EFEITOS DOS GLICOSAMINOGLICANOS NA LIGAÇÃO E INFECÇÃO DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA DE TIPO I INDEPENDENTES DA CICLOFILINA E DEPENDENTES DO ENVELOPE.

YI-jun Zang, Theodora Hatziioannou, Trinity Zang, Douglas Braaten, Jeremy Luban, Stephen P. Goff, e Paul D. Bieniasz

Referência: PMID: 12021366

RESUMO

Os glicosaminoglicanos (GAGs) de superfície celular, em particular o sulfato de heparan (HS), têm sido sugeridos como mediadores da ligação do vírus da imunodeficiência humana de tipo I (HIV-1) a células alvo antes da entrada do vírus, e ambas a proteína viral gp120 e a ciclofilina A (CypA) associada ao vírion têm sido mostradas por interagiram diretamente com o sulfato de heparan e seus análogos. Para determinar o papel das GAGs na ligação e infecção por HIV, nós geramos células de linhagem CHO (células de ovário de hamster chinês) suscetíveis ao HIV que tanto expressavam altos níveis de GAGs (CHO-KI) ou a falta de GAGs (pgsA745). Usando um painel de envelopes do HIV, nós achamos que os efeitos mediados por GAGs na superfície celular na ligação e infecção do vírion varia na dependência do tipo de envelope mas de modo independente do co-receptor. De fato, a infecção mediada por GAG na superfíce celular está confinada a isolados que contém a sequência do laço V3 (de gp120) altamente carregadas positivamente, enquanto a infecção pela maioria dos tipos é aparentemente inibida na presença dos GAGs. Além disso, os efeitos de aumento e inibição de policátions e poliânions na infecção por HIV-1 são amplamente dependentes da presença de GAGs de superfície celular. Essas observações são consistentes com um modelo no qual as GAGs infuenciam a infecção primária do HIV-1 “in-vitro” por modificação das características de carga das superfícies das células alvo. Finalmente, os efeitos das GAGs na infecção por HIV-1 são observados em extensão equivalente enquanto a CypA está presente ou ausente dos vírions. Em geral, esses dados excluem um papel principal para as GAGs na mediação do acesso dos muitos tipos de HIV-1 a células alvo por via das interações de gp120 ou CypA associadas ao vírion.

INTRODUÇÃO

O sulfato de Heparan (HS) e o sulfato de chrondroitina (CS) são carboidratos amplamente expressados, chamados glicosaminoglicanos (GAGs), que existem na superfície das células, ligados covalentemente ao cerne de proteínas associadas à membrana. Desses, o sulfato de heparan, em particular, tem sido apresentado por ser um importante fator de acesso para um número de protozoários, bactérias e patógenos virais. Em contraste, o papel do HS na ligação do vírus da imunodeficiência humana à superfície celular das células alvo tem sido algo controvertido. Enquanto está claro que a expressão de CD4 e um receptor de quimiocina apropriado é necessário para a infecção eficiente do HIV-1, é menos evidente se outras moléculas de superfície celular, incluindo o HS, devam constituir sítios de ligação inicial na célula alvo. Essas interações puderam, com efeito, servir para concentrar os vírions na superfície da célula alvo antes do casamento específico de gp120/CD4/co-receptor e dessa forma facilitar a entrada do vírus. De fato, a ligação dos vírions à superfície celular das células alvo parece ser uma etapa de limitação da taxa de entrada do HIV-1. A evidência de que o HS atua num papel importante no acesso e infecção por HIV-1 inclui a observação de que a heparina (um análogo de sulfato de heparan) e um número de outros polissacarídeos sulfatados inibem potencialmente a infecção por HIV-1. Em adição, a remoção enzimática do sulfato de heparan da superfície de ambas as linhagens de células HeLa-CD4 ou células T podem atenuar dramaticamente ambas a ligação e a replicação do HIV-1. Este último efeito parece ser ao menos um tanto específico, em que a remoção enzimática de sulfato de chrondroitina (CS) das superfícies celulares alvo não afeta a infecção por HIV-1. Esses achados são consistentes com a hipótese de que o contato inicial entre o vírium do HIV-1 e sua célula alvo é mediado por sulfato de heparina. Vários componentes do vírion, incluindo a terceira região hiper-variável de gp120 (o laço V3) assim como seu domínio básico conservado de interação com o co-receptor, e elementos da glicoproteína transmembrana do envelope gp41, têm sido também noticiados por servirem como sítios de interação com heparina, HS e/ou outros polissacarídeos sulfatados. Intrigantemente, um estudo recente indicou um papel para ciclofilina A (CypA) na mediação da ligação do HIV-1. Está bem estabelecido que CypA é incorporada dentro de partículas do HIV-1 durante a reunião por via da interação específica com o domínio CA de Pr55 GAG. Além disso, a atenuação genética ou farmacológica dessa interação abole a incorporação de CypA e reduz a infectividade dos vírions descendentes em um estágio anterior à transcrição reversa. Um mecanismo potencial que pode contabilizar o efeito positivo da infectividade do HIV-1 com CypA foi proposto recentemente. Especificamente, a proporção de partículas de HIV associadas com CypA é aparentemente exposta na superfície dos vírions e foi apresentada por mediar interações independentes do envelope com HS na superfície de células alvo por via de resíduos de aminoácidos básicos situados no terminal C de Cypa.

Em contraste com os estudos mencionados afora que proporcionam clara evidência em favor de um papel positivo dos Sulfatos de Heparan na superfície das células na ligação do HIV-1 e subseqüente infecção, outros investigadores têm mostrado que a remoção enzimática do sulfato de heparan da superfície celular de linfócitos primários não teve efeito em sua capacidade de manter a replicação do HIV-1. Em adição, alguns estudos têm mostrado marcadas diferenças dependentes da linhagem no grau em que o envelope do HIV-1 pode ligar-se a HS (sulfato de heparan) e outros polissacarídeos sulfatados e para os quais a ligação do vírion dependente do envelope a células alvo exibe um requisito para o Sulfato de Heparan na superfície celular, embora o número de isolados (HIV-1) examinados até agora seja limitado.

Para resolver esta questão, nós exploramos um derivativo da linha celular CHO-K1, chamado pgsA745, que foi selecionado com base na ausência de síntese de GAGs, seguindo a mutagênese química. Essa linha celular foi considerada por ser deficiente em xylosyltransferase, uma atividade que é essencial para a adição de sulfato de heparan e polímeros CS (sulfato de crondroitina) nos cernes protéicos sindecano e glipicano. Assim, a célula pgsA745 carece dos glicosaminoglicanos de sulfato de heparan e sulfato de crondroitina detectáveis na superfície, e como tal, constituem um reagente ideal para testar o papel dessas moléculas na entrada do HIV-1. Em meio a um painel de envelopes do HIV-1, nós encontramos marcadas diferenças dependentes da linhagem na preferência ou, de outra forma, na presença de GAGs na superfície celular, durante a fixação do e infecção por HIV-1. Estes fenótipos são similarmente determinados pela carga do envelope, já que o aumento da infecção dependente de GAG é observado somente nas linhagens de HIV-1 que codificam uma sequência do laço V3 de gp120 altamente básica. Esses efeitos dos glicosaminoglicanos de superfície celular dependentes da linhagem e em oposição na infecção por HIV-1 são independentes de qual co-receptor é utilizado e são observados em ambas a presença ou ausência de CypA dentro da partícula viral.

[MATERIAIS E MÉTODOS: TEXTO NÃO REPRODUZIDO AQUI.]




RESULTADOS


1-As linhagens celulares positiva e negativa para GAG suscetíveis ao HIV-1.


Para examinar o papel das GAGs na fixação do HIV-1 e infecção, derivativos das linhas celulares CHO-K1 (que expressam altos níveis de GAGs) suscetíveis ao HIV-1 e um derivativo pgsA745 (que carece inteiramente de GAGs), foram construídas. Isso foi concluído pela expressão estável de cDNAs codificando a CD4 humana e um co-receptor (ambos CXCR4 e CCR5), assim como uma forma mutante da CycT1 (Tyr261Cys) murina que é capaz de manter a função da Tat lentiviral do primata. Os níveis de expressão de CD4 e co-receptores nas populações de células isoladas por FACS estão apresentados na figura 1A. [A transcrição o vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV) requer a interação de uma sub-unidade ciclina T1 (CycT1) de um fator celular do hospedeiro, o fator B de alongamento de transcrição positiva (P-TEFb), com a proteína Tat no elemento de reação de transativação (TAR) de transcritos nascentes. PMID: 18931076. Obs.: os novos vírions utilizam o mecanismo de transcrição do hospedeiro depois da primeira inserção no DNA.]

[REPRODUÇÃO DA FIGURA 1A:

1) K1/X4: CD4 (2,3); CXCR4 (2,4); HS (2,7);
2) K1/R5: CD4 (2,1); CCR5 (1,7); HS (2,8);
3) 745/X4: CD4 (2,9); CXCR4 (2,7); HS (0,7);
4) 745/R5: CD4 (2,8); CCR5 (1,7); HS (0,7);



Texto da figura 1

(A) Análises FACS de expressão do receptor de HS em linhas celulares derivadas de CHO-K1 (K1/X4 e K1/R5) e pgsA745 (745/X4 e 745/R5). A expressão do receptor e de HS foi medida usando anticorpos anti-CD4 conjugados com allophycocyanin (aloficocianina?) e anticorpos anti-CXCR4 conjugados com ficoeritrina e anticorpos anti-CCR5 conjugados com ficoeritrina. Alternativamente, a expressão de HS foi medida usando-se o anticorpo monoclonal IgM anti-HS seguido por anti-IgM conjugado com isotiocianato fluorescente. O logaritmo de intensidade fluorescente principal para cada linha celular está entre parêntesis. A experimentação com coloração (tintura) com reagentes controle de isotipo está mostrada por histogramas abertos (?).

(B) As mesmas linhas celulares foram inoculadas com provisão de vírus derivados de NL4-3. O vírus NL/HXB foi usado para K1/X4 e 745/X4, e o NL/ADA foi usado para K1/R5 e 745/R5. Quarenta e oito horas após a inoculação, as células infectadas foram visualisadas por tintura fluorescente usando-se um anticorpo monoclonal anti-p-24.]

Esta análise demonstrou que o estado estável de CD4 e de cada co-receptor é similar nas linhas celulares derivadas de CHO-KI (K1/X4 e K1/R5) e derivadas de pgs745 (745/X4 e 745/R5), embora os níveis de expressão de CD4 sejam ligeiramente mais altos nos derivados de pgsA745. Em adição, nós verificamos que as células derivadas de CHO-K1 e pgsA745 mantiveram os fenótipos GAG positivo e GAG negativo das linhas celulares parentais por análises FACS com anticorpos anti-HS (fig 1.A)

Para determinar se, e em que extensão, as linhas celulares derivadas de pgsA745 e de CHO-K1 foram sensíveis à infecção por HIV-1, as células K1/X4 e 745/X4 foram inoculadas com o vírus NL/HXB (tropismo para CXCR4). Similarmente, as linhas celulares K1/R5 e 745/R5 foram inoculadas com NL/ADA (tropismo para CCR5). A infecção foi monitorada 48 horas após a inoculação por imunofluorescência usando-se anticorpo monoclonal anti-p-24. Como pode ser visto na figura 1.B, cada uma das linhas celulares foi infectada pelas linhagens do HIV-1 com sucesso transportando um envelope apropriado para o co-receptor específico. Como tem sido previamente noticiado, a presença de GAGs na superfície aparentemente aumentou o nível de infecção do HIV-1 envelopado HXB. Surpreendentemente, entretanto, o vírus envelopado ADA pareceu ser marcadamente mais infeccioso nas células 745/R5 que carecem de GAGs do que nas linhas celulares K1/R5.


2-Efeitos contrários das GAGs na superfície das células alvo na infecção por HIV-1 dependente do envelope.


Vírions do HIV-1 contendo envelopes HXB e ADA do HIV-1 exibiram diferenças marcadas e contraditórias de infectividade na presença ou ausência de GAGs na superfície celular alvejada. Por isso, nós examinamos a seguir este fenótipo de maneira mais quantitativa usando um painel de clones moleculares de HIV-1 infeccioso derivados de pNL4-3 nos quais o gene do envelope tivesse sido recolocado com cada um daqueles (produtos) codificados por uma seleção de isolados. Este painel incluiu os envelopes com tropismo primário para CCR5 (ADA, JRFL, YU2, 91US005.11,92MW965.26, 92RW020.5 e 92BR020.4) e com tropismo primário para CXCR4 (92UG021-6, 92UG024.2 e 92HT599.24), bem como os envelopes HXB adaptados para a linhagem de células T e o envelope de duplo tropismo 89.6. A infectividade de cada estirpe viral colhida diretamente de células 293T infectadas com plasmídio do pró-vírus, foi medida por uso de ambas as células CHO-K1 e pgsA745 carregando o apropriado co-receptor. Como pode ser visto na figura 2.A., cada uma das estirpes virais envelopadas primariamente para CCR5 exibiram infectividade mais alta nas linhas celulares 745/R5 (Gag-negativas) do que nas linhas celulares K1/R5 (GAG-positivas). A magnitude deste efeito foi modesta (6 vezes ou menos) mas claramente reprodutível. Convergentemente, e como está mostrado na figura 2.B, duas das viroses CXCR4 (NL/HXB e NL/92HT599.24) exibiram infectividade significativamente mais alta na linha celular K1/X4 GAG-positivas do que na contrapartida 745/X4 GAG-negativas. No caso do HXB, essa diferença foi maior que 10 vezes. Entretanto, a preferência pela presença de GAGs na superfície celular durante a infecção viral não foi uma propriedade universal para viroses com tropismo para CXCR4. De fato duas outras viroses X4, NL/92UG021.6 e NL/92UG024.2, foram claramente mais infecciosas (aproximadamente 4 vezes) em células alvo GAG-negativas 745/X4 do que nas células K1/X4. Por isso, a preferência de uma dada linhagem de HIV-1 pela presença de GAGs na superfície de células alvo é dependente do envelope mas não determinada pelo co-receptor usado. Esta conclusão foi sustentada por dados obtidos com vírus carregando o envelope de duplo tropismo do HIV-1 89.6. Como mostrado na figura 2.C, o NL/89.6 foi claramente mais infeccioso em células alvo GAG-positivas do que em contrapartidas (homólogas) GAG-negativas. Importantemente, este fenótipo foi observado independentemente de qual co-receptor, CXCR4 e CCR5 foi usado durante a infecção. Em adição, o SIV isolado mac239 com tropismo para CCR5 foi modestamente mais infeccioso em células alvo GAG-positivas do que em células GAG-negativas. Em geral, exemplos de ambas as lentiviroses primatas utilizando CXCR4 e CCR5 que exibiam preferências opostas para a presença ou ausência de GAG nas superfícies alvo foram obtidas nesta experiência. Entretanto, o fenótipo mais prevalente entre os envelopes de HIV-1 isolados primários, não obstante com pequena (mas diversa) amostra de isolados, parece ter a infectividade modestamente aumentada na ausência de GAGs na superfície.

3-Efeitos opostos das GAGs na fixação do vírion do HIV-1 dependentes do envelope.


Trabalhos prévios têm sugerido um importante papel para GAGs, em particular o HS, na fixação do HIV-1 nas células alvo. Para examinar se os vírions de HIV-1 carregando diferentes proteínas do envelope apresentam diferenças em suas habilidades respectivas para fixar-se a células GAG-positivas versus células GAG-negativas, nós geramos partículas virais fluorescentes carregando tanto as proteínas HXB ou ADA do envelope. Isso foi feito por co-transferência de células 293T com pNL/HXB ou pNL/ADA juntamente com um plasmídio de expressão da fusão protéica GFP-Vpr (Proteína fluorescente verde ligada à Vpr viral). Como tem sido previamente descrito, a incorporação de uma fusão protéica GFP-Vpr produziu vírus que podem ser visualizados com um microscópio de fluorescência. Para gerar partículas de controle similares ao vírus sem uma proteína funcional do envelope, o pNL/δenv foi substituído (? Ou o substituidor?) para os plasmídios de vírus infecciosos.

Os vírions fluorescentes foram incubados com células CHO-K1 ou pgsA745, os quais carecem dos receptores do HIV-1, sob condições (4OC) que permitam a fixação do vírus, mas não a entrada. A ligação (fixação) do vírion foi avaliada microscopicamente após lavagem, fixação e tingimento para revelar a arquitetura celular. Imagens representativas estão apresentadas na figura 3.A, e a enumeração dos vírus ligados a células está mostrada na figura 3.B.

Adaptação dos dados apresentados na figura 3.B
- Número de GFP+ partículas ligadas por célula :

VÍRUS/CÉLULA - NL/HXB ------- NL/ADA ------- NL/ δenv

CHO-K1 ------>DE 135 A 165------DE 15 A 20-----DE 10 A 15

pgsA745------>DE 30 A 40--------DE 35 A 40-----25




As partículas fluorescentes de NL/HXB ligaram-se aproximadamente 5 vezes mais eficientemente a células CHO-K1 do que a células pgsA745. Este aumento da ligação/fixação do vírium dependente de GAG foi claramente dependente do envelope. De fato, partículas fluorescentes NL/ADA não se ligaram eficientemente a células CHO-K1 e, de fato, ligaram-se com ligeira maior eficiência a células pgsA745. A magnitude dessa diferença foi pequena (aproximadamente 2,5 vezes) mas reproduzida em múltiplas repetições da experiência. Vírions carecendo de uma proteína do envelope ligaram-se pobremente a ambas as linhas celulares, porém, exibiram como o NL/ADA, uma modesta preferência para ligação a pgsA745 mais que a células CHO-K1. Os fenótipos em oposição de vírions envelopados de receptor lembram aqueles observados em ensaios de infectividade (dependentes de receptor) (Fig.2) Essas observações sugerem, particularmente no caso de NL/HXB, que os efeitos mediados por GAGs da superfície celular na infectividade do HIV-1 são manifestados antes do específico casamento ao receptor e influenciam a fixação do vírion em células alvo.

4-O laço V3 de gp120 é um determinante principal dos efeitos da GAG na superfície da célula alvo na infecção por HIV-1.

Devido ao painel de clones do HIV-1 usados na figura 2 terem apresentado marcada diferença, preferência dependente do envelope pela presença ou ausência de GAGs na superfície da célula alvo durante a infecção, a seguir nós procuramos correlacionar estes fenótipos com propriedades da proteína do envelope viral. Já que a presença de GAGs altamente sulfatadas pode, em princípio, afetar marcadamente a carga eletrostática geral nos arredores da membrana plasmática, pareceu pelo menos possível que superfícies carregadas na glicoproteína do envelope viral pudessem representar determinantes virais significativos do fenótipo mediado por GAG. De fato, tem sido previamente noticiado que polissacarídeos sulfatados podem ligar-se a superfícies básicas na proteína gp120 do envelope do HIV-1 incluindo o laço V3 e a epítopos induzidos de ligação a CD4. Como pode ser visto na figura 4, a extensão para a qual o laço V3 de gp120 apresenta uma carga positiva correlacionou com a habilidade da proteína do envelope para mediar diferencialmente a infecção de células GAG-positivas versus células GAG-negativas. De fato, somente envelopes que contém uma sequência de laço V3 altamente básica foram mais infecciosos em células GAG-positivas do que em contrapartidas Gag-negativas. A única exceção foi o envelope de 92HT599.24, o qual carrega uma carga positiva líquida de somente +5, ainda é mais infeccioso em células GAG-positivas do que em células GAG-negativas. Entretanto, o laço V3 deste isolado (vírus isolado 92HT599.24) é altamente incomum no que contém quatro resíduos de histidina (em oposição a um ou dois na maioria dos outros isolados, incluindo aqueles usados neste estudo). A histidina é convencionalmente não incluída nos cálculos da carga do laço V3. Todavia, devido à pKa de histidina ser fechada em 7, é aceitável que cálculos simplistas de carga do laço V3 usados aqui e algures subestimem um pouco a carga pH positiva indistinta (neutra) nos laços V3 de gp120 e o isolado 92HT599.24 em particular. Não obstante este menor aviso, a carga do laço V3 parece ser o prognóstico de se um dado envelope do HIV-1 media altos níveis de infecção nas células alvo GAG-positivas ou GAG-negativas.

Para determinar especificamente o papel do laço V3 na mediação da infecção dependente de GAG, nós examinamos as propriedades de NL/V3 (ADA/JRFL). Este vírus contém um envelope quimérico que é derivado predominantemente do HXB mas no qual o laço V3 altamente carregado (+9) tem sido substituído pelo ADA, o qual é menos carregado (+3) e idêntico a JRFL na sequência. Os dados estão apresentados na tabela 1. De fato, a resposta de NL/V3 (ADA/JRFL) à presença ou ausência de GAGs na superfície da célula alvo foi similar à de NL/ADA e NL/JRFL, o qual é mais infeccioso em células alvo GAG negativas, mais do que NL/HXB, o qual exibe o fenótipo oposto. (Tabela 1). Assim, enquanto os efeitos de GAG na infecção por HIV-1 são independentes da seletividade do co-receptor, o laço V3 de gp120 é um determinante principal de ambas as propriedades.

TABELA 1 (REPRODUÇÃO):

O laço V3 é o principal determinante viral dos efeitos na infecão do HIV-1 mediados por GAGs na superfície celular

Títulos (padrão de concentração)de infecção (FFU/ml)a (proporção b)


CHO-K1:

(5,3 + 1,1) x 106 - HXB
(8,2 + 0,4) x 105 - ADA
(1,6 + 0,4) x 106 - JRFL
(2,8 + 0,6) x 106 - V3 (ADA/JRFL)c

pgsA745:

(5,6 + 0,5) x 105 (9,5 ) -HXB
(4,2 + 0,6) x 106 (0,19) -ADA
(6,8 + 0,7) x 106 (0,24) -JRFL
(7,3 +106) x 106 (0,38) - V3 (ADA/JRFL)c

a: Títulos infecciosos de viroses derivadas de NL4-3 contendo os genes de envelope indicados foram medidos por uso de células alvo derivadas de CHO-K1 e pgsA745, e os focos de infecção foram enumerados após a imunofluorescência como descrito no sub-título (não traduzido) Materiais e Métodos. FFU= unidade de formação de foco.

b: Título em células alvo derivadas de CHO-K1/título em células alvo derivadas de pgsA745.

c: V3 (ADA/JRFL) é um envelope quimérico contendo sequências do laço V3 de ADA/JRFL numa experiência em HXB.