Soroconversão e atividade citotóxica/supressora em hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=8324903
AVALIAÇÃO FENOTÍPICA E FUNCIONAL DOS LINFÓCITOS TCD8+/S6F1+ EM INDIVÍDUOS HEMOFÍLICOS COM INFECÇÃO POR HIV-1

F.Cavallin, A.Traldi & Zambello (1993)

Sumário

Neste estudo nós investigamos a distribuição do antígeno S6F1, um epítopo do antígeno associado à função linfocitária, nos linfócitos TCD8+ em uma série de pacientes de hemofilia sendo 15 HIV-1+ e 20 HIV-1-. Anticorpos monoclonais (MoAbs) reconhecedores do antígeno S6F1 têm sido alegados por distinguir entre células killer efetoras (brilhantemente marcadas S6F1+ ) e células supressoras (marcadas em escuro S6F1+) dentro da população CD8+ linfóide. Em adição, nós tentamos encontrar a co-relação entre a síntese espontânea de imunoglobulina in vitro de linfócitos do sangue periférico de pacientes e o padrão de expressão de S6F1. Embora o número total de células duplamente positivas CD8+/S6F1+ fosse similar em ambos os pacientes hemofílicos portadores de HIV-1+ e não portadores de HIV-1 (HIV-1­-), um aumento significante na população de CD8+/S6F1+ brilhante versus escuro foi documentada nos infectados por HIV-1 com respeito a hemofílicos HIV-1- (proporção de brilhante/opaca 3.97 + 0.61 versus 0.75 + 0.1, respectivamente, P<0.005). Esse achado foi co-relacionado com um aumento significativo da produção espontânea de imunoglobulna in vitro em sujeitos HIV-1 + comparado com hemofílicos controle (P<0.005). Linfócitos CD8+ purificados de sujeitos HIV-1+ apresentaram reduzida atividade supressora na produção de imunoglobulina induzida por mitógeno (substâncias que estimulam a mitose e a transformação de linfócitos como lectinas, concanavalina A, ou derivadas de patógenos como estreptococos). Tomados em conjunto, esses dados sugerem que a infecção por HIV-1 favorece a geração de células brilhantes para CD8+/S6F1+ com suposta função citotóxica associadas, levando a uma progressiva redução no número de linfócitos supressores CD8+/S6F1+ opacos. Este fenômeno pode contribuir para a hipergamaglobulinemia policlonal presente nos pacientes hemofílicos HIV-1+. (Hipergamaglobulinemia é o aumento de globulinas gama no plasma como ocorre freqüentemente em doenças infecciosas crônicas.)

INTRODUÇÃO
É bem sabido que hemofílicos representam um grupo de risco para a infecção por HIV-1, em conseqüência do fato de que os indivíduos afetados são freqüentemente obrigados a receber produtos derivados do sangue, os chamados fatores VIII e IX. Nesses sujeitos, assim como para outros indivíduos pertencentes ao grupo de risco para infecção por HIV-1, a soro-conversão é geralmente associada com considerável aumento dos níveis de linfócito CD8 + circulante comparado a pacientes soronegativos. Em particular, vários estudos têm mostrado que o número absoluto de células TCD8+ eleva-se progressivamente da soro-conversão durante os primeiros 6 meses, com aumento não-adicional ocorrendo durante os dois ou três anos seguintes. A diminuição dos linfócitos CD8+ paraleliza com o desenvolvimento total da AIDS.
A população de linfócitos TCD8+ contém células supressoras e citotóxicas. Essas distinções são principalmente baseadas no uso de ensaios funcionais. Em adição, diferentes marcadores têm sido gerados para caracterizar os subgrupos CD8+. Entre eles, um anticorpo monoclonal recentemente produzido reconhecedor de um epítopo do antígeno 1 (LFA-1) associado a linfócito, chamado antígeno S6F1, tem sido alegado por distinguir entre células killer efetoras e supressoras dentro dos linfócitos T CD8+. De fato, a expressão fenotípica do antígeno SF1 nas células CD8+ apresentam uma positividade bimodal (indicando uma curva de freqüência caracterizada por dois picos), permitindo a discriminação de células S6F1+ brilhantemente manchadas, com suposta função citotóxica e células S6F1+ opacas, com atividade supressora associada à produção de imunoglobulinas por linfócitos B. Como estudos in vitro e in vivo com relação à resposta de linfócitos B de indivíduos infectados com HIV-1 tâm revelado uma hiper-ativação generalizada de células B, o presente estudo foi encarregado de determinar o relacionamento entre a expressão do antígeno S6F1 nos linfócitos T CD8+ e a produção espontânea de imunoglobulina in vitro a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) numa série de sujeitos hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-.

PACIENTES E MÉTODOS

Pacientes

Três grupos de sujeitos foram estudados:

1) 15 pacientes hemofílicos para o anticorpo do HIV-1 (com 15-43 anos, média de 29 anos), pertencendo ao estágio III ou IV da classificação Walter Reed, 14 estavam incluídos no primeiro grupo. Todos eles tinham recebido previamente os concentrados de fator VIII ou IX ou crio-precipitados (precipitado que se forma quando um material solúvel é resfriado, principalmente em relação ao precipitado que se forma no plasma sangüíneo normal que foi submetido à precipitação por frio e que é rico em FVIII.) sobre 500 U/kg por ano. Nenhum deles recebeu somente crio-precipitados.
2) 20 sujeitos hemofílicos HIV-1- (de idade entre 13 e 24 anos, média de 23 anos). Esses sujeitos foram usualmente tratados com crio-precipitados de fator VIII e IX, embora alguns indivíduos também recebessesm concentrados (abaixo de 100 U/kg por ano).
3) 20 sujeitos doadores de sangue de idade alternada.

Sorologia do HIV-1
Amostras de como foram ensaiadas para anticorpos contra o HIV-1 usando um ELISA comercial e a soro-positividade foi confirmada por Western blot.

Análises Fenotípicas

Células do sangue periférico foram manchadas com um painel de MoAbs conjugados diretamente com PE (RD1) ou FITC, incluindo anti-CD3 (T3), anti-CD4(T4), e anti-CD8(T8) para definir linfócitos T e seus sub-conjuntos; anti-CD19(B4) para identificar células B; e anti-CD56 (NKH-1) para reconhecer células natural killer (NK CD3-/CD56+). Todos estes anticorpos foram obtidos de Coulter Immunology (Hialeah, FL). A combinação de anti-CD8 e MoAbs IgG2 (Coulter) foram usados para definir uma ligação não-específica de MoAbs sob estudo para análise da tipificação de células ativadas fluorescentes. Marcadores foram montados /organizados para incluir mais do que 98% dos linfócitos manchados de controle. As células foram analisadas usando um citômetro de fluxo Epic 751 (Coulter) equipado com um computador MDAPS. Dez mil (10.000) células portando o típico amontoado de linfócitos foram marcadas /registradas.

Condição de Cultura da Célula

PBMC (células mononucleares do sangue periférico) foram isoladas através de um gradiente Ficoll-Hypaque e lavadas duas vezes em PBS. As células foram cultivadas em RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) com 10% de soro de feto de bezerro (FCS; Flow Laboratories, Costa Mesa, CA) e 1% de streptomicina/penciclina. Culturas triplicadas de 1x106 PBMC/ml foram incubadas em 24 placas de fundo razo ( Costar, Cambridge, MA) por sete (07) dias numa atmosfera de 37oC com 5% de CO2; depois as supernadantes foram coletadas, filtradas num filtro de 0.25 µm (micrômetro= 10-6m)(Millipore, Bedford,MA) e estocadas a -80oC antes do uso.

Avaliação de liberação de imunoglobulinas na cultura supernadante.

O total de imunoglobulinas na cultura supernadante foi examinado usando-se um método ELISA. Resumidamente, placas microtitre (Coster) foram revestidas com anti-imunoglobulina (IgG + IgA + IgM; Dako, Copenhagen, Denmark) , anticorpos policlonais em 0.015 carbonato de sódio M amenizado de PH 9.6 a 4oC durante a noite. As culturas de supernadantes foram diluídas 1:10 em RPMI contendo 10% de FCS, também, adicionadas e incubadas por 3 horas na temperatura ambiente. Após a lavagem, anticorpos anti-imunoglobulina humana conjugados com peroxidase em meio contendo 10% de FCS e 0.5% de Tween 20 (Sigma Chemichal CO, ST Louis, MO) foram adicionados em cada qual e as placas foram incubadas no escuro por 20 minutos a 37oC. A reação foi então parada pela adição de 2M H2SO4 e a concentração foi lida em 492nm.

Purificação dos Linfócitos CD8+

As amostras de 8 hemofílicos HIV-1+ e 10 hemofílicos HIV-1-, pacientes em estudo, foram enriquecidas para linfócitos CD8 usando uma versão modificada do método previamente descrito. A suspensão de células foi inicialmente diminuída de células aderentes por incubação por 45 minutos em louça plástica Petri a 37o em uma atmosfera de 95% de ar 5% de CO2. Os linfócitos CD8+ foram purificados adicionalmente por remoção de linfócitos CD4+, CD19+ e CD16+ usando microsferas (glóbulos de material radio-marcado como albumina macro-carregada medindo cerca de 15 mícrons) magnéticas revestidas com IgG anti-camundongo (Dynakads, Dynal, Noway) de acordo com o método já mencionado. Rapidamente, após a incubação (45 min a 4oC) das células em suspensão obtidas como acima (descrito) com anti-CD4 (GKT4, Ortho, Raritan, NJ), anti-CD19 (Leu-12, Becton Dickinson, Mountain View, CA) e anti- CD16 (Leu-11a, Becton Dicleinson) MoAbs, 40x106 contas (unidades?) foram incubadas com 10x106 células/ml por 30 minutos a 4oC sob contínua e lenta rotação. As células agregando-se em roseta (em forma de rosa) revestidas com contas de anticorpo foram então isoladas e removidas por aplicação de um sistema magnético na parede externa dos tubos de teste por 2 minutos. Seguindo este procedimento de múltiplas etapas de seleção negativa, mais do que 97% das células estavam viáveis quando testadas pelo teste de exclusão de azul de tripano (corante azo-ácido usado para coloração vital do sistema reticulo-endotelial, túbulos uriníferos e células em cultura de tecido) e mais de 90% expressavam o antígeno CD8.

A Atividade Supressora dos Linfócitos CD8+

Para acessar a atividade supressora dos linfócitos CD8+, culturas triplicadas de 2x105 PBMC de doadores normais foram co-cultivadas com populações de 5x104 linfócitos enriquecidos com CD8+ de pacientes hemofílicos HIV-1+ ou HIV-1- na presença de 1% de mitógeno (substância que estimula a mitose) (PWM) (Sigma) em 24 placas (Costar) por 7 dias a 37oC em atmosfera com 5% de CO2. Essas doses e tempos foram previamente demonstradas por induzir a máxima produção de imunoglobulina por doadores normais de PBMC. A porcentagem de síntese de imunoglobulina de supressão foi calculada de acordo com a fórmula seguinte: porcentagem de imunolobulina de supressão= (1 – produção de imunoglobulina em presença de células CD8+/produção de imunoglobulina na ausência de células CD8+) x100.

Análises Estatísticas

Todos os dados foram expressados como meio-termo + S.E.M. Comparações os grupos foram feitas usando o teste Wilcoxon ordem de soma. Co-relações entre coeficientes foram calculadas usando análise de co-relação de ordem de Spearman. Um valor de P < 0.05 foi aceito como significativo.

Resultados

A tabela I apresenta os resultados das análises fenotípicas. O número de linfócits CD3+ estava reduzido nos pacientes HIV-1+ em relação aos hemofílicos HIV-1-. Linfócitos CD8+ estavam significativamente aumentados nos hemofílicos comparados com doadores normais; nenhuma diferença foi observada entre indivíduos HIV-1+ e HIV-1-.Análises de corante duplos demonstraram que mais de 95% das CD8+ expressam o antígeno CD3, indicando a origem T dos linfócitos CD8+ em pacientes hemofílicos. As células CD4+ foram grandemente reduzidas nos pacientes infectados com HIV-1 comparados aos hemofílicos HIV-1- e controles normais. Ambos os linfócitos CD56+ e CD19+ foram significativamente reduzidos nos sujeitos HIV-1+ comparados aos hemofílicos HIV-1-.
Embora o número de linfócitos CD8+ expressando o antígeno S6F1 fosse comparável em ambos os grupos hemofílicos, a proporção de linfócitos CD8+/S6F1+ luminosos versus CD8+/S6F1+ opaco foi significativamente diferente. De fato, a maioria dos linfócitos CD8+ nos indivíduos HIV-1+ expressavam o antígeno S6F1 em alta densidade (proporção de luminosos/opacos de 3.97 + 0.61), enquanto a população de CD8+ de pacientes HIV-1- apresentou uma razão de luminosos/opacos consistente com a de indivíduos normais (0.75 + 0.10 versus 1.02 + 0.08, P,NS). A figura 1 mostra o padrão típico de expressão do antígeno S6F1 numa representação de hemofílicos HIV-1+, HIV-1- e controles saudáveis. (Obs.: Os hemofílicos HIV-1+ apresentam muitíssimos S6F1 brilhosos e pouquíssimos opacos; os hemofílicos HIV-1- apresentam poucos brilhosos e muitos opacos e os controles saudáveis apresentam poucos brilhosos e muitíssimos opacos.)
Como mostrado na tabela 2, a síntese espontânea de imunogloulina in vitro aumentou significativamente em pacientes HIV-1+ comparados com pacientes HIV-1- e controles. Em adição, uma forte correlação positiva foi demonstrada entre a produção de imunoglobulina e a razão de CD8+/S6F1+ brilhosa/opaca (P<0.0001), indicando um decréscimo relevante da atividade supressora em pacientes HIV-1+. De acordo com esses dados, as células CD8+ purificadas de sujeitos HIV-1+ (mais do que 60% CD8+/S6F1+ brilhosas) apresentaram marcadamente reduzida a atividade supressora em produção de imunoglobulinas em células B normais dirigida por PWM comparada com células CD8+ de hemofílicos HIV-1-.

Discussão

Neste estudo nós demonstramos que os linfócitos T CD8+ expressam o antígeno S6F1 em alta densidade nos pacientes hemofílicos HIV-1+. Este achado foi fortemente co-relacionado com um aumento espontâneo de produção da imunoglobulina in vitro.
Independentemente de infecção por HIV-1, o número de linfócitos CD3+ CD8+ é normalmente aumentado em pacientes hemofílicos em comparação com a população normal. Esse achado é principalmente relacionado ao fardo antigênico (concentrados de fator VIII) que os sujeitos hemofílicos recebem usualmente como terapia anti-hemorrágica devido à sua condição clínica. Entretanto, a expressão do antígeno S6F1 apresenta diferente comportamento, de acordo com a soro-conversão para o HIV-1. De fato, um aumento consistente na população de CD8+/S6F1+ brilhosos pode ser documentada somente em pacientes infectados com HIV-1, enquanto os hemofílicos HIV-1- apresentam proporção de CD8/S6F1 brilhante/opaca consistente com aquela dos indivíduos saudáveis. Estes resultados indicam que uma co-relação direta existe entre a soro-conversão do HIV-1 e a alta expressão do antígeno S6F1 nas células T CD8+.
Estudos diferentes têm demonstrado que linfócitos CD8+ apresentam um perfil fenotípico peculiar durante a infecção do HIV-1. Uma redução de linfócitos CD8+ corados opacamente (pertencendo ao sub-conjunto NK) tem sido relatado em associação com o progressivo aumento de linfócitos CD8+ corados brilhantemente (pertencendo à linhagem T). Além disso, a proporção de linfócitos T CD8+ co-expressando CD38, CD57 e HLA-DR é aumentada nos sujeitos infectados com HIV-1, e tem sido sugerido que este parâmetro correlaciona-se com a progressão da doença.
Desde que as células brilhantes para CD8+/S6F1+ têm sido relatadas por serem citotóxicas in vitro, e incluem o sub-conjunto específico reativo contra células infectadas pelo HIV-1, nossos dados são consistentes com a possibilidade de que a infecção viral induz um deslocamento junto ao desenvolvimento de linfócitos citotóxicos CD8+. De acordo com este achado, poderia ser sugerido que o número de células CD8+/S6F1+ opacas com atividade supressora torna-se marcadamente reduzido.
Para verificar se a alta proporção de células CD8+/S6F1+ brilhantes/opacas poderia estar associada com uma reduzida atividade supressora in vitro, nós testamos a produção espontânea de imunoglobulina em hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-. Nossos dados demonstraram que um aumento marcado da síntese de imunoglobulina in vitro pode ser demonstrado somente em indivíduos HIV-1+. Embora dados similares tenham sido noticiados por diferentes autores, a interpretação deste fenômeno é ainda controverso. De fato, achados experimentais indicam que tanto uma deficiência mediada pelo HIV-1 de linfócitos B, de cooperação com células B e TCD4+, uma atividade assessória deficiente de monócitos, ou a combinação dessas possibilidades pode ser observada nos indivíduos HIV-1+. Nossos resultados sugerem que a redução progressiva do sub-conjunto CD8+/S6F1+ opaco com atividade supressora deve representar um mecanismo adicional envolvido na aumentada produção de imunoglobulina in vitro. Além disso, nós proporcionamos evidência de uma abafada capacidade de suprimir a síntese de imunoglobulinas dirigida por PWM in vitro por linfócitos CD8+ purificados (a maioria expressando o antígeno S6F1 brilhantemente) em hemofílicos HIV-1+. Finalmente, a demonstração de que alguns casos raros de hemofílicos HIV-1+ com uma razão normal de CD8+/S6F1+ brilhante/opaca apresenta uma produção espontânea de imunoglobulina in vitro consistente com indivíduos HIV-1-, mais confirmam esta interpretação, (F.Cavallin, observações pessoais.)Embora o relacionamento que nós documentamos entre o aumento de linfócitos CD8+/S6F1+ brilhantemente corados e a alta liberação espontânea de imunoglobulinas seja um achado in vitro, é interessante especular que um fenômeno similar deve tomar espaço in vivo. Mais estudos são necessários para testar esta possibilidade.
Em contraste, os dados referidos neste estudo indicam que a soro-conversão para o HIV-1 está associada com o aumento do número de células brilhantes para CD8+/S6F1 e uma redução dos linfócitos CD8+/S6F1+ opacos nos sujeitos hemofílicos. Essa mudança fenotípica está co-relacionada com uma síntese alterada in vitro de imunoglobulina, indicando que a redução do potencial supressor (linfócitos CD8+/S6F1+ opacos) devem estar envolvidos nos mecanismos que levam à super-síntese de imunoglobulinas durante a infecção por HIV-1.