EFEITOS DOS GLICOSAMINOGLICANOS NA LIGAÇÃO E INFECÇÃO DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA DE TIPO I INDEPENDENTES DA CICLOFILINA E DEPENDENTES DO ENVELOPE.

YI-jun Zang, Theodora Hatziioannou, Trinity Zang, Douglas Braaten, Jeremy Luban, Stephen P. Goff, e Paul D. Bieniasz

Referência: PMID: 12021366

(continuação)


Os dados afora mencionados implicam o laço V3, e suas propriedades de carga em particular, como um importante determinante viral dos efeitos de GAG na infecção por HIV-1. De nota, um estudo recente sugeriu que o laço V3 atua num papel principal na determinação da carga geral de superfície de gp120 que é prevista por projetar-se para fora do vírion e é por isso aceitável por ser aquele que primeiro encontra a célula alvo. Esse achado é especialmente pronunciado quando o laço V3 é altamente básico. Por isso, nós especulamos que os efeitos de intensificação e inibitórios de GAGs carregadas negativamente na infecção por HIV-1 representam interações relativamente não-específicas do envelope e da superfície celular entre cargas eletrostáticas similares ou opostas. Tais interações puderam facilitar a infecção por isolados do HIV-1 trazendo laços V3 altamente carregados positivamente (tais como HXB). Alternativamente, GAGs carregadas negativamente na superfície de células alvo puderam transmitir uma barreira eletrostática que inibe a infecção por víriuns que trazem a gp120 menos carregada positivamente tais como ADA. O polibrene [1.polybrene é hexadimethrine bromide; 2. Hexadimethrine é uma molécula sintética, um polímero que aglutina células vermelhas usado como antagonista da heparina cujo nome químico é 1,6-hexamediamina, N,N,N’,N’- tetrametil, polímero com 1,3-dibromopropano; 3. Bromide = brometo; ânion Br_; sal do brometo de hidrogênio; vários sais originalmente utilizados como sedativos, hipnóticos e anticonvulsionantes; 4. Polybrene é um polímero catiônico usado para aumentar a eficiência da infecção de certas células com um retrovírus em cultura celular. O polybrene atua neutralizando a repulsão da carga entre os vírions e o ácido siálico na superfície celular. Ele tem outros usos como seqüenciamento protéico.], ou policátion, é largamente usado para facilitar a infecção retroviral de células em cultura e é considerado mediador desses efeitos por neutralizar ou reverter as cargas negativas repulsivas na superfície de células alvo. De fato, a infecção inicial do HIV-1 de linhas celulares engenheiradas segregadas é conhecida por ser facilitada pelo polibrene. Se nossa especulação (de que os efeitos mediados por GAGs na infecção por HIV-1 são simplesmente o resultado da modificação da carga na superfície celular) for correta, então nós poderemos prever que o Polybrene inibiria a infecção em células GAG-positivas por NL/HXB e aumentaria a infecção de células GAG-positivas por NL/ADA. Além disso, esses efeitos estariam ausentes, ou menos evidentes na infecção de células sem GAGs. [Obs.: a carga dos GAGs é negativa.]

Como está mostrado nas figuras 5.A e 5.B, essa previsão prova ser exata. De fato, a infecção de células K1/X4 por NL/HXB foi modestamente inibida (duas vezes) pelo polibrene. Um resultado similar foi obtido previamente com o isolado HIV-1/IIIB e uma gama de linhagens celulares humanas. Além disso, essa inibição foi observada somente em células GAG-positivas; a infecção de células 745/X4 por NL/HXB não foi afetada pelo Polybrene. Inversamente, a infecção de células K1/R5 por NL/ADA foi significativamente aumentada (aproximadamente 6 vezes) por polibrene. De novo, o efeito foi dependente de GAG, o caso de pequeno ou nenhum aumento da infecção foi observado quando células alvo careciam de GAGs. De fato, o tratamento de células GAG-positivas com Polibrene aumentou a infecção por NL/ADA para um nível similar àquele observado nas células GAG-negativas tratadas ou não com polibrene.

Como está mostrado nas figuras 5.C e 5.D, nós também observamos marcados efeitos dependentes de GAG nas superfícies celulares na inibição da infecção por HIV-1 mediada por poliânions. Para esses experimentos, nós usamos heparina, um análogo do sulfato de heparan (HS) altamente sulfatado. Poliânions, tais como a heparina, podem ligar-se a superfícies conservadas básicas em gp120, assim como o laço V3, que são considerados juntos por representar o principal sítio de interação para co-receptores. Se a inibição da ligação viral ao co-receptor específico é o único mecanismo pelo qual os poliânions inibem a infecção do HIV-1, então a presença ou ausência de GAGs na superfície de células alvo deve ter pouco ou nenhum efeito na potência com a qual os poliânions inibem a infecção por uma dada linhagem do HIV-1. Entretanto, enquanto a heparina inibiu a infecção de NL/HXB e, células K1/X4, ela foi menos efetiva numa ordem de magnitude de 1 e 2 na prevenção da infecção por NL/HXB em células 745/X4. Por isso, a maioria das atividades de inibição de infecção da heparina é preferivelmente atribuível a ambas condições:
1-competição por ligação a sítios GAG nos envelopes de vírus NL/HXB, ou;
2-redução da carga geral positiva nos vírus NL/HXB, tais que a atração eletrostática entre cargas positivas nos vírus e cargas negativas em GAGs são atenuadas nas células alvo. O frágil efeito inibitório residual da heparina na infecção por NL/HXB que é observada quando as células 745/X4 são usadas como alvo é provávelmente resultante do bloqueio de interações específicas do envelope e receptor envolvendo vírions com a superfície do envelope positivamente carregadas.

No caso de NL/ADA, a heparina foi um pobre inibidor da infecção. De fato a infecção de células 745/R5 por NL/ADA foi quase inteiramente refratória à inibição por heparina. Entretanto, uma modesta atividade inibitória de heparina foi observada quando células alvo GAG-positivas foram usadas. Já que as GAGs de superfície celular transmitem uma carga negativa que é aparentemente inibitória para a ligação e infecção por NL/ADA, é aceitável que a ligação ineficiente da heparina negativamente carregada do envelope ADA acentue esse efeito eletrostático negativo.

Em geral, esses resultados sugerem que a modificação característica da carga tanto das células alvo quanto dos vírions pode ter significativos efeitos na eficiência da infecção pelo HIV-1. Além disso, eles sugerem fortemente que as GAGs na superfície de células alvo do HIV-1 transmitem uma carga negativa que pode tanto aumentar ou inibir a infecção por HIV-1, de um modo dependente do envelope. Finalmente, as GAGs de superfície celular são determinantes celulares predominantes que governam efeitos de poliânions e policátions na infectividade do HIV-1 “in vitro”.

6-Os efeitos das GAGs na superfície de células alvo na infecção por HIV-1 são independentes de CypA.

Os resultados apresentados até agora indicam que efeitos de GAGs na superfície celular na infecção por HIV-1 são mediados largamente, talvez inteiramente, pelas proteínas do envelope viral. Esses dados são difíceis de conciliar com um modelo recentemente proposto no qual a ciclofilina encapsulada no vírion transloca-se para a superfície do vírion de onde ela media a ligação com a célula alvo por via da interação com sulfato de heparan. Entretanto, para tratar deste tema especificamente, nós adotamos três estratégias experimentais para esvaziar os vírions de CypA e examinamos os efeitos dessas manifestações na infectividade das linhagens do HIV-1 que são mais infecciosas na presença (NL/HXB) ou ausência (NL/ADA) de GAGs na superfície celular. Se o papel da CypA na infecção por HIV-1 é promover a ligação do vírion a sulfato de heparan na superfície das células alvo, então a ausência de CypA dos vírions deverá reduzir a infectividade do HIV-1 em células expressando sulfato de heparan. Entretanto, a presença ou ausência de CypA associada aos vírions não deverá ter efeito na infectividade quando as células que carecerem inteiramente de HS forem usadas como alvo.

Primeiro nós construímos plasmídios pró-virais cujos resíduos dentro da proteína do capsídeo que são essenciais para a incorporação de CypA foram mutados (G89V e P90A). A mutação P90A foi combinada com uma substituição suplementar (A92E) que foi previamente noticiada por restaurar parcialmente a competência de replicação do HIV-1 quando a incorporação de CypA está bloqueada por manipulação farmacológica ou genética. Como pode ser visto na figura 6.A, os vírions NL/HXB contendo estas proteínas mutantes do capsídeo foram menos infecciosos (de cinco a seis vezes) quando as células K1/X4 foram usadas como alvos, como esperado. Entretanto, ambos os vírions de tipo selvagem e mutante foram aproximadamente 10 vezes menos infecciosos nas células 745/X4. Por outro lado, os efeitos das mutações em CA que impedem a incorporação de CypA na infectividad em NL/HXB foi similar quando células alvo K1/X4 (HS-positivas) e 745/X4 (Hs-negativas) foram usadas. Este resultado está inconsistente com a noção de que as mutações no capsídeo reduzem a infectividade do HIV-1 por impedirem interações dependentes de CypA entre o vírion e o sulfato de heparan na superfície de células alvo. Além disso, um vírus (NL/ADA) que é mais infeccioso nas células que carecem de HS exibem reduções de infectividade similares sob a mutação da proteína do capsídeo para abolir a incorporação de CypA. Uma vez mais, a redução da infectividade que resulta de impedimento genético da incorporação de CypA dentro de vírions NL/ADA foi observada em ambas as células alvo HS-positivas e HS-negativas.

A incorporação de CypA nos Vírions HIV-1 também é efetivamente bloqueada em células que produzem vírus por tratamento com CsA, uma droga que impede a interação de CypA com CA (capsídeo) por competição pelo sítio de ligação a CA em CypA. Como resultado, vírions colhidos de células tratadas com CsA exibiram reduzida infectividade. Como está mostrado na figura 6.B, a linhagem de vírus colhidos de células T293 com transmissão de pNL/HXB e tratadas com CsA foram de fato menos infcciosas do que aquelas derivadas de células não tratadas. A magnitude da redução induzida por CsA na infectividade (de 5 a 6 vezes) foi similar àquela observada quando a incorporação de CypA foi abolida por mutação de resíduos dentro da proteína do capsídeo. De importância, entretanto, esse fenótipo foi observado se o senão o sulfato de heparan estava presente nas células alvo que foram usadas para mensurar a infectividade. Além disso, o tratamento com CsA de células produzindo NL/ADA também levou a reduções equivalentes na infectividade dos vírions indiferentemente a se células HS-positivas ou HS-negativas foram usadas para a titulação do vírus.

Finalmente, nós fizemos uso de uma linhagem celular derivada de células Jurkat na qual ambas as cópias do gene de CypA foram quebradas/partidas por recombinações homólogas. A replicação do HIV-1 é atenuada em células Cypa -/- porque os vírus derivados delas são menos infecciosos. Já que que as células Jurkat carecem do co-receptor CCR5 e por isso não podem sustentar a entrada do NL/ADA, ambos os genomas de NL/HXB e NL/ADA foram introduzidos em células Jurkat CypA +/+ e CypA -/- por pseudotipagem com VSV-G. A infectividade dos vírions descendentes (progênie dos vírus) foi então mensurada por uso de células HS-positivas e HS-negativas, como feito previamente. É importante notar que enquanto cada vírus foi introduzido dentro das células Jurkat por uso de envelope VSV, sua progênie dispõe somente do envelope autêntico do HIV-1 (HXB ou ADA). Isso foi verificado por demonstração de que cada vírus derivado de Jurkat não era infeccioso em células que não apresentavam o co-receptor apropriado para o envelope específico do HIV-1 (dados não mostrados). Como mostrado na figura 6.C, os vírions NL/HXB e NL/ADA derivados de células Jurkat CypA +/+ dispunham de um fenótipo virtualmente idêntico ao observado quando essas viroses foram obtidas de células T293 transmitidas (infectadas), isto é, o NL/HXB era mais infeccioso nas células K1/X4 GAG-positivas do que em células 745/X4 GAG-negativas, enquanto o NL/ADA era mais infeccioso em células 745/R5 do que em células K1/R5. Enquanto os níveis de NL/HXB e NL/ADA infecciosos colhidos de células Jurkat CypA -/- eram reduzidos em comparação àqueles obtidos de células Jurkat CypA +/+, cada uma dessas viroses exibiu a mesma preferência para a presença (NL/HXB) ou ausência (NL/ADA) da expressão de GAG pelas células alvo. Esses dados mostram claramente que a incorporação da CypA dentro de partículas virais não modula a habilidade diferencial do HIV-1 para infectar células que expressam ou não o sulfato de heparan.

DISCUSSÃO

Nesta série de experimentos nós temos mostrado que a presença das GAGs na superfície de células alvo pode modular sua suscetibilidade à infecção por HIV-1. Esses achados estão de acordo com dados previamente publicados que mostraram que linhagens do HIV-1 derivadas dos isolados IIIB/LAV/LAI, chamados HXB neste estudo, exibem níveis significativamente mais altos de infectividade (aproximadamente 10 vezes) quando o HS está presente na superfície da célula alvo. Entretanto, nós temos achado que este fenótipo é uma característica de linhagens minoritárias do HIV. De fato, a maioria das proteínas do envelope usadas em experimentos apresentados aqui (sobre este assunto), as quais incluíam formas representativas dos subtipos A, B, C, e D conferem infectividade mais alta quando as células alvo carecem inteiramente de GAGs. Somente duas das doze proteínas do envelope derivadas de isolados primários (um X4 e um X4R5) exibiram uma clara preferência pela presença de GAGs na superfície de células alvo durante a infecção.

Além disso, esses fenótipos discordantes parecem ser determinados pelo laço V3 de gp120 e correlacionarem-se com a carga do laço V3 (tabela 1, fig.4). De fato, somente linhagens virais carregando uma proteína gp120 que contenha uma sequência altamente básica no laço V3 exibe uma capacidade preferencial para infectar células GAG-positivas. Esta observação, casada com outros dados apresentados aqui ou recentemente publicados por outros grupos, sugere que o efeito das GAGs na superfície celular na infecção por HIV-1 reflete simplesmente a repulsão eletrostática ou a atração entre componentes carregados similarmente ou em oposição da célula alvo e do vírion. Especialmente, o laço V3 é aceitavelmente o principal maior determinante da carga geral da face de gp120 que projeta-se junto à célula alvo, particularmente quando o V3 por si mesmo é altamente básico. Assim, as faces próximas da célula alvo de, por exemplo, HXB e gp120 89.6, ambas as quais conferem infectividade mais alta em células GAG-positivas, são substancialmente mais positivamente carregadas do que aquelas de, por exemplo, JRFL, o qual exibe o fenótipo inverso (tabela 1.Fig2). Além disso, o policátion Polybrene e o poliânion heparina tiveram efeitos na infecção por HIV-1 que diferiam de acordo com qual proteína do envelope estava presente. No momento, a infecção por NL/ADA, cujo laço V3 carrega uma carga positiva baixa, foi significativamente aumentada pela penetração das células alvo com Polybrene. Esse composto é pensado por aumentar a infecção por diversas retroviroses por neutralização ou reversão de cargas negativas na superfície das células alvo. Consistentemente com esta noção, o Polybrene inibiu modestamente a infecção por NL/HXB, cujo envelope é altamente positivamente carregado. Significativamente, ambos estes efeitos foram dependentes das cargas na superfície das células alvo. A implicação desses resultados é que as GAGs transmitem uma carga negativa à superfície de células alvo que inibe a fixação e infecção por partículas virais menos positivamente carregadas (e.g. NL/ADA) mas promove a fixação e a infecção por vírions positivamente carregados (e.g. NL/HXB) e pode ser neutralizada por Polybrene.

Similarmente os efeitos de heparina na infecção por HIV-1 também foram dependentes de ambos o envelope viral e da expressão de GAG na célula alvo. Polissacarídeos sulfatados têm afinidade engrandecida para, e atividade antiviral mais alta contra, envelopes X4 tais com HXB do que para envelopes R5 tais como ADA e JRCSF. Os resultados apresentados sobre este assunto indicam que a habilidade de heparina para bloquear ambas as infecções por NL/HXB e NL/ADA é ao menos em parte dependente da presença das GAGs na superfície das células alvo. Quando vistas em conjunto com os resultados discutidos anteriormente, esses achados sugerem que a ligação de heparina a componentes do vírion positivamente carregados (a qual é mais eficiente no caso de NL/HXB) neutraliza a carga positiva associada ao vírus e aumenta a quantidade de carga negativa associada ao vírus. A conseqüência óbvia seria que a atração eletrostática para GAGs de superfície celular negativamente carregadas seria decrescida e a repulsão eletrostática por cargas similares seria acentuada.

Os efeitos positivos e negativos das GAGs na superfície das células alvo e heparina exogenamente adicionada na infecção por HIV-1 parece ser estritamente dependente da seqüência do envelope. Esses achado não são consistentes com a hipótese de que a CypA media a interação inicial do vírion com as células alvo por ligação a heparan sulfato na superfície celular. De fato, a eliminação da incorporação de CypA dentro das partículas de NL/HXB ou NL/ADA farmacologicamente (por tratamento com CsA) ou geneticamente (mutação no capsídeo) reduziu a infectividade do vírion de um modo que foi independente de se o sulfato de heparan estivesse ou não presente na superfície das células alvo. Mais convincentemente, as linhagens descendentes de vírus NL/HXB ou NL/ADA provenientes de células Jurkat CypA -/-, as quais carecem de CypA, exibiram preferência pela presença ou ausência de GAGs na superfície de células alvo idêntica àquela linha de descendência derivada de células Jurkat ou T293 CypA +/+. Claramente, a reduzida infectividade dos vírions de HIV-1 que resulta de uma carência de CypA não pode ser atribuída à eliminação da fixação dependente de HS às células alvo.

Os efeitos diferenciais na infecção por HIV-1 que resulta da presença ou ausência de GAGs na superfície de células alvo derivadas de CHO-K1 são aceitáveis por representar extremas manifestações desses fenótipos. A expressão de HS está particularmente alta em células CHO-K1 e completamente ausentes de células pgsA745. Ainda assim, essas duas linhas celulares diferem bastante modestamente, 10 vezes ou menos, em sua suscetibilidade para infecção por vírions d HIV-1 carregando cada um dos envelopes testados. A célula alvo predominante natural para a infecção por HIV-1, chamada, primeiramente de linfócito T, expressa somente baixos níveis de HS. Assim, os efeitos, se algum, da expressão de HS na infecção do HIV-1 em células primárias são aceitavelmente mais modestos do que os documentados aqui para células derivadas de CHO-K1. De fato, efeitos positivos significativos de GAGs na superfície de células alvo na infecção por HIV-1 têm sido obtidos predominantemente com linhas de células imortalizadas de linha de células adaptadas a vírus isolados. De fato, o tratamento com heparinase dos linfócitos primários foi encontrado por ter efeitos insignificantes na infecção por HIV-1 mediada por ambos os envelopes X4 e R5.

Não obstante esses achado, permanece formalmente possível que os GAGs na superfície celular devam atuar em algum papel na biologia do HIV-1 in vivo. No momento, a infecção de macrófagos pode ser tanto influenciada positivamente ou negativamente por GAGs na superfície celular, as quais são mais abundantes neste tipo de célula. Em adição, altas concentrações da quimiocina RANTES tem sido mostradas por aumentar dramaticamente a infecção in vivo por ambos os vírions de HIV-1 e da leucemia murina, de uma maneira independente do envelope. O aumento da infecção dependente de RANTES é ao menos em parte mediado através da fixação aumentada do vírion, e dependente das GAGs de superfície celular, e é mais aceitável como resultado da ligação cruzada da célula com o vírion por oligômeros RANTES [oligômero é um polímero de até 20 unidades repetidas]. Não está claro no presente se concentrações locais de RANTES “in vivo” devem atingir os níveis requeridos para este efeito. Finalmente, a transmissão seletiva aparente de linhagens do HIV-1/R5 na superfície da mucosa, onde GAGs parece ser mais abundantes, pode em princípio ser influenciada pela variação fenotípica nas propriedades do envelope descritas aqui. Neste caso, seria necessário confrontar um mecanismo indireto pelo qual as GAGs seqüestram seletivamente, e dessa forma previnem a transmissão de, linhagens X4 carregando envelopes altamente positivamente carregados enquanto permitisse a transmissão de linhagens carregando envelopes menos positivamente carregados.

Em geral, contudo, os dados apresentados aqui indicam que, na maioria dos casos, o encontro inicial entre um vírion HIV-1 e sua célula alvo não é aceitável por ser mediado por interações gp120-GAG ou CypA-GAG. Assim, ao menos para a maioria das linhagens primárias do HIV-1, não encontramos evidências que sugiram que baixos níveis de GAGs presentes nas células T circundantes in vivo atuariam num papel direto e significativo na promoção da fixação e replicação do HIV-1.