O ENVOLVIMENTO DE FcyRI (CD64) NO MECANISMO DE INIBIÇÃO DO HIV-1 EM MACRÓFAGOS DERIVADOS DE MONÓCITOS PELA IgG POLICLONAL PURIFICADA DE PACIENTES INFECTADOS .

Vincent Holl, Stéphane Hemmerter, Renaud Burrer, Sylvie Schmidt, Alain Bohbot, Anne-Marie Aubertin, e Christiane Moog.

Resumo:

O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo da neutralização do HIV-1 usando macrófagos derivados de monócitos (MDM) em comparação com células PBMC (células precursoras da medula óssea) como células alvo (obs.: alvo do HIV-1, e consequentemente do anticorpo IgG). Neste propósito, nós analisamos as atividades neutralizantes de diferentes amostras de IgG policlonais humanas purificadas do soro de indivíduos infectados por HIV-1 usando um ensaio de infecção de um único ciclo. Nós encontramos um aumento do título neutralizante quando macrófagos foram usados versus PBMC (células mononucleares do sangue periférico) como células alvo. Além disso, as IgG policlonais de pacientes infectados com HIV-1 que não são capazes de neutralizar o vírus quando as PBMC são usadas como células alvo inibiram fortemente a infecção em macrófagos derivados de monócitos (MDM). Resultados similares foram obtidos com mAbs (anticorpos monoclonais) neutralizantes. Para explorar a participação dos FcyRs (receptores de Fc gama) na inibição do HIV-1, as F(ab’)2 e Fab (FAB é a porção Ig do anticorpo que tem uma cadeia pesada e outra leve) dessas Igs foram produzidas. Os resultados indicaram que ambas a F(ab’)2 e Fab foram menos efetivas para inibir a replicação do vírus em MDM. Além disso, experimentos de competição com fragmentos Fc de IgG de doadores saudáveis ou com Ab (anticorpo) monoclonais anti-FcyRs purificados tonificaram (reforçaram) a participação dos Receptores de Fc gama, e em particular do FcyRI (CD64) na inibição do HIV-1 em macrófagos derivados de monócitos. Mecanismos pelo qual a IgG específica ao HIV inibe a replicação viral em macrófagos cultivados estão propostos e o benefício da indução de tais anticorpos por vacinação é discutido.

Texto:

Não obstante a melhora clínica associada com as múltiplas terapias anti-retrovirais altamente ativas (HAART), os agentes anti-virais atuais não são capazes de erradicar o HIV-1 devido à persistência de reservatórios virais latentes. Santuários virais constituem em células permissivas ao HIV-1 persistente com potencial para vida longa que não podem ser suprimidas pela HAART. Alguns desses reservatórios do HIV-1 identificados são linfócitos TCD4+ de memória em descanso (quiescentes), monócitos do sangue periférico, macrófagos e células dendríticas. Monócitos e macrófagos derivados de monócitos (MDM) constituem a população celular onde o vírus replicativo é quase exclusivamente detectado após a HAART. Estas células são de particular importância na patogênese do HIV-1 e seu papel na enfermidade da AIDS é em documentado. Os macrófagos são uma origem produtiva do HIV-1. Uma vez infectados, eles são capazes de produzir grande quantidade de HIV-1 intracelular e extracelular sem necessariamente sucumbirem aos efeitos citopáticos da infecção viral produtiva. Essas células primárias também contribuem para a persistência viral nos tecidos e para a disseminação a despeito da vigilância imune. Macrófagos infectados com HIV-1 têm sido enunciados por serem “cavalos de tróia” para a disseminação de partículas infecciosas. A infecção dos macrófagos pelo HIV-1 também pode persistir no tecido por extensos períodos de tempo (meses) com grande número de partículas infecciosas contidas dentro dos vacúolos intra-citoplasmáticos. Eles têm sido implicados nos primeiros estágios da enfermidade por atuarem num papel importante na transmissão inicial do HIV-1, na distribuição do vírus e transmissão de célula para célula nos tecidos linfóides assim como nos estágios avançados da doença causando danos no cérebro. A neutralização por anticorpos e/ou a inibição da infecção por HIV-1 nesses fagócitos mononucleares primários pode bloquear potencialmente ou ao menos reduzir a replicação e disseminação do HIV-1.

Estudos prévios têm mostrado que, quando os macrófagos são usados como células alvo no lugar dos (em vez de) linfócitos autólogos do sangue, uma eficiência aumentada, de no mínimo 100 vezes, do título de neutralização foi observada para o plasma ou soro de macacos infectados com SIV ou pacientes infectados com HIV. Ruppach e outros têm observado atividades neutralizantes autólogas em macrófagos humanos primários mas não em linfócitos quando analisa soro de indivíduos recém infectados (menos de 12 meses após a soro-conversão). Como o título de neutrallização mensurado pode variar consideravelmente de acordo com condições de cultura experimental usadas e é dependente do nível de replicação e produção viral, nós reavaliamos a variação do título de neutralização usando um novo ensaio de neutralização baseado em um único ciclo de infecção em macrófagos, similar àquele recentemente desenvolvido para PBMC. Nós mostramos uma atividade neutralizante de IgG purificada de indivíduos HIV-soropositivos tardios consideravelmente mais alta quando os macrófagos foram usados como células alvo. O papel dos FcyR na superfície de macrófagos humanos primários na fagocitose e na remoção de complexos imunes de IgG do vírus foi investigado.

Materiais e Métodos (não traduzido aqui).

Resultados:

Padrões de concentração (títulos) de Neutralização de IgG Policlonal e Monoclonal usando PBMC e MDM primários como Células Alvo.

Primeiro nós detectamos quais sub-conjuntos de células são infectados “n vitro” após um ciclo de infecção quando as PBMC e MDM são usadas como células alvo. A principal população de células detectada como positiva para coloração p24 foram células TCD4+CD45RO+ e macrófagos diferenciados, 24 horas após a infecção de PBMC e MDM, respectivamente (dados não mostrados). Como essas células representam as principais células infectadas “in vivo”, nós usamos adicionalmente as PBMC e os MDM em nossos protocolos de neutralização. Usando um ensaio de neutralização de único ciclo, nós comparamos o título de neutralização de amostras de IgG policlonal obtidas de um grupo francês de pacientes bem estudados infectados com o HIV quando as PBMC ou MDM foram usadas como células alvo. Como mostrado na figura 1, a amostra no 8 de IgG policlonal é capaz de inibir a replicação do HIV em ambos os linfócitos e macrófagos do sangue periférico infectados por HIV após uma única rodada de infecção. Entretanto, a concentração de Ab necessária para reduzir a proporção de células p24 Ag-positivas para 0,4% é muito mais alta quando as PBMC são usadas como células alvo para o HIV.

Quando as PBMC foram usadas como células alvo do HIV, amostras purificadas de IgG apresentaram títulos de neutralização similares tanto se múltiplas rodadas padronizadas de infecção ou um ciclo de infecção fossem usados. Diferentes espectros (luminosidades) de neutralização puderam ser identificados (sumarizados na legenda da tabela 1). Nós não conseguimos detectar a atividade neuralizante nas amostras 2, 3 e ii contra o vírus Bx08, embora essas amostras contivessem altos níveis de partículas virais ligando-se a IgG. Duas dessas amostras de IgG, nos 22 e 12, foram capazes de inibir a replicação do vírus BaL com baixos títulos de neutralização de 1/15 e 1/12, respectivamente. As outras amostras de IgG testadas aqui podem ser divididas em dois grupos diferentes de IgG neutralizante: um grupo compreendendo as amostras nos 8 e 44 que neutralizaram eficientemente ambas as viroses Bx08 e BaL, e o outro grupo, com um título de neutralização médio, abrangendo as amostras de IgG remanescentes.

Quando os MDM foram usados como células alvo do HIV, nós encontramos um drástico aumento do título de neutralização dessas amostras de IgG contra ambos os isolados primários do HIV-1 BaL e Bx08. Como retratado na Tabela 1, títulos de neutralização das diferentes IgGs purificadas aumentam de 100 para 2000 vezes quando os macrófagos foram usados como células alvo do HIV. Além disso, as IgGs policlonais, que não foram achadas neutralizando viroses em PBMCs, inibiram fortemente a replicação em MDMs. Por exemplo, a amostra de IgG purificada de no 11 tem alto título de neutralização (fator de diluição 1/2000) em MDMs infectados com HIV enquanto esta amostra não teve atividade neutralizante detectável quando as PBMCs foram usadas como células alvo. Quando as PBMC e MDM foran obtidas do mesmo doador, nós também detectamos um título de neutralização mais alto em MDM infectadas com HIV (tabela II), indicando que a diferença na atividade neutralizante pode não estar atribuída à diferença na suscetiblidade das células doadas. Quando avaliada a neutralização do HIV em múltiplas rodadas de infecção (Tabela 1), a atividade inibitória de IgG está suplementarmente aumentada em comparação com ensaios de um único ciclo de infecção em MDM. Esse aumentado título de neutralização não foi evidenciado quando as PMC foram usadas como células alvo (tabela 1).

Nós também comparamos os títulos de neutralização de três anticorpos monoclonais, a IgG1b12, AE10 e 2F5, descritos por exibirem ampla atividade neutralizante cruzada quando as PBMC são usadas como células alvo. Nas PBMCs, as concentrações neutralizantes de mAbs eram similares tanto se nós usássemos um ensaio de múltiplas rodadas de infecção que mensurava o título viral ou um ensaio de única rodada de infecção que quantificava a produção intracelular de p24. Quando as MDM foram usadas como células alvo, nós detectamos de novo um drástico aumento da atividade neutralizante dos mAbs. É notável que para 2F5, o qual reconheceu um epítipo conservado em gp41, a concentraão de mAb capaz de inibir 90% das células infectadas é de 4000 a 12.000 vezes mais baixa nos MDMs versus PBMCs, a concentração neutralizante do mAb IgG1b12 direcionado contra o sítio de ligação de gp120 a CD4 é somente de 10 a 25 vezes mais baixa nos MDM. IgGs purificadas do soro de indivíduos soronegativos foram incluídas como HIV-negativos de controle e não tiveram nenhuma atividade neutralizante. Assim, uma atividade neutralizante mais alta é observada para ambas a IgG policlonal e o mAbs quando os MDMs ao invés das PBMCs são usados. Experimentos adicionais foram designados para investigar os mecanismos pelos quais IgGs policlonais e monoclonais neutralizam o HIV mais eficientemente quando os MDMs são usados como células alvo.

A Atividade Neutralizante dos Fab ou F(ab’)2 Correspondentes de IgG e IgA Policlonais Purificadas de Pacientes Infectados pelo HIV


Como os MDM têm a capacidade de inibir os complexos vírus-IgG por via do receptor de Fcy (receptor do framento Fc gama) presentes na superfície dos macrófagos, nós avaliamos a capacidade de Fab e F(ab’)2 obtidas de amostras de IgG policlonais para neutralizar a replicação do HIV-1 primário isolado nessas células primárias humanas. As concentrações de IgG policlonal ou F(ab’)2 ou Fab correspondentes requerida para inibir 90% das células infectadas após uma única rodada de infecção em MDMs versus PBMCs estão apresentadas na tabela III. A IgG inibe a replicação do HIV em MDM com muito mais eficiência do que seus correspondentes F(ab’)2 ou Fab numa concentração para mais de 100 vezes mais baixa do que estas IgGs policlonais são capazes de diminuir o número de células infectadas em 90% (fig.2 e tabela III). Entretanto, esses fragmentos têm atividades neutralizantes similares a IgG quando as PBMCs são usadas num ensaio de única rodada de neutralização (tabela III), e uma curva similar na atividade de resposta de dose é observada para F(ab’)2, Fab, e a IgG completa em PBMCs infectadas por HIV(fig.3). É notável que a concentração neutralizante de F(ab’)2 ou Fab é comparável em PBMCs e MDMs. A atividade neutralizante mais baixa observada para F(ab’)2 ou Fab, comparada com a IgG completa, em MDM infectado por HIV sugere fortemente a participação da porção Fc da IgG na inibição do HIV-1 nos MDMs. Diferentes grupos têm mostrado o potente papel da IgA na neutralização do HIV-1. Dessa forma, nós mensuramos a atividade neutralizante da IgA policlonal nos MDMs, previamente descritas por inibirem a replicação do HIV-1 nas PBMCs. Nenhuma significativa diferença no título de neutralização de três IgAs policlonais purificadas de pacientes infectados por HIV foi encontrada tanto se os experimentos de neutralização fossem desempenhados nos MDMs quanto nas PBMCs (tabela III). Além disso, as F(ab’)2 de IgA no 8 exibem título de neutralização similar ao do correspondente total de IgA. Assim, contrariamente às amostras de IgG, nós não pudemos detectar um efeito inibitório aumentado de IgA quando os MDMs foram usados como células alvo. Esses resultados mostram que a atividade inibitória aumentada observada para essas IgGs está relacionada com a parte Fc gama da IgG policlonal que pode atuar num papel de remoção do vírus, mas não relacionada às partículas virais ligadas às F(ab’)2 ou Fab ou partículas virais ligadas a IgA. [Obs.: Fragmento Fab é a parte da Ig que tem uma cadeia leve e outra pesada que se ligam ao antígeno. A porção Fc ligada à Fab é quem se liga ao receptor celular.]


A Participação d FcyR (receptor de Fc gama) na Inibição do HIV-1 nos MDMs.


Num esforço para determinar a implicação do FcyR na remoção de imunocomplexos IgG-HIV, nós desempenhamos experimentos de competição de anticorpos (Ab) entre as IgGs de indivíduos infectados com HIV-1 e IgG ou fragmentos Fc gama de IgG policlonais purificadas do soro de doadores HIV-negativos. A incubação de IgG humana normal ou seus fragmentos Fcy com os MDMs permitiu diminuir consideravelmente as atividades inibitórias de IgGs policlonais de indivíduos HIV positivos. Similarmente, a competição de anticorpos ou de fragmentos Fcy de IgGs de doadores não infectados por HIV com o anticorpo monoclonal 2F5 diminuiu marcadamente a atividade inibitória destes anticorpos monoclonais (mAb) de modo dependente da concentração, como mostrado na figura 3.C. Resultados similares foram obtidos quando FcyRs em MDMs foram saturados com IgG humana de doadores HIV-negativos, 10 minutos antes da adição de imunocomplexos ou quando os experimentos de competição foram desempenhados usando-se múltiplas rodadas de infecção (dados não mostrados). Em contraste, a incubação de PBMCs com IgG purificada de indivíduos não infectados por HIV não afetou a atividade neutralizante de IgG policlonal das amostras de nos 8 e 44. O decréscimo de atividade inibitória observada na presença de IgGs ou seus fragmentos Fc sugere que os FcyRs contribuem numa porção principal para essa atividade inibitória registrada. Para avaliar qual tipo de FcyR está implicado neste mecanismo, experimentos de competição de Ab com diferentes IgGs monoclonais purificadas contra os específicos receptores de fragmento Fc gama humanos FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), ou FcyRIII(CD16) foram adicionados ao vírus e aos anticorpos antes da incubação com os MDMs. Como registrado na Figura 4, os anticorpos monoclonais anti-CD64 humana purificados diminuíram a atividade inibitória do HIV das IgGs policlonais das amostras nos 8 ou 11 (Fig 4, A e B) e do anticorpo monoclonal 2F5 (fig. 4.C), enquanto ambos os mAbs (anticorpos monoclonais) anti-CD16 e anti-CD32 humanas purificadas não tiveram efeito na atividade inibitória das IgGs monoclonais ou policlonais testadas. Esses dados demonstraram a participação específica do FcyRI humano ou de CD64 na inibição da replicação do HIV-1 nos MDMs.

Não Há Correlação Entre a Inibição Viral e a Produção Inicial da Quimiocina.

Os MDMs são infectados principalmente através do receptor de quimiocina CCR5, altamente expressado nessas células. Vários estudos têm mostrado que a regulação da expressão de CCR5 para menos ou a ligação por quimiocinas CC nos MDM está associada à redução da entrada e replicação do vírus R5. Quimiocinas tais como MIP-1α, RANTES e MIP-1β são ligantes naturais do receptor CCR5, e são bem identificadas como inibidores da linhagem do HIVR5. Para excluir que essas quimiocinas pudessem contribuir para a inibição do vírus, nós temos mensurado a produção de MIP-1α, β e RANTES nos primeiros sobrenadantes, 2 e 6 oras após a infecção em paralelo com os experimentos de competição de Ab (anticorpos) (tabela IV). RANTES, MIP-1α e MIP-1β foram detectados tão cedo quanto duas horas após a infecção e o aumento de aproximadamente 3 vezes na produção dessas quimiocinas foi medido 6 horas após a infecção (Tabela IV). Nas condições de nossas culturas, a quantidade de quimiocinas induzida foi similar quando as células infectadas foram tratadas com anticorpos monoclonais 2F5 ou amostras de IgG policlonal no 8 na presença ou ausência da porção Fc de IgG de doadores HIV-negativos. Assim, a produção das quimiocinas detectadas logo após a infecção não está correlacionada com a inibição do HIV observada às 24 horas (tabela III).