é de alguma relevância fisiológica para a regulação da expressão do fVIII endógeno ‘in vivo’. Nós não podemos excluir a possibilidade de que elementos seqüenciais que são normalmente separados por íntrons e, assim, estão há muitas quilobases de distância são adjacentes no cDNA e por coincidência ganham tal função. O fragmento de 305 pares de bases Xmn-BglII é derivado dos éxons de nove a onze do gene fVIII e compreende mais de nove quilobases de DNA genômico.
O mecanismo detalhado pelo qual o repressor atua ainda está obscuro. A falta de transcrição do domínio A1 como foi observada pela ausência de sinal de hibridização com a prova fVIII-A1 exclui a atenuação transcricional no domínio A2 como um mecanismo. Tal mecanismo tem sido encontrado por regular a expressão do gene c-myc. A observação de que a repressão pode ser aliviada pela co-transfecção de quantidades excessivas de DNA competidor implica que a repressão não é causada pela sequência de DNA em si (ou seja, uma conformação do DNA que seja desfavorável à transcrição), mas além disso sugere que componentes celulares atuam num papel de repressão. A inspeção da sequência do fragmento de 305 pares de bases que está envolvido na repressão não revela imediatamente quaisquer sítios de consenso deliberado para ligação de candidatos a repressor. Até o momento, entretanto, somente poucos sistemas repressores nos eucariotos superiores foram caracterizados com detalhes. No fragmento de 305 pares de bases, nós notamos duas sequências com uma razão de 10/11 com o consenso WTTTAYRTTTW (W é triptofano, T é Treonina, A é Alanina, Y é Tirosina, R é Arginina) observado em sequências de replicação autônoma (ARS) das leveduras. Os elementos ARS permitem a manutenção de plasmídios extra-cromossômicos nas leveduras e têm sido implicados em funcionar na origem da replicação do cromossomo e como regiões de fixação à matriz nuclear (MARs), bem como moduladores da atividade de estimuladores e silenciadores transcricionais. Nas MARs dos eucariotos superiores, sequências consenso similares tem sido encontradas. Assim, uma MAR ou ARS no cDNA do fVIII poderia explicar os efeitos repressores do cDNA do fVIII na transcrição. Em adição, a observação de que a deleção do Xmn I-Bgl II (XmnI-Bgl II, de 1375 ao 1680) alivia a repressão enquanto o fragmento por si só não é suficiente para diminuir a expressão concorda plenamente com a estrutura modular dos elementos MARs e bem como de ARS. A remoção ou mutação de alguns elementos ARS diminuem sua função, mas não a abole completamente. Nós temos evidência de que os elementos WTTTAYRTTTW derivados do fVIII podem reprimir a expressão de genes heterólogos se inseridos na unidade de transcrição, mostrando o potencial desses elementos no cDNA do fVIII em reprimir a expressão. Se a expressão do fVIII está inibida pela fortuita presença de ARS ou MARs no cDNA do fVIII, múltiplas mutações serão requeridas para abolir completamente o repressor. A retirada do fragmento XmnI-Bgl II de 305 pares de bases dos vetores de expressão não é uma opção. Essa região da molécula é essencial para a função do fVIII, já que oito mutações de sentido trocado foram identificadas nessa região que resultam na hemofilia A. Correntemente, nós estamos tentando elucidar o mecanismo preciso da repressão e definir as sequências envolvidas, por exemplo, pela identificação de elementos de ligação a proteína no fragmento Xmn I-Bgl II de 305 pares de bases. A identificação de elementos responsáveis permitirá a eliminação dos sítios de ligação pela introdução de mutações não codificadoras. Como uma abordagem alternativa, os íntrons poderiam ser introduzidos para separar e inativar potencialmente vários elementos repressores. A geração de cDNAs de fVIII mutado que são expressados mais eficientemente aumentará a quantidade da proteína fVIII produzida nas células e melhorará o título de estoques de vírus de fVIII. Isso, é claro, não somente melhorará a executividade da terapia genética para hemofilia A, mas também será de considerável importância para a produção de fVIII derivado de DNA recombinante para transfusão.
Obs.: Enzimas de Restrição Que Cortam a Fita Dupla de DNA e Respectivos Sítios de Atuação
Acc I : GTATAC ou GTCGAC (?);
Bgl II : AGATCT;
Xho I : CTCGAG;
Sal I: GTCGAC;
Spe I ACTAGT;
Xmn I: GAANNNNTTC (produz final cego);
BamH I: GGATCC;
Hind II: 5’ AAGCTT 3’
Fonte:
PMID: 7727775 - http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/85/9/2447
Por Rob C. Hoeben, Frits J. Fallaux, Steve J. Cramer, Diana J.M. van den Wollenberg, Hans van Ormondt, Ernest Briët e Alex J. van der Eb
DISCUSSÃO
Este relatório descreve a identificação de sequências na região codificadora do cDNA do fVIII humano que reprime a expressão ao nível da transcrição. Esse repressor modula para menos a expressão de vetores retro-virais contendo o gene fVIII, o que resulta na síntese inferior da proteína fVIII e reduz a produção de retro-viroses recombinantes em ao menos duas ordens de magnitude. A escassez do mRNA específico do vetor nas linhagens de empacotamento (células) pode explicar completamente os baixos títulos de vetores retro-virais do fVIII. Isso está de acordo com a observação de que a amplificação do vetor do fVIII nas linhas de células de empacotamento aumenta a produção viral. Além disso, a quantidade de transcritos neoR nas células alvo pode ser muito baixa para permitir a célula sobreviver à seleção por G418, baixando o título viral aparente. Nossas observações confirmam e estendem a descrição por Lynch e outros sobre a inibição da acumulação do mRNA por sequencias do cDNA do fVIII (nucleotídeos de 1681 a 2277, seguidos dos nucleotídeos de 5002 a 5582). Entretanto, nós encontramos a repressão em dependência da presença do fragmento Xmn I-BglII (do nucleotídeo 135 ao 1680), o qual está localizado fora da região identificada por estes investigadores. A causa dessa discrepância não está clara. Enquanto o estudo mencionado acima consistia na produção do vírus como um parâmetro para a repressão, nós exploramos um ensaio mais direto baseado na expressão transitória do gene CAT, dessa forma circunscrevendo os problemas com a instabilidade (deleção de sequências do fVIII) dos vetores virais.
Kaufman e outros estudaram os níveis de RNA em células de ovário de ramster (CHO) contendo múltiplos (mais de 100) vetores de expressão de cDNA de fVIII e de cDNA de vWF e observaram quantidades 40 vezes mais baixas de RNA de fVIII do que de RNA de vWF quando corrigidos para número de cópias de vetor de expressão. As taxas de transcrição de ambos os genes foram encontradas similares em análises de busca nuclear, o que sugeriu que a causa da repressão seria pós-transcricional. Em contraste, nosso estudo sugere que a inibição é causada por um mecanismo de transcrição. Nossa conclusão está baseada em várias linhas de evidência. Primeira: a diferença na quantidade de RNA específico para o vetor em estado estável observada em células infectadas com o vetor M5neo e seu derivado M5F8dB2.6 reflete as taxas de transcrição como medidas em ensaio de busca nuclear. Segundo: o RNA neoR sub-genômico, o qual não contém nenhuma sequência de fVIII, é reprimido em células que contém o vetor de fVIII, sugerindo um mecanismo que opera antes da ocorrência do splicing. Terceiro: a estabilidade relativa do mRNA do fVIII nas linhagens de empacotamento exclui a estabilidade citoplasmática como um mecanismo. Isso é sustentado ainda mais pela observação de que a inserção do fragmento SX para dentro da unidade de transcrição do repórter CAT não altera a estabilidade do transcrito. Também, a observação de que o tratamento das células com sódio butirato, um conhecido estimulador da transcrição, aumenta os níveis de RNA de fVIII muitas vezes, argúi contra um mecanismo que opera no nível da estabilidade do RNA. Além disso, o elemento repressor suspeito nesse estudo funciona independentemente de sua orientação em uma unidade de transcrição, sustentando um mecanismo que opera no nível do DNA mais do que no do RNA. Finalmente o fragmento AH, codificador do domínio A2, também reprime marcadamente a expressão quando colocado a montante do LTR do MuLV que dirige o gene marcador CAT. Coletivamente, esses dados sugerem que as sequências repressoras atuam como silenciadoras transcricionais da expressão.
Ainda não está claro se a repressão observada é de alguma relevância fisiológica para a regulação da expressão do fVIII endógeno ‘in vivo’. Nós não podemos excluir a possibilidade de que elementos seqüenciais que são normalmente separados por íntrons e, assim, estão há muitas quilobases de distância são adjacentes no cDNA e por coincidência ganham tal função. O fragmento de 305 pares de bases Xmn-BglII é derivado dos éxons de nove a onze do gene fVIII e compreende mais de nove quilobases de DNA genômico.
O mecanismo detalhado pelo qual o repressor atua ainda está obscuro. A falta de transcrição do domínio A1 como foi observada pela ausência de sinal de hibridização com a prova fVIII-A1 exclui a atenuação transcricional no domínio A2 como um mecanismo. Tal mecanismo tem sido encontrado por regular a expressão do gene c-myc. A observação de que a repressão pode ser aliviada pela co-transfecção de quantidades excessivas de DNA competidor implica que a repressão não é causada pela sequência de DNA em si (ou seja, uma conformação do DNA que seja desfavorável à transcrição), mas além disso sugere que componentes celulares atuam num papel de repressão. A inspeção da sequência do fragmento de 305 pares de bases que está envolvido na repressão não revela imediatamente quaisquer sítios de consenso deliberado para ligação de candidatos a repressor. Até o momento, entretanto, somente poucos sistemas repressores nos eucariotos superiores foram caracterizados com detalhes. No fragmento de 305 pares de bases, nós notamos duas sequências com uma razão de 10/11 com o consenso WTTTAYRTTTW (W é triptofano, T é Treonina, A é Alanina, Y é Tirosina, R é Arginina) observado em sequências de replicação autônoma (ARS) das leveduras. Os elementos ARS permitem a manutenção de plasmídios extra-cromossômicos nas leveduras e têm sido implicados em funcionar na origem da replicação do cromossomo e como regiões de fixação à matriz nuclear (MARs), bem como moduladores da atividade de estimuladores e silenciadores transcricionais. Nas MARs dos eucariotos superiores, sequências consenso similares tem sido encontradas. Assim, uma MAR ou ARS no cDNA do fVIII poderia explicar os efeitos repressores do cDNA do fVIII na transcrição. Em adição, a observação de que a deleção do Xmn I-Bgl II (XmnI-Bgl II, de 1375 ao 1680) alivia a repressão enquanto o fragmento por si só não é suficiente para diminuir a expressão concorda plenamente com a estrutura modular dos elementos MARs e bem como de ARS. A remoção ou mutação de alguns elementos ARS diminuem sua função, mas não a abole completamente. Nós temos evidência de que os elementos WTTTAYRTTTW derivados do fVIII podem reprimir a expressão de genes heterólogos se inseridos na unidade de transcrição, mostrando o potencial desses elementos no cDNA do fVIII em reprimir a expressão. Se a expressão do fVIII está inibida pela fortuita presença de ARS ou MARs no cDNA do fVIII, múltiplas mutações serão requeridas para abolir completamente o repressor. A retirada do fragmento XmnI-Bgl II de 305 pares de bases dos vetores de expressão não é uma opção. Essa região da molécula é essencial para a função do fVIII, já que oito mutações de sentido trocado foram identificadas nessa região que resultam na hemofilia A. Correntemente, nós estamos tentando elucidar o mecanismo preciso da repressão e definir as sequências envolvidas, por exemplo, pela identificação de elementos de ligação a proteína no fragmento Xmn I-Bgl II de 305 pares de bases. A identificação de elementos responsáveis permitirá a eliminação dos sítios de ligação pela introdução de mutações não codificadoras. Como uma abordagem alternativa, os íntrons poderiam ser introduzidos para separar e inativar potencialmente vários elementos repressores. A geração de cDNAs de fVIII mutado que são expressados mais eficientemente aumentará a quantidade da proteína fVIII produzida nas células e melhorará o título de estoques de vírus de fVIII. Isso, é claro, não somente melhorará a executividade da terapia genética para hemofilia A, mas também será de considerável importância para a produção de fVIII derivado de DNA recombinante para transfusão.
Obs.: Enzimas de Restrição Que Cortam a Fita Dupla de DNA e Respectivos Sítios de Atuação
Acc I : GTATAC ou GTCGAC (?);
Bgl II : AGATCT;
Xho I : CTCGAG;
Sal I: GTCGAC;
Spe I ACTAGT;
Xmn I: GAANNNNTTC (produz final cego);
BamH I: GGATCC;
Hind II: 5’ AAGCTT 3’
Fonte:
PMID: 7727775 - http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/85/9/2447
sábado, 19 de dezembro de 2009
#607822 ALZHEIMER DISEASE 3
Alternative titles; symbols
AD3ALZHEIMER DISEASE 3, EARLY-ONSETALZHEIMER DISEASE, FAMILIAL, 3, WITH SPASTIC PARAPARESIS AND APRAXIA, INCLUDED
Lócus do Gene Mapeado 14q24.3
TEXTO
Um sinal # é usado nesta entrada porque a doença de Alzheimer familiar de estabelecimento precoce 3 (AD3) é causada por mutação no gene presenilina-1 (PSEN; omim 104311).
Para uma descrição fenotípica e uma discussão da heterogeneidade genética da doença de Alzheimer, veja OMIM 104300.
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Campion e outros (1995) estudaram um grande pedigree que incluía 34 pessoas com demência progressiva de estabelecimento precoce com uma idade média de surgimento máxima aos 46 e mínima de 3,5 anos e idade média de falecimento de 52,6 anos. Mioclônus (contração muscular única ou em série de músculos) e sinais extrapiramidais (sinais físicos que incluem tremores, rigidez e lentidão nos movimentos que lembram sintomas da doença de Parkinson.) eram comuns; convulsões estavam presentes em todos os sujeitos afetados. Havia alterações neuropatológicas típicas da doença de Alzheimer nos dois cérebros examinados.
Lopera e outros (1997) descreveram um amplo pedigree com a doença de Alzheimer de estabelecimento precoce de uma comunidade da Antioquia na Colômbia. Os pacientes afetados tinham a idade média de 46,8 anos (de alcance entre 34 e 62) no surgimento e um intervalo médio de oito anos antes da morte. Foi notada dor de cabeça nos indivíduos afetados significativamente mais frequentemente do que nos não afetados. Os sintomas mais frequentes eram perda de memória seguida de alterações no comportamento e personalidade e perda da capacidade linguística. Nos estágios finais, distúrbios no andar, convulsões e mioclônus eram frequentes.
Hull e outros (1998) descreveram uma família Alemã com doença de Alzheimer de estabelecimento precoce com uma mutação no gene PSEN1. A partir da idade dos 43 anos, o probando tinha-se queixado de perda de memória de curto prazo. Os parentes tinham notados seus sintomas ainda mais cedo e dataram o estabelecimento da deficiência aos 38 anos quando ele mostrava aumento na interrupção do discurso seguindo-se ao afastamento social. Havia forte histórico familiar de demência. Por três gerações o estabelecimento da demência nesta família estava entre 42 e 45 anos de idade.
Rippon e outros (2003) relataram uma família afro-americana com demência e psicose rapidamente progressivas autossômica dominante ocorrendo no início da quinta década. Dois irmãos apresentavam-se com alterações na personalidade, humor transitório, dificuldades de linguagem, psicose, reflexos primitivos consistentes com demência frontotemporal (omim 600274), mas também foram achadas diminuição da memória e características neuropatológicas diagnósticas de AD. Ambos irmãos tinham uma mutação no gene PSEN1. Seus pais haviam falecido na sexta década com doença similar. Os autores comentaram sobre a apresentação clínica atípica.
Godbolt e outros (2004) noticiaram dois irmãos com doença de Alzheimer de estabelecimento precoce confirmados por análise genética. Ambos os pacientes apresentava-se em tornos dos 50 anos de idade com dificuldade de achar palavras e função executiva frontal diminuída, mas com relativa preservação da memória. A irmã exibia discurso disfluente com parafasias (troca de palavras) fonêmicas, disgrafia e dispraxia (funcionamento difícil ou doloroso de um órgão). Depois ela desenvolveu o mutismo, rigidez generalizada, mioclônus dos membros superiores, postura distônica (incompatível com o movimento voluntário) da mão direita, e confusão no andar. O irmão exibia debilidade na repetição se frases e palavras polissilábicas, trocava nomes, tinha disgrafia e discalculia. O MRI de ambos os pacientes mostrou muiltiplos focos de sinal de alterações na matéria branca.
Ataka e outros (2004) noticiaram um paciente Japonês com estabelecimento da debilidade na memória e dificuldade em dirigir um carro na idade de 26 anos. Testes neuropsicológicos mostraram que ele tinha apraxia visual estrutural, agnósia (comprometimento da capacidade de reconhecer) espaço-visual, e ataxia (incapacidade de controlar a atividade muscular no movimento voluntário) ótica, consistentes com a variante visual da AD na qual existe um déficit cognitivos espaço-visual. O paciente era heterozigoto para uma mutação no gene PSEN1.
MAPEAMENTO
St. George-Hyslop e outros (1992), Van Broeckhoven e outros (1992), e Mullan e outros (1992) apresentaram evidência da ligação da FAD de estabelecimento precoce com o cromossomo 14q.
Em duas famílias belgas com AD autossômica dominante de estabelecimento precoce, Van Broeckhoven e outros (1987) excluíram a ligação ao lócus da APP (precursora da amilóide beta, omim 104760 – 21q21) no cromossomo 21q. Um pedigree continha 36 pacientes em seis gerações, e o outro tinha 22 pacientes estendendo-se por cinco gerações. Por análises de ligação das duas famílias estudadas por Van Broeckhoven e outros (1987), Van Broeckhoven e outros (1987) descobriram a ligação ao cromossomo 14q. Eles restringiram a região candidata a uma área de 8,9 cM entre D14S42 e D14S53, flanqueando o D14S43 em ambos os lados.
Mullan e outros (1992) localizaram o gene próximo ao da alfa-1-antiquimiotripsina (AACT; omim 107280), excluindo assim a AACT, a qual é um componente dos cernes da placa e um inibidor de protease, como um possível gene candidato para AD.
[OMIM 107280 – A Alfa-1-antiquimiotripsina é um inibidor de protease do plasma sintetizado no fígado. Ela é uma cadeia glicopeptídica única de aproximadamente 68 quilo-dáltons e pertence à classe dos inibidores de protease de serina (uma serpina). No homem, o nível normal no soro é aproximadamente um décimo do da alfa-1-antitripsina (PI; omim 107400), com a qual ela compartilha homologia de sequência de ácidos nucléicos e na proteína (Chandra e outros, 1983). Ambas são reagentes principais de fase aguda; suas concentrações no plasma aumentam em resposta a trauma, cirurgia e infecção. A anti-trombina III, a qual também é estruturalmente similar à alfa-1-anti-tripsina, apresenta menos homologia seqüencial à antiquimiotripsina e não é um reagente de fase aguda.]
Schellemberg e outros (1993) exploraram o papel do cromossomo 14 na FAD de estabelecimento tardio. Eles estudaram 49 famílias com uma idade média de estabelecimento aos 60 anos ou mais. Nenhuma evidência de ligação foi obtida, e forte evidência contra a ligação a marcadores do cromossomo 3 foi encontrada. Foi encontrada evidência de ligação ao D14S52 para um sub-grupo de famílias de idade intermediária de estabelecimento, a saber, com mais de 60 mas menos de 70 anos de idade. Eles concluíram que o lócus do cromossomo 14 não era responsável pela doença de Alzheimer na maioria dos parentes com FAD de estabelecimento tardio.
Em dois grandes pedigrees de FAD de estabelecimento precoce, Nechiporuk e outros (1993) encontraram estreita ligação com D14S43 e D14S53. Em um grande pedigree com FAD de estabelecimento precoce, Campion e outros (1995) observaram um lod score de 5,48 em uma recombinação fração de theta=0,0 com o marcador genético D14S43, confirmando a localização do gene responsável no cromossomo 14q24.3.
HISTÓRIA
A doença de Alzheimer de estabelecimento precoce com paraparesia (fraqueza que afeta os membos inferiores) foi relatada primeiro por Barrett (1913).
Ettinger e outros (1994) propuseram que a doença familiar de Alzheimer está associada com a instabilidade cromossômica e a quebra em sítios não aleatórios. Usando um nova técnica de co-transferidor de genes envolvendo marcadores ligados ao X, eles encontraram diminuída co-transferência dos marcadores em fibroblastos FAD comparados aos controles, sugerindo ruptura cromossômica aumentada. Os autores hipotetizaram um papel para a proteína trifuncional C(1)-THF sintase (omim 172460), a qual está mapeada em 14q24, na geração da instabilidade cromossômica na FAD.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=607822
Alternative titles; symbols
AD3ALZHEIMER DISEASE 3, EARLY-ONSETALZHEIMER DISEASE, FAMILIAL, 3, WITH SPASTIC PARAPARESIS AND APRAXIA, INCLUDED
Lócus do Gene Mapeado 14q24.3
TEXTO
Um sinal # é usado nesta entrada porque a doença de Alzheimer familiar de estabelecimento precoce 3 (AD3) é causada por mutação no gene presenilina-1 (PSEN; omim 104311).
Para uma descrição fenotípica e uma discussão da heterogeneidade genética da doença de Alzheimer, veja OMIM 104300.
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Campion e outros (1995) estudaram um grande pedigree que incluía 34 pessoas com demência progressiva de estabelecimento precoce com uma idade média de surgimento máxima aos 46 e mínima de 3,5 anos e idade média de falecimento de 52,6 anos. Mioclônus (contração muscular única ou em série de músculos) e sinais extrapiramidais (sinais físicos que incluem tremores, rigidez e lentidão nos movimentos que lembram sintomas da doença de Parkinson.) eram comuns; convulsões estavam presentes em todos os sujeitos afetados. Havia alterações neuropatológicas típicas da doença de Alzheimer nos dois cérebros examinados.
Lopera e outros (1997) descreveram um amplo pedigree com a doença de Alzheimer de estabelecimento precoce de uma comunidade da Antioquia na Colômbia. Os pacientes afetados tinham a idade média de 46,8 anos (de alcance entre 34 e 62) no surgimento e um intervalo médio de oito anos antes da morte. Foi notada dor de cabeça nos indivíduos afetados significativamente mais frequentemente do que nos não afetados. Os sintomas mais frequentes eram perda de memória seguida de alterações no comportamento e personalidade e perda da capacidade linguística. Nos estágios finais, distúrbios no andar, convulsões e mioclônus eram frequentes.
Hull e outros (1998) descreveram uma família Alemã com doença de Alzheimer de estabelecimento precoce com uma mutação no gene PSEN1. A partir da idade dos 43 anos, o probando tinha-se queixado de perda de memória de curto prazo. Os parentes tinham notados seus sintomas ainda mais cedo e dataram o estabelecimento da deficiência aos 38 anos quando ele mostrava aumento na interrupção do discurso seguindo-se ao afastamento social. Havia forte histórico familiar de demência. Por três gerações o estabelecimento da demência nesta família estava entre 42 e 45 anos de idade.
Rippon e outros (2003) relataram uma família afro-americana com demência e psicose rapidamente progressivas autossômica dominante ocorrendo no início da quinta década. Dois irmãos apresentavam-se com alterações na personalidade, humor transitório, dificuldades de linguagem, psicose, reflexos primitivos consistentes com demência frontotemporal (omim 600274), mas também foram achadas diminuição da memória e características neuropatológicas diagnósticas de AD. Ambos irmãos tinham uma mutação no gene PSEN1. Seus pais haviam falecido na sexta década com doença similar. Os autores comentaram sobre a apresentação clínica atípica.
Godbolt e outros (2004) noticiaram dois irmãos com doença de Alzheimer de estabelecimento precoce confirmados por análise genética. Ambos os pacientes apresentava-se em tornos dos 50 anos de idade com dificuldade de achar palavras e função executiva frontal diminuída, mas com relativa preservação da memória. A irmã exibia discurso disfluente com parafasias (troca de palavras) fonêmicas, disgrafia e dispraxia (funcionamento difícil ou doloroso de um órgão). Depois ela desenvolveu o mutismo, rigidez generalizada, mioclônus dos membros superiores, postura distônica (incompatível com o movimento voluntário) da mão direita, e confusão no andar. O irmão exibia debilidade na repetição se frases e palavras polissilábicas, trocava nomes, tinha disgrafia e discalculia. O MRI de ambos os pacientes mostrou muiltiplos focos de sinal de alterações na matéria branca.
Ataka e outros (2004) noticiaram um paciente Japonês com estabelecimento da debilidade na memória e dificuldade em dirigir um carro na idade de 26 anos. Testes neuropsicológicos mostraram que ele tinha apraxia visual estrutural, agnósia (comprometimento da capacidade de reconhecer) espaço-visual, e ataxia (incapacidade de controlar a atividade muscular no movimento voluntário) ótica, consistentes com a variante visual da AD na qual existe um déficit cognitivos espaço-visual. O paciente era heterozigoto para uma mutação no gene PSEN1.
MAPEAMENTO
St. George-Hyslop e outros (1992), Van Broeckhoven e outros (1992), e Mullan e outros (1992) apresentaram evidência da ligação da FAD de estabelecimento precoce com o cromossomo 14q.
Em duas famílias belgas com AD autossômica dominante de estabelecimento precoce, Van Broeckhoven e outros (1987) excluíram a ligação ao lócus da APP (precursora da amilóide beta, omim 104760 – 21q21) no cromossomo 21q. Um pedigree continha 36 pacientes em seis gerações, e o outro tinha 22 pacientes estendendo-se por cinco gerações. Por análises de ligação das duas famílias estudadas por Van Broeckhoven e outros (1987), Van Broeckhoven e outros (1987) descobriram a ligação ao cromossomo 14q. Eles restringiram a região candidata a uma área de 8,9 cM entre D14S42 e D14S53, flanqueando o D14S43 em ambos os lados.
Mullan e outros (1992) localizaram o gene próximo ao da alfa-1-antiquimiotripsina (AACT; omim 107280), excluindo assim a AACT, a qual é um componente dos cernes da placa e um inibidor de protease, como um possível gene candidato para AD.
[OMIM 107280 – A Alfa-1-antiquimiotripsina é um inibidor de protease do plasma sintetizado no fígado. Ela é uma cadeia glicopeptídica única de aproximadamente 68 quilo-dáltons e pertence à classe dos inibidores de protease de serina (uma serpina). No homem, o nível normal no soro é aproximadamente um décimo do da alfa-1-antitripsina (PI; omim 107400), com a qual ela compartilha homologia de sequência de ácidos nucléicos e na proteína (Chandra e outros, 1983). Ambas são reagentes principais de fase aguda; suas concentrações no plasma aumentam em resposta a trauma, cirurgia e infecção. A anti-trombina III, a qual também é estruturalmente similar à alfa-1-anti-tripsina, apresenta menos homologia seqüencial à antiquimiotripsina e não é um reagente de fase aguda.]
Schellemberg e outros (1993) exploraram o papel do cromossomo 14 na FAD de estabelecimento tardio. Eles estudaram 49 famílias com uma idade média de estabelecimento aos 60 anos ou mais. Nenhuma evidência de ligação foi obtida, e forte evidência contra a ligação a marcadores do cromossomo 3 foi encontrada. Foi encontrada evidência de ligação ao D14S52 para um sub-grupo de famílias de idade intermediária de estabelecimento, a saber, com mais de 60 mas menos de 70 anos de idade. Eles concluíram que o lócus do cromossomo 14 não era responsável pela doença de Alzheimer na maioria dos parentes com FAD de estabelecimento tardio.
Em dois grandes pedigrees de FAD de estabelecimento precoce, Nechiporuk e outros (1993) encontraram estreita ligação com D14S43 e D14S53. Em um grande pedigree com FAD de estabelecimento precoce, Campion e outros (1995) observaram um lod score de 5,48 em uma recombinação fração de theta=0,0 com o marcador genético D14S43, confirmando a localização do gene responsável no cromossomo 14q24.3.
HISTÓRIA
A doença de Alzheimer de estabelecimento precoce com paraparesia (fraqueza que afeta os membos inferiores) foi relatada primeiro por Barrett (1913).
Ettinger e outros (1994) propuseram que a doença familiar de Alzheimer está associada com a instabilidade cromossômica e a quebra em sítios não aleatórios. Usando um nova técnica de co-transferidor de genes envolvendo marcadores ligados ao X, eles encontraram diminuída co-transferência dos marcadores em fibroblastos FAD comparados aos controles, sugerindo ruptura cromossômica aumentada. Os autores hipotetizaram um papel para a proteína trifuncional C(1)-THF sintase (omim 172460), a qual está mapeada em 14q24, na geração da instabilidade cromossômica na FAD.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=607822
600278 RAP1, GTPase-ACTIVATING PROTEIN 1; RAP1GA1
Símbolo Alternativo
Proteína de Ativação de GTPase, RAP1, 1; RAP1GAP
Lócus do Mene Mapeado 1p36.1-p35
CLONAGEM
Os genes relacionados a Ras codificam uma super-família de proteínas p21 que estão envolvidas no crescimento e diferenciação celular e apresentam atividades que são influenciadas pela ligação e hidrólise de GTP. Proteínas específicas ativadoras de GTPase que atuam em papéis regulatórios nesse processo enzimático foram identificadas como a proteína homóloga de RAS (ARHG; omim 179505) e RAP1A (179520). Dessas proteínas, a proteína de ativação de GTPase de RAS (RASA; omim139150) é a que foi melhor definida, cuja sobre-expressão pode suprimir a atividade transformadora de RAS. A proteína p21 RAP1 é de particular interesse já que foi mostrada como antagonista de RAS e é capaz de suprimir a transformação celular. Sugeriu-se que a RAP1 se liga competitivamente à RASA, interferindo assim com sua função efetora de RAS. Rubinfeld e outros (1991) isolaram uma proteína ativadora de GTPase que pode regular a atividade de RAP1. Ela mostrou-se com grande expressão em indiferenciadas células tumorais, sugerindo que ela deve ter um papel na diferenciação e crescimento de células malígnas.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
Daumke e outros (2004) apresentaram a estrutura cristalina do domínio catalítico da RAP1GAP em resolução de 2,9 angstrons. Por análises de mutação, titulação de fluorescência e ensaio cinético de paralisação de fluxo, Daumke e outros (2004) demonstraram que a RAP1GAP tem uma asparagina catalítica na posição 290 para estimular a hidrólise da GTP.
MAPEAMENTO
Weiss e outros (1994) mapearam a RAP1GA1 no lócus 1p36.1-p35, usando fluorescência em sítio de hibridização seguida de análises de Southern blot do DNA isolado de células somáticas híbridas de ramsteres e humanos ou de camundongo e humanas.
Fonte :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=600278
Símbolo Alternativo
Proteína de Ativação de GTPase, RAP1, 1; RAP1GAP
Lócus do Mene Mapeado 1p36.1-p35
CLONAGEM
Os genes relacionados a Ras codificam uma super-família de proteínas p21 que estão envolvidas no crescimento e diferenciação celular e apresentam atividades que são influenciadas pela ligação e hidrólise de GTP. Proteínas específicas ativadoras de GTPase que atuam em papéis regulatórios nesse processo enzimático foram identificadas como a proteína homóloga de RAS (ARHG; omim 179505) e RAP1A (179520). Dessas proteínas, a proteína de ativação de GTPase de RAS (RASA; omim139150) é a que foi melhor definida, cuja sobre-expressão pode suprimir a atividade transformadora de RAS. A proteína p21 RAP1 é de particular interesse já que foi mostrada como antagonista de RAS e é capaz de suprimir a transformação celular. Sugeriu-se que a RAP1 se liga competitivamente à RASA, interferindo assim com sua função efetora de RAS. Rubinfeld e outros (1991) isolaram uma proteína ativadora de GTPase que pode regular a atividade de RAP1. Ela mostrou-se com grande expressão em indiferenciadas células tumorais, sugerindo que ela deve ter um papel na diferenciação e crescimento de células malígnas.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
Daumke e outros (2004) apresentaram a estrutura cristalina do domínio catalítico da RAP1GAP em resolução de 2,9 angstrons. Por análises de mutação, titulação de fluorescência e ensaio cinético de paralisação de fluxo, Daumke e outros (2004) demonstraram que a RAP1GAP tem uma asparagina catalítica na posição 290 para estimular a hidrólise da GTP.
MAPEAMENTO
Weiss e outros (1994) mapearam a RAP1GA1 no lócus 1p36.1-p35, usando fluorescência em sítio de hibridização seguida de análises de Southern blot do DNA isolado de células somáticas híbridas de ramsteres e humanos ou de camundongo e humanas.
Fonte :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=600278
sexta-feira, 18 de dezembro de 2009
*179520 RAS-RELATED PROTEIN 1A; RAP1A
Símbolo Alternativo KREV1
Lócus do Gene Mapeado 1p13.3
CLONAGEM
Rousseau-Merck e outros (1990) estabelceram que três novos cDNAs humanos codificadores de proteínas relacionadas com RAS, designados RAP1A, RAP1B (omim179530) e RAP2 (omim179540), foram isolados por Pizon e outros (1988) e Pizon e outros (1988). Essas proteínas compartilham aproximadamente 50% de identidade de aminoácidos com as clássicas proteínas RAS e têm numerosas feições estruturais em comum. A mais notória diferença entre as proteínas RAP e RAS residem em seus 6 primeiros aminoácidos (their 61st amino acid): a glutamina na RAS é substituída pela treonina nas proteínas RAP.
Kitayama e outros (1989) isolaram um cDNA humano chamado Krev1 que pode suprimir o fenótipo trasnformado de uma linhagem celular transformada Kirsten. A sequência de aminoácidos prevista da proteína Krev1 é idêntica à de RAP1A.
FUNÇÃO DO GENE
Boussiotis e outros (1997) notaram que a C3G [omim 600303 A C3G é uma proteína de liberação do nucleotído guanina (GNRP) identificada como uma proteína CRK (164762) de ligação a SH3 (domínio 3 de homologia a Src); a proteína CXORF9 (omim300441- sequencia aberta de leitura do cromossomo X) tem um domínio SH3 (Obs.: Sequencia aberta de leitura é a que fica entre o código iniciador e finalizador.)] catalisa o permutador de GTP da Rap1. Análises de imuno-pigmentação mostraram que nas células T anérgicas, a CBL [omim 165360 O proto-oncogene CBL funciona como um regulador negativo de várias vias de sinalização de receptores de proteínas cinases de tirosina e como uma proteína adaptadora na sinalização dependente da fosforilação da tirosina.] está constitutivamente fosforilada, os complexos CRKL (omim602007)-C3G são recrutados, e a Rap1, uma antagonista da função de Ras e um regulador negativo da transcrição da IL-2, é ativada. Boussiotis e outros (1997) sugeriram que a chave determinante do resultado funcional dos sinais inciados pelo receptor de célula T podem estar na razão da Ras-GTP para RAP1-GTP, com predomínio de uma forma aumentando e da outra bloqueando a transcrição da IL2.
Asha e outros (1999) demonstraram que as vias de sinalização mediadas pela RAS-1 na Drosófila não são influenciadas pelos níveis de RAP1, sugerindo que a RAS1 e a RAP1 funcinam por diferentes caminhos. Além disso, uma mutação que abole o suspeito sítio de fosforilação de cinase dependente de AMP cíclico da RAP1 da Drosófla pode ainda resgatar o fenótipo mutante da RAP1. Asha e outros (1999) demonstraram que a RAP1 não é necessária para a proliferação celular e a especificação do destino celular mas tem uma função crítica na regulação da morfogênese normal da célula no disco ocular, ovário e embrião. As mutações na RAP1 também rompem a migração celular e causam anomalias no formato da célula. Esses achados indicam um papel para as proteínas RAP como reguladoras da morfogênese in vivo.
Mochizuki e outros (2001) usaram sensores baseados em tranferidor de energia por ressonância fluorescente (FRET) para avaliar imagens espaço-temporais da ativação da RAS e da RAP1 induzida por fator de crescimento. O Fator de Crescimento da Epiderme (omim131530) ativou a RAS na membrana plasmática periférica e a RAP1 na região perinuclear intracelular em células COS-1. Em células PC12, a ativação da RAS induzida pelo fator de crescimento do nervo (veja omim 162030) foi iniciada na membrana plasmática e transmitida para todo o corpo celular. Após três horas, alta atividade de RAS foi observada em neuritos [um neurito significa uma projeção a partir de um corpo celular de um neurônio, que pode ser um axônio ou um dendrito. http://en.wikipedia.org/wiki/Neurite] em expansão. Com uso de técnica de FRAP (recuperação de fluorescência após foto-branqueamento), Mochizuki e outros (2001) descobriram que a RAS nos neuritos retornam rapidamente; por esse motivo, a atividade sustentada da RAS nos neuritos foi devida à alta taxa de permutação de GTP para GDP e/ou baixa atividade de GTPase, mas não pela retenção da RAS ativa. Enquanto análises bioquímicas prévias raramente detectavam mais do que 40% de ativação da RAS na estimulação por fator de crescimento, Mochizuki e outros (2001) concluíram que seus dados mostram que a estimulação pelo fator de crescimento ativa fortemente a RAS/RAP1 em áreas muito restritas dentro das células, e que uma grande população de RAS ou RAP1 permanece inativa, causando uma resposta aparente de baixos níveis em ensaios bioquímicos.
Zhu e outros (2002) examinaram as pequenas GTPases RAS e RAP em sinalização pós-sinapticas subjacentes à plasticidade sináptica. Eles mostraram que a RAS retransmite a sinalização do receptor NMDA (veja omim 138252) e e da proteína cinase II (veja 114078) dependente de calcio/calmodulina que dirigem a entrega sinaptica dos receptores AMPA [veja omim 138248 - Receptores de glutamato são os receptores de neurotrasmissores exitatórios predominantes no cérebro dos mamíferos e são ativados em uma variedade de processos neurofisiológicos. A classificação dos receptores de glutamato é baseada em sua ativação por diferentes agonistas (competidores) farmacológicos. Assim os receptores de glutamato foram denominados de acordo com seus agonistas respectivos, o N-methyl-D-aspartato (NMDA), ácido quisquálico [aminoácido excitatório obtido das sementes de Quisqualis chinensis. Stedman] (QUIS), cainato (KA) [ácido caínico é um análogo do glutamato que exibe atividade exitatória e tóxica potente e prolongada sobre os neurônios. Stedman], e receptores 2-amino-4-fosfonobutirato [butirato é sal ou éster de ácido butírico.Stedman] (AP4)] durante potenciação de longo prazo. Em contraste, a RAP foi encontrada mediando a remoção de recpetores AMPA sinápticos dependente do receptor NMDA que ocorre durante a depressão de longo prazo. Os autores determinaram que a RAS e a RAP exercem seus efeitos nos receptores AMPA que contém diferentes composições de sub-unidades. Assm, a RAS e a RAP, cujas atividades podem ser controladas por enzimas pós-sinapticas, servem como reguladores independentes para potencialização e depressão de sinapses centrais (do sistema nervoso central).
Knox e Brown (2002) descobriram que distribuição de junções aderentes também é um processo ativo que requer a RAP1. Células mutante para RAP1 condensaram suas junções de adesão ao sítio 1 da célula. Isso rompeu o comportamento normal da célula epitelial e clones da célula mutante dispersaram-se para dentro do tecido normal à sua volta. A RAP1 é enriquecida em junções de adesão, particularmente entre novas células irmãs divididas onde ela pode revalidar a área de junção aderente.
MAPEAMENTO
Rousseau-Merck e outros (1990) usaram provas de cDNA para assinar os genes de RAP por hibridização em sítio; foram assinados RAP1A, RAP1B e RAP2A em 1p13-p12, 12q14 e 13q34, respectivamente, sem hibridização cruzada ou nenhum sinal secundário. Através de fluorescência em sítio de hibridização, Takai e outros (1993) restringiram a assinatura do gene KREV1 em 1p13.3 e mapearam seu pseudogene (KREV1P) em 14q24.3. [OBS.: fica perto da alfa-1-antitripsina?]
MODELO ANIMAL
Usando camundongos transgênicos para expressão constitutica da Rap1 dentro da linhagem de células T, Sebzda e outros (2002) descobriram que apesar da anergia, essas células T mostravam aumentadas respostas mediadas por receptor de célula T, ambas em timócitos e células T maduras. Em adição, a ativação da Rap1a induziu orte ativação das integrinas beta-1 e beta-2. Os autores concluíram que a Rap1a influencia positivamente as células T pelo aumento em suas respostas e direcionamento da ativação de integrinas.
Li e outros (2007) geraram camundongos carentes de Rap1a. Embora a perda da Rap1a não tivesse afetado o tamanho ou a viabilidade dos camundongos inicialmente, no acasalamento com camundongos C57BL/6J alguns embriões Rap1a-/- morreram no útero. Os camundongos Rap1a-/- não mostraram defeitos no desenvolvimento de células T, B ou mielóides. Entretanto, os macrófagos Rap1a-/- exibiram aumentada amplitude de movimentos ou haptotaxia (hapto = agarrar http://www.pdamed.com.br/diciomed/pdamed_0001_08804.php; taxia = mover em direção) nas matrizes de fibronectna (FN1 omim 135600) e vitronectina (VTN omim 193190) que correlacionavam com adesão diminuída. As respostas quimiotáticas (relativas à quimiotaxia) das céluas linfóides e mielóides Rap1a-/- à Cxcl12 (omim600835) e à Ccl21 (602737) estavam significativamente reduzidas, mas a fagocitose mediada pelo FcR [receptor do fragmento Fc dos anticorpos] (veja omim 146790) estava aumentada. Neutrófilos de camundongos Rap1a -/- tinham reduzida produção de superóxido quando estimulados com o peptídeo sintético quimiotático FMLP. Li e outros (2007) concluíram que, a despeito da identidade sequencial de 95%, distribuição intracelular similar, e distribuição tecidual ampla, a Rap1a e a Rap1b não são funcionalmente redundantes e, ao invés disso, regulam diferenciadamente alguns eventos celulares.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=179520
Símbolo Alternativo KREV1
Lócus do Gene Mapeado 1p13.3
CLONAGEM
Rousseau-Merck e outros (1990) estabelceram que três novos cDNAs humanos codificadores de proteínas relacionadas com RAS, designados RAP1A, RAP1B (omim179530) e RAP2 (omim179540), foram isolados por Pizon e outros (1988) e Pizon e outros (1988). Essas proteínas compartilham aproximadamente 50% de identidade de aminoácidos com as clássicas proteínas RAS e têm numerosas feições estruturais em comum. A mais notória diferença entre as proteínas RAP e RAS residem em seus 6 primeiros aminoácidos (their 61st amino acid): a glutamina na RAS é substituída pela treonina nas proteínas RAP.
Kitayama e outros (1989) isolaram um cDNA humano chamado Krev1 que pode suprimir o fenótipo trasnformado de uma linhagem celular transformada Kirsten. A sequência de aminoácidos prevista da proteína Krev1 é idêntica à de RAP1A.
FUNÇÃO DO GENE
Boussiotis e outros (1997) notaram que a C3G [omim 600303 A C3G é uma proteína de liberação do nucleotído guanina (GNRP) identificada como uma proteína CRK (164762) de ligação a SH3 (domínio 3 de homologia a Src); a proteína CXORF9 (omim300441- sequencia aberta de leitura do cromossomo X) tem um domínio SH3 (Obs.: Sequencia aberta de leitura é a que fica entre o código iniciador e finalizador.)] catalisa o permutador de GTP da Rap1. Análises de imuno-pigmentação mostraram que nas células T anérgicas, a CBL [omim 165360 O proto-oncogene CBL funciona como um regulador negativo de várias vias de sinalização de receptores de proteínas cinases de tirosina e como uma proteína adaptadora na sinalização dependente da fosforilação da tirosina.] está constitutivamente fosforilada, os complexos CRKL (omim602007)-C3G são recrutados, e a Rap1, uma antagonista da função de Ras e um regulador negativo da transcrição da IL-2, é ativada. Boussiotis e outros (1997) sugeriram que a chave determinante do resultado funcional dos sinais inciados pelo receptor de célula T podem estar na razão da Ras-GTP para RAP1-GTP, com predomínio de uma forma aumentando e da outra bloqueando a transcrição da IL2.
Asha e outros (1999) demonstraram que as vias de sinalização mediadas pela RAS-1 na Drosófila não são influenciadas pelos níveis de RAP1, sugerindo que a RAS1 e a RAP1 funcinam por diferentes caminhos. Além disso, uma mutação que abole o suspeito sítio de fosforilação de cinase dependente de AMP cíclico da RAP1 da Drosófla pode ainda resgatar o fenótipo mutante da RAP1. Asha e outros (1999) demonstraram que a RAP1 não é necessária para a proliferação celular e a especificação do destino celular mas tem uma função crítica na regulação da morfogênese normal da célula no disco ocular, ovário e embrião. As mutações na RAP1 também rompem a migração celular e causam anomalias no formato da célula. Esses achados indicam um papel para as proteínas RAP como reguladoras da morfogênese in vivo.
Mochizuki e outros (2001) usaram sensores baseados em tranferidor de energia por ressonância fluorescente (FRET) para avaliar imagens espaço-temporais da ativação da RAS e da RAP1 induzida por fator de crescimento. O Fator de Crescimento da Epiderme (omim131530) ativou a RAS na membrana plasmática periférica e a RAP1 na região perinuclear intracelular em células COS-1. Em células PC12, a ativação da RAS induzida pelo fator de crescimento do nervo (veja omim 162030) foi iniciada na membrana plasmática e transmitida para todo o corpo celular. Após três horas, alta atividade de RAS foi observada em neuritos [um neurito significa uma projeção a partir de um corpo celular de um neurônio, que pode ser um axônio ou um dendrito. http://en.wikipedia.org/wiki/Neurite] em expansão. Com uso de técnica de FRAP (recuperação de fluorescência após foto-branqueamento), Mochizuki e outros (2001) descobriram que a RAS nos neuritos retornam rapidamente; por esse motivo, a atividade sustentada da RAS nos neuritos foi devida à alta taxa de permutação de GTP para GDP e/ou baixa atividade de GTPase, mas não pela retenção da RAS ativa. Enquanto análises bioquímicas prévias raramente detectavam mais do que 40% de ativação da RAS na estimulação por fator de crescimento, Mochizuki e outros (2001) concluíram que seus dados mostram que a estimulação pelo fator de crescimento ativa fortemente a RAS/RAP1 em áreas muito restritas dentro das células, e que uma grande população de RAS ou RAP1 permanece inativa, causando uma resposta aparente de baixos níveis em ensaios bioquímicos.
Zhu e outros (2002) examinaram as pequenas GTPases RAS e RAP em sinalização pós-sinapticas subjacentes à plasticidade sináptica. Eles mostraram que a RAS retransmite a sinalização do receptor NMDA (veja omim 138252) e e da proteína cinase II (veja 114078) dependente de calcio/calmodulina que dirigem a entrega sinaptica dos receptores AMPA [veja omim 138248 - Receptores de glutamato são os receptores de neurotrasmissores exitatórios predominantes no cérebro dos mamíferos e são ativados em uma variedade de processos neurofisiológicos. A classificação dos receptores de glutamato é baseada em sua ativação por diferentes agonistas (competidores) farmacológicos. Assim os receptores de glutamato foram denominados de acordo com seus agonistas respectivos, o N-methyl-D-aspartato (NMDA), ácido quisquálico [aminoácido excitatório obtido das sementes de Quisqualis chinensis. Stedman] (QUIS), cainato (KA) [ácido caínico é um análogo do glutamato que exibe atividade exitatória e tóxica potente e prolongada sobre os neurônios. Stedman], e receptores 2-amino-4-fosfonobutirato [butirato é sal ou éster de ácido butírico.Stedman] (AP4)] durante potenciação de longo prazo. Em contraste, a RAP foi encontrada mediando a remoção de recpetores AMPA sinápticos dependente do receptor NMDA que ocorre durante a depressão de longo prazo. Os autores determinaram que a RAS e a RAP exercem seus efeitos nos receptores AMPA que contém diferentes composições de sub-unidades. Assm, a RAS e a RAP, cujas atividades podem ser controladas por enzimas pós-sinapticas, servem como reguladores independentes para potencialização e depressão de sinapses centrais (do sistema nervoso central).
Knox e Brown (2002) descobriram que distribuição de junções aderentes também é um processo ativo que requer a RAP1. Células mutante para RAP1 condensaram suas junções de adesão ao sítio 1 da célula. Isso rompeu o comportamento normal da célula epitelial e clones da célula mutante dispersaram-se para dentro do tecido normal à sua volta. A RAP1 é enriquecida em junções de adesão, particularmente entre novas células irmãs divididas onde ela pode revalidar a área de junção aderente.
MAPEAMENTO
Rousseau-Merck e outros (1990) usaram provas de cDNA para assinar os genes de RAP por hibridização em sítio; foram assinados RAP1A, RAP1B e RAP2A em 1p13-p12, 12q14 e 13q34, respectivamente, sem hibridização cruzada ou nenhum sinal secundário. Através de fluorescência em sítio de hibridização, Takai e outros (1993) restringiram a assinatura do gene KREV1 em 1p13.3 e mapearam seu pseudogene (KREV1P) em 14q24.3. [OBS.: fica perto da alfa-1-antitripsina?]
MODELO ANIMAL
Usando camundongos transgênicos para expressão constitutica da Rap1 dentro da linhagem de células T, Sebzda e outros (2002) descobriram que apesar da anergia, essas células T mostravam aumentadas respostas mediadas por receptor de célula T, ambas em timócitos e células T maduras. Em adição, a ativação da Rap1a induziu orte ativação das integrinas beta-1 e beta-2. Os autores concluíram que a Rap1a influencia positivamente as células T pelo aumento em suas respostas e direcionamento da ativação de integrinas.
Li e outros (2007) geraram camundongos carentes de Rap1a. Embora a perda da Rap1a não tivesse afetado o tamanho ou a viabilidade dos camundongos inicialmente, no acasalamento com camundongos C57BL/6J alguns embriões Rap1a-/- morreram no útero. Os camundongos Rap1a-/- não mostraram defeitos no desenvolvimento de células T, B ou mielóides. Entretanto, os macrófagos Rap1a-/- exibiram aumentada amplitude de movimentos ou haptotaxia (hapto = agarrar http://www.pdamed.com.br/diciomed/pdamed_0001_08804.php; taxia = mover em direção) nas matrizes de fibronectna (FN1 omim 135600) e vitronectina (VTN omim 193190) que correlacionavam com adesão diminuída. As respostas quimiotáticas (relativas à quimiotaxia) das céluas linfóides e mielóides Rap1a-/- à Cxcl12 (omim600835) e à Ccl21 (602737) estavam significativamente reduzidas, mas a fagocitose mediada pelo FcR [receptor do fragmento Fc dos anticorpos] (veja omim 146790) estava aumentada. Neutrófilos de camundongos Rap1a -/- tinham reduzida produção de superóxido quando estimulados com o peptídeo sintético quimiotático FMLP. Li e outros (2007) concluíram que, a despeito da identidade sequencial de 95%, distribuição intracelular similar, e distribuição tecidual ampla, a Rap1a e a Rap1b não são funcionalmente redundantes e, ao invés disso, regulam diferenciadamente alguns eventos celulares.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=179520
quinta-feira, 10 de dezembro de 2009
O FATOR VIII CONTRIBUI PARA A FORMAÇÃO DO TROMBO DE FIBRINA E PLAQUETA PELA VIA DA GERAÇÃO DE TROMBINA SOB CONDIÇÕES DE POUCA LESÃO
Sugita C, Yamashita A, Moriguchi-Goto S, Furukoji E, Takahashi M, Harada A, Soeda T, Kitazawa T, Hattori K, Tamura S, Asada Y.
INTRODUÇÃO: O crescimento do trombo sob baixa velocidade do fluxo sanguíneo atua num importante papel no desenvolvimento da trombose venosa profunda (DVT). O aumento dos níveis plasmáticos e das atividades do Fator VIII da coagulação (FVIII) constituem fatores de risco para a DVT e o tromboembolismo pulmonar.
OBJETIVO: Localizar o FVIII no trombo venoso na DVT e determinar se o FVIII contribui para a formação do trombo sob condições de pouca lesão.
MÉTODOS: A localização do FVIII no trombo venoso obtido de pacientes com DVT foi examinada por imuno-histoquimica. O papel do FVIII na formação do trombo foi investigado usando-se um sistema de câmara de fluxo. O sangue venoso de voluntários saudáveis foi incubado com um anticorpo monoclonal anti-FVIII (VIII-3776) ou IgG de camundongos não imunizados. As amostras de sangue foram perfusadas (perfusão é a passagem de líquido em um tecido) em colágeno de tipo III em paredes vazadas nas proporções de 70/s e 400/s e então a superfície da área coberta por plaquetas e fibrina foi avaliada morfometricamente. A geração do fragmento de protrombina 1+2 (PF1+2) foi medida antes e depois da perfusão.
RESULTADOS: O trombo venoso na DVT consiste de uma mistura de plaquetas, fibrina e eritrócitos. O Fator VIII pareceu estar co-localizado com a glicoproteína IIb/IIIa, a fibrina e o fator von Willebrand no trombo. O VIII-3776 reconheceu especificamente a cadeia leve do FVIII e prolongou o tempo de tromboplastina parcialmente ativada (aPTT), mas não o tempo de protrombina (PT). O anticorpo reduziu significativamente as plaquetas na cobertura de fibrina, bem como a geração do fragmento PF1+2 na parede vazada em taxas de 70/s e 400/s.
CONCLUSÕES: Esses resultados sugerem que o FVIII contribui para a agregação das plaquetas e a formação da fibrina pela via da geração de trombina sob condições de pouca tosquia.
PMID: 19660789
Sugita C, Yamashita A, Moriguchi-Goto S, Furukoji E, Takahashi M, Harada A, Soeda T, Kitazawa T, Hattori K, Tamura S, Asada Y.
INTRODUÇÃO: O crescimento do trombo sob baixa velocidade do fluxo sanguíneo atua num importante papel no desenvolvimento da trombose venosa profunda (DVT). O aumento dos níveis plasmáticos e das atividades do Fator VIII da coagulação (FVIII) constituem fatores de risco para a DVT e o tromboembolismo pulmonar.
OBJETIVO: Localizar o FVIII no trombo venoso na DVT e determinar se o FVIII contribui para a formação do trombo sob condições de pouca lesão.
MÉTODOS: A localização do FVIII no trombo venoso obtido de pacientes com DVT foi examinada por imuno-histoquimica. O papel do FVIII na formação do trombo foi investigado usando-se um sistema de câmara de fluxo. O sangue venoso de voluntários saudáveis foi incubado com um anticorpo monoclonal anti-FVIII (VIII-3776) ou IgG de camundongos não imunizados. As amostras de sangue foram perfusadas (perfusão é a passagem de líquido em um tecido) em colágeno de tipo III em paredes vazadas nas proporções de 70/s e 400/s e então a superfície da área coberta por plaquetas e fibrina foi avaliada morfometricamente. A geração do fragmento de protrombina 1+2 (PF1+2) foi medida antes e depois da perfusão.
RESULTADOS: O trombo venoso na DVT consiste de uma mistura de plaquetas, fibrina e eritrócitos. O Fator VIII pareceu estar co-localizado com a glicoproteína IIb/IIIa, a fibrina e o fator von Willebrand no trombo. O VIII-3776 reconheceu especificamente a cadeia leve do FVIII e prolongou o tempo de tromboplastina parcialmente ativada (aPTT), mas não o tempo de protrombina (PT). O anticorpo reduziu significativamente as plaquetas na cobertura de fibrina, bem como a geração do fragmento PF1+2 na parede vazada em taxas de 70/s e 400/s.
CONCLUSÕES: Esses resultados sugerem que o FVIII contribui para a agregação das plaquetas e a formação da fibrina pela via da geração de trombina sob condições de pouca tosquia.
PMID: 19660789
quarta-feira, 9 de dezembro de 2009
O Gene Resposta Primária de Crescimento 2, Um Fator de Transcrição com Dedos de Zinco, é Requerido para a Indução Completa da Anergia Clonal nas Células T CD4+
RESUMO
A tolerância imune a um antígeno específico resulta da indução de mecanismos celulares que limitam as respostas de célula T a antígenos seletivos. Um desses mecanismos é caracterizado pela atenuada proliferação e decréscimo na produção de IL-2 em células Th CD4+ fartamente estimuladas e é denotado pela anergia da célula T. Nós relatamos a identificação do gene reposta primária de crescimento (Egr-2;Krox-20), um fator de transcrição com dedos de zinco, como uma proteína-chave requerida para a indução da anergia em células T em cultura. A sondagem do gene em série revelou que a alta expressão da Egr-2 persiste em células T A.E7 murinas anergizadas mas sem proliferação. Em contraste, a Egr-1, um membro parental da família induzida na co-estimulação, exibe pouca ou nenhuma expressão no estado de anergia. A anulação da anergia mediada pela IL-2 causa rápida depleção da proteína Egr-2. A farta estimulação de células T A.E7 falha em aumentar a IL-2 e a expressão da Egr-1, enquanto a expressão da Egr-2 é gradiosamente aumentada. O silenciamento da expressão do gene Er-2 pelo tratamento de células T A.E7 com pequenos RNA de interferência antes da incubação com anti-CD3 sozinha impede a indução completa da anergia. Entretanto, a depleção da Egr-2 mediada pelo pequeno RNA de interferência cinco dias após a indução da anergia não parece abolir a hipo-responsividade à estimulação. Esses dados indicam que a expressão sustentada da Egr-2 é necessária para induzir um completo estado anérgico através de ações de genes regulados por este fator de transcrição.
INTRODUÇÃO
A estimulação dos linfócitos T pelo antígeno através do TCR (receptor de célula T) na ausência da co-estimulação através de receptores acessórios resulta na produção deficiente de IL-2 e falta de proliferação. A conseqüência dessa sinalização parcial é a hipo-responsividade de longo prazo à co-estimulação subseqüente, um estado conhecido como anergia clonal da célula T. A indução ‘in vitro’ da anergia clonal é atingível pelo tratamento de linfócitos T A.E7 cultivados com anticorpos monoclonais anti-TCR imobilizados (anti-CD3) somente, enquanto uma robusta produção de IL-2 e proliferação são conseguidas se for incluído anticorpo monoclonal anti-CD8. Em contraste, a remoção da IL-2 lavando-se as células ou com adição de anticorpos neutralizantes de IL-2 resulta em anergia, ainda que em um ambiente co-estimulador. Em adição. A administração da IL-2 é suficiente para recuperar as células T de seu fenótipo anérgico.
Análises farmacológicas comparativas foram usadas para caracterizar a contribuição da sinalização do IL-2R (receptor de IL-2) para a evasão da anergia. O impedimento à proliferação da célula T com rapamicina, uma droga que bloqueia a transição do ciclo celular da fase G1 para a fase S através da interação com a sinalização intermediária da IL-2 nos mamíferos alvo da rapamicina, induz anergia em células T completamente estimuladas. Em contraste, a hidroxiuréia, uma droga que retém o crescimento celular na fase S mas permita a sinalização da IL-2, não promove o estado anérgico. Foi proposto que a anergia da célula T resulta da sobre-regulação de fatores específicos de anergia subseqüentes ao encaixe do TCR, mas esses fatores são diluídos ou degradados a seguir à sinalização da IL-2. Em contraste, células anérgicas, as quais não recebem estimulação de IL-2, parecem manter altos níveis desses fatores. Células anérgicas expostas a IL-2 exógena proliferam, provavelmente diluindo ou sub-regulando esses fatores, e escapam ao fenótipo hiporesponsivo. Não estão claros quais eventos são responsáveis pela indução da anergia em seguida à estimulação do TCR e quais eventos a seguir à sinalização no IL-2R podem impedir tanto a indução da anergia quanto abolir o estado de anergia em clones não respondedores.
A estimulação produtiva das células T resulta na produção de IL-2, um processo que requer a iniciação de múltiplas vias de sinalização paralelas, incluindo a ativação da NFAT (fator nuclear de células T ativadas); os membros JNK da família MAPK [Omim 601158 – As proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPKs) são uma família de proteínas cinases de treonina-serina que participam em um sistema maior de sinalização através do qual as células transformam estímulos extracelulares em respostas intracelulares. Dentro deste grupo estavam as cinases extracelularmente reguladas, ou ERKs (Omim 176948 – As ERKs também são conhecidas como proteínas cinases ativadas por maturação ou mitógeno.Na ativação, ela se movimenta para o núcleo da célula estimulada, onde fosforila alvos nucleares.), bem como outra sub-família, chamada proteínas cinases ativadas por estresse (SAPKs). Derijard e outros (1994) clonaram e caracterizaram uma cinase assim, chamada por eles de JNK1, de uma biblioteca de cérebro fetal humano. A sequência prevista da proteína apresenta 64,5% de homologia com ERK1(omim 601795) e 67,6% de homologia com ERK2. Os autores demonstraram que a expressão da JNK1 é induzida por luz ultravioleta e que ela se liga ao domínio terminal em amina (NH2) de transativação de c-JUN (cuja atividade de ativação de transcrição é aumentada ), fosforilando este domínio na serina 63 e na serina 73.], ERK e p38 (uma SAPK); e NF-KB [Omim 164011 – O NFKB1 foi primeiramente descrito como agente de interação com uma sequência de 11 pares de base atuando em cis (cis em oposto a trans, ou seja do mesmo lado da fita) no intensificador da cadeia leve de imunoglobulina. O complexo NFKB tem duas sub-unidades alternativas de ligação a DNA, a p105 e a p52/p100.]. A contribuição individual de cada via para a produção de IL-2 é complexa e correntemente é objeto de estudo intenso. Muitos componentes dessas vias são conhecidos, e têm sido comparados com populaçãoes de células T completamente responsivas e com populações anérgicas. Por exemplo, a ativação da NFAT requer um influxo primário de cálcio ao citoplasma, um evento que ocorre comparavelmente em populações normais e anérgicas e resulta na mobilização da NFAT para o núcleo. Entretanto, a produção e localização nuclear dos constituintes da AP-1 fos e jun são defeituosos nas células anérgicas. [O fator de transcrição AP-1 media a expressão de genes primários imediata em resposta à exposição das células a estímulo extracelular. A AP-1 é composta de complexos diméricos formados por membros dos grupos de fatores de transcrição Jun e Fos. A ativação da AP-1 é causada por: 1) aumento da expressão das proteínas Fos e Jun e 2) modificação da Fos e da Jun por fosforilação após a tradução. As atividades de proteína cinase que fosforilam e ativam a Jun (JNK) e a Fos (FRK) foram descritas. Equanto a cinase de c-Fos FRK é pouco compreendida, a cinase de c-Jun foi estudada em detalhes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC450211/?tool=pubmed] em adição, as diminuições na ativação de membros da via MAPK como Ras, JNK e EPK foram descritas em células T anérgicas, sugerindo numerosos pontos de regulação para a atividade da AP-1.
Vários grupos têm usado agora métodos de sondagem para provar a identidade de fatores de anergia que podem mediar o fenótipo anérgico descrito, usando exposição diferencial e técnicas de micro-arranjo (microarray) em modelos de anergia tanto ‘in vitro’ quanto ‘in vivo’. Um número de proteínas prováveis por contribuírem para a indução da anergia foi descrito, incluindo membros da família de ligase de ubiquitina [uma pequena proteína encontrada em todas as células e que modifica histonas e degrada proteínas intracelulares. Stedman] E3. A presença dessas prováveis leva à degradação de proteínas de sinalização necessárias para a entrada dentro do ciclo celular, impedindo assim uma etapa de proliferação necessária para escapar-se à anergia.
Nós usamos uma sondagem genômica para identificar genes seletivamente expressados nas célula T A.E7 anérgicas mas não em populações de células de controle imitando a simulação ou completamente estimuladas. Nós relatamos que a expressão do gene 2 da resposta primária de crescimento (Egr) persiste nas populações de células anérgicas, embora sua expressão seja muito mais transitória na presença da sinalização de CD28. A família dos genes Egr consiste de quatro membros (de Egr-1 a Egr-4) que são expressados rapidamente em seguida à estimulação. Uma característica marcante da família Egr é o domínio de ligação a DNA que consiste de três motivos de dedos de zinco. Esse domínio é conhecido por ligar-se à sequência GCGGGGGCG e sua presença em regiões de promotores do gene tem sido mostrada como um facilitador da trans-ativação de genes alvo. A Egr-2 tem sido a mais amplamente estudada no contexto do sistema nervoso, e seu alvejamento em camundongos nocauteados (sem a Egr-2) resulta na letalidade precoce concorrente aos defeitos na padronização da parte de trás do cérebro, mielinação dos nervos periféricos e formação dos ossos. A habiliade da Egr-2 para sobre-regular genes alvo têm-se mostrado regulada por co-repressores tais como membros da família de ligação NGFI-A e Ddx20. O papel da Egr-2 no compartimento imune não está descrito extensivamente, embora tenha sido mostrado que a trans-ativaçao da Egr-2 é dependente de membros da família NFAT nos linfócitos T, e a Egr-2 pode atuar num papel na regulação do ligante de Fas dependente da NFAT. Nós mostramos que a Egr-2 é sub-regulada aproximadamente dois dias após a estimulação total, quando ocorre a proliferação ativa a seguir a sinalização do receptor de IL-2. Em contraste, as células anérgicas mantém níveis elevados da proteína durante dez dias após a estimulação inicial. A exposição de células anérgicas à IL-2 resulta na diluição ou deradação da Egr-2 aproximadamente de 3 a 5 dias após a adição da IL-2, quando a proliferação está mais ativa. A depleção da Egr-2 através do silenciamento do gene mediado por pequeno RNA de interferência (siRNA) rompe a anergia demostrada pela ativação restaurada da ERK, produção de IL-2, e proliferação ainda que o siRNA de controle não tenha efeito significativo. Esses dados sugerem que a expressão da Egr-2 é requerida para a indução completa da anergia nas células T.
RESULTADOS
A Estimulação de Clones das Células T A.E7 Através do TCR na Ausência de Co-estimulação Resulta em Anergia
Um método para indução de anergia em linfócitos T é a entrega do sinal através do TCR na ausência de co-estimulação através da CD28. Para otimizar condições para a identificação de genes com perfil de expressão única em células T anérgicas, nós anergizamos as células T A.E7 cultivadas com anticorpo monoclonal anti CD3 e comparamos sua responsividade com células que tinham sido fingidamente estimuladas (anticorpo IgG imobilizado de controle) ou com células totalmente ativadas (com anticorpo monoclonal anti-CD3 mais anti-CD28 solúvel [o anticorpo pega as duas CDs?]). Nós determinamos que cinco dias de cultura após a remoção do anti-CD3 era o tempo mais inicial no qual as células anérgicas poderiam ser identificadas como fenotípicamente distintas das células totalmente estimuladas. As células anergizadas incorporaram menos [3H] timidina no DNA em resposta ao desafio subseqüente com anticorpo para PCC (Pigeon cytochrome c; citocromo c de pombo) e esplenócitos singênicos (geneticamente idênticos) irradiados comparados com células que tinham sido totalmente ativadas inicialmente. Dados similares foram obtidos quando a produção de IL-2 foi medida. Nos primeiros períodos (ou seja, três dias após a estimulação inicial), ambas as células tratadas com somente anti-CD3 e aquelas tratadas com anti-CD3 mais anti-CD28 (primeiro e segundo sinais PMID: 17277121) não responderam ao desafio subsequente com anticorpo.
Células T Anérgicas Sobre-regulam e Mantém a Expressão da Egr-2 por Longo Prazo
Os perfis de transcrição de mRNA foram comparados entre as células A.E7 anergizadas, completamente estimuladas e não tratadas usando-se Fragmentos de Genes Affymetrix. As células foram processadas para isolamento de mRNA e síntese de cRNA em três pontos de tempo: imediatamente após a remoção de um estímulo de 12 horas, dois dias após a remoção do estímulo, e cinco dias após a remoção do estímulo. A réplica dos experimentos foi desempenhada para cada condição e tempo, e uma porção de cada grupo de células foi estimulado novamente com anticorpo para verificar a presença de seus fenótipos pretendidos respectivos. Análises dos dados obtidos das séries de expressão mostraram que a Egr-2 estava mais altamente expressada nas células anérgicas em comparação com os controles nos dias 2 e 5. Em contraste, nas horas iniciais (12 horas) a Egr-2 foi altamente expressada em ambas as células anérgicas e completamente ativadas.
Para comparação, a expressão dos transcritos da IL-2 e e da Egr-1 estão mostrados (Figura 2, B e C). Como esperado, a expressão da IL-2 é significativa somente nas células T ativadas nas primeiras 12 horas. A expressão da IL-2 em células anérgicas é induzida em alguma extensão em comparação com as células simuladamente estimuladas, mas significaticamente menos ainda (5 vezes) do que nas células completamente ativadas. Em contraste a Egr-1, um gene conhecido pelo envolvimento na ativação inicial da célula T e na indução da IL-2, está igualmente induzido em ambas as células T anérgica e completamente ativada nas 12 horas mas não mantém sua expressão passado esse estágio inicial. Análises quantitativas de RT-PCR do RNA de Egr-2 com experimentos representativos de fragmentos de gene confirmaram os resultados dos fragmentos de genes.
A Expressão da Proteína Egr-2 é Diminuída em Células em Proliferação a Seguir a Ativação Completa ou em Seguida ao Tratamento das Células Anérgicas com IL-2
A proteína Egr-2 foi examinada por Pigmentação Western em células anergizada, simuladamente estimuladas e completamente estimuladas. A proteína foi isolada imediatamente após a remoção das células do estímulo de 12 horas, e todos os dias por nove dias desde então. Após 12 horas de estimulação, as células tratadas tanto com anti-CD3 sozinho ou com ambos anti-CD3 e anti-CD28 exibiram alta expressão da proteína Egr-2. De importância é que as células que foram completamente ativadas mostraram rápida perda da Egr-2 tal que pelo quinto dia pouca ou nenhuma pôde ser detectada. Em contraste, as células anergizadas mostraram marcadamente uma diminuição inicial procrastinada na expressão de Egr-2, e essas células retiveram significativa expressão do fator de transcrição em todo o período de nove dias. Assim, a expressão da Erg-2 correlaciona-se inversamente com a responsividade de cada população de células estudada. Nós também avaliamos a proliferação da célula T pela contagem do número de células vivas todos os dias por nove dias após a remoção do estímulo. A viabilidade foi determinada por exclusão de azul de tripano. Como foi mostrado, a expressão da Egr-2 é diminuída em células completamente ativadas durante a proliferação.
Porque o fenótipo hipo-responsivo é abolido quando as células T anérgicas são expostas à IL-2 durante o período de descanso, nós examinamos os níveis da proteína Egr-2 em células estimuladas simuladamente e em células anérgicas A.E7 subsequentemente tratadas com IL-2. As células foram anergizadas com anti-CD3 imobilizadas ou simuladamente estimuladas com anticorpo IgG de controle imobilizado. A porção de cada população celular foi processada por Pigmentação Western imediatamente após a remoção do estímulo de 12 horas, enquanto as células remanescentes foram cada divididas em duas sub-populações e incubadas com ou sem 10U/ml rmIL-2. As células foram extraídas após os dias 1, 3, 5, 7 e 10 para serem avaliados os níveis de proteína e de Egr-2 por Western blot. Esses dados mostram que a proteína Egr-2 é rapidamente diminuída nas células anérgicas após a exposição à IL-2 exógena, e isso é mais evidente entre o primeiro e o quinto dia. Que a IL-2 abole a anergia foi confirmado pela medição da responsividade dessas células ao desafio com o antígeno, avaliado pela incorporação de [3H] timidina no décimo dia. Tomados juntos, os dados nas figuras 2 e 3 revelam que a expressão da Egr-2 correlaciona-se inversamente com a responsividade das células T ao estímulo do antígeno, e que as células anérgicas retêm comparativamente níveis elevados desse fator de transcrição.
Em Comparação com as Células Respondedoras, a Erg-2 é Expressada Maximamente em Células Anérgicas Após o Desafio Enquanto a Expressão de Erg-1 é Reprimida
As células anérgicas ou simuladamente estimuladas previamente foram a desafiadas novamente por zero, três e seis horas com APCs apartadas de células T que tinham sido carregadas com alta (10μM) ou baixa (0,3 μM) concentração de PCC. As células foram recolhidas ao gelo, permeabilizada, e tingidas para Egr-2 ou Egr-1 para análises de citometria de fluxo. Como previamente mostrado por Western blot, antes da estimulação (zero hora) a Erg-2 é mais altamente expressada nas células anérgicas enquanto a Egr-1 não é expressada em nenhuma população.
A Egr-2 é induzida aos níveis máximos em células previamente estimuladas simuladamente por três horas e permanece em altos níveis por ao menos seis horas. Nas células anérgias, a Egr-2 começa em níveis aumentados mas foi induzida além para os níveis máximos com a estimulação após três horas. A máxima expressão da Er-2 após a re-estimulação foi igual em ambas as células simuladamente estimuladas e anérgicas. A estimulação com ambas as doses de antígeno incutiu o mesmo padrão de expressão de proteínas, entretanto uma alta dose de antígeno resultou em aumento da expressão da Erg-2 em ambas as populações.
A Egr-1 foi sobre-regulada aos níveis máximos nas células previamente simuladamente estimuladas por três horas, porém começou a retornar aos níveis baixos após seis horas. Isso é verdade para as duas dosagens de antígeno. As células anérgicas falharam em sobre-regular a Egr-1 para os níveis das células simuladamente estimuladas quando foram estimuladas com ambas as concentrações alta ou baixa de antígeno, Também em contraste com células previamente estimuladas com simulação, os níveis expressados de Egr-1 nas células anérgicas foram quase reduzidos aos baixos níveis após o pico de expressão.
Para confirmar esses dados, os níveis das proteínas foram avaliados por análises de Western blot. Os níveis de Egr-2 foram sobre-regulados em ambas as populações na incubação com anti-CD3 e anti-CD28, e persistiram todo o tempo, enquanto os níveis da proteína Egr-1 aumentaram inicialmente na população anérgica e foi subsequentemente sub-regulado durante o curso de oito horas. Isso ficou em contraste com a população estimulada simuladamente, na qual a expressão da Egr-1 persistiu.
A Proliferação e a Produção de IL-2 Foi Parcialmente Restabelecida nas Células Anérgicas
Carentes de Egr-2 nos Primeiros Estágios, Mas Não nos Últimos Estágios da Anergia
Nós testamos se a Egr-2 é necessária para a indução do fenótipo anérgico pela atenuação da expressão da Egr-2 através do silenciamento do gene mediado por siRNA. As células A.E7 foram eletroporadas com siRNA construídos específicamente para Egr-2, com siRNA de controle, ou sem siRNA, levada em conta a retomada por 4 a 6 horas, e então incubadas por doze horas com anticorpo monoclonal imobilizado anti-CD3 para induzir a anergia (só o primeiro sinal). Outra amostra de células foi eletroporada sem siRNA e restou não estimulada para servir como células T de controle não anergizadas. Para ensaiar a eficiência da transfecção. Nós transfectamos uma amostra de células com siRNA etiquetado com FITC. Através de citometria de fluxo, nós determinamos a eficiência da transfecção consistentemente na amplitude de 90 a 99%. Usando microscopia de fluorescência, nós descartamos a possibilidade de que o siRNA fosse simplesmente aderente ao sito externo da célula. Cinco dias após a remoção das células T ao estímulo anergizante (somente com anti-CD3), os níveis da proteína Egr-2 estavam significativamente mais baixos na presença de ambos os siRNAs direcionados contra diferentes regiões do mensageiro de Egr-2. Células anérgicas eletroporadas com siRNA de controle ou com nenhum siRNA retiveram altos níveis da proteína Egr-2. Notavelmente, as células anérgicas tratadas com siRNA com diminuída expressão da proteína Egr-2 foram mais responsivas do que as anérgicas de controle ao desafio com antígeno. A aumentada resposta proliferativa das células com baixos níveis da proteína Egr-2 foi avaliada por ambas a incorporação de [3H] timidina no DNA e pela diluição com CFSE. Através deste último ensaio, 97% das células em descanso dividiram-se ao menos uma vez, enquanto somente 50% das células anérgicas eletroporadas com controle ou com siRNA nenhum dividiram-se ao menos uma vez. Em contraste, 73% das células anérgicas depletadas de Egr-2 dividiram-se ao menos uma vez. Adicionalmente, o defeito na produção de IL-2 nas células T anérgicas é parcialmente restabelecido com a depleção da Egr-2 mediada pelo siRNA. Esses dados confirmam uma correlação inversa entre a expressão de Egr-2 e a responsividade das células T, e sugerem uma relação de causa entre a alta expressão de Egr-2 e o estado de anergia.
Para avaliar se os efeitos da Egr-2 estão presentes nas horas mais tardias, células T A.E7 foram anergizadas, descansadas por cinco dias, e então eletroporadas com siRNA de fita dupla específicos para Egr-2, com siRNA, ou sem siRNA. As células foram então descansadas por mais dois dias, então re-estimuladas com antígeno mais esplenócitos singênicos irradiados. Embora a proteína Egr-2 estivesse reduzida nas células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2 sob essas condições, elas permaneceram não respondedoras à estimulação do antígeno como avaliado pela incorporação da [3H] timidina e pela produção de IL-2.
Porque alguma proteína Egr-2 é expressada as células estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28, a responsividade dessas células foi comparada com a das células anérgicas, e as células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2. Na estimulação antigênica, as células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2 manifestam uma resposta que é intermediária à da população anérgica de controle e à da população completamente estimulada.
A Fosforilação da ERK é Restaurada nas Células Anérgicas que Carecem de Egr-2
Com base a restauração da resposta proliferativa e da produção de IL-2 nas células T A.E7 anergizadas com a atenuação da expressão da Egr-2 durante a indução da anergia, nós avaliamos a integridade da via de sinalização da MAPK nessas células. A fosforilação deficiente, e a ativação da ERK-1 e da ERK-2 nas células T anérgicas em resposta a estimulação completa tem sido bem documentada. Nós pudemos confirmar o decréscimo na fosforilação da ERK na estimulação das células T anergizadas. Esse defeito observado na fosforilação da ERK na estimulação das células T anérgicas com anti-CD3 mais anti-CD28 foi revertido quando a expressão da EGR-2 foi reduzida através do silenciamento do gene mediado por siRNA. Assim a depleção da Egr-2 em células T a.E7 impede a indução das três propriedades chaves das células anérgicas mediadas pelo TCR: a falência na proliferação, a falha na produção de IL-2 e a sub-regulação da cascata MAPK.
A Depleção dos Níveis da Proteína Egr-2 em Células Estimuladas com CD3+CD28 Aumenta sua Responsividade à Estimulação
Como é mostrado na figura 5G, é possível detectar baixos níveis de Egr-2 em células completamente estimuladas, ainda que em momentos tardios. Para determinar o efeito que isso deve ter na responsividade celular, nós tratamos as células A.E7 com siRNA de Egr-2 e as estimulamos com anti-CD3 e anti-CD28 imobilizadas. Após a remoção do estímulo, as células foram deixadas em descanso por cinco dias, e então, re-estimuladas com esplenócitos singênicos irradiados pulsados com antígeno PCC. Nas células tratadas com siRNA de Egr-2, a responsividade estava aumentada em comparação àquelas tratadas com um siRNA de controle, demonstrando adicionalmente que a presença de Egr-2 abate a capacidade das células T para responder à estimulação completa.
DISCUSSÃO
Foi bem documentado que a estimulação das células T através do TCR na ausência da co-estimulação pode resultar em hipo-responsividade de longo prazo à uma estimulação subseqüente, chamada anergia. Embora o fenótipo anérgico tenha sido bem estudado, os eventos moleculares responsáveis pela indução e manutenção da anergia não são plenamente conhecidos. A anergia é muito provavelmente um processo complexo envolvendo um número de genes que servem para mediar a resistência à co-estimulação. Os dados apresentados neste relato indicam fortemente que o fator de transcrição Egr-2 funciona no estabelecimento do estado anérgico nas células T A.E7. O perfil de expressão da Egr-2 está consistente com as características de uma fator que confere anergia como previsto por Powell e outros em que: 1) é inicialmente sobre-regulada em ambas as células T anergizadas e plenamente ativadas antes de sua proliferação e sua expressão é impedida pela ciclosporina A; 2) sua expressão decresce mais rapidamente em células proliferativas do que nas célula anergizadas; e 3) altos níveis de expressão da Egr-2 na anergia são abolidos pela IL-2, a qual reverte concorrentemente o estado de anergia.
Interessantemente, a alta expressão da Egr-2 foi encontrada em outros estudos enquanto associada com a anergia, mas os achados iniciais não foram extendidos. Lechner e outros sondaram genes expressados em células T primárias anergizadas ‘in vivo’, e relataram a indução da expressão da Egr-2 na população de células T anergizada. Entretanto, nesses estudos a comparação foi feita com células T primárias purificadas estimuladas com uma dose mitogênica de anti-CD3 por 16 horas, um ponto de tempo anterior à sub-regulação da Egr-2. De fato essas células de controle estimuladas também mostraram alta expressão de Egr-2. Em um segundo estudo de perfil de expressão, Macian e outros também observaram a sobre-regulação da Egr-2 a seguir ao estímulo de anergização mas avaliaram somente os momentos iniciais após a indução da anergia na célula T, antes da proliferação nessa população de controle ativada. Outro estudo usando micro-seriação (microarray) para analisar linfócitos B em tolerância mostrou alta expressão da Egr-2 em comparação com células de controle não estimuladas. Todos estes estudos estão consistentes com os dados apresentados neste relato, e com a conclusão de que a Egr-2 atua num papel em conferir o estado anérgico.
Nossa observação de que a Egr-1 ativadora da IL-2 está reprimida nas células anérgicas estimuladas é uma novidade, e paraleliza com a repressão dos componentes da AP-1 fos e jun. Esse efeito pode ser ainda outro mecanismo de hipo-responsividade nas células anérgicas. O fato de que a sobre-regulação da Egr-2 ocorre normalmente em células anérgicas estimuladas pode explicar por que as células anérgicas requerem a exposição seus antígenos para manter a hipo-responsividade. Tanchot e outros descrevem um sistema de indução de anergia para um peptídeo ‘in vivo’ no qual as células T sobrevivem e permanecem tolerantes ‘in vivo’ enquanto o antígeno estiver presente. Se as células anérgicas são transferidas para um novo hospedeiro que não expressa este peptídeo, as células recuperam a responsividade. Se são transferidas para outro novo hospedeiro que expressa o antígeno, elas são induzidas a um nível ainda mais profundo de anergia. Em outro sistema descrito por Pape e outros, no qual a anergia é induzida em células com TCR transgênico em hospedeiro normal com injeção de peptídeo na ausência de adjuvante, as células anérgicas perdem a não responsividade após um período de tempo. Essa perda da responsividade é precedida pela remoção do antígeno no hospedeiro. Se o antígeno tolerado é repetidamente introduzido as células anérgicas permanecem hipo-respondedoras por mais tempo do que com uma única injeção.
Ao longo do tempo, nós observamos essa dissipação de anergia na linha de células A.E7 coincidente com uma perda da expressão de Egr-2. É possível que a Egr-2 mantenha a transcrição de moléculas efetoras da anergia por longo prazo, e que a perda da expressão da Egr-2 ao longo do tempo contribua para a não permanência da anergia. Devido à estimulação completa das células anérgicas ser capaz de revigorar a expressão da Egr-2 aos níveis máximos sem indução da transcrição de IL-2 ou de proliferação, é possível que a presença do antígeno em modelos ‘in vivo’ discutido anteriormente mantenha a hipo-responsividade por sucessiva sobre-regulação da Egr-2. Embora não não sejamos capazes de observar a abolição da anergia pelo silenciamento da Egr-2 no quinto dia após a indução da anergia, é possível que alvos transcricionais chave da Egr-2 estejam presentes neste ponto de tempo e não sejam abatidos rápido o suficiente para restaurar a responsividade nos nossos experimentos.
Dada sua natureza de fator de transcrição, a Egr-2 pode ser responsável pela ativação em uma rede de genes cujas proteínas mediam os muito diferentes aspectos do fenótipo anérgico observado, incluindo a hipo-responsividade, direcionamento diferenciado, e produção de citocina. O fato de outros estudos terem observado a indução da Egr-2 em linfócitos tolerantes ambos in vitro e in vivo sugere que a Egr-2 pode funcionar na anergia induzida por uma variedade de mecanismos. Baseados nesses dados apresentados nesta reportagem, a identificação de fatores sob regulação pela Egr-2 nesses modelos deverá proporcionar esclarecimentos importantes sobre os mecanismos envolvidos na manutenção da tolerância imune. Um número de artigos recentes tem demonstrado a importância das ligases de ubiquitina E3 na indução da anergia. Os mecanismos pelos quais elas induzem a anergia não foram fartamente demonstrados, mas têm-se especulado que elas induzem a anergia através da degradação de importantes moléculas de sinalização tais como as proteínas cinases C e fosfolipase C ƴ-1. É possível que a sobre-regulação das ligases de ubiquitina E3 também impeçam a produção de IL-2 pela degradação de proteínas necessárias para a mensagem de transcrição da IL-2. Será interessante determinar em estudos futuros se os mecanismos relacionados com a função da Egr-2 nas células T convergem com aqueles iniciados pelas ligases de ubiquitina E3.
FONTE
http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/173/12/7331
RESUMO
A tolerância imune a um antígeno específico resulta da indução de mecanismos celulares que limitam as respostas de célula T a antígenos seletivos. Um desses mecanismos é caracterizado pela atenuada proliferação e decréscimo na produção de IL-2 em células Th CD4+ fartamente estimuladas e é denotado pela anergia da célula T. Nós relatamos a identificação do gene reposta primária de crescimento (Egr-2;Krox-20), um fator de transcrição com dedos de zinco, como uma proteína-chave requerida para a indução da anergia em células T em cultura. A sondagem do gene em série revelou que a alta expressão da Egr-2 persiste em células T A.E7 murinas anergizadas mas sem proliferação. Em contraste, a Egr-1, um membro parental da família induzida na co-estimulação, exibe pouca ou nenhuma expressão no estado de anergia. A anulação da anergia mediada pela IL-2 causa rápida depleção da proteína Egr-2. A farta estimulação de células T A.E7 falha em aumentar a IL-2 e a expressão da Egr-1, enquanto a expressão da Egr-2 é gradiosamente aumentada. O silenciamento da expressão do gene Er-2 pelo tratamento de células T A.E7 com pequenos RNA de interferência antes da incubação com anti-CD3 sozinha impede a indução completa da anergia. Entretanto, a depleção da Egr-2 mediada pelo pequeno RNA de interferência cinco dias após a indução da anergia não parece abolir a hipo-responsividade à estimulação. Esses dados indicam que a expressão sustentada da Egr-2 é necessária para induzir um completo estado anérgico através de ações de genes regulados por este fator de transcrição.
INTRODUÇÃO
A estimulação dos linfócitos T pelo antígeno através do TCR (receptor de célula T) na ausência da co-estimulação através de receptores acessórios resulta na produção deficiente de IL-2 e falta de proliferação. A conseqüência dessa sinalização parcial é a hipo-responsividade de longo prazo à co-estimulação subseqüente, um estado conhecido como anergia clonal da célula T. A indução ‘in vitro’ da anergia clonal é atingível pelo tratamento de linfócitos T A.E7 cultivados com anticorpos monoclonais anti-TCR imobilizados (anti-CD3) somente, enquanto uma robusta produção de IL-2 e proliferação são conseguidas se for incluído anticorpo monoclonal anti-CD8. Em contraste, a remoção da IL-2 lavando-se as células ou com adição de anticorpos neutralizantes de IL-2 resulta em anergia, ainda que em um ambiente co-estimulador. Em adição. A administração da IL-2 é suficiente para recuperar as células T de seu fenótipo anérgico.
Análises farmacológicas comparativas foram usadas para caracterizar a contribuição da sinalização do IL-2R (receptor de IL-2) para a evasão da anergia. O impedimento à proliferação da célula T com rapamicina, uma droga que bloqueia a transição do ciclo celular da fase G1 para a fase S através da interação com a sinalização intermediária da IL-2 nos mamíferos alvo da rapamicina, induz anergia em células T completamente estimuladas. Em contraste, a hidroxiuréia, uma droga que retém o crescimento celular na fase S mas permita a sinalização da IL-2, não promove o estado anérgico. Foi proposto que a anergia da célula T resulta da sobre-regulação de fatores específicos de anergia subseqüentes ao encaixe do TCR, mas esses fatores são diluídos ou degradados a seguir à sinalização da IL-2. Em contraste, células anérgicas, as quais não recebem estimulação de IL-2, parecem manter altos níveis desses fatores. Células anérgicas expostas a IL-2 exógena proliferam, provavelmente diluindo ou sub-regulando esses fatores, e escapam ao fenótipo hiporesponsivo. Não estão claros quais eventos são responsáveis pela indução da anergia em seguida à estimulação do TCR e quais eventos a seguir à sinalização no IL-2R podem impedir tanto a indução da anergia quanto abolir o estado de anergia em clones não respondedores.
A estimulação produtiva das células T resulta na produção de IL-2, um processo que requer a iniciação de múltiplas vias de sinalização paralelas, incluindo a ativação da NFAT (fator nuclear de células T ativadas); os membros JNK da família MAPK [Omim 601158 – As proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPKs) são uma família de proteínas cinases de treonina-serina que participam em um sistema maior de sinalização através do qual as células transformam estímulos extracelulares em respostas intracelulares. Dentro deste grupo estavam as cinases extracelularmente reguladas, ou ERKs (Omim 176948 – As ERKs também são conhecidas como proteínas cinases ativadas por maturação ou mitógeno.Na ativação, ela se movimenta para o núcleo da célula estimulada, onde fosforila alvos nucleares.), bem como outra sub-família, chamada proteínas cinases ativadas por estresse (SAPKs). Derijard e outros (1994) clonaram e caracterizaram uma cinase assim, chamada por eles de JNK1, de uma biblioteca de cérebro fetal humano. A sequência prevista da proteína apresenta 64,5% de homologia com ERK1(omim 601795) e 67,6% de homologia com ERK2. Os autores demonstraram que a expressão da JNK1 é induzida por luz ultravioleta e que ela se liga ao domínio terminal em amina (NH2) de transativação de c-JUN (cuja atividade de ativação de transcrição é aumentada ), fosforilando este domínio na serina 63 e na serina 73.], ERK e p38 (uma SAPK); e NF-KB [Omim 164011 – O NFKB1 foi primeiramente descrito como agente de interação com uma sequência de 11 pares de base atuando em cis (cis em oposto a trans, ou seja do mesmo lado da fita) no intensificador da cadeia leve de imunoglobulina. O complexo NFKB tem duas sub-unidades alternativas de ligação a DNA, a p105 e a p52/p100.]. A contribuição individual de cada via para a produção de IL-2 é complexa e correntemente é objeto de estudo intenso. Muitos componentes dessas vias são conhecidos, e têm sido comparados com populaçãoes de células T completamente responsivas e com populações anérgicas. Por exemplo, a ativação da NFAT requer um influxo primário de cálcio ao citoplasma, um evento que ocorre comparavelmente em populações normais e anérgicas e resulta na mobilização da NFAT para o núcleo. Entretanto, a produção e localização nuclear dos constituintes da AP-1 fos e jun são defeituosos nas células anérgicas. [O fator de transcrição AP-1 media a expressão de genes primários imediata em resposta à exposição das células a estímulo extracelular. A AP-1 é composta de complexos diméricos formados por membros dos grupos de fatores de transcrição Jun e Fos. A ativação da AP-1 é causada por: 1) aumento da expressão das proteínas Fos e Jun e 2) modificação da Fos e da Jun por fosforilação após a tradução. As atividades de proteína cinase que fosforilam e ativam a Jun (JNK) e a Fos (FRK) foram descritas. Equanto a cinase de c-Fos FRK é pouco compreendida, a cinase de c-Jun foi estudada em detalhes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC450211/?tool=pubmed] em adição, as diminuições na ativação de membros da via MAPK como Ras, JNK e EPK foram descritas em células T anérgicas, sugerindo numerosos pontos de regulação para a atividade da AP-1.
Vários grupos têm usado agora métodos de sondagem para provar a identidade de fatores de anergia que podem mediar o fenótipo anérgico descrito, usando exposição diferencial e técnicas de micro-arranjo (microarray) em modelos de anergia tanto ‘in vitro’ quanto ‘in vivo’. Um número de proteínas prováveis por contribuírem para a indução da anergia foi descrito, incluindo membros da família de ligase de ubiquitina [uma pequena proteína encontrada em todas as células e que modifica histonas e degrada proteínas intracelulares. Stedman] E3. A presença dessas prováveis leva à degradação de proteínas de sinalização necessárias para a entrada dentro do ciclo celular, impedindo assim uma etapa de proliferação necessária para escapar-se à anergia.
Nós usamos uma sondagem genômica para identificar genes seletivamente expressados nas célula T A.E7 anérgicas mas não em populações de células de controle imitando a simulação ou completamente estimuladas. Nós relatamos que a expressão do gene 2 da resposta primária de crescimento (Egr) persiste nas populações de células anérgicas, embora sua expressão seja muito mais transitória na presença da sinalização de CD28. A família dos genes Egr consiste de quatro membros (de Egr-1 a Egr-4) que são expressados rapidamente em seguida à estimulação. Uma característica marcante da família Egr é o domínio de ligação a DNA que consiste de três motivos de dedos de zinco. Esse domínio é conhecido por ligar-se à sequência GCGGGGGCG e sua presença em regiões de promotores do gene tem sido mostrada como um facilitador da trans-ativação de genes alvo. A Egr-2 tem sido a mais amplamente estudada no contexto do sistema nervoso, e seu alvejamento em camundongos nocauteados (sem a Egr-2) resulta na letalidade precoce concorrente aos defeitos na padronização da parte de trás do cérebro, mielinação dos nervos periféricos e formação dos ossos. A habiliade da Egr-2 para sobre-regular genes alvo têm-se mostrado regulada por co-repressores tais como membros da família de ligação NGFI-A e Ddx20. O papel da Egr-2 no compartimento imune não está descrito extensivamente, embora tenha sido mostrado que a trans-ativaçao da Egr-2 é dependente de membros da família NFAT nos linfócitos T, e a Egr-2 pode atuar num papel na regulação do ligante de Fas dependente da NFAT. Nós mostramos que a Egr-2 é sub-regulada aproximadamente dois dias após a estimulação total, quando ocorre a proliferação ativa a seguir a sinalização do receptor de IL-2. Em contraste, as células anérgicas mantém níveis elevados da proteína durante dez dias após a estimulação inicial. A exposição de células anérgicas à IL-2 resulta na diluição ou deradação da Egr-2 aproximadamente de 3 a 5 dias após a adição da IL-2, quando a proliferação está mais ativa. A depleção da Egr-2 através do silenciamento do gene mediado por pequeno RNA de interferência (siRNA) rompe a anergia demostrada pela ativação restaurada da ERK, produção de IL-2, e proliferação ainda que o siRNA de controle não tenha efeito significativo. Esses dados sugerem que a expressão da Egr-2 é requerida para a indução completa da anergia nas células T.
RESULTADOS
A Estimulação de Clones das Células T A.E7 Através do TCR na Ausência de Co-estimulação Resulta em Anergia
Um método para indução de anergia em linfócitos T é a entrega do sinal através do TCR na ausência de co-estimulação através da CD28. Para otimizar condições para a identificação de genes com perfil de expressão única em células T anérgicas, nós anergizamos as células T A.E7 cultivadas com anticorpo monoclonal anti CD3 e comparamos sua responsividade com células que tinham sido fingidamente estimuladas (anticorpo IgG imobilizado de controle) ou com células totalmente ativadas (com anticorpo monoclonal anti-CD3 mais anti-CD28 solúvel [o anticorpo pega as duas CDs?]). Nós determinamos que cinco dias de cultura após a remoção do anti-CD3 era o tempo mais inicial no qual as células anérgicas poderiam ser identificadas como fenotípicamente distintas das células totalmente estimuladas. As células anergizadas incorporaram menos [3H] timidina no DNA em resposta ao desafio subseqüente com anticorpo para PCC (Pigeon cytochrome c; citocromo c de pombo) e esplenócitos singênicos (geneticamente idênticos) irradiados comparados com células que tinham sido totalmente ativadas inicialmente. Dados similares foram obtidos quando a produção de IL-2 foi medida. Nos primeiros períodos (ou seja, três dias após a estimulação inicial), ambas as células tratadas com somente anti-CD3 e aquelas tratadas com anti-CD3 mais anti-CD28 (primeiro e segundo sinais PMID: 17277121) não responderam ao desafio subsequente com anticorpo.
Células T Anérgicas Sobre-regulam e Mantém a Expressão da Egr-2 por Longo Prazo
Os perfis de transcrição de mRNA foram comparados entre as células A.E7 anergizadas, completamente estimuladas e não tratadas usando-se Fragmentos de Genes Affymetrix. As células foram processadas para isolamento de mRNA e síntese de cRNA em três pontos de tempo: imediatamente após a remoção de um estímulo de 12 horas, dois dias após a remoção do estímulo, e cinco dias após a remoção do estímulo. A réplica dos experimentos foi desempenhada para cada condição e tempo, e uma porção de cada grupo de células foi estimulado novamente com anticorpo para verificar a presença de seus fenótipos pretendidos respectivos. Análises dos dados obtidos das séries de expressão mostraram que a Egr-2 estava mais altamente expressada nas células anérgicas em comparação com os controles nos dias 2 e 5. Em contraste, nas horas iniciais (12 horas) a Egr-2 foi altamente expressada em ambas as células anérgicas e completamente ativadas.
Para comparação, a expressão dos transcritos da IL-2 e e da Egr-1 estão mostrados (Figura 2, B e C). Como esperado, a expressão da IL-2 é significativa somente nas células T ativadas nas primeiras 12 horas. A expressão da IL-2 em células anérgicas é induzida em alguma extensão em comparação com as células simuladamente estimuladas, mas significaticamente menos ainda (5 vezes) do que nas células completamente ativadas. Em contraste a Egr-1, um gene conhecido pelo envolvimento na ativação inicial da célula T e na indução da IL-2, está igualmente induzido em ambas as células T anérgica e completamente ativada nas 12 horas mas não mantém sua expressão passado esse estágio inicial. Análises quantitativas de RT-PCR do RNA de Egr-2 com experimentos representativos de fragmentos de gene confirmaram os resultados dos fragmentos de genes.
A Expressão da Proteína Egr-2 é Diminuída em Células em Proliferação a Seguir a Ativação Completa ou em Seguida ao Tratamento das Células Anérgicas com IL-2
A proteína Egr-2 foi examinada por Pigmentação Western em células anergizada, simuladamente estimuladas e completamente estimuladas. A proteína foi isolada imediatamente após a remoção das células do estímulo de 12 horas, e todos os dias por nove dias desde então. Após 12 horas de estimulação, as células tratadas tanto com anti-CD3 sozinho ou com ambos anti-CD3 e anti-CD28 exibiram alta expressão da proteína Egr-2. De importância é que as células que foram completamente ativadas mostraram rápida perda da Egr-2 tal que pelo quinto dia pouca ou nenhuma pôde ser detectada. Em contraste, as células anergizadas mostraram marcadamente uma diminuição inicial procrastinada na expressão de Egr-2, e essas células retiveram significativa expressão do fator de transcrição em todo o período de nove dias. Assim, a expressão da Erg-2 correlaciona-se inversamente com a responsividade de cada população de células estudada. Nós também avaliamos a proliferação da célula T pela contagem do número de células vivas todos os dias por nove dias após a remoção do estímulo. A viabilidade foi determinada por exclusão de azul de tripano. Como foi mostrado, a expressão da Egr-2 é diminuída em células completamente ativadas durante a proliferação.
Porque o fenótipo hipo-responsivo é abolido quando as células T anérgicas são expostas à IL-2 durante o período de descanso, nós examinamos os níveis da proteína Egr-2 em células estimuladas simuladamente e em células anérgicas A.E7 subsequentemente tratadas com IL-2. As células foram anergizadas com anti-CD3 imobilizadas ou simuladamente estimuladas com anticorpo IgG de controle imobilizado. A porção de cada população celular foi processada por Pigmentação Western imediatamente após a remoção do estímulo de 12 horas, enquanto as células remanescentes foram cada divididas em duas sub-populações e incubadas com ou sem 10U/ml rmIL-2. As células foram extraídas após os dias 1, 3, 5, 7 e 10 para serem avaliados os níveis de proteína e de Egr-2 por Western blot. Esses dados mostram que a proteína Egr-2 é rapidamente diminuída nas células anérgicas após a exposição à IL-2 exógena, e isso é mais evidente entre o primeiro e o quinto dia. Que a IL-2 abole a anergia foi confirmado pela medição da responsividade dessas células ao desafio com o antígeno, avaliado pela incorporação de [3H] timidina no décimo dia. Tomados juntos, os dados nas figuras 2 e 3 revelam que a expressão da Egr-2 correlaciona-se inversamente com a responsividade das células T ao estímulo do antígeno, e que as células anérgicas retêm comparativamente níveis elevados desse fator de transcrição.
Em Comparação com as Células Respondedoras, a Erg-2 é Expressada Maximamente em Células Anérgicas Após o Desafio Enquanto a Expressão de Erg-1 é Reprimida
As células anérgicas ou simuladamente estimuladas previamente foram a desafiadas novamente por zero, três e seis horas com APCs apartadas de células T que tinham sido carregadas com alta (10μM) ou baixa (0,3 μM) concentração de PCC. As células foram recolhidas ao gelo, permeabilizada, e tingidas para Egr-2 ou Egr-1 para análises de citometria de fluxo. Como previamente mostrado por Western blot, antes da estimulação (zero hora) a Erg-2 é mais altamente expressada nas células anérgicas enquanto a Egr-1 não é expressada em nenhuma população.
A Egr-2 é induzida aos níveis máximos em células previamente estimuladas simuladamente por três horas e permanece em altos níveis por ao menos seis horas. Nas células anérgias, a Egr-2 começa em níveis aumentados mas foi induzida além para os níveis máximos com a estimulação após três horas. A máxima expressão da Er-2 após a re-estimulação foi igual em ambas as células simuladamente estimuladas e anérgicas. A estimulação com ambas as doses de antígeno incutiu o mesmo padrão de expressão de proteínas, entretanto uma alta dose de antígeno resultou em aumento da expressão da Erg-2 em ambas as populações.
A Egr-1 foi sobre-regulada aos níveis máximos nas células previamente simuladamente estimuladas por três horas, porém começou a retornar aos níveis baixos após seis horas. Isso é verdade para as duas dosagens de antígeno. As células anérgicas falharam em sobre-regular a Egr-1 para os níveis das células simuladamente estimuladas quando foram estimuladas com ambas as concentrações alta ou baixa de antígeno, Também em contraste com células previamente estimuladas com simulação, os níveis expressados de Egr-1 nas células anérgicas foram quase reduzidos aos baixos níveis após o pico de expressão.
Para confirmar esses dados, os níveis das proteínas foram avaliados por análises de Western blot. Os níveis de Egr-2 foram sobre-regulados em ambas as populações na incubação com anti-CD3 e anti-CD28, e persistiram todo o tempo, enquanto os níveis da proteína Egr-1 aumentaram inicialmente na população anérgica e foi subsequentemente sub-regulado durante o curso de oito horas. Isso ficou em contraste com a população estimulada simuladamente, na qual a expressão da Egr-1 persistiu.
A Proliferação e a Produção de IL-2 Foi Parcialmente Restabelecida nas Células Anérgicas
Carentes de Egr-2 nos Primeiros Estágios, Mas Não nos Últimos Estágios da Anergia
Nós testamos se a Egr-2 é necessária para a indução do fenótipo anérgico pela atenuação da expressão da Egr-2 através do silenciamento do gene mediado por siRNA. As células A.E7 foram eletroporadas com siRNA construídos específicamente para Egr-2, com siRNA de controle, ou sem siRNA, levada em conta a retomada por 4 a 6 horas, e então incubadas por doze horas com anticorpo monoclonal imobilizado anti-CD3 para induzir a anergia (só o primeiro sinal). Outra amostra de células foi eletroporada sem siRNA e restou não estimulada para servir como células T de controle não anergizadas. Para ensaiar a eficiência da transfecção. Nós transfectamos uma amostra de células com siRNA etiquetado com FITC. Através de citometria de fluxo, nós determinamos a eficiência da transfecção consistentemente na amplitude de 90 a 99%. Usando microscopia de fluorescência, nós descartamos a possibilidade de que o siRNA fosse simplesmente aderente ao sito externo da célula. Cinco dias após a remoção das células T ao estímulo anergizante (somente com anti-CD3), os níveis da proteína Egr-2 estavam significativamente mais baixos na presença de ambos os siRNAs direcionados contra diferentes regiões do mensageiro de Egr-2. Células anérgicas eletroporadas com siRNA de controle ou com nenhum siRNA retiveram altos níveis da proteína Egr-2. Notavelmente, as células anérgicas tratadas com siRNA com diminuída expressão da proteína Egr-2 foram mais responsivas do que as anérgicas de controle ao desafio com antígeno. A aumentada resposta proliferativa das células com baixos níveis da proteína Egr-2 foi avaliada por ambas a incorporação de [3H] timidina no DNA e pela diluição com CFSE. Através deste último ensaio, 97% das células em descanso dividiram-se ao menos uma vez, enquanto somente 50% das células anérgicas eletroporadas com controle ou com siRNA nenhum dividiram-se ao menos uma vez. Em contraste, 73% das células anérgicas depletadas de Egr-2 dividiram-se ao menos uma vez. Adicionalmente, o defeito na produção de IL-2 nas células T anérgicas é parcialmente restabelecido com a depleção da Egr-2 mediada pelo siRNA. Esses dados confirmam uma correlação inversa entre a expressão de Egr-2 e a responsividade das células T, e sugerem uma relação de causa entre a alta expressão de Egr-2 e o estado de anergia.
Para avaliar se os efeitos da Egr-2 estão presentes nas horas mais tardias, células T A.E7 foram anergizadas, descansadas por cinco dias, e então eletroporadas com siRNA de fita dupla específicos para Egr-2, com siRNA, ou sem siRNA. As células foram então descansadas por mais dois dias, então re-estimuladas com antígeno mais esplenócitos singênicos irradiados. Embora a proteína Egr-2 estivesse reduzida nas células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2 sob essas condições, elas permaneceram não respondedoras à estimulação do antígeno como avaliado pela incorporação da [3H] timidina e pela produção de IL-2.
Porque alguma proteína Egr-2 é expressada as células estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28, a responsividade dessas células foi comparada com a das células anérgicas, e as células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2. Na estimulação antigênica, as células anérgicas tratadas com siRNA de Egr-2 manifestam uma resposta que é intermediária à da população anérgica de controle e à da população completamente estimulada.
A Fosforilação da ERK é Restaurada nas Células Anérgicas que Carecem de Egr-2
Com base a restauração da resposta proliferativa e da produção de IL-2 nas células T A.E7 anergizadas com a atenuação da expressão da Egr-2 durante a indução da anergia, nós avaliamos a integridade da via de sinalização da MAPK nessas células. A fosforilação deficiente, e a ativação da ERK-1 e da ERK-2 nas células T anérgicas em resposta a estimulação completa tem sido bem documentada. Nós pudemos confirmar o decréscimo na fosforilação da ERK na estimulação das células T anergizadas. Esse defeito observado na fosforilação da ERK na estimulação das células T anérgicas com anti-CD3 mais anti-CD28 foi revertido quando a expressão da EGR-2 foi reduzida através do silenciamento do gene mediado por siRNA. Assim a depleção da Egr-2 em células T a.E7 impede a indução das três propriedades chaves das células anérgicas mediadas pelo TCR: a falência na proliferação, a falha na produção de IL-2 e a sub-regulação da cascata MAPK.
A Depleção dos Níveis da Proteína Egr-2 em Células Estimuladas com CD3+CD28 Aumenta sua Responsividade à Estimulação
Como é mostrado na figura 5G, é possível detectar baixos níveis de Egr-2 em células completamente estimuladas, ainda que em momentos tardios. Para determinar o efeito que isso deve ter na responsividade celular, nós tratamos as células A.E7 com siRNA de Egr-2 e as estimulamos com anti-CD3 e anti-CD28 imobilizadas. Após a remoção do estímulo, as células foram deixadas em descanso por cinco dias, e então, re-estimuladas com esplenócitos singênicos irradiados pulsados com antígeno PCC. Nas células tratadas com siRNA de Egr-2, a responsividade estava aumentada em comparação àquelas tratadas com um siRNA de controle, demonstrando adicionalmente que a presença de Egr-2 abate a capacidade das células T para responder à estimulação completa.
DISCUSSÃO
Foi bem documentado que a estimulação das células T através do TCR na ausência da co-estimulação pode resultar em hipo-responsividade de longo prazo à uma estimulação subseqüente, chamada anergia. Embora o fenótipo anérgico tenha sido bem estudado, os eventos moleculares responsáveis pela indução e manutenção da anergia não são plenamente conhecidos. A anergia é muito provavelmente um processo complexo envolvendo um número de genes que servem para mediar a resistência à co-estimulação. Os dados apresentados neste relato indicam fortemente que o fator de transcrição Egr-2 funciona no estabelecimento do estado anérgico nas células T A.E7. O perfil de expressão da Egr-2 está consistente com as características de uma fator que confere anergia como previsto por Powell e outros em que: 1) é inicialmente sobre-regulada em ambas as células T anergizadas e plenamente ativadas antes de sua proliferação e sua expressão é impedida pela ciclosporina A; 2) sua expressão decresce mais rapidamente em células proliferativas do que nas célula anergizadas; e 3) altos níveis de expressão da Egr-2 na anergia são abolidos pela IL-2, a qual reverte concorrentemente o estado de anergia.
Interessantemente, a alta expressão da Egr-2 foi encontrada em outros estudos enquanto associada com a anergia, mas os achados iniciais não foram extendidos. Lechner e outros sondaram genes expressados em células T primárias anergizadas ‘in vivo’, e relataram a indução da expressão da Egr-2 na população de células T anergizada. Entretanto, nesses estudos a comparação foi feita com células T primárias purificadas estimuladas com uma dose mitogênica de anti-CD3 por 16 horas, um ponto de tempo anterior à sub-regulação da Egr-2. De fato essas células de controle estimuladas também mostraram alta expressão de Egr-2. Em um segundo estudo de perfil de expressão, Macian e outros também observaram a sobre-regulação da Egr-2 a seguir ao estímulo de anergização mas avaliaram somente os momentos iniciais após a indução da anergia na célula T, antes da proliferação nessa população de controle ativada. Outro estudo usando micro-seriação (microarray) para analisar linfócitos B em tolerância mostrou alta expressão da Egr-2 em comparação com células de controle não estimuladas. Todos estes estudos estão consistentes com os dados apresentados neste relato, e com a conclusão de que a Egr-2 atua num papel em conferir o estado anérgico.
Nossa observação de que a Egr-1 ativadora da IL-2 está reprimida nas células anérgicas estimuladas é uma novidade, e paraleliza com a repressão dos componentes da AP-1 fos e jun. Esse efeito pode ser ainda outro mecanismo de hipo-responsividade nas células anérgicas. O fato de que a sobre-regulação da Egr-2 ocorre normalmente em células anérgicas estimuladas pode explicar por que as células anérgicas requerem a exposição seus antígenos para manter a hipo-responsividade. Tanchot e outros descrevem um sistema de indução de anergia para um peptídeo ‘in vivo’ no qual as células T sobrevivem e permanecem tolerantes ‘in vivo’ enquanto o antígeno estiver presente. Se as células anérgicas são transferidas para um novo hospedeiro que não expressa este peptídeo, as células recuperam a responsividade. Se são transferidas para outro novo hospedeiro que expressa o antígeno, elas são induzidas a um nível ainda mais profundo de anergia. Em outro sistema descrito por Pape e outros, no qual a anergia é induzida em células com TCR transgênico em hospedeiro normal com injeção de peptídeo na ausência de adjuvante, as células anérgicas perdem a não responsividade após um período de tempo. Essa perda da responsividade é precedida pela remoção do antígeno no hospedeiro. Se o antígeno tolerado é repetidamente introduzido as células anérgicas permanecem hipo-respondedoras por mais tempo do que com uma única injeção.
Ao longo do tempo, nós observamos essa dissipação de anergia na linha de células A.E7 coincidente com uma perda da expressão de Egr-2. É possível que a Egr-2 mantenha a transcrição de moléculas efetoras da anergia por longo prazo, e que a perda da expressão da Egr-2 ao longo do tempo contribua para a não permanência da anergia. Devido à estimulação completa das células anérgicas ser capaz de revigorar a expressão da Egr-2 aos níveis máximos sem indução da transcrição de IL-2 ou de proliferação, é possível que a presença do antígeno em modelos ‘in vivo’ discutido anteriormente mantenha a hipo-responsividade por sucessiva sobre-regulação da Egr-2. Embora não não sejamos capazes de observar a abolição da anergia pelo silenciamento da Egr-2 no quinto dia após a indução da anergia, é possível que alvos transcricionais chave da Egr-2 estejam presentes neste ponto de tempo e não sejam abatidos rápido o suficiente para restaurar a responsividade nos nossos experimentos.
Dada sua natureza de fator de transcrição, a Egr-2 pode ser responsável pela ativação em uma rede de genes cujas proteínas mediam os muito diferentes aspectos do fenótipo anérgico observado, incluindo a hipo-responsividade, direcionamento diferenciado, e produção de citocina. O fato de outros estudos terem observado a indução da Egr-2 em linfócitos tolerantes ambos in vitro e in vivo sugere que a Egr-2 pode funcionar na anergia induzida por uma variedade de mecanismos. Baseados nesses dados apresentados nesta reportagem, a identificação de fatores sob regulação pela Egr-2 nesses modelos deverá proporcionar esclarecimentos importantes sobre os mecanismos envolvidos na manutenção da tolerância imune. Um número de artigos recentes tem demonstrado a importância das ligases de ubiquitina E3 na indução da anergia. Os mecanismos pelos quais elas induzem a anergia não foram fartamente demonstrados, mas têm-se especulado que elas induzem a anergia através da degradação de importantes moléculas de sinalização tais como as proteínas cinases C e fosfolipase C ƴ-1. É possível que a sobre-regulação das ligases de ubiquitina E3 também impeçam a produção de IL-2 pela degradação de proteínas necessárias para a mensagem de transcrição da IL-2. Será interessante determinar em estudos futuros se os mecanismos relacionados com a função da Egr-2 nas células T convergem com aqueles iniciados pelas ligases de ubiquitina E3.
FONTE
http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/173/12/7331
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