O ENVOLVIMENTO DE FcyRI (CD64) NO MECANISMO DE INIBIÇÃO DO HIV-1 EM MACRÓFAGOS DERIVADOS DE MONÓCITOS PELA IgG POLICLONAL PURIFICADA DE PACIENTES INFECTADOS .

Vincent Holl, Stéphane Hemmerter, Renaud Burrer, Sylvie Schmidt, Alain Bohbot, Anne-Marie Aubertin, e Christiane Moog.

Resumo:

O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo da neutralização do HIV-1 usando macrófagos derivados de monócitos (MDM) em comparação com células PBMC (células precursoras da medula óssea) como células alvo (obs.: alvo do HIV-1, e consequentemente do anticorpo IgG). Neste propósito, nós analisamos as atividades neutralizantes de diferentes amostras de IgG policlonais humanas purificadas do soro de indivíduos infectados por HIV-1 usando um ensaio de infecção de um único ciclo. Nós encontramos um aumento do título neutralizante quando macrófagos foram usados versus PBMC (células mononucleares do sangue periférico) como células alvo. Além disso, as IgG policlonais de pacientes infectados com HIV-1 que não são capazes de neutralizar o vírus quando as PBMC são usadas como células alvo inibiram fortemente a infecção em macrófagos derivados de monócitos (MDM). Resultados similares foram obtidos com mAbs (anticorpos monoclonais) neutralizantes. Para explorar a participação dos FcyRs (receptores de Fc gama) na inibição do HIV-1, as F(ab’)2 e Fab (FAB é a porção Ig do anticorpo que tem uma cadeia pesada e outra leve) dessas Igs foram produzidas. Os resultados indicaram que ambas a F(ab’)2 e Fab foram menos efetivas para inibir a replicação do vírus em MDM. Além disso, experimentos de competição com fragmentos Fc de IgG de doadores saudáveis ou com Ab (anticorpo) monoclonais anti-FcyRs purificados tonificaram (reforçaram) a participação dos Receptores de Fc gama, e em particular do FcyRI (CD64) na inibição do HIV-1 em macrófagos derivados de monócitos. Mecanismos pelo qual a IgG específica ao HIV inibe a replicação viral em macrófagos cultivados estão propostos e o benefício da indução de tais anticorpos por vacinação é discutido.

Texto:

Não obstante a melhora clínica associada com as múltiplas terapias anti-retrovirais altamente ativas (HAART), os agentes anti-virais atuais não são capazes de erradicar o HIV-1 devido à persistência de reservatórios virais latentes. Santuários virais constituem em células permissivas ao HIV-1 persistente com potencial para vida longa que não podem ser suprimidas pela HAART. Alguns desses reservatórios do HIV-1 identificados são linfócitos TCD4+ de memória em descanso (quiescentes), monócitos do sangue periférico, macrófagos e células dendríticas. Monócitos e macrófagos derivados de monócitos (MDM) constituem a população celular onde o vírus replicativo é quase exclusivamente detectado após a HAART. Estas células são de particular importância na patogênese do HIV-1 e seu papel na enfermidade da AIDS é em documentado. Os macrófagos são uma origem produtiva do HIV-1. Uma vez infectados, eles são capazes de produzir grande quantidade de HIV-1 intracelular e extracelular sem necessariamente sucumbirem aos efeitos citopáticos da infecção viral produtiva. Essas células primárias também contribuem para a persistência viral nos tecidos e para a disseminação a despeito da vigilância imune. Macrófagos infectados com HIV-1 têm sido enunciados por serem “cavalos de tróia” para a disseminação de partículas infecciosas. A infecção dos macrófagos pelo HIV-1 também pode persistir no tecido por extensos períodos de tempo (meses) com grande número de partículas infecciosas contidas dentro dos vacúolos intra-citoplasmáticos. Eles têm sido implicados nos primeiros estágios da enfermidade por atuarem num papel importante na transmissão inicial do HIV-1, na distribuição do vírus e transmissão de célula para célula nos tecidos linfóides assim como nos estágios avançados da doença causando danos no cérebro. A neutralização por anticorpos e/ou a inibição da infecção por HIV-1 nesses fagócitos mononucleares primários pode bloquear potencialmente ou ao menos reduzir a replicação e disseminação do HIV-1.

Estudos prévios têm mostrado que, quando os macrófagos são usados como células alvo no lugar dos (em vez de) linfócitos autólogos do sangue, uma eficiência aumentada, de no mínimo 100 vezes, do título de neutralização foi observada para o plasma ou soro de macacos infectados com SIV ou pacientes infectados com HIV. Ruppach e outros têm observado atividades neutralizantes autólogas em macrófagos humanos primários mas não em linfócitos quando analisa soro de indivíduos recém infectados (menos de 12 meses após a soro-conversão). Como o título de neutrallização mensurado pode variar consideravelmente de acordo com condições de cultura experimental usadas e é dependente do nível de replicação e produção viral, nós reavaliamos a variação do título de neutralização usando um novo ensaio de neutralização baseado em um único ciclo de infecção em macrófagos, similar àquele recentemente desenvolvido para PBMC. Nós mostramos uma atividade neutralizante de IgG purificada de indivíduos HIV-soropositivos tardios consideravelmente mais alta quando os macrófagos foram usados como células alvo. O papel dos FcyR na superfície de macrófagos humanos primários na fagocitose e na remoção de complexos imunes de IgG do vírus foi investigado.

Materiais e Métodos (não traduzido aqui).

Resultados:

Padrões de concentração (títulos) de Neutralização de IgG Policlonal e Monoclonal usando PBMC e MDM primários como Células Alvo.

Primeiro nós detectamos quais sub-conjuntos de células são infectados “n vitro” após um ciclo de infecção quando as PBMC e MDM são usadas como células alvo. A principal população de células detectada como positiva para coloração p24 foram células TCD4+CD45RO+ e macrófagos diferenciados, 24 horas após a infecção de PBMC e MDM, respectivamente (dados não mostrados). Como essas células representam as principais células infectadas “in vivo”, nós usamos adicionalmente as PBMC e os MDM em nossos protocolos de neutralização. Usando um ensaio de neutralização de único ciclo, nós comparamos o título de neutralização de amostras de IgG policlonal obtidas de um grupo francês de pacientes bem estudados infectados com o HIV quando as PBMC ou MDM foram usadas como células alvo. Como mostrado na figura 1, a amostra no 8 de IgG policlonal é capaz de inibir a replicação do HIV em ambos os linfócitos e macrófagos do sangue periférico infectados por HIV após uma única rodada de infecção. Entretanto, a concentração de Ab necessária para reduzir a proporção de células p24 Ag-positivas para 0,4% é muito mais alta quando as PBMC são usadas como células alvo para o HIV.

Quando as PBMC foram usadas como células alvo do HIV, amostras purificadas de IgG apresentaram títulos de neutralização similares tanto se múltiplas rodadas padronizadas de infecção ou um ciclo de infecção fossem usados. Diferentes espectros (luminosidades) de neutralização puderam ser identificados (sumarizados na legenda da tabela 1). Nós não conseguimos detectar a atividade neuralizante nas amostras 2, 3 e ii contra o vírus Bx08, embora essas amostras contivessem altos níveis de partículas virais ligando-se a IgG. Duas dessas amostras de IgG, nos 22 e 12, foram capazes de inibir a replicação do vírus BaL com baixos títulos de neutralização de 1/15 e 1/12, respectivamente. As outras amostras de IgG testadas aqui podem ser divididas em dois grupos diferentes de IgG neutralizante: um grupo compreendendo as amostras nos 8 e 44 que neutralizaram eficientemente ambas as viroses Bx08 e BaL, e o outro grupo, com um título de neutralização médio, abrangendo as amostras de IgG remanescentes.

Quando os MDM foram usados como células alvo do HIV, nós encontramos um drástico aumento do título de neutralização dessas amostras de IgG contra ambos os isolados primários do HIV-1 BaL e Bx08. Como retratado na Tabela 1, títulos de neutralização das diferentes IgGs purificadas aumentam de 100 para 2000 vezes quando os macrófagos foram usados como células alvo do HIV. Além disso, as IgGs policlonais, que não foram achadas neutralizando viroses em PBMCs, inibiram fortemente a replicação em MDMs. Por exemplo, a amostra de IgG purificada de no 11 tem alto título de neutralização (fator de diluição 1/2000) em MDMs infectados com HIV enquanto esta amostra não teve atividade neutralizante detectável quando as PBMCs foram usadas como células alvo. Quando as PBMC e MDM foran obtidas do mesmo doador, nós também detectamos um título de neutralização mais alto em MDM infectadas com HIV (tabela II), indicando que a diferença na atividade neutralizante pode não estar atribuída à diferença na suscetiblidade das células doadas. Quando avaliada a neutralização do HIV em múltiplas rodadas de infecção (Tabela 1), a atividade inibitória de IgG está suplementarmente aumentada em comparação com ensaios de um único ciclo de infecção em MDM. Esse aumentado título de neutralização não foi evidenciado quando as PMC foram usadas como células alvo (tabela 1).

Nós também comparamos os títulos de neutralização de três anticorpos monoclonais, a IgG1b12, AE10 e 2F5, descritos por exibirem ampla atividade neutralizante cruzada quando as PBMC são usadas como células alvo. Nas PBMCs, as concentrações neutralizantes de mAbs eram similares tanto se nós usássemos um ensaio de múltiplas rodadas de infecção que mensurava o título viral ou um ensaio de única rodada de infecção que quantificava a produção intracelular de p24. Quando as MDM foram usadas como células alvo, nós detectamos de novo um drástico aumento da atividade neutralizante dos mAbs. É notável que para 2F5, o qual reconheceu um epítipo conservado em gp41, a concentraão de mAb capaz de inibir 90% das células infectadas é de 4000 a 12.000 vezes mais baixa nos MDMs versus PBMCs, a concentração neutralizante do mAb IgG1b12 direcionado contra o sítio de ligação de gp120 a CD4 é somente de 10 a 25 vezes mais baixa nos MDM. IgGs purificadas do soro de indivíduos soronegativos foram incluídas como HIV-negativos de controle e não tiveram nenhuma atividade neutralizante. Assim, uma atividade neutralizante mais alta é observada para ambas a IgG policlonal e o mAbs quando os MDMs ao invés das PBMCs são usados. Experimentos adicionais foram designados para investigar os mecanismos pelos quais IgGs policlonais e monoclonais neutralizam o HIV mais eficientemente quando os MDMs são usados como células alvo.

A Atividade Neutralizante dos Fab ou F(ab’)2 Correspondentes de IgG e IgA Policlonais Purificadas de Pacientes Infectados pelo HIV


Como os MDM têm a capacidade de inibir os complexos vírus-IgG por via do receptor de Fcy (receptor do framento Fc gama) presentes na superfície dos macrófagos, nós avaliamos a capacidade de Fab e F(ab’)2 obtidas de amostras de IgG policlonais para neutralizar a replicação do HIV-1 primário isolado nessas células primárias humanas. As concentrações de IgG policlonal ou F(ab’)2 ou Fab correspondentes requerida para inibir 90% das células infectadas após uma única rodada de infecção em MDMs versus PBMCs estão apresentadas na tabela III. A IgG inibe a replicação do HIV em MDM com muito mais eficiência do que seus correspondentes F(ab’)2 ou Fab numa concentração para mais de 100 vezes mais baixa do que estas IgGs policlonais são capazes de diminuir o número de células infectadas em 90% (fig.2 e tabela III). Entretanto, esses fragmentos têm atividades neutralizantes similares a IgG quando as PBMCs são usadas num ensaio de única rodada de neutralização (tabela III), e uma curva similar na atividade de resposta de dose é observada para F(ab’)2, Fab, e a IgG completa em PBMCs infectadas por HIV(fig.3). É notável que a concentração neutralizante de F(ab’)2 ou Fab é comparável em PBMCs e MDMs. A atividade neutralizante mais baixa observada para F(ab’)2 ou Fab, comparada com a IgG completa, em MDM infectado por HIV sugere fortemente a participação da porção Fc da IgG na inibição do HIV-1 nos MDMs. Diferentes grupos têm mostrado o potente papel da IgA na neutralização do HIV-1. Dessa forma, nós mensuramos a atividade neutralizante da IgA policlonal nos MDMs, previamente descritas por inibirem a replicação do HIV-1 nas PBMCs. Nenhuma significativa diferença no título de neutralização de três IgAs policlonais purificadas de pacientes infectados por HIV foi encontrada tanto se os experimentos de neutralização fossem desempenhados nos MDMs quanto nas PBMCs (tabela III). Além disso, as F(ab’)2 de IgA no 8 exibem título de neutralização similar ao do correspondente total de IgA. Assim, contrariamente às amostras de IgG, nós não pudemos detectar um efeito inibitório aumentado de IgA quando os MDMs foram usados como células alvo. Esses resultados mostram que a atividade inibitória aumentada observada para essas IgGs está relacionada com a parte Fc gama da IgG policlonal que pode atuar num papel de remoção do vírus, mas não relacionada às partículas virais ligadas às F(ab’)2 ou Fab ou partículas virais ligadas a IgA. [Obs.: Fragmento Fab é a parte da Ig que tem uma cadeia leve e outra pesada que se ligam ao antígeno. A porção Fc ligada à Fab é quem se liga ao receptor celular.]


A Participação d FcyR (receptor de Fc gama) na Inibição do HIV-1 nos MDMs.


Num esforço para determinar a implicação do FcyR na remoção de imunocomplexos IgG-HIV, nós desempenhamos experimentos de competição de anticorpos (Ab) entre as IgGs de indivíduos infectados com HIV-1 e IgG ou fragmentos Fc gama de IgG policlonais purificadas do soro de doadores HIV-negativos. A incubação de IgG humana normal ou seus fragmentos Fcy com os MDMs permitiu diminuir consideravelmente as atividades inibitórias de IgGs policlonais de indivíduos HIV positivos. Similarmente, a competição de anticorpos ou de fragmentos Fcy de IgGs de doadores não infectados por HIV com o anticorpo monoclonal 2F5 diminuiu marcadamente a atividade inibitória destes anticorpos monoclonais (mAb) de modo dependente da concentração, como mostrado na figura 3.C. Resultados similares foram obtidos quando FcyRs em MDMs foram saturados com IgG humana de doadores HIV-negativos, 10 minutos antes da adição de imunocomplexos ou quando os experimentos de competição foram desempenhados usando-se múltiplas rodadas de infecção (dados não mostrados). Em contraste, a incubação de PBMCs com IgG purificada de indivíduos não infectados por HIV não afetou a atividade neutralizante de IgG policlonal das amostras de nos 8 e 44. O decréscimo de atividade inibitória observada na presença de IgGs ou seus fragmentos Fc sugere que os FcyRs contribuem numa porção principal para essa atividade inibitória registrada. Para avaliar qual tipo de FcyR está implicado neste mecanismo, experimentos de competição de Ab com diferentes IgGs monoclonais purificadas contra os específicos receptores de fragmento Fc gama humanos FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), ou FcyRIII(CD16) foram adicionados ao vírus e aos anticorpos antes da incubação com os MDMs. Como registrado na Figura 4, os anticorpos monoclonais anti-CD64 humana purificados diminuíram a atividade inibitória do HIV das IgGs policlonais das amostras nos 8 ou 11 (Fig 4, A e B) e do anticorpo monoclonal 2F5 (fig. 4.C), enquanto ambos os mAbs (anticorpos monoclonais) anti-CD16 e anti-CD32 humanas purificadas não tiveram efeito na atividade inibitória das IgGs monoclonais ou policlonais testadas. Esses dados demonstraram a participação específica do FcyRI humano ou de CD64 na inibição da replicação do HIV-1 nos MDMs.

Não Há Correlação Entre a Inibição Viral e a Produção Inicial da Quimiocina.

Os MDMs são infectados principalmente através do receptor de quimiocina CCR5, altamente expressado nessas células. Vários estudos têm mostrado que a regulação da expressão de CCR5 para menos ou a ligação por quimiocinas CC nos MDM está associada à redução da entrada e replicação do vírus R5. Quimiocinas tais como MIP-1α, RANTES e MIP-1β são ligantes naturais do receptor CCR5, e são bem identificadas como inibidores da linhagem do HIVR5. Para excluir que essas quimiocinas pudessem contribuir para a inibição do vírus, nós temos mensurado a produção de MIP-1α, β e RANTES nos primeiros sobrenadantes, 2 e 6 oras após a infecção em paralelo com os experimentos de competição de Ab (anticorpos) (tabela IV). RANTES, MIP-1α e MIP-1β foram detectados tão cedo quanto duas horas após a infecção e o aumento de aproximadamente 3 vezes na produção dessas quimiocinas foi medido 6 horas após a infecção (Tabela IV). Nas condições de nossas culturas, a quantidade de quimiocinas induzida foi similar quando as células infectadas foram tratadas com anticorpos monoclonais 2F5 ou amostras de IgG policlonal no 8 na presença ou ausência da porção Fc de IgG de doadores HIV-negativos. Assim, a produção das quimiocinas detectadas logo após a infecção não está correlacionada com a inibição do HIV observada às 24 horas (tabela III).

CONT.
O ENVOLVIMENTO DE FcyRI (CD64) NO MECANISMO DE INIBIÇÃO DO HIV-1 EM MACRÓFAGOS DERIVADOS DE MONÓCITOS PELA IgG POLICLONAL PURIFICADA DE PACIENTES INFECTADOS .


Discussão:


Estes experimentos foram designados para analisar os mecanismos de inibição da replicação do HIV pela IgG humana monoclonal ou policlonal nos MDMs 24 horas após a infecção. Neste propósito, nós compomos/geramos um ensaio de único ciclo de infecção usando tanto o MDM quanto a PBMC como alvo do HIV. Nós encontramos a neutralização de isolados primários do HIV-1 por amostras de IgG monoclonal e IgG policlonal purificadas de indivíduos infectados com o HIV-1 consideravelmente mais alta quando os MDMs, no lugar das PBMCs, foram usados. Além disso, amostras de IgG purificadas, as quais não exibiam potente atividade neutralizante em PBMCs infectadas pelo HIV, exibiram potente atividade neutralizante em MDMs. Zhuge e outros e Ruppach e outros noticiaram previamente resultados mostrando neutralização mais alta de SIV ou HIV quando os MDMs foram usados como células alvo ao invés de PBMCs em ensaios de neutralização de múltiplas rodadas. Ruppach e outros analisaram neutralizações autólogas de vírus isolados logo após a infecção por seus soros correspondentes e o procedimento experimental para neutralização usando ambos PBMC ou MDM não foi estritamente idêntico. Como nós encontramos um aumento comparável na neutralização da infecção em macrófagos usando a IgG policlonal de indivíduos infectados por longo período, nós demonstramos que esse aumento da atividade neutralizante não está restrito às IgGs autólogas iniciais. Além disso, nós usamos um ensaio de único ciclo de neutralização com condições de experimentação idênticas para ambos a PBMC e o MDM. Considerando uma única rodada de infecção, um aumento eventual da neutralização devido à baixa produção de vírus nos macrófagos humanos primários está minimizada. De fato, nós efetivamente observamos um título de neutralização mais alto das amostras de IgG nos ensaios de replicação do HIV em múltiplas rodadas comparados com os ensaios de neutralização de um único ciclo, quando os MDMs foram usados como células alvo.

A atividade inibidora mais alta não é somente devida a implicações de uma sub-população de anticorpos presente na amostra de IgG policlonal direcionada a epítopos especificamente envolvidos na inibição da replicação do HIV nos MDMs como os mAbs IgG1b12, 4E10 e 2F5 que também neutralizaram mais eficientemente os isolados primários do HIV nestas células. Estes mAbs têm sido descritos por exibirem ampla atividade de neutralização cruzada contra um amplo raio de ação de isolados primários do HIV-1 em ensaios “in vitro” envolvendo as PBMCs como células alvo. Stamatatos e outros já descreveram um aumento similar a 10 vezes na inibição da infecção em MDMs por mAb IgG1b12. Este último grupo propôs que este título de neutralização medido mais alto deve resultar da expressão mais baixa de sítios alvo CD4 nos MDM. De fato, os MDM expressam menos moléculas CD4 do que as PBMCs e assim, menos IgG1b12 devem ser necessárias para bloquear a interação dos vírions com os receptores CD4 presentes nestas células. Entretanto, nós encontramos que o bloqueio da interação do vírus com a CD4 por CD4 solúvel foi tão eficiente quanto foram usadas PBMCs ou MDMs, sugerindo que a aumentada atividade neutralizante nos MDMs não é simplesmente a conseqüência da expressão mais baixa de CD4 nessas células humanas primárias. Nós observamos um aumento mais alto na atividade de neutralização (maior que 300 vezes) para ambos os mABs 2F5 e 4E10 do que para IgG1b12; isso pode sugerir que o epítopo conservado em gp41 é mais relevante do que o epítopo do sítio de ligação de CD4 para a neutralização da infecção em MDMs ou que a atividade pode ser modulada por diferenças em suas estruturas. Como o epítopo em gp41 não é muito acessível na partícula viral nativa, nós podemos enfatizar suplementarmente que a ligação do Abs às partículas virais não está correlacionada com a neutralização na infecção do macrófago. Tal discordância entre a ligação e a neutralização foi previamente noticiada para outros mAbs por Stamatatos e outros. As amostras de IgG policlonal purificadas de pacientes infectados por HIV usadas neste estudo foram todas capazes de capturar eficientemente os dois isolados do HIV primários usados para a determinação do título de neutrallização. Entretanto, a eficiência das amostras de IgG purificadas na captura do vírus não foi correlacionada aos títulos de neutralização obtidos quando tanto PBMCs ou MDMs foram usadas como células alvo.

Como a IgA tem sido apresentada por exibir atividade neutralizante do HIV, nós avaliamos a capacidade de algumas IgA purificadas do soro de pacientes infectados por HIV neutralizarem isolados primários quando as células alvo usadas foram as PBMC e as MDM. Contrariamente à IgG, nós não observamos uma neutralização aumentada do HIV em MDM por IgA policlonal, indicando que esse aumento do título de neutralização observado em MDM é específico para IgG.

Contrariando notícias prévias, quando ao MDMs foram usados como células alvo, a atividade neutralizante de Fab ou F(ab’)2 das IgG policlonais foi reduzida à atividade inibitória detectada quando as PBMCs são as células alvo do HIV em ensaios de neutralização.

As duas primeiras reportagens analisando a neutralização da infecção de macrófagos encontraram que o Fab tem uma atividade inibitória similar a seu correspondente IgG total (o anticorpo todo). Tais discrepâncias entre esses resultados prévios e nossos achados não puderam ser atribuídos à degradação, diluição ou perda de material resultante de tratamento enzimático de novas preparações de Fab ou F(ab’)2 pois esses fragmentos conservaram sua potência de neutralização quando as PBMCs foram usadas como células alvo do HIV. A discrepância também não pode estar relacionada ao tipo de ensaio usado, pois nós também detectamos uma grande diferença na atividade inibitória entre a IgG total e o Fab ou F(ab’)2 em ensaios de múltiplas rodadas, similar ao ensaio usado por Zhuge e outros ou Ruppach e outros (dados não mostrados). A diferença pode estar relacionada às amostras policlonais usadas. Ruppach e outros têm avaliado a capacidade neutralizante do soro e uma amostra de IgG purificada de indivíduos recentemente infectados (poucos meses após a soroconversão); Zhuge e outros usaram soro e duas amostras de IgG purificada obtidas de macacos, 6 meses após a inoculação com SIV enquanto nossas amostras de IgG foram obtidas de indivíduos assintomáticos coletadas após uma infecção com duração média de sete anos. É notável que Ruppach e outros tenham regulado as quantidades de IgG correspondendo a 10% estimadas no soro dos pacientes por SDS-PAGE. Nas nossas condições experimentais de neutralização, nossos Fab ou F(ab’)2 também são capazes de inibir completamente a replicação do HIV nos MDMs quando usados em altas concentrações (correspondendo a 10% das IgG no soro). Entretanto as nossas IgG policlonais tem atividade inibitória para o HIV mais de 100 vezes mais alta do que o Fab ou F(ab’)2, pois aproximadamente 2µg/ml de IgG purificada é o suficiente para reduzir perto de 90% o número de células MDMs infectadas. Todavia, essa observação não se aplica para os resultados publicados por Zhuge e outros que acharam a concentração de 1μg/ml de Fab tendo atividade inibitória similar à IgG completa do soro de macacos infectados com SIV.

Experimentos de competição efetivados entre fragmentos Fc de IgG de doadores não infectados com HIV e amostras de IgG policlonal de indivíduos infectados com HIV validaram ainda mais a participação dos domínios Fc de IgG na forte inibição observada quando as MDM são usadas como células alvo do HIV. Além disso, nós demonstramos que essa inibição do HV-1 nos MDM por IgG policlonal e monoclonal envolvem principalmente a participação do FcyRI (ou CD64). O FcyRI é largamente expressado (> 90%) na superfície celular dos macrófagos e têm alta afinidade para IgG. Esses FcyRs estão implicados na degradação do vírus por fagocitose ou na lise de macrófagos infectados por citotoxidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Ambos os mecanismos TAM sido largamente descritos por representarem a destruição dos vírus nessas células. Macrófagos e outras células fagocíticas (neutrófilos, monócitos e células dendríticas) estão no encargo da rápida degradação do vírus, as quais uma vez opsonizadas por IgG podem ligar-se em cruzamento com os FcyRs na superfície celular de outra célula efetora e sofrerem fagocitose. Para ADCC, o anticorpo fixado por via de FcyRs na superfície dos MDM reconhece uma célula infectada, a qual expressa o Ag (antígeno) viral em suas membranas de superfície, e media a lise dessa última célula. Além disso, a citotoxidade dependente de complemento ativada através da ligação de C1q ao domínio Fc de IgG ou IgM, complexado com Ags , também explica a lise de células infectadas.

Como nossas IgGs purificadas não contém complemento, nós podemos excluir a citotoxidade dependente do complemento como um possível mecanismo de inibição. O fato de que nós temos sido incapazes de detectar um aumento no número de células submetendo-se à apoptose ou necrose na presença de concentrações de Abs inibitórios após um único ciclo de replicação do HIV (dados não mostrados) não está a favor do mecanismo de ADCC, mas é difícil quantificar um baixo nível de citotoxidade dada a porcentagem muito baixa de células infectadas com o HIV. Além disso, a adição de IgG, três horas após a adição dos vírus nas células, não protege os MDM da infecção por HIV-1 (dados não mostrados) contestando o mecanismo de ADCC nas condições de nossa cultura experimental. Assim, nós propusemos dois mecanismos de inibição do HIV-1 nos MDM: o primeiro consistindo na neutralização de inectividade por anticorpos que reconhecem epítopos específicos do HIV (um mecanismo que é comum para PBMC e MDM e ocorre em amplitudes de concentração similares) e o segundo baseado na inibição do HIV por via do FcyRI envolvido na fagocitose dos complexos IgG-vírus por macrófagos (captura de complexos imunes por FcyRI, internalização por via de vesículas endossômicas, e degradação suplementar do vírus).

Dependendo de seus sub-tipos, a IgG liga-se a FcyR com eficiência variada, assim, diferenças em sua região Fc de IgG podem influenciar na inibição do HIV por endocitose. Entretanto, para os dois anticorpos monoclonais usados, 2F5 e IgG1b12, as regiões Fc eram similares (IgG1ĸ) sugerindo que a diferença na inibição do HIV observada com esses dois anticorpos monoclonais não é devida ao subtipo de IgG.

Os FcyRs também têm sido implicados no aumento da infecção dependente de anticorpos. Trichmann e outros puderam detectar um aumento da produção do vírus em macrófagos primários humanos quando imunocomplexos de HIV formados com certos Abs ligaram-se ao receptor CD16 ou ao FcyRIII. Em nosso estudo, nós não observamos nenhum aumento de infecção de MDM com os anticorpos policlonais e monoclonais testados usando o ensaio de infecção de rodada de ciclo.

Recentemente, Perez-Bercoff e outros propuseram que a estimulação de FcyR pela IgG humana de doadores não infectados com HIV poderia mediar a inibição da replicação do HIV em macrófagos “in vitro” quando revestidas numa placa. Esses autores especularam que a ativação do macrófago através da ligação cruzada a FcyR, sozinha ou em sinergia com outro estímulo tais como lipopolissacarídeos ou citocinas, poderia contribuir para a proteção natural contra a infecção por HIV-1 em alguns indivíduos expostos não infectados por inibição da transmissão viral. Nossos achados estão de acordo com o papel central dos FcyRs presentes na membrana celular dos macrófagos, os quais podem contribuir para a remoção de imunocomplexos HIV-IgG “in vitro”. Em contraste, a ligação cruzada de FcyR em monócitos humanos e MDMs tem sido noticiada por induzir um painel de quimiocinas e citocinas, notavelmente GM-CSF. Quimiocinas, tais como MIP-1α, MIP-1β e RANTES tem sido mostradas por inibir a replicação quando adicionadas durante e após a infecção e poderiam assim contribuir para a supressão da replicação do HIV-1 detectado em nosso ensaio. Por isso nós quantificamos os níveis dessas quimiocinas nos supernadantes de MDMs infectados em paralelo com os experimentos de competição de anticorpos. As quantidades de MIP-1 alfa, MIP-1beta e RANTES detectados nos sobrenadantes de MDM, 2 e 6 horas após a infecção, estavam abaixo da concentração inibitória requerida para inibir a replicação do HIV nestas células e não estavam correlacionadas com a inibição viral observada após uma única rodada de replicação viral. De nota, a secreção de quimiocina registrada 24 horas após a infecção foi da mesma ordem de magnitude daquela medida às 6 horas (nossos resultados não publicados).

Macrófagos representam uma população de leucócitos envolvida na primeira linha de defesa contra muitas infecções, incluindo a infecção por HIV. Através da apresentação de antígenos para células T e da produção de citocinas e quimiocinas, os macrófagos constituem uma ligação importante entre os sistemas imunes adaptativo e inato. Múltiplos estudos incluindo os nossos dados têm sugerido o papel potencial dos macrófagos na inibição do HIV, tanto por fagocitose de imuno-complexos, por mediação de ADCC, ou mesmo através da produção de quimiocinas. Entretanto, embora os anticorpos altamente eficientes em inibir a infecção dos MDMs “in vitro” fossem encontrados no soro de quase todos os indivíduos infectados, o HIV dissemina-se e persiste nestes indivíduos.

A carência de remoção de imunocomplexos HIV-IgG pode ser atribuída à diminuída fagocitose específica por FcyR como descrito em alguns pacientes com AIDS. De fato, após a infecção “in vitro” com HIV-1 BaL, a fagocitose de imuno-complexos mediada tanto por FcyR e receptores de complemento está diminuída nos MDMs humanos infectados. Estes autores têm mostrado que a infecção dos macrófagos por HIV não afeta a expressão de superfície nem de FcyR nem do principal receptor de complemento, mas nos macrófagos infectados com HIV a transdução de sinal é diminuída e a remoção de alvos opsonizados por IgG por via de FcyR está alterada. Assim a IgG humana presente na maioria dos indivíduos infectados por HIV são capazes de ligar-se a partículas do HIV e formar complexos imunes, mas a fagocitose está diminuída nos macrófagos infectados.

Não somente os complexos IgG-vírus puderam ser ineficientes para inibir a replicação do HIV “in vivo”, a ligação de IgG ao vírus pode mesmo favorecer sua persistência quando apanhados por células dendríticas foliculares. De fato, um estudo recente tem mostrado que a manutenção da ótima infectividade do HIV requer tanto anticorpos contra determinantes associados a partículas quanto contra FDC-FcyR. Em adição à fagocitose diminuída e à captura do vírus pelas células dendríticas, o escape imune, a infecção dependente de anticorpo e mediada pelo complemento nos MDM podem contribuir para a falência de anticorpos neutralizantes no controle do HIV.

Todavia, antes da infecção ser estabelecida e células dendríticas foliculares estarem ricas em HIV e numerosos macrófagos infectados, alguém pode esperar que tais anticorpos, os quais eficientemente inibiram o HIV quando os MDMs foram usados como células alvo, poderiam participar na redução da carga viral no plasma na fase inicial assintomática.

A transmissão passiva de HIVIG (IgG policlonal derivada do plasma de múltiplos HIV de doadores positivos) exclusivamente em macacos, 24 horas antes do desafio com o vírus SHIV89.6PD, reduziu o declínio da contagem de células TCD4+ e preveniu a AIDS clínica durante 14 semanas de observação. Neste trabalho, um declínio na carga viral do plasma foi observado a despeito do HIVIG não estar sendo muito eficiente na neutralização da infecção em PBMC. Como nós não sabemos se o HIVIG é capaz de inibir SHIV89.6PD quando os MDM são usados como células alvo, nós não podemos concluir se este declínio (quando usaram-se as PBMC) poderia ser atribuído à remoção do vírus por macrófagos. Em outro estudo de transferência passiva, Binley e outros infundiram anticorpos coletados de macacos infectados com SIVmac251 em outros macacos infectados que tinham uma resposta negligente de anticorpos. Esses anticorpos não foram capazes de neutralizar a infecção nas PBMC mas certamente formaram complexos imunes pois eles ligaram-se às partículas virais. A transferência de tais anticorpos resultou em decréscimo de 3 vezes na carga de RNA no plasma concomitante a um similar surgimento de surpresa de RNA viral associado a células dentro de 2 horas após a infusão. A inibição é entretanto somente transitória. Esses autores concluíram a partir da cinética da inibição que o decréscimo do vírus observado está inconsistente com a neutralização de novos ciclos de infecção ou com o mecanismo de remoção dos imuno-complexos e que a melhor explicação aceitável é que os anticorpos infundidos mataram células infectadas por SIV por via de um mecanismo efetor como ADCC.

Estudos adicionais poderiam ser desempenhados para esclarecer as implicações clínicas dos Abs capazes de inibir a replicação do HIV in vitro quando os macrófagos são células alvo, como, por exemplo, as análises de neutralização de vírus autólogos isolados pelas correspondentes amostras de IgG nos sujeitos apropriados (i.e. não progressores de longo tempo versus rápidos progressores). Se tais anticorpos atuam num papel “in vivo” na proteção contra a infecção, eles também devem ser um dos componentes a serem induzidos por vacinação, e presentes no sítio de infecção para permitir a primeira e eficiente remoção do HIV-1 por macrófagos. Como tais Abs são detectados em níveis muito mais altos após a infecção do que Abs neutralizando a infecção nas PBMC, alguém pode especular que sua indução por vacinação também deveria ser alcançada mais facilmente.

Fonte: http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/173/10/6274

EFEITOS DOS GLICOSAMINOGLICANOS NA LIGAÇÃO E INFECÇÃO DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA DE TIPO I INDEPENDENTES DA CICLOFILINA E DEPENDENTES DO ENVELOPE.

YI-jun Zang, Theodora Hatziioannou, Trinity Zang, Douglas Braaten, Jeremy Luban, Stephen P. Goff, e Paul D. Bieniasz

Referência: PMID: 12021366

RESUMO

Os glicosaminoglicanos (GAGs) de superfície celular, em particular o sulfato de heparan (HS), têm sido sugeridos como mediadores da ligação do vírus da imunodeficiência humana de tipo I (HIV-1) a células alvo antes da entrada do vírus, e ambas a proteína viral gp120 e a ciclofilina A (CypA) associada ao vírion têm sido mostradas por interagiram diretamente com o sulfato de heparan e seus análogos. Para determinar o papel das GAGs na ligação e infecção por HIV, nós geramos células de linhagem CHO (células de ovário de hamster chinês) suscetíveis ao HIV que tanto expressavam altos níveis de GAGs (CHO-KI) ou a falta de GAGs (pgsA745). Usando um painel de envelopes do HIV, nós achamos que os efeitos mediados por GAGs na superfície celular na ligação e infecção do vírion varia na dependência do tipo de envelope mas de modo independente do co-receptor. De fato, a infecção mediada por GAG na superfíce celular está confinada a isolados que contém a sequência do laço V3 (de gp120) altamente carregadas positivamente, enquanto a infecção pela maioria dos tipos é aparentemente inibida na presença dos GAGs. Além disso, os efeitos de aumento e inibição de policátions e poliânions na infecção por HIV-1 são amplamente dependentes da presença de GAGs de superfície celular. Essas observações são consistentes com um modelo no qual as GAGs infuenciam a infecção primária do HIV-1 “in-vitro” por modificação das características de carga das superfícies das células alvo. Finalmente, os efeitos das GAGs na infecção por HIV-1 são observados em extensão equivalente enquanto a CypA está presente ou ausente dos vírions. Em geral, esses dados excluem um papel principal para as GAGs na mediação do acesso dos muitos tipos de HIV-1 a células alvo por via das interações de gp120 ou CypA associadas ao vírion.

INTRODUÇÃO

O sulfato de Heparan (HS) e o sulfato de chrondroitina (CS) são carboidratos amplamente expressados, chamados glicosaminoglicanos (GAGs), que existem na superfície das células, ligados covalentemente ao cerne de proteínas associadas à membrana. Desses, o sulfato de heparan, em particular, tem sido apresentado por ser um importante fator de acesso para um número de protozoários, bactérias e patógenos virais. Em contraste, o papel do HS na ligação do vírus da imunodeficiência humana à superfície celular das células alvo tem sido algo controvertido. Enquanto está claro que a expressão de CD4 e um receptor de quimiocina apropriado é necessário para a infecção eficiente do HIV-1, é menos evidente se outras moléculas de superfície celular, incluindo o HS, devam constituir sítios de ligação inicial na célula alvo. Essas interações puderam, com efeito, servir para concentrar os vírions na superfície da célula alvo antes do casamento específico de gp120/CD4/co-receptor e dessa forma facilitar a entrada do vírus. De fato, a ligação dos vírions à superfície celular das células alvo parece ser uma etapa de limitação da taxa de entrada do HIV-1. A evidência de que o HS atua num papel importante no acesso e infecção por HIV-1 inclui a observação de que a heparina (um análogo de sulfato de heparan) e um número de outros polissacarídeos sulfatados inibem potencialmente a infecção por HIV-1. Em adição, a remoção enzimática do sulfato de heparan da superfície de ambas as linhagens de células HeLa-CD4 ou células T podem atenuar dramaticamente ambas a ligação e a replicação do HIV-1. Este último efeito parece ser ao menos um tanto específico, em que a remoção enzimática de sulfato de chrondroitina (CS) das superfícies celulares alvo não afeta a infecção por HIV-1. Esses achados são consistentes com a hipótese de que o contato inicial entre o vírium do HIV-1 e sua célula alvo é mediado por sulfato de heparina. Vários componentes do vírion, incluindo a terceira região hiper-variável de gp120 (o laço V3) assim como seu domínio básico conservado de interação com o co-receptor, e elementos da glicoproteína transmembrana do envelope gp41, têm sido também noticiados por servirem como sítios de interação com heparina, HS e/ou outros polissacarídeos sulfatados. Intrigantemente, um estudo recente indicou um papel para ciclofilina A (CypA) na mediação da ligação do HIV-1. Está bem estabelecido que CypA é incorporada dentro de partículas do HIV-1 durante a reunião por via da interação específica com o domínio CA de Pr55 GAG. Além disso, a atenuação genética ou farmacológica dessa interação abole a incorporação de CypA e reduz a infectividade dos vírions descendentes em um estágio anterior à transcrição reversa. Um mecanismo potencial que pode contabilizar o efeito positivo da infectividade do HIV-1 com CypA foi proposto recentemente. Especificamente, a proporção de partículas de HIV associadas com CypA é aparentemente exposta na superfície dos vírions e foi apresentada por mediar interações independentes do envelope com HS na superfície de células alvo por via de resíduos de aminoácidos básicos situados no terminal C de Cypa.

Em contraste com os estudos mencionados afora que proporcionam clara evidência em favor de um papel positivo dos Sulfatos de Heparan na superfície das células na ligação do HIV-1 e subseqüente infecção, outros investigadores têm mostrado que a remoção enzimática do sulfato de heparan da superfície celular de linfócitos primários não teve efeito em sua capacidade de manter a replicação do HIV-1. Em adição, alguns estudos têm mostrado marcadas diferenças dependentes da linhagem no grau em que o envelope do HIV-1 pode ligar-se a HS (sulfato de heparan) e outros polissacarídeos sulfatados e para os quais a ligação do vírion dependente do envelope a células alvo exibe um requisito para o Sulfato de Heparan na superfície celular, embora o número de isolados (HIV-1) examinados até agora seja limitado.

Para resolver esta questão, nós exploramos um derivativo da linha celular CHO-K1, chamado pgsA745, que foi selecionado com base na ausência de síntese de GAGs, seguindo a mutagênese química. Essa linha celular foi considerada por ser deficiente em xylosyltransferase, uma atividade que é essencial para a adição de sulfato de heparan e polímeros CS (sulfato de crondroitina) nos cernes protéicos sindecano e glipicano. Assim, a célula pgsA745 carece dos glicosaminoglicanos de sulfato de heparan e sulfato de crondroitina detectáveis na superfície, e como tal, constituem um reagente ideal para testar o papel dessas moléculas na entrada do HIV-1. Em meio a um painel de envelopes do HIV-1, nós encontramos marcadas diferenças dependentes da linhagem na preferência ou, de outra forma, na presença de GAGs na superfície celular, durante a fixação do e infecção por HIV-1. Estes fenótipos são similarmente determinados pela carga do envelope, já que o aumento da infecção dependente de GAG é observado somente nas linhagens de HIV-1 que codificam uma sequência do laço V3 de gp120 altamente básica. Esses efeitos dos glicosaminoglicanos de superfície celular dependentes da linhagem e em oposição na infecção por HIV-1 são independentes de qual co-receptor é utilizado e são observados em ambas a presença ou ausência de CypA dentro da partícula viral.

[MATERIAIS E MÉTODOS: TEXTO NÃO REPRODUZIDO AQUI.]




RESULTADOS


1-As linhagens celulares positiva e negativa para GAG suscetíveis ao HIV-1.


Para examinar o papel das GAGs na fixação do HIV-1 e infecção, derivativos das linhas celulares CHO-K1 (que expressam altos níveis de GAGs) suscetíveis ao HIV-1 e um derivativo pgsA745 (que carece inteiramente de GAGs), foram construídas. Isso foi concluído pela expressão estável de cDNAs codificando a CD4 humana e um co-receptor (ambos CXCR4 e CCR5), assim como uma forma mutante da CycT1 (Tyr261Cys) murina que é capaz de manter a função da Tat lentiviral do primata. Os níveis de expressão de CD4 e co-receptores nas populações de células isoladas por FACS estão apresentados na figura 1A. [A transcrição o vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV) requer a interação de uma sub-unidade ciclina T1 (CycT1) de um fator celular do hospedeiro, o fator B de alongamento de transcrição positiva (P-TEFb), com a proteína Tat no elemento de reação de transativação (TAR) de transcritos nascentes. PMID: 18931076. Obs.: os novos vírions utilizam o mecanismo de transcrição do hospedeiro depois da primeira inserção no DNA.]

[REPRODUÇÃO DA FIGURA 1A:

1) K1/X4: CD4 (2,3); CXCR4 (2,4); HS (2,7);
2) K1/R5: CD4 (2,1); CCR5 (1,7); HS (2,8);
3) 745/X4: CD4 (2,9); CXCR4 (2,7); HS (0,7);
4) 745/R5: CD4 (2,8); CCR5 (1,7); HS (0,7);



Texto da figura 1

(A) Análises FACS de expressão do receptor de HS em linhas celulares derivadas de CHO-K1 (K1/X4 e K1/R5) e pgsA745 (745/X4 e 745/R5). A expressão do receptor e de HS foi medida usando anticorpos anti-CD4 conjugados com allophycocyanin (aloficocianina?) e anticorpos anti-CXCR4 conjugados com ficoeritrina e anticorpos anti-CCR5 conjugados com ficoeritrina. Alternativamente, a expressão de HS foi medida usando-se o anticorpo monoclonal IgM anti-HS seguido por anti-IgM conjugado com isotiocianato fluorescente. O logaritmo de intensidade fluorescente principal para cada linha celular está entre parêntesis. A experimentação com coloração (tintura) com reagentes controle de isotipo está mostrada por histogramas abertos (?).

(B) As mesmas linhas celulares foram inoculadas com provisão de vírus derivados de NL4-3. O vírus NL/HXB foi usado para K1/X4 e 745/X4, e o NL/ADA foi usado para K1/R5 e 745/R5. Quarenta e oito horas após a inoculação, as células infectadas foram visualisadas por tintura fluorescente usando-se um anticorpo monoclonal anti-p-24.]

Esta análise demonstrou que o estado estável de CD4 e de cada co-receptor é similar nas linhas celulares derivadas de CHO-KI (K1/X4 e K1/R5) e derivadas de pgs745 (745/X4 e 745/R5), embora os níveis de expressão de CD4 sejam ligeiramente mais altos nos derivados de pgsA745. Em adição, nós verificamos que as células derivadas de CHO-K1 e pgsA745 mantiveram os fenótipos GAG positivo e GAG negativo das linhas celulares parentais por análises FACS com anticorpos anti-HS (fig 1.A)

Para determinar se, e em que extensão, as linhas celulares derivadas de pgsA745 e de CHO-K1 foram sensíveis à infecção por HIV-1, as células K1/X4 e 745/X4 foram inoculadas com o vírus NL/HXB (tropismo para CXCR4). Similarmente, as linhas celulares K1/R5 e 745/R5 foram inoculadas com NL/ADA (tropismo para CCR5). A infecção foi monitorada 48 horas após a inoculação por imunofluorescência usando-se anticorpo monoclonal anti-p-24. Como pode ser visto na figura 1.B, cada uma das linhas celulares foi infectada pelas linhagens do HIV-1 com sucesso transportando um envelope apropriado para o co-receptor específico. Como tem sido previamente noticiado, a presença de GAGs na superfície aparentemente aumentou o nível de infecção do HIV-1 envelopado HXB. Surpreendentemente, entretanto, o vírus envelopado ADA pareceu ser marcadamente mais infeccioso nas células 745/R5 que carecem de GAGs do que nas linhas celulares K1/R5.


2-Efeitos contrários das GAGs na superfície das células alvo na infecção por HIV-1 dependente do envelope.


Vírions do HIV-1 contendo envelopes HXB e ADA do HIV-1 exibiram diferenças marcadas e contraditórias de infectividade na presença ou ausência de GAGs na superfície celular alvejada. Por isso, nós examinamos a seguir este fenótipo de maneira mais quantitativa usando um painel de clones moleculares de HIV-1 infeccioso derivados de pNL4-3 nos quais o gene do envelope tivesse sido recolocado com cada um daqueles (produtos) codificados por uma seleção de isolados. Este painel incluiu os envelopes com tropismo primário para CCR5 (ADA, JRFL, YU2, 91US005.11,92MW965.26, 92RW020.5 e 92BR020.4) e com tropismo primário para CXCR4 (92UG021-6, 92UG024.2 e 92HT599.24), bem como os envelopes HXB adaptados para a linhagem de células T e o envelope de duplo tropismo 89.6. A infectividade de cada estirpe viral colhida diretamente de células 293T infectadas com plasmídio do pró-vírus, foi medida por uso de ambas as células CHO-K1 e pgsA745 carregando o apropriado co-receptor. Como pode ser visto na figura 2.A., cada uma das estirpes virais envelopadas primariamente para CCR5 exibiram infectividade mais alta nas linhas celulares 745/R5 (Gag-negativas) do que nas linhas celulares K1/R5 (GAG-positivas). A magnitude deste efeito foi modesta (6 vezes ou menos) mas claramente reprodutível. Convergentemente, e como está mostrado na figura 2.B, duas das viroses CXCR4 (NL/HXB e NL/92HT599.24) exibiram infectividade significativamente mais alta na linha celular K1/X4 GAG-positivas do que na contrapartida 745/X4 GAG-negativas. No caso do HXB, essa diferença foi maior que 10 vezes. Entretanto, a preferência pela presença de GAGs na superfície celular durante a infecção viral não foi uma propriedade universal para viroses com tropismo para CXCR4. De fato duas outras viroses X4, NL/92UG021.6 e NL/92UG024.2, foram claramente mais infecciosas (aproximadamente 4 vezes) em células alvo GAG-negativas 745/X4 do que nas células K1/X4. Por isso, a preferência de uma dada linhagem de HIV-1 pela presença de GAGs na superfície de células alvo é dependente do envelope mas não determinada pelo co-receptor usado. Esta conclusão foi sustentada por dados obtidos com vírus carregando o envelope de duplo tropismo do HIV-1 89.6. Como mostrado na figura 2.C, o NL/89.6 foi claramente mais infeccioso em células alvo GAG-positivas do que em contrapartidas (homólogas) GAG-negativas. Importantemente, este fenótipo foi observado independentemente de qual co-receptor, CXCR4 e CCR5 foi usado durante a infecção. Em adição, o SIV isolado mac239 com tropismo para CCR5 foi modestamente mais infeccioso em células alvo GAG-positivas do que em células GAG-negativas. Em geral, exemplos de ambas as lentiviroses primatas utilizando CXCR4 e CCR5 que exibiam preferências opostas para a presença ou ausência de GAG nas superfícies alvo foram obtidas nesta experiência. Entretanto, o fenótipo mais prevalente entre os envelopes de HIV-1 isolados primários, não obstante com pequena (mas diversa) amostra de isolados, parece ter a infectividade modestamente aumentada na ausência de GAGs na superfície.

3-Efeitos opostos das GAGs na fixação do vírion do HIV-1 dependentes do envelope.


Trabalhos prévios têm sugerido um importante papel para GAGs, em particular o HS, na fixação do HIV-1 nas células alvo. Para examinar se os vírions de HIV-1 carregando diferentes proteínas do envelope apresentam diferenças em suas habilidades respectivas para fixar-se a células GAG-positivas versus células GAG-negativas, nós geramos partículas virais fluorescentes carregando tanto as proteínas HXB ou ADA do envelope. Isso foi feito por co-transferência de células 293T com pNL/HXB ou pNL/ADA juntamente com um plasmídio de expressão da fusão protéica GFP-Vpr (Proteína fluorescente verde ligada à Vpr viral). Como tem sido previamente descrito, a incorporação de uma fusão protéica GFP-Vpr produziu vírus que podem ser visualizados com um microscópio de fluorescência. Para gerar partículas de controle similares ao vírus sem uma proteína funcional do envelope, o pNL/δenv foi substituído (? Ou o substituidor?) para os plasmídios de vírus infecciosos.

Os vírions fluorescentes foram incubados com células CHO-K1 ou pgsA745, os quais carecem dos receptores do HIV-1, sob condições (4OC) que permitam a fixação do vírus, mas não a entrada. A ligação (fixação) do vírion foi avaliada microscopicamente após lavagem, fixação e tingimento para revelar a arquitetura celular. Imagens representativas estão apresentadas na figura 3.A, e a enumeração dos vírus ligados a células está mostrada na figura 3.B.

Adaptação dos dados apresentados na figura 3.B
- Número de GFP+ partículas ligadas por célula :

VÍRUS/CÉLULA - NL/HXB ------- NL/ADA ------- NL/ δenv

CHO-K1 ------>DE 135 A 165------DE 15 A 20-----DE 10 A 15

pgsA745------>DE 30 A 40--------DE 35 A 40-----25




As partículas fluorescentes de NL/HXB ligaram-se aproximadamente 5 vezes mais eficientemente a células CHO-K1 do que a células pgsA745. Este aumento da ligação/fixação do vírium dependente de GAG foi claramente dependente do envelope. De fato, partículas fluorescentes NL/ADA não se ligaram eficientemente a células CHO-K1 e, de fato, ligaram-se com ligeira maior eficiência a células pgsA745. A magnitude dessa diferença foi pequena (aproximadamente 2,5 vezes) mas reproduzida em múltiplas repetições da experiência. Vírions carecendo de uma proteína do envelope ligaram-se pobremente a ambas as linhas celulares, porém, exibiram como o NL/ADA, uma modesta preferência para ligação a pgsA745 mais que a células CHO-K1. Os fenótipos em oposição de vírions envelopados de receptor lembram aqueles observados em ensaios de infectividade (dependentes de receptor) (Fig.2) Essas observações sugerem, particularmente no caso de NL/HXB, que os efeitos mediados por GAGs da superfície celular na infectividade do HIV-1 são manifestados antes do específico casamento ao receptor e influenciam a fixação do vírion em células alvo.

4-O laço V3 de gp120 é um determinante principal dos efeitos da GAG na superfície da célula alvo na infecção por HIV-1.

Devido ao painel de clones do HIV-1 usados na figura 2 terem apresentado marcada diferença, preferência dependente do envelope pela presença ou ausência de GAGs na superfície da célula alvo durante a infecção, a seguir nós procuramos correlacionar estes fenótipos com propriedades da proteína do envelope viral. Já que a presença de GAGs altamente sulfatadas pode, em princípio, afetar marcadamente a carga eletrostática geral nos arredores da membrana plasmática, pareceu pelo menos possível que superfícies carregadas na glicoproteína do envelope viral pudessem representar determinantes virais significativos do fenótipo mediado por GAG. De fato, tem sido previamente noticiado que polissacarídeos sulfatados podem ligar-se a superfícies básicas na proteína gp120 do envelope do HIV-1 incluindo o laço V3 e a epítopos induzidos de ligação a CD4. Como pode ser visto na figura 4, a extensão para a qual o laço V3 de gp120 apresenta uma carga positiva correlacionou com a habilidade da proteína do envelope para mediar diferencialmente a infecção de células GAG-positivas versus células GAG-negativas. De fato, somente envelopes que contém uma sequência de laço V3 altamente básica foram mais infecciosos em células GAG-positivas do que em contrapartidas Gag-negativas. A única exceção foi o envelope de 92HT599.24, o qual carrega uma carga positiva líquida de somente +5, ainda é mais infeccioso em células GAG-positivas do que em células GAG-negativas. Entretanto, o laço V3 deste isolado (vírus isolado 92HT599.24) é altamente incomum no que contém quatro resíduos de histidina (em oposição a um ou dois na maioria dos outros isolados, incluindo aqueles usados neste estudo). A histidina é convencionalmente não incluída nos cálculos da carga do laço V3. Todavia, devido à pKa de histidina ser fechada em 7, é aceitável que cálculos simplistas de carga do laço V3 usados aqui e algures subestimem um pouco a carga pH positiva indistinta (neutra) nos laços V3 de gp120 e o isolado 92HT599.24 em particular. Não obstante este menor aviso, a carga do laço V3 parece ser o prognóstico de se um dado envelope do HIV-1 media altos níveis de infecção nas células alvo GAG-positivas ou GAG-negativas.

Para determinar especificamente o papel do laço V3 na mediação da infecção dependente de GAG, nós examinamos as propriedades de NL/V3 (ADA/JRFL). Este vírus contém um envelope quimérico que é derivado predominantemente do HXB mas no qual o laço V3 altamente carregado (+9) tem sido substituído pelo ADA, o qual é menos carregado (+3) e idêntico a JRFL na sequência. Os dados estão apresentados na tabela 1. De fato, a resposta de NL/V3 (ADA/JRFL) à presença ou ausência de GAGs na superfície da célula alvo foi similar à de NL/ADA e NL/JRFL, o qual é mais infeccioso em células alvo GAG negativas, mais do que NL/HXB, o qual exibe o fenótipo oposto. (Tabela 1). Assim, enquanto os efeitos de GAG na infecção por HIV-1 são independentes da seletividade do co-receptor, o laço V3 de gp120 é um determinante principal de ambas as propriedades.

TABELA 1 (REPRODUÇÃO):

O laço V3 é o principal determinante viral dos efeitos na infecão do HIV-1 mediados por GAGs na superfície celular

Títulos (padrão de concentração)de infecção (FFU/ml)a (proporção b)


CHO-K1:

(5,3 + 1,1) x 106 - HXB
(8,2 + 0,4) x 105 - ADA
(1,6 + 0,4) x 106 - JRFL
(2,8 + 0,6) x 106 - V3 (ADA/JRFL)c

pgsA745:

(5,6 + 0,5) x 105 (9,5 ) -HXB
(4,2 + 0,6) x 106 (0,19) -ADA
(6,8 + 0,7) x 106 (0,24) -JRFL
(7,3 +106) x 106 (0,38) - V3 (ADA/JRFL)c

a: Títulos infecciosos de viroses derivadas de NL4-3 contendo os genes de envelope indicados foram medidos por uso de células alvo derivadas de CHO-K1 e pgsA745, e os focos de infecção foram enumerados após a imunofluorescência como descrito no sub-título (não traduzido) Materiais e Métodos. FFU= unidade de formação de foco.

b: Título em células alvo derivadas de CHO-K1/título em células alvo derivadas de pgsA745.

c: V3 (ADA/JRFL) é um envelope quimérico contendo sequências do laço V3 de ADA/JRFL numa experiência em HXB.

EFEITOS DOS GLICOSAMINOGLICANOS NA LIGAÇÃO E INFECÇÃO DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA DE TIPO I INDEPENDENTES DA CICLOFILINA E DEPENDENTES DO ENVELOPE.

YI-jun Zang, Theodora Hatziioannou, Trinity Zang, Douglas Braaten, Jeremy Luban, Stephen P. Goff, e Paul D. Bieniasz

Referência: PMID: 12021366

(continuação)


Os dados afora mencionados implicam o laço V3, e suas propriedades de carga em particular, como um importante determinante viral dos efeitos de GAG na infecção por HIV-1. De nota, um estudo recente sugeriu que o laço V3 atua num papel principal na determinação da carga geral de superfície de gp120 que é prevista por projetar-se para fora do vírion e é por isso aceitável por ser aquele que primeiro encontra a célula alvo. Esse achado é especialmente pronunciado quando o laço V3 é altamente básico. Por isso, nós especulamos que os efeitos de intensificação e inibitórios de GAGs carregadas negativamente na infecção por HIV-1 representam interações relativamente não-específicas do envelope e da superfície celular entre cargas eletrostáticas similares ou opostas. Tais interações puderam facilitar a infecção por isolados do HIV-1 trazendo laços V3 altamente carregados positivamente (tais como HXB). Alternativamente, GAGs carregadas negativamente na superfície de células alvo puderam transmitir uma barreira eletrostática que inibe a infecção por víriuns que trazem a gp120 menos carregada positivamente tais como ADA. O polibrene [1.polybrene é hexadimethrine bromide; 2. Hexadimethrine é uma molécula sintética, um polímero que aglutina células vermelhas usado como antagonista da heparina cujo nome químico é 1,6-hexamediamina, N,N,N’,N’- tetrametil, polímero com 1,3-dibromopropano; 3. Bromide = brometo; ânion Br_; sal do brometo de hidrogênio; vários sais originalmente utilizados como sedativos, hipnóticos e anticonvulsionantes; 4. Polybrene é um polímero catiônico usado para aumentar a eficiência da infecção de certas células com um retrovírus em cultura celular. O polybrene atua neutralizando a repulsão da carga entre os vírions e o ácido siálico na superfície celular. Ele tem outros usos como seqüenciamento protéico.], ou policátion, é largamente usado para facilitar a infecção retroviral de células em cultura e é considerado mediador desses efeitos por neutralizar ou reverter as cargas negativas repulsivas na superfície de células alvo. De fato, a infecção inicial do HIV-1 de linhas celulares engenheiradas segregadas é conhecida por ser facilitada pelo polibrene. Se nossa especulação (de que os efeitos mediados por GAGs na infecção por HIV-1 são simplesmente o resultado da modificação da carga na superfície celular) for correta, então nós poderemos prever que o Polybrene inibiria a infecção em células GAG-positivas por NL/HXB e aumentaria a infecção de células GAG-positivas por NL/ADA. Além disso, esses efeitos estariam ausentes, ou menos evidentes na infecção de células sem GAGs. [Obs.: a carga dos GAGs é negativa.]

Como está mostrado nas figuras 5.A e 5.B, essa previsão prova ser exata. De fato, a infecção de células K1/X4 por NL/HXB foi modestamente inibida (duas vezes) pelo polibrene. Um resultado similar foi obtido previamente com o isolado HIV-1/IIIB e uma gama de linhagens celulares humanas. Além disso, essa inibição foi observada somente em células GAG-positivas; a infecção de células 745/X4 por NL/HXB não foi afetada pelo Polybrene. Inversamente, a infecção de células K1/R5 por NL/ADA foi significativamente aumentada (aproximadamente 6 vezes) por polibrene. De novo, o efeito foi dependente de GAG, o caso de pequeno ou nenhum aumento da infecção foi observado quando células alvo careciam de GAGs. De fato, o tratamento de células GAG-positivas com Polibrene aumentou a infecção por NL/ADA para um nível similar àquele observado nas células GAG-negativas tratadas ou não com polibrene.

Como está mostrado nas figuras 5.C e 5.D, nós também observamos marcados efeitos dependentes de GAG nas superfícies celulares na inibição da infecção por HIV-1 mediada por poliânions. Para esses experimentos, nós usamos heparina, um análogo do sulfato de heparan (HS) altamente sulfatado. Poliânions, tais como a heparina, podem ligar-se a superfícies conservadas básicas em gp120, assim como o laço V3, que são considerados juntos por representar o principal sítio de interação para co-receptores. Se a inibição da ligação viral ao co-receptor específico é o único mecanismo pelo qual os poliânions inibem a infecção do HIV-1, então a presença ou ausência de GAGs na superfície de células alvo deve ter pouco ou nenhum efeito na potência com a qual os poliânions inibem a infecção por uma dada linhagem do HIV-1. Entretanto, enquanto a heparina inibiu a infecção de NL/HXB e, células K1/X4, ela foi menos efetiva numa ordem de magnitude de 1 e 2 na prevenção da infecção por NL/HXB em células 745/X4. Por isso, a maioria das atividades de inibição de infecção da heparina é preferivelmente atribuível a ambas condições:
1-competição por ligação a sítios GAG nos envelopes de vírus NL/HXB, ou;
2-redução da carga geral positiva nos vírus NL/HXB, tais que a atração eletrostática entre cargas positivas nos vírus e cargas negativas em GAGs são atenuadas nas células alvo. O frágil efeito inibitório residual da heparina na infecção por NL/HXB que é observada quando as células 745/X4 são usadas como alvo é provávelmente resultante do bloqueio de interações específicas do envelope e receptor envolvendo vírions com a superfície do envelope positivamente carregadas.

No caso de NL/ADA, a heparina foi um pobre inibidor da infecção. De fato a infecção de células 745/R5 por NL/ADA foi quase inteiramente refratória à inibição por heparina. Entretanto, uma modesta atividade inibitória de heparina foi observada quando células alvo GAG-positivas foram usadas. Já que as GAGs de superfície celular transmitem uma carga negativa que é aparentemente inibitória para a ligação e infecção por NL/ADA, é aceitável que a ligação ineficiente da heparina negativamente carregada do envelope ADA acentue esse efeito eletrostático negativo.

Em geral, esses resultados sugerem que a modificação característica da carga tanto das células alvo quanto dos vírions pode ter significativos efeitos na eficiência da infecção pelo HIV-1. Além disso, eles sugerem fortemente que as GAGs na superfície de células alvo do HIV-1 transmitem uma carga negativa que pode tanto aumentar ou inibir a infecção por HIV-1, de um modo dependente do envelope. Finalmente, as GAGs de superfície celular são determinantes celulares predominantes que governam efeitos de poliânions e policátions na infectividade do HIV-1 “in vitro”.

6-Os efeitos das GAGs na superfície de células alvo na infecção por HIV-1 são independentes de CypA.

Os resultados apresentados até agora indicam que efeitos de GAGs na superfície celular na infecção por HIV-1 são mediados largamente, talvez inteiramente, pelas proteínas do envelope viral. Esses dados são difíceis de conciliar com um modelo recentemente proposto no qual a ciclofilina encapsulada no vírion transloca-se para a superfície do vírion de onde ela media a ligação com a célula alvo por via da interação com sulfato de heparan. Entretanto, para tratar deste tema especificamente, nós adotamos três estratégias experimentais para esvaziar os vírions de CypA e examinamos os efeitos dessas manifestações na infectividade das linhagens do HIV-1 que são mais infecciosas na presença (NL/HXB) ou ausência (NL/ADA) de GAGs na superfície celular. Se o papel da CypA na infecção por HIV-1 é promover a ligação do vírion a sulfato de heparan na superfície das células alvo, então a ausência de CypA dos vírions deverá reduzir a infectividade do HIV-1 em células expressando sulfato de heparan. Entretanto, a presença ou ausência de CypA associada aos vírions não deverá ter efeito na infectividade quando as células que carecerem inteiramente de HS forem usadas como alvo.

Primeiro nós construímos plasmídios pró-virais cujos resíduos dentro da proteína do capsídeo que são essenciais para a incorporação de CypA foram mutados (G89V e P90A). A mutação P90A foi combinada com uma substituição suplementar (A92E) que foi previamente noticiada por restaurar parcialmente a competência de replicação do HIV-1 quando a incorporação de CypA está bloqueada por manipulação farmacológica ou genética. Como pode ser visto na figura 6.A, os vírions NL/HXB contendo estas proteínas mutantes do capsídeo foram menos infecciosos (de cinco a seis vezes) quando as células K1/X4 foram usadas como alvos, como esperado. Entretanto, ambos os vírions de tipo selvagem e mutante foram aproximadamente 10 vezes menos infecciosos nas células 745/X4. Por outro lado, os efeitos das mutações em CA que impedem a incorporação de CypA na infectividad em NL/HXB foi similar quando células alvo K1/X4 (HS-positivas) e 745/X4 (Hs-negativas) foram usadas. Este resultado está inconsistente com a noção de que as mutações no capsídeo reduzem a infectividade do HIV-1 por impedirem interações dependentes de CypA entre o vírion e o sulfato de heparan na superfície de células alvo. Além disso, um vírus (NL/ADA) que é mais infeccioso nas células que carecem de HS exibem reduções de infectividade similares sob a mutação da proteína do capsídeo para abolir a incorporação de CypA. Uma vez mais, a redução da infectividade que resulta de impedimento genético da incorporação de CypA dentro de vírions NL/ADA foi observada em ambas as células alvo HS-positivas e HS-negativas.

A incorporação de CypA nos Vírions HIV-1 também é efetivamente bloqueada em células que produzem vírus por tratamento com CsA, uma droga que impede a interação de CypA com CA (capsídeo) por competição pelo sítio de ligação a CA em CypA. Como resultado, vírions colhidos de células tratadas com CsA exibiram reduzida infectividade. Como está mostrado na figura 6.B, a linhagem de vírus colhidos de células T293 com transmissão de pNL/HXB e tratadas com CsA foram de fato menos infcciosas do que aquelas derivadas de células não tratadas. A magnitude da redução induzida por CsA na infectividade (de 5 a 6 vezes) foi similar àquela observada quando a incorporação de CypA foi abolida por mutação de resíduos dentro da proteína do capsídeo. De importância, entretanto, esse fenótipo foi observado se o senão o sulfato de heparan estava presente nas células alvo que foram usadas para mensurar a infectividade. Além disso, o tratamento com CsA de células produzindo NL/ADA também levou a reduções equivalentes na infectividade dos vírions indiferentemente a se células HS-positivas ou HS-negativas foram usadas para a titulação do vírus.

Finalmente, nós fizemos uso de uma linhagem celular derivada de células Jurkat na qual ambas as cópias do gene de CypA foram quebradas/partidas por recombinações homólogas. A replicação do HIV-1 é atenuada em células Cypa -/- porque os vírus derivados delas são menos infecciosos. Já que que as células Jurkat carecem do co-receptor CCR5 e por isso não podem sustentar a entrada do NL/ADA, ambos os genomas de NL/HXB e NL/ADA foram introduzidos em células Jurkat CypA +/+ e CypA -/- por pseudotipagem com VSV-G. A infectividade dos vírions descendentes (progênie dos vírus) foi então mensurada por uso de células HS-positivas e HS-negativas, como feito previamente. É importante notar que enquanto cada vírus foi introduzido dentro das células Jurkat por uso de envelope VSV, sua progênie dispõe somente do envelope autêntico do HIV-1 (HXB ou ADA). Isso foi verificado por demonstração de que cada vírus derivado de Jurkat não era infeccioso em células que não apresentavam o co-receptor apropriado para o envelope específico do HIV-1 (dados não mostrados). Como mostrado na figura 6.C, os vírions NL/HXB e NL/ADA derivados de células Jurkat CypA +/+ dispunham de um fenótipo virtualmente idêntico ao observado quando essas viroses foram obtidas de células T293 transmitidas (infectadas), isto é, o NL/HXB era mais infeccioso nas células K1/X4 GAG-positivas do que em células 745/X4 GAG-negativas, enquanto o NL/ADA era mais infeccioso em células 745/R5 do que em células K1/R5. Enquanto os níveis de NL/HXB e NL/ADA infecciosos colhidos de células Jurkat CypA -/- eram reduzidos em comparação àqueles obtidos de células Jurkat CypA +/+, cada uma dessas viroses exibiu a mesma preferência para a presença (NL/HXB) ou ausência (NL/ADA) da expressão de GAG pelas células alvo. Esses dados mostram claramente que a incorporação da CypA dentro de partículas virais não modula a habilidade diferencial do HIV-1 para infectar células que expressam ou não o sulfato de heparan.

DISCUSSÃO

Nesta série de experimentos nós temos mostrado que a presença das GAGs na superfície de células alvo pode modular sua suscetibilidade à infecção por HIV-1. Esses achados estão de acordo com dados previamente publicados que mostraram que linhagens do HIV-1 derivadas dos isolados IIIB/LAV/LAI, chamados HXB neste estudo, exibem níveis significativamente mais altos de infectividade (aproximadamente 10 vezes) quando o HS está presente na superfície da célula alvo. Entretanto, nós temos achado que este fenótipo é uma característica de linhagens minoritárias do HIV. De fato, a maioria das proteínas do envelope usadas em experimentos apresentados aqui (sobre este assunto), as quais incluíam formas representativas dos subtipos A, B, C, e D conferem infectividade mais alta quando as células alvo carecem inteiramente de GAGs. Somente duas das doze proteínas do envelope derivadas de isolados primários (um X4 e um X4R5) exibiram uma clara preferência pela presença de GAGs na superfície de células alvo durante a infecção.

Além disso, esses fenótipos discordantes parecem ser determinados pelo laço V3 de gp120 e correlacionarem-se com a carga do laço V3 (tabela 1, fig.4). De fato, somente linhagens virais carregando uma proteína gp120 que contenha uma sequência altamente básica no laço V3 exibe uma capacidade preferencial para infectar células GAG-positivas. Esta observação, casada com outros dados apresentados aqui ou recentemente publicados por outros grupos, sugere que o efeito das GAGs na superfície celular na infecção por HIV-1 reflete simplesmente a repulsão eletrostática ou a atração entre componentes carregados similarmente ou em oposição da célula alvo e do vírion. Especialmente, o laço V3 é aceitavelmente o principal maior determinante da carga geral da face de gp120 que projeta-se junto à célula alvo, particularmente quando o V3 por si mesmo é altamente básico. Assim, as faces próximas da célula alvo de, por exemplo, HXB e gp120 89.6, ambas as quais conferem infectividade mais alta em células GAG-positivas, são substancialmente mais positivamente carregadas do que aquelas de, por exemplo, JRFL, o qual exibe o fenótipo inverso (tabela 1.Fig2). Além disso, o policátion Polybrene e o poliânion heparina tiveram efeitos na infecção por HIV-1 que diferiam de acordo com qual proteína do envelope estava presente. No momento, a infecção por NL/ADA, cujo laço V3 carrega uma carga positiva baixa, foi significativamente aumentada pela penetração das células alvo com Polybrene. Esse composto é pensado por aumentar a infecção por diversas retroviroses por neutralização ou reversão de cargas negativas na superfície das células alvo. Consistentemente com esta noção, o Polybrene inibiu modestamente a infecção por NL/HXB, cujo envelope é altamente positivamente carregado. Significativamente, ambos estes efeitos foram dependentes das cargas na superfície das células alvo. A implicação desses resultados é que as GAGs transmitem uma carga negativa à superfície de células alvo que inibe a fixação e infecção por partículas virais menos positivamente carregadas (e.g. NL/ADA) mas promove a fixação e a infecção por vírions positivamente carregados (e.g. NL/HXB) e pode ser neutralizada por Polybrene.

Similarmente os efeitos de heparina na infecção por HIV-1 também foram dependentes de ambos o envelope viral e da expressão de GAG na célula alvo. Polissacarídeos sulfatados têm afinidade engrandecida para, e atividade antiviral mais alta contra, envelopes X4 tais com HXB do que para envelopes R5 tais como ADA e JRCSF. Os resultados apresentados sobre este assunto indicam que a habilidade de heparina para bloquear ambas as infecções por NL/HXB e NL/ADA é ao menos em parte dependente da presença das GAGs na superfície das células alvo. Quando vistas em conjunto com os resultados discutidos anteriormente, esses achados sugerem que a ligação de heparina a componentes do vírion positivamente carregados (a qual é mais eficiente no caso de NL/HXB) neutraliza a carga positiva associada ao vírus e aumenta a quantidade de carga negativa associada ao vírus. A conseqüência óbvia seria que a atração eletrostática para GAGs de superfície celular negativamente carregadas seria decrescida e a repulsão eletrostática por cargas similares seria acentuada.

Os efeitos positivos e negativos das GAGs na superfície das células alvo e heparina exogenamente adicionada na infecção por HIV-1 parece ser estritamente dependente da seqüência do envelope. Esses achado não são consistentes com a hipótese de que a CypA media a interação inicial do vírion com as células alvo por ligação a heparan sulfato na superfície celular. De fato, a eliminação da incorporação de CypA dentro das partículas de NL/HXB ou NL/ADA farmacologicamente (por tratamento com CsA) ou geneticamente (mutação no capsídeo) reduziu a infectividade do vírion de um modo que foi independente de se o sulfato de heparan estivesse ou não presente na superfície das células alvo. Mais convincentemente, as linhagens descendentes de vírus NL/HXB ou NL/ADA provenientes de células Jurkat CypA -/-, as quais carecem de CypA, exibiram preferência pela presença ou ausência de GAGs na superfície de células alvo idêntica àquela linha de descendência derivada de células Jurkat ou T293 CypA +/+. Claramente, a reduzida infectividade dos vírions de HIV-1 que resulta de uma carência de CypA não pode ser atribuída à eliminação da fixação dependente de HS às células alvo.

Os efeitos diferenciais na infecção por HIV-1 que resulta da presença ou ausência de GAGs na superfície de células alvo derivadas de CHO-K1 são aceitáveis por representar extremas manifestações desses fenótipos. A expressão de HS está particularmente alta em células CHO-K1 e completamente ausentes de células pgsA745. Ainda assim, essas duas linhas celulares diferem bastante modestamente, 10 vezes ou menos, em sua suscetibilidade para infecção por vírions d HIV-1 carregando cada um dos envelopes testados. A célula alvo predominante natural para a infecção por HIV-1, chamada, primeiramente de linfócito T, expressa somente baixos níveis de HS. Assim, os efeitos, se algum, da expressão de HS na infecção do HIV-1 em células primárias são aceitavelmente mais modestos do que os documentados aqui para células derivadas de CHO-K1. De fato, efeitos positivos significativos de GAGs na superfície de células alvo na infecção por HIV-1 têm sido obtidos predominantemente com linhas de células imortalizadas de linha de células adaptadas a vírus isolados. De fato, o tratamento com heparinase dos linfócitos primários foi encontrado por ter efeitos insignificantes na infecção por HIV-1 mediada por ambos os envelopes X4 e R5.

Não obstante esses achado, permanece formalmente possível que os GAGs na superfície celular devam atuar em algum papel na biologia do HIV-1 in vivo. No momento, a infecção de macrófagos pode ser tanto influenciada positivamente ou negativamente por GAGs na superfície celular, as quais são mais abundantes neste tipo de célula. Em adição, altas concentrações da quimiocina RANTES tem sido mostradas por aumentar dramaticamente a infecção in vivo por ambos os vírions de HIV-1 e da leucemia murina, de uma maneira independente do envelope. O aumento da infecção dependente de RANTES é ao menos em parte mediado através da fixação aumentada do vírion, e dependente das GAGs de superfície celular, e é mais aceitável como resultado da ligação cruzada da célula com o vírion por oligômeros RANTES [oligômero é um polímero de até 20 unidades repetidas]. Não está claro no presente se concentrações locais de RANTES “in vivo” devem atingir os níveis requeridos para este efeito. Finalmente, a transmissão seletiva aparente de linhagens do HIV-1/R5 na superfície da mucosa, onde GAGs parece ser mais abundantes, pode em princípio ser influenciada pela variação fenotípica nas propriedades do envelope descritas aqui. Neste caso, seria necessário confrontar um mecanismo indireto pelo qual as GAGs seqüestram seletivamente, e dessa forma previnem a transmissão de, linhagens X4 carregando envelopes altamente positivamente carregados enquanto permitisse a transmissão de linhagens carregando envelopes menos positivamente carregados.

Em geral, contudo, os dados apresentados aqui indicam que, na maioria dos casos, o encontro inicial entre um vírion HIV-1 e sua célula alvo não é aceitável por ser mediado por interações gp120-GAG ou CypA-GAG. Assim, ao menos para a maioria das linhagens primárias do HIV-1, não encontramos evidências que sugiram que baixos níveis de GAGs presentes nas células T circundantes in vivo atuariam num papel direto e significativo na promoção da fixação e replicação do HIV-1.

*180435 RIBONUCLEASE L; RNASEL
Alternative titles; symbols
RIBONUCLEASE 4; RNS4RIBONUCLEASE, 2-5A-DEPENDENT, INTERFERON-INDUCEDINTERFERON-INDUCED 2-5A-DEPENDENT RNase
Gene map locus 1q25
TEXTO

DESCRIÇÃO

A RNase dependente de 2-5A [oligoadenilatos ligados em 2'-5' ] é um componente do sistema 2-5A de interferon regulado que funciona nos papéis antiviral e anti-proliferativo dos interferões. O tratamento de células com interferões resulta em níveis aumentados de ambas a RNase dependente de 2-5A e um grupo de sintetases que produzem um primeiro 5 trifosforilado, e primeiro 2 e primeiro 5 oligoadenilatos (2-5A) a partir de ATP. O papel do sistema 2-5A no controle do crescimento viral e celular sugere que defeitos no gene da RNase dependente do 2-5A pode resultar em reduzida imunidade à infecção viral e ao câncer (Hassel e outros, 1993).

FUNCTION do GENE

Bisbal e outros (1995) revisaram o mecanismo da via de 2-5A/RNase L induzida por interferon e idetificaram um inibidor de RNase 4, ao qual eles se referiram como inibidor de RNase L.
Usando uma linha cellular de fibroblasto de camundongo carecendo de RNaseL, Mda5 (606951), Rigi (609631), ou Ips1 (610979), Malathi e outros (2007) observaram uma reduzida capacidade de expressar IFNbeta (147640) em resposta ao primeiro 2 trifosforilado (ativo), e ao oligoadenilato ligado ao primeiro 5 (2-5A) ou a expressão do vírus Sendai, um vírus de fita de RNA negativa. Numa linha celular de câncer de próstata humano, a derrubada de MDA5, RIGI, ou IPS1 também inibiu a expressão de IFNB. A infecção de camundongos deficientes em RNase L com viroses de RNA de filamento marcadamente negativo (minus) ou positivo também resultou em reduzida produção de IFNB. Malathi e outros (2007) concluíram que o RNASEL é crucial para a produção aumentada de IFNB através da cascata RIGI-MDAS-IPS1 e que a RNASEL contribui para a resposta antiviral de IFN por, removendo diretamente RNA viral e mesmo celular, sustentar um amplo estado antiviral no hospedeiro.

MAPEAMENTO

Por hibridização fluorescente in vitro, Squire e outros (1994) assinaram o gene RNS4 em 1q25. Squire e outros (1994) apontaram para várias desordens congênitas e neoplásicas que mapeiam naquela região do braço longo do cromossomo1.

GENETICA MOLECULAR

Uma forma de câncer de próstata hereditário, HPC1 (601518), está ligada à região 1q24-q25. Por uma abordagem posicional de clonagem/gene candidato, Carpten e outros (2002) identificaram o gene RNASEL como o sítio de diferentes mutações de linhas germinativas nas famílias ligadas a 2 HPC1. Inicialmente eles rastrearam um conjunto de amostras de DNA representando um indivíduo afetado a partir de cada uma das 26 famílias em alto risco para câncer de próstata, incluindo 8 famílias que apresentaram ligação para a região HPC1 e que tinham ao menos quatro indivíduos afetados compartilhando o mesmo haplótipo de HPC1. Eles identificaram uma mutação de glu265 para códon de finalização em uma probando de uma família e uma transição de G para A no códon da metionina de iniciação (AUG) do transcrito de RNase L numa segunda família.

Rokman e outros (2002) rastrearam mutações de linha germinativa em RNASEL em 66 pacientes Finlandeses com HPC e determinaram a freqüência das mutações no índice de pacientes de 116 famílias com HPC, em 492 pacientes com câncer de próstrata não selecionado (PRCA), em 223 pacientes com hiperplasia prostática benigna (BHP), e 566 controles. Uma mutação de produto truncado, E265X, foi encontrada em 5 (4,35) dos 116 pacientes das famílias com HPC; esta foi significativamente mais alta do que a freqüência em controles (1,8%). A freqüência mais alta desta mutação (9,5%) foi encontrada em pacientes de famílias com 4 ou mais membros afetados. A idade média do estabelecimento da doença para portadores da mutação E265X foi 11 anos menos do que para não portadores nas mesmas famílias. Uma mutação sem sentido, R462Q, apresentou uma associação com HPC (OR=1,96). Rokman e outros (2002) concluíram que, embora mutações em RNASEL não expliquem a segregação da doença nas famílias Finlandesas com HPC, as variantes são enriquecidas em famílias com mais de dois membros afetados e podem também estar associadas com a idade no estabelecimento da doença. Isso sugere um possível papel modificador na predisposição para o câncer.

MODELO ANIMAL

Zhou e outros (1997) geraram um camundongo com uma interrupção alvejada do gene RNase L para determinar os papéis fisiológicos do sistema 2-5A. O efeito antiviral do interferon alfa foi diminuído nos camundongos deficientes em RNase L, proporcionando a primeira evidência de que o sistema 2-5ª funciona como uma via antiviral nos animais. Em adição, o notável alargamento do timo em camundongos RNaseL -/- resultou de uma supressão da apoptose. Existia um decréscimo de duas vezes na apoptose “in vivo” nos timos e nos baços de camundongos RNase L -/-. Além disso, a apoptose foi substancialmente suprimida em timócitos RNaseL -/- e fibroblastos tratados com diferentes agentes apoptóticos. Baseado nestes resultados, Zhou e outros (1997) concluíram que ambos a ação do interferon e a apoptose podem ser controlados no nível da estabilidade do RNA pela RNase L, e sugeriram que o sistema 2-5A é aceitável por contribuir para a atividade antiviral do interferon por induzir a apoptose de células infectadas.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=180435

*605237 XENOTROPIC AND POLYTROPIC RETROVIRUS RECEPTOR; XPR1
Alternative titles; symbols
X RECEPTORSYG1, YEAST, HOMOLOG OF; SYG1
Gene map locus 1q25.1
TEXTO


Existem quarto classes de vírus da leucemia murina (MLV): xenotrópica (X), ecotrópica (E)[ecotaxia: migração de linfócitos residentes do timo e da medula óssea para tecidos que possuem um micro-ambiente apropriado], anfotrópica (A) [ampho= ambos os lados] e politrópica (P). O MLV X e E não podem infectar as células do camundongo exogenamente e são herdados como parte do genoma do camundongo. Enquanto a X-MLV pode infectar outras espécies de mamíferos mas não células de camundongos de laboratório, a A- (veja SLC20A2; 158378) e P-MLV podem infectar o camundongo e outras espécies. Veja Levy (1999) para uma revisão dos MLVs.


Por clonagem de uma biblioteca de cDNA de linfócito T dentro de um vetor retroviral, transduzindo a biblioteca para dentro de fibroblastos do camundongo resistente ao MLV X, e amplificação por PCR, Tailor e outros (1999) isolaram um cDNA codificador de XPR1. A expressão de XPR1 nos fibroblastos de camundongo e de hamstes resistentes produziram células suscetíveis a ambos os MLV X e P. A proteína XPR1 deduzida em 696 aminoácidos contém 8 ou 9 regiões com potencial de atravessar a membrana, 7 sítios com potencial de glicolisação N, e 7 di-leucinas que podem estimular a endocitose por via de covas de clatrina [principal constituinte de uma rede poliédrica de proteínas que reveste as membranas (vesículas) e depressões revestidas das células eucarióticas, parecendo envolvida na secreção de proteínas]. Análises de Northern blot detectaram um transcrito de 4,5 quilo-bases de XPR1 em todos os tecidos testados, com expressão mais alta no pâncreas, rins, placenta, tecidos hematopoiéticos, e coração, e expressão mais baixa no músculo esquelético. A expressão de XPR1 foi maior no fígado fetal e do fígado adulto. Um transcrito de XPR1 de 9,5 quilo-bases também foi detectado em todos os tecidos testado exceto no fígado e na medula óssea.

Usando métodos similares àqueles de Tailor e outros (1999), Battini e outros (1999) isolaram uma cDNA codificador de XPR1. As análises da seqüência previram que XPR1, o qual compartilha 25% de identidade de aminoácidos com a proteína Syg1 da levedura, contém uma região terminal N hidrofílica de 236 aminoácidos, que precede os 8 domínios hidrofóbicos.

Por análises de radiação híbrida, Battini e outros (1999) mapearam o gene XPR1 em 1q25.1, flanqueado pelos genes AT3 e LAMC1. Yang e outros (1999) e Tailor e outros (1999) mapearam o gene Xpr1 do camundongo, também chamado Rmc1, no cromossomo 1.


Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=605237

*604828 CHEMOKINE, C MOTIF, LIGAND 2; XCL2
Alternative titles; symbols
SMALL INDUCIBLE CYTOKINE SUBFAMILY C, MEMBER 2;
SCYC2SINGLE CYSTEINE MOTIF 1B; SCM1B
Gene map locus 1q23
TEXTO

Quimiocinas são um grupo de pequenas (aproximadamente de 8 a 14 quilo-dáltons), na maioria básicas, moléculas estruturalmente relacionadas que regulam o tráfego de vários tipos de leucócitos através de interações com um sub-grupo de sete receptores casados (parelhados) com proteína G transmembrânicos. As quimiocinas também atuam em papéis fundamentais no desenvolvimento, hemostasia e função do sistema imune, e elas tem efeitos nas células do sistema nervoso central assim como nas células endoteliais envolvidas na angiogênese ou angiostasia. As quimiocinas são divididas em duas sub-famílias principais, a CXC e CC, baseado no arranjo de seus dois primeiros dos quatro resíduos conservados de cisteína; as duas cisteínas são separadas por um único aminoácido nas quimiocinas CXC e são adjacentes nas quimiocinas CC.

Por sondagem de um biblioteca de cDNA de linfócito T CD8+ com uma prova (sonda) de linfotactina de camundongo, Kennedy e outros (1995) isolaram um cDNA codificador da linfotactina (SCYC1; 600250), também chamada SCM1, ou XCL1. Eles também identificaram uma forma variante de SCYC1, a qual apresentou somente dois aminoácidos em diferença com os 114 aminoácidos deduzidos da proteína SCYC1. Ambas proteínas são mais homólogas às quimiocinas CC CCL8 e CCL3, mas diferem em sua carência da primeira e terceira cisteínas características das quimiocinas CC e CXC. Yoshida e outros (1996) identificaram a variante de SCYC1 como um gene separado. Por sondagem de toda uma biblioteca genômica do sangue com uma prova (sonda) de SCM1, eles clonaram ambos o SCYC1, ao qual eles chamaram SCM1-alfa, e SCYC2, ao qual eles chamaram SCM1-beta e o qual também é conhecido como XCL2. O gene SCYC2 codifica his (histidina) e arg (arginina) nas posições 28 e 29 (ou posições 7 e 8 na proteína madura) em vez de asp (aspargina) e lys (lisina) como a proteína SCYC1. Ambos os genes contém 3 éxons e 2 íntrons, mas diferem em 1,5 quilo-bases no primeiro íntron que estão deletadas no gene SCYC2. Análises de Southern blot (DNA) de várias linhas celulares assim como de células de indivíduos normais de diferentes bases raciais confirmaram a existência de dois genes distintos de 5,3 e 3,8 quilobases. Análises de RT-PCR revelaram que, como o SCYC1, o SCYC2 é expressado em células T ativadas, embora a expressão de baixos níveis de SCYC2 seja detectada em células não estimuladas.

Yoshida e outros (1998) observaram que XCL2 induz a migração de células expressando XCR1 (600552).

Yoshida e outros (1996) mapearam o gene SCYC2 no cromossomo 1q23 por peixe. (peixe zebra?)

Fonte: OMIM http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez

p53 Cellular tumor antigen Animation


P53, também conhecida como a proteína 53 (TP53), é um fator de transcrição que regula o ciclo celular e portanto funciona como um supressor de tumor. Ela é importante em organismos multicelulares já que suprime o câncer. A p53 tem sido descrita como a “guardiã do genoma”, “o anjo da guarda do gene”, ou o “vigilante mestre”, em referência a seu papel na conservação da estabilidade por prevenção de mutações no genoma.


O nome p53 é referente a sua massa molecular aparente: ela flui como uma proteína de 53 quilo-dáltons (kDa) em SDS-PAGE. Mas diferentes modos de mensuração da massa molecular podem produzir diferentes resultados. Com base em cálculos de seus resíduos de aminoácidos, a massa de p53 é atualmente de apenas 43,7 quilo-dáltons. Essa diferença é devida ao alto número de resíduos de do aminoácido prolina na proteína p53 com baixa migração de p53 no SDS-PAGE, assim fazendo-a parecer maior. Este efeito é observado com a p53 de várias espécies, incluindo humanas, de roedores, anfíbios e peixes.


Nome official da proteína: antígeno tumoral cellular p53

Sinônimos:
Supressor de tumor p53
Fosfoproteína p53
Antígeno NY-CO-13

Gene

O gene humano que codifica para p53 é TP53. O gene foi chamado TP53 após a proteína para a qual ele codifica (TP53 é outro nome de p53). Os caracteres itálicos são usadas para distinguir o gene TP53 da proteína TP53 do mesmo nome. O gene é localizado no cromossomo humano 17 (17p13.1).

A localização também tem sido mapeada em outros modelos animais:

Camundongo: cromossomo 11
Rato: cromossomo 10
Cão: cromossomo 5
Porco: cromossomo 12.

Estrutura

A p53 humana tem o comprimento de 393 aminoácidos e tem sete domínios:

- Um domínio de ativação de transcrição no terminal N (TAD), também conhecido como domínio 1 de ativação (AD1) o qual ativa fatores de transcrição: resíduos de 1 a 42.

- Um domínio 2 de ativação (AD2) importante para atividade apoptótica: resíduos de 43 a 63.

- Um domínio rico em prolina importante para a atividade apoptótica de p53: resíduos de 80 a 94.

- Um domínio central no cerne de ligação a DNA (DBD). Contém um átomo de zinco e vários aminoácidos arginina: resíduos de 100-300.

- Um domínio de sinalização de localização nuclear (OD): resíduos de 307 a 355. A tetramerização é essencial para a atividade de p53 “in vivo”.

- Um terminal C envolvido na regulação para menos de ligação do domínio central a DNA: resíduos de 356 a 393.

Mutações que desativam a p53 no câncer normalmente ocorrem no domínio DBD. A maioria dessas mutações destrói a capacidade da proteína ligar-se a seus alvos de seqüências de DNA, e assim impede a ativação transcricional desses genes. Tal qual, mutações no domínio DBD são mutações recessivas de perda de função. Moléculas de p53 com mutações em OD formam dímeros com a p53 de tipo selvagem, e as impedem de ativarem a transcrição. Por isso mutações em OD têm um efeito dominante negativo na função de p53.

A p53 de tipo selvagem (normal) é uma proteína sujeita à alteração química, compreendendo regiões dobradas e não estruturadas cuja função é de tipo sinérgica (sinergia é a ação coordenada de duas ou mais estruturas).

Importância Funcional

A p53 tem muitos mecanismos anti-câncer:
- Ela pode ativar proteínas de reparo do DNA quando o DNA tiver sofrido dano;
- Ela também pode deter o ciclo celular no ponto de regulação G1/S no reconhecimento do dano ao DNA (se ela suspende a célula aqui por tempo suficiente, as proteínas de reparo do DNA terão tempo para fixarem-se ao dano e a célula estará livre (aprovada) para continuar o ciclo).
- Ela pode iniciar a apoptose, a morte celular programada, se o dano ao DNA provar-se irreparável.


A p53 é central para muitos dos mecanismo anti-câncer das células. Ela pode induzir o retardo do crescimento, a apoptose e a senescência (envelhecimento). Em células normais a p53 está usualmente inativa, ligada à proteína MDM2 (também chamada HDM2 em humanos), a qual impede sua ação e promove sua degradação atuando como uma ligase de ubiquitina. A p53 ativa é induzida após os efeitos de vários agentes causadores do câncer tais como radiação UV, oncogenes e algumas drogas que causam dano ao DNA. O dano ao DNA é sentido por “controles” em um ciclo celular, e causa a fosforilação de p53 por proteínas tais como ATM, CHK1 e CHK2 em sítios que são fechados para ou dentro da região de ligação a MDM2 e dentro da região de ligação da proteína MDM2 à p53. Os oncogenes também estimulam a ativação de p53, mediados pela proteína p14ARF. Alguns oncogenes também podem estimular a transcrição de proteínas as quais ligam-se a MDM2 e inibem sua atividade. Uma vez ativada, a p53 ativa a expressão de vários genes incluindo um codificador para p21. A p21 liga-se aos complexos G1-S/CDK e S/CDK (moléculas importantes para a transição G1/S no ciclo celular) inibindo sua atividade. A p53 tem muitos mecanismos anti-câncer, e desempenha um papel na apoptose, estabilidade genética, e inibição de angiogênese.



O gene p53 tem sido mapeado no cromossomo 17. Na célula , a ligação da proteína p53 ao DNA, a qual, por sua vez, estimula outro gene a produzir a proteína chamada p21 que interage com a proteína de estimulação da divisão celular (cdk2). Quando a p21 forma um complexo com a cdk2, a célula não consegue passar para o estágio seguinte da divisão celular. A p53 mutante não pode mais ligar-se ao DNa de modo efetivo, e como suma conseqüência a proteína p21 não é tornada disponível para agir como um sinal de parada para a divisão celular. Assim as células dividem-se descontroladamente, e formam tumores.


Pesquisas recentes também tem relacionado as vias de p53 e RB1, por via de p14ARF, levantando a possibilidade de que as vias possam regular uma à outra.

Pesquisas publicadas em 2007 mostraram que, quando a expressão de p53 é estimulada pela luz solar, esta inicia uma cadeia de eventos levando ao bronzeamento. (?)



Regulação da atividade de p53

A p53 torna-se ativada em resposta a muitos tipos de estresse, os quais incluem, mas não estão limitados ao dano ao DNA (induzido tanto por UV, IR ou agentes químicos, tais como peróxido de hidrogênio {peróxido são substâncias que contêm uma ligação –O-O-}), estresse oxidativo, choque osmótico, esgotamento do ribonucleotídeo e expressão desregulada de oncogenes. Esta ativação é marcada por dois eventos principais. Primeiramente, a meia-vida da proteína p53 é aumentada drasticamente, levando a uma rápida acumulação da p53 em células cansadas (estressadas). Secundariamente, uma mudança conformacional força a p53 a tomar uma papel ativo como regulador transcricional nessas células. O evento mais crítico que leva à ativação de p53 é a fosforilação de seu domínio terminal N. A ativação do domínio terminal N de ativação transcricional contém um grande número de sítios de fosforilação e pode ser considerado como o alvo primário para proteínas quinases transdutoras de sinais de estresse.



As proteínas quinases que são conhecidas por mirar este domínio de ativação transcricional de p53, podem ser grosseiramente divididas em dois grupos. Um primeiro grupo de proteínas quinases pertence à família MAPK (JNK1-3, ERK1-2, p38 MAPK), o qual é conhecido por responder a vários tipos de estresse (tensão), tais como danificação da membrana, estresse oxidativo, choque osmótico, choque de calor, etc... Um segundo grupo de proteínas quinases (ATR, ATM, Chk1, Chk2, DNA-PK, CAK) está implicado no controle da integridade do genoma, uma cascata molecular que detecta e responde a várias formas de dano no DNA causada por tensão genotóxica.

In unstressed cells, p53 levels are kept low through a continuous degradation of p53. A protein called Mdm2 binds to p53 and transports it from the nucleus to the cytosol where it becomes degraded by the proteasome. Phosphorylation of the N-terminal end of p53 by the above mentioned protein kinases disrupts Mdm2-binding. Other proteins, such as Pin1, are then recruited to p53 and induce a conformational change in p53 which prevents Mdm2-binding even more. Trancriptional coactivators, like p300 or PCAF, then acetylate the carboxy-terminal end of p53, exposing the DNA binding domain of p53, allowing it to activate or repress specific genes. Deacetylase enzymes, such as Sirt1 and Sirt7 can deacetylate p53, leading to an inhibition of apoptosis.


Em células não estressadas (que não estão sob pressão ou tensão), os níveis de p53 são mantidos baixos através de uma contínua degradação de p53. Uma proteína chamada Mdm2 liga-se a p53 e a transporta do núcleo para o citosol onde p53 torna-se degradada pelo proteossomo (um conjunto de proteínas que parece estar envolvido no processo celular e no transporte de peptídios na formação de moléculas de classe I do MHC). A fosforilação do terminal N final de p53 pelas proteínas quinases mencionadas acima rompe a ligação com Mdm2. Outras proteínas, tais como Pin1, são então recrutadas para p53 e induzem uma mudança conformacional na p53 a qual impede mais ainda a ligação de Mdm2. Co-ativadores transcricionais, tais como p300 ou PCAF, acetilam, então, o terminal carboxila (terminal C) final de p53, expondo o domínio de ligação a DNA de p53, permitindo-a ativar ou reprimir genes específicos. Enzimas desacetilases, tais como Sirt1 e Sirt7 podem desacetilar p53, levando a uma inibição de apoptose.

O Papel de p53 na doença

Se o gene TP53 for danificado, a supressão tumoral é severamente reduzida. Pessoas que herdam somente uma cópia funcional do gene TP53 desenvolverão tumores com mais facilidade na vida adulta, uma doença conhecida como síndrome de Li-Fraumeni. O gene TP53 também pode ser danificado nas células por mutagênese (químicas, por radiação ou viroses), aumentando a facilidade com a qual a célula iniciará uma divisão descontrolada. Mais de 50 por cento dos tumores humanos contém uma mutação ou deleção no gene TP53. O aumento da quantidade de p53, o que pode inicialmente parece uma boa via para o tratamento de tumores ou impedir sua disseminação, atualmente não é um método usável para o tratamento, já que pode causar envelhecimento precoce. Entretanto, a restauração da função endógena de p53 sustenta muitas promessas.

Alguns patógenos podem também afetar a proteína p53 que o gene TP53 expressa. Um exemplo disso, o papilomavírus humano (HPV), codifica uma proteína, E6, que liga-se a p53 e a inativa. Esta, em sinergia com a inativação de outro regulador do ciclo celular, p105RB, permite a divisão celular repetida manifestada na doença clínica da papila (verruga).


Em pessoas saudáveis, a proteína p53 é continuamente produzida e degradada na célula. A degradação da proteína p53 é, como mencionado, associada com a ligação a MDM2. Em uma reação negativa o laço com MDM2 é induzido por si mesmo pela proteína p53. Entretanto as proteínas p53 mutantes freqüentemente não induzem MDM2, e são assim capazes de acumularem-se em concentrações muito altas. Pior, a proteína p53 mutante por si mesmo pode inibir os níveis normais da proteína p53.

Fonte:

http://bioisolutions.blogspot.com/2008/05/p53-cellular-tumor-antigen-p53.html