LINFÓCITOS TCD8+ REGULAM A RESPOSTA ARTERIOGÊNICA À ISQUEMIA POR INFILTRAÇÃO DO SÍTIO DE DESENVOLVIMENTO DOS VASOS COLATERAIS E RECRUTAMENTO DE CÉLULAS CD4+ MONONUCLEARES ATRAVÉS DA EXPRESSÃO DA INTERLEUCINA 16 (IL-16)
In: http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/113/1/118

EXPERIÊNCIA:

Estudos prévios têm demonstrado que macrófagos e linfócitos T CD4+ atuam em papéis centrais no desenvolvimento colateral. Evidências indiretas sugerem que células TCD8 também tenham um papel. Assim, após a isquemia cerebral aguda, as células T CD8+ infiltram o espaço perivascular e secretam interleucina 16 (IL-16), um potente quimo-atrativo para monócitos e células T CD4+. Nós testamos se os linfócitos T CD8+ contribuem para o desenvolvimento de vasos colaterais e se a falta de células T CD8+ circulando impede a expressão de IL-16, debilitam o recrutamento de células mononucleares CD4+ e reduzem o crescimento de vasos colaterais após a ligação da artéria femoral em camundongos CD8 -/-.

MÉTODOS E RESULTADOS:

Após a excisão cirúrgica da artéria femoral, as imagens de perfusão a laser Doppler demonstraram reduzida recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/- comparados com camundongos C57/BL6 (isquêmicos/ não-isquêmicos do membro no 28o dia, 0.66 + 0.04 versus 0.87 + 0.04, respectivamente; P< 0.01). Isto resultou em maior atrofia do músculo da panturrilha (média de área fibrosa 785+68 versus 1067+69 µm2, respectivamente; P<0.01) e aumentado contingente de tecido fibroso (10.8 +1.2% versus 7+ 1%, respectivamente; P<0.01). Além disso, camundongos CD8 -/- apresentaram reduzida expressão de IL-16 e recrutamento de células T CD4+ reduzido no sítio de desenvolvimento de vasos colaterais. Células T CD8+ exógenas, infundidas aos camundongos CD8 -/- imediatamente após a ligação da artéria femoral, direcionaram-se seletivamente para o membro isquêmico traseiro e expressaram IL-16. A restauração da expressão de IL-16 resultou em significativa infiltração de células CD4 mononucleares do membro isquêmico, recuperação mais rápida do fluxo sangüíneo, e reduzida atrofia/fibrose do músculo traseiro do membro. Quando células T CD8+ deficientes em IL-16 (IL-16 -/-) foram infundidas em camundongos CD8 -/- imediatamente após a ligação da artéria femoral, elas direcionaram-se seletivamente para o membro traseiro isquêmico mas foram incapazes de recrutar células CD4+ mononucleares e não melhoraram a recuperação do fluxo sangüíneo.

CONCLUSÕES:

Esses resultados demonstraram que as células T CD8+ contribuem com muita importância para a fase inicial do desenvolvimento colateral. Após a ligação da artéria femoral, as células T CD8+ infiltram o sítio de crescimento dos vasos colaterais e recrutam as células mononucleares CD4+ através da expressão de IL-16. Nossos estudos proporcionam evidência adicional do papel significativo do sistema imune na modulação do desenvolvimento colateral na resposta à isquemia periférica.
(Circulation.2006; 113:118-124)

Aterosclerose é a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Um dos mecanismos compensatórios envolvidos na resposta ao enfraquecimento do fluxo sangüíneo que segue o desenvolvimento da placa aterosclerótica é a formação de vasos colaterais.

PERSPECTIVAS CLÍNICAS:

Recentemente tem sido mostrado que componentes celulares dos sistemas imune e inflamatório atuam num papel central na modulação do desenvolvimento de vasos colaterais. Em particular, várias investigações têm demonstrado a importância dos monócitos/macrófagos na colaterogênese (angiogênese colateral). Um estudo indicando que camundongos “despidos” (que são deficientes em todos os componentes da população de células T) exibem um pronunciado déficit em respostas colaterais, sugeriu um possível papel dos sub-conjuntos CD4+ e CD8+ na aterogênese colateral. O conceito de que linfócitos T CD4+ atuam tal como um papel (repertório) foi confirmado por recentes demonstrações de que na ausência dos linfócitos T CD4+, as respostas inflamatória e colateral após a indução da isquemia são enfraquecidas.
Estudos de infartos cerebrais em humanos sugerem que linfócitos TCD4+ não são as únicas células T envolvidas na ateriogênese colateral. Assim, dentro das primeiras poucas horas de injúria, células T CD8+ infiltram a periferia dos infartos cerebrais. Uma vez lá, essas células secretam interleucina 16, um potente quimoatrativo para várias células dos sistemas imune e inflamatório, incluindo monócitos e células TCD4. Dados os papéis dos monócitos e dos linfócitos T CD4 no processo da ateriogênese colateral, a presente investigação foi designada para testar a hipótese de que linfócitos T CD8+ são críticos para o desenvolvimento colateral induzido por isquemia e que este efeito é dependente da expressão do quimoatrativo de células imunes IL-16. Neste objetivo, nós usamos um modelo de isquemia do membro traseiro para determinar se a recuperação do fluxo sangüíneo mediada pelo colateral (fluxo) após aguda indução de isquemia está diminuída em camundongos sem CD8 ativa (CD8-/-) em comparação com o camundongo controle de tipo selvagem C57BL/6.

MÉTODOS:

MODELO DE CAMUNDONGO COM ISQUEMIA UNILATERAL DO MEMBRO POSTERIOR (TRASEIRO).

Sob narcose com xilazina [um sedativo hipnótico e anestésico ] (40 mg/kg) e cetamina [anestésico](100mg/kg) intra-muscular, camundongos CD8a-/- e C57BL/6 de doze semanas de idade (Laboratórios Jackson) foram submetidos à ligação cirúrgica da artéria femoral esquerda para criar uma isquemia unilateral do membro traseiro. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado animal do Instituto de Pesquisas Med Star.

IMAGEM DE PERFUSÃO:

Repetidas medições do fluxo sangüíneo do membro posterior na região de interesse (desde a rótula do joelho até o meio do pé) foram obtidas em linha de base, imediatamente pós operatoriamente, e serialmente durante 4 (quatro) semanas com imagem de perfusão a laser Doppler (LDPI) (Instrumentos Moor). A perfusão é expressada como uma razão do membro esquerdo (isquêmico) para o direito (normal). A região de interesse não inclui o pé distante porque essa área é mais sujeita à isquemia nesse modelo de animal (camundongo).

AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO DO MEMBRO E DANO ISQUÊMICO IN VIVO:

A avaliação semi-quantitativa de uso diminuído do membro isquêmico e a medida semi-quantitativa do dano isquêmico foram realizados em série.


ANÁLISES DE WESTERN BLOT (transferência de proteínas de um gel de agarose para uma membrana de náilon ou nitrocelusose, onde a proteína procurada pode ser identificada por corantes) E IMUNO-HISTOQUÍMICAS:

Em diferentes pontos de tempo após a cirurgia, os músculos adutores (músculos adutores são os que promovem o alongamento do membro) estavam homogeneizados em mistura de gelo frio, e as proteínas foram extraídas, separadas com SOS-PAGE, e manchadas (tingidas) dentro de nitrocelulose (Invitrogen). Manchas foram incubadas com anticorpos primários (1:250 para anti-IL-16; 1:1000 para α-tubulina; Santa Cruz). Nos mesmos pontos de tempo, os músculos adutores foram seccionados com criostato, fixados em metanol, bloqueados e incubados durante a noite com anticorpos primários (1:50 para anti-IL-16; 1:50 para anti-CD4; Santa Cruz). DAPI foi usado para obter faixas nucleares. Um microscópio óptico (Olympus BX41, Olympus) e um software de Imagem Pro Plus (Media Optronics) foram usados para analisar a infiltração celular.

ANÁLISES HISTOLÓGICAS:

Após a avaliação durante 28 dias completos, os músculos do membro traseiro foram removidos e fixados em formalina. Sobre a coxa anterior, secções foram preparadas e tingidas com solução van Gieson. Somente as artérias foram contadas. Veias foram identificadas como artérias se tinham lâminas elásticas internas contínuas, ao menos uma camada de eixo muscular, e uma área matematicamente derivada maior que 30µm2. O número de artérias presentes em cada coxa foi expressado como a razão do número de artérias para a área superficial do músculo analisado. A partir do gastrocnêmio (panturrilha) , secções foram preparadas e depois tingidas com Sirius vermelho, e a fração volumétrica do colágeno foi determinada. Nas mesmas secções, a área muscular foi calculada e dividida pelo número de fibras musculares presente no campo para obter a média do tamanho da fibra para um campo dado.

EXPERIMENTOS DE RESGATE POR INFUSÃO DE CÉLULAS CD8+ A PARTIR DE CAMUNDONGOS C57BL/6 E CAMUNDONGOS IL-16-/- :

Células mononucleares foram isoladas a partir de baços de camundongos C57BL/6 ou IL-16 -/- (em segundo plano C57BL/6) de idade e gênero correspondentes e separados em frações de CD8+e CD8- com seleção positiva (não sendo por exclusão) por classificação magnética (Miltenyi Biotecnology, Inc).
Na indução de isquemia, 3x 105 células CD8+/IL-16 -/- foram infundidas intra-venosamente em camundongos CD8 ‑/-. Para avaliar o direcionamento de células injetadas, um sub-grupo de camundongos foi injetado com o mesmo número de células classificadas por CFSE [citometria de fluxo com sonda eletrônica](Molecular Probes, Inc). Os animais foram sacrificados serialmente durante 48 horas e músculos foram preparados por detecção de fluorescência. A porcentagem de células marcadas em diferentes campos da infiltração inflamatória foi calculada.
ANÁLISES ESTATÍSTICAS:
Todos os resultados foram apresentados como significado de + (mais ou menos) SEM [microscopia com sondagem eletrônica – scanning electron microscopia]. Um teste T Student emparelhado foi usado para comparar os valores brutos e analisados. REMANOVA foi usado para comparar valores entre os grupos todo o tempo. Um valor de P=0.05 foi considerado significativo.

FLUXO SANGÜÍNEO DO MEMBRO TRASEIRO RECUPERADO APÓS A LIGAÇÃO DA ARTÉRIA FEMORAL

Em camundongos controle, o fluxo sangüíneo foi cortado precipitadamente/acentuadamente após a cirurgia, permaneceu diminuído por três dias, aumentado para 70% do valor no membro não isquêmico por sete dias, e finalmente retornou aos níveis próximos do normal ao final do acompanhamento. Uma redução similar do fluxo sangüíneo do membro posterior ocorreu em camundongos CD8 -/-, mas em contraste com os camundongos controle, a recuperação do fluxo foi marcadamente atenuada. Comparado com C57BL/6, o fluxo em camundongos CD8-/- foi significativamente menor no terceiro dia, uma diferença persistente em cada um dos pontos de tempo subseqüentes (7o, 14 o e 28 o dias); o fluxo nunca atingiu mais do que 65% daquele medido no membro contra-lateral. Em camundongos controle, o uso ativo do pé direito cortado significativamente após a cirurgia permaneceu diminuído por sete dias, e gradualmente retornou para os níveis próximos do normal em 28 dias (contagem de enfraquecimento locomotor, 0.23 + 0.16). Uma redução abrupta similar no uso ativo do membro posterior ocorreu nos camundongos CD8-/-, mas a recuperação foi marcadamente atenuada no sétimo dia (contagem de enfraquecimento da atividade locomotora 1.7+ 0.18; P<0.05> 0.05) e resultou em uma aumentada incidência de auto-amputações menores pelo 28o dia. Ao final do estudo, animais CD8-/- apresentaram uma significativa redução na densidade das artérias colaterais no alto da coxa do membro traseiro operado em comparação com os camundongos C57BL/6 (0.33 + 0.02 versus 0.44 + 0.04 artérias > 300µm2/mm2 de área muscular; P < 0.05). Nenhuma diferença foi observada nos membros não operados.

CONDIÇÃO DE SAÚDE DO ANIMAL APÓS A ISQUEMIA DO MEMBRO TRASEIRO INDUZIDA CIRURGICAMENTE

Os camundongos CD8-/- podem ser mais suscetíveis do que os de tipo selvagem à infecções sobrepostas resultantes da cirurgia, as quais afetam sua capacidade de recuperação. Para excluir essa possibilidade, pelo menos enquanto relacionadas a infecções bacterianas, nós cultivamos espécies do músculo isquêmico no sétimo dia após a cirurgia. Nenhum crescimento bacteriano foi detectado em cada grupo. Assim, a incidência aumentada de necrose tecidual no membro isquêmico de camundongos CD-/- não pode ser atribuída à gangrena séptica. Mais do que isso, os camundongos CD8-/- exibiram durante o acompanhamento o mesmo ganho de peso que os camundongos C57BL/6, demonstrando uma ausência de qualquer efeito principal da cirurgia na saúde geral desses camundongos.