(contiuação de LINFÓCITOS TCD8+ REGULAM A RESPOSTA ARTERIOGÊNICA À ISQUEMIA POR INFILTRAÇÃO DO SÍTIO DE DESENVOLVIMENTO DOS VASOS COLATERAIS E RECRUTAMENTO DE CÉLULAS CD4+ MONONUCLEARES ATRAVÉS DA EXPRESSÃO DA INTERLEUCINA 16 (IL-16)
In: http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/113/1/118)

EFEITO DA RECONSTITUIÇÃO DAS CÉLULAS CD8+ EM CAMUNDONGOS CD8-/- SUJEITADOS À ISQUEMIA DO MEMBRO TRASEIRO:

Imediatamente após a cirurgia infundimos intravenosamente nos camundongos CD8-/- células T CD8+ purificadas derivadas do baço de camundongos controle (do grupo CD8+). As células CD8+ exógenas direcionaram-se seletivamente para áreas de infiltração de células inflamatórias do membro traseiro isquêmico. Nenhuma célula CD8+ exógena foi encontrada infiltrando fibras musculares do membro traseiro colateral. O fluxo sangüíneo ao entorno (fora do centro) diminuiu nos camundongos CD8-/- que receberam infusão de células CD8+ purificadas (grupo tratado com CD8+) em comparação com os camudongos que receberam esplenócitos (células do baço) CD8- (grupo tratado com CD8-). Durante o acompanhamento, em todos os pontos de tempo, a recuperação do fluxo sangüíneo nos camundongos do grupo tratado com CD8+ foi similar àqueles camundongos de tipo selvagem C57BL/6. Esses camundongos exibem reduzido dano isquêmico, como observado por diminuída aparência do membro e reduzido enfraquecimento locomotor.

EXTENSÃO DO DANO ISQUÊMICO FORA DO MEMBRO:

Para confirmar os resultados derivados de dados LDPI (Imagem de Perfusão a Laser Doppler) e da análise patológica do desenvolvimento de vasos colaterais, nós procedemos a uma estimativa/avaliação adicional independente do dano isquêmico dos membros traseiros operados por análise da extensão de fibrose/atrofia do músculo gastrocnêmio (da panturrilha). O exame de necropsia do músculo da barriga da perna 28 dias após a cirurgia revelou um conteúdo pronunciado de tecido mais fibrótico (10.8 + 1.2% versus 6.6 + 1.3%; P<0.01) e aumentada atrofia da fibra muscular em CD8-/- comparados com camundongos de tipo selvagem C57BL/6 (indica área de fibra, 785 + 68 versus 1067 + 69 m2; P<0.01). Além disso, a melhora na recuperação do fluxo sangüíneo do membro traseiro observada no grupo tratado com CD8+ foi associada com reduzida fibrose muscular e atrofia. Nenhuma diferença de fibrose/atrofia foi detectada no âmbito do músculo entre os grupos originais de camundongos CD8-/- e camundongos tratados com CD8-.

RESPOSTAS DE INFLAMAÇÃO TECIDUAL À ISQUEMIA:

Nós examinamos o músculo adutor do membro operado 48 horas após a ligação da artéria. Manchas de hematoxilina (corante usado em histologia para núcleos e cromossomas celulares, estrias musculares transversais e células eterocromafins; a substância cristalina contendo o corante hematoxylon campechianum (pau de Campeche) do qual é extraído com éter) e de eosina (derivado de fluoresceína usado como corante ácido fluorescente para coloração e concentrações citoplasmáticas em histologia) revelaram diferentes números de leucócitos inflamatórios nos camundongos de tipo selvagem versus camundongos CD8-/-. Em particular, o número de leucócitos CD4+ infiltrantes era mais baixo em camundongos CD8-/- do que nos camundongos de tipo selvagem. Além disso, nos animais de controle, a IL-16 foi induzida após a ligação da artéria femoral e foi expressada no sítio de infiltração da célula mononuclear. Em contraste, a expressão da IL-16 após a isquemia foi reduzida nos camundongos CD8-/-.

A DEFICIÊNCIA DE IL-16 DIMINUIU A CAPACIDADE DE CÉLULAS CD8+ EXÓGENAS RESTITUÍREM A RECUPERAÇÃO DO FLUXO SANGÜÍNEO EM CAMUNDONGOS CD8-/- :

Em camundongos CD8-/-, a expressão de IL-16 no músculo isquêmico foi observada no sítio de infiltração da célula exógena em dois dias após a ligação da artéria femoral e de infusão de células CD8+. A co-localização de CFSE e sinal fluorescente de IL-16 demonstrou que, em camundongos reconstituídos CD8-/-, as células CD8+ exógenas expressam L-16. Em 48 horas após a ligação da artéria femoral, no membro isquêmico de camundongos CD8-/- tratados com células CD8+, a expressão de IL-16 foi quase igual àquela observada nos camundongos de tipo selvagem C57Bl/6. A presença dessa citocina está associada com um aumentado número de leucócitos infiltrantes nos membros isquêmicos de camundongos CD8-/- tratados com células CD8+ comparados com camundongos tratados com células CD8-. Finalmente, quando as células T CD8+ deficientes em IL-16 foram infundidas em camundongos CD8 -/- após a ligação da artéria femoral, elas seguiram para o membro traseiro isquêmico (dados não apresentados), mas nós não observamos um aumento no recrutamento de células mononucleares CD4+ para os membros traseiros isquêmicos. Essa inibição do recrutamento de células CD4+ está associada com a falta de capacidade para resgatar a recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/- e atrofia muscular mais pronuncada e fibrose do membro isquêmico (dados não mostrados).

DISCUSSÃO:

Os principais achados de nosso estudo são:

1) Desenvolvimento colateral em resposta à isquemia é enfraquecido em camundongos CD8-/- comparados aos camundongos de tipo selvagem C57BL/6 de controle;
2) Camundongos CD8-/- têm reduzida expressão de IL-16 após a ligação da artéria femoral e diminuída resposta inflamatória no sítio de crescimento dos vasos colaterais;
3) Células T CD8+ purificadas derivadas do baço, quando infundidas em camundongos CD8-/-, localizam-se seletivamente no membro isquêmico, recrutam células CD4+ mononucleares, e aumentam a recuperação do fluxo sangüíneo; e
4) A habilidade das células T CD8+ para regular respostas inflamatórias e recuperação do fluxo sangüíneo após a isquemia é dependente da expressão de IL-16.

Um dos importantes pontos ao final do nosso estudo está baseado na avaliação do fluxo no membro por expressão de LDPI (Doppler). O fluxo estimado de LDPI correlaciona-se bem com a perfusão estimada de microsfera e o número e tamanho da segunda e terceira geração de artérias colaterais bifurcadas/ramificadas. (Obs.: microsferas são diminutos glóbulos de material radio-marcado como albumina macro-carregada, medindo cerca de 15 mícrons.) De acordo com esses dados baseados em LDPI, nós encontramos que o número de artérias colaterais aumentaram significativamente no membro operado dos camundongos de tipo selvagem, mudanças que eram marcadamente atenuadas nos camundongos CD8-/-.

O reduzido desenvolvimento de vasos colaterais observado nos camundongos CD8-/- correlaciona-se com um enfraquecimento funcional mais prolongado e mais severo do membro, uma aumentada incidência de necrose isquêmica, e uma aumentada incidência de auto-amputação. Como um parâmetro independente da severidade de injúria isquêmica em camundongos CD8-/-, nós avaliamos a histologia do músculo da panturrilha quatro semanas após a ligação da artéria femoral. Nesses animais, um determinado tamanho de fibra muscular era marcadamente reduzido comparado com o camundongo de tipo selvagem uma mudança associada com aumento de fibrose muscular.

As diferenças de fluxo entre o camundongo de tipo selvagem e o depletado (CD8-/-) provavelmente superam o limite do fluxo da viabilidade tecidual (pertencem àquele cujas células morrerão). Assim, a diminuição do fluxo em camundongos CD8-/-, embora relativamente pequena, provavelmente contribui para as grandes mudanças que nós observamos na atrofia muscular e na fibrose.

Para provar definitivamente que o desenvolvimento diminuído do fluxo colateral que nós observamos no camundongo CD8-/- era causado por um suprimento deficiente de células T CD8+, nós procedemos a um experimento de resgate no qual nós infundimos células T CD8+ purificadas derivadas do baço em camundongos CD8-/-. As células T CD8+ direcionaram-se seletivamente para o sítio ativo do desenvolvimento colateral, restauraram a recuperação do fluxo para níveis observados nas linhagens parentais de tipo selvagem, e preservou a estrutura muscular da panturrilha, como demonstrado por uma redução da atrofia e fibrose.
Quando nós avaliamos o padrão de resposta inflamatória nos membros isquêmicos de animais CD8-/-, nós observamos que o número global de células mononucleares infiltrando o interstício entre as fibras musculares era mais baixo do que o visto em camundongos de tipo selvagem C57BL/6J. Em particular, o número de células CD4+ infiltrantes foi reduzido em 50%.

IL-16 é um potente quimioatrativo para várias células imunes tais como monócitos, eosinófilos e células dendríticas. Similarmente, a IL-16 tem sido caracterizada como um ligante natural para CD4, através da qual ela induz a resposta migratória nas células T CD4+. A IL-16 também é provável como reguladora do recrutamento e ativação de células TH-1 em sítios de inflamação tais como aqueles de crescimento ativo de vasos colaterais. Quando nós acompanhamos a expressão de IL-16 após a ligação da artéria femoral dos músculos adutores, nós observamos uma falta de indução dessa citocina nos camundongos CD8-/-. De relevância, dentro das primeiras horas de isquemia, as células CD8+ infiltraram a periferia de infartos cerebrais e secretaram IL-16.

Em nossos experimentos, as células TCD8+ de camundongos IL-16 -/- não melhoraram a recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/-, indicando que Il-16 é um possível efetor neste processo. A falta do efeito no fluxo sangüíneo também foi associada com um reduzido recrutamento de células mononucleares CD4+ no sítio de desenvolvimento de vasos colaterais demonstrando assim a importância do papel desta citocina nas fases iniciais da resposta inflamatória à isquemia periférica.

Os colaterais são origem, ao menos em parte, de vasos pré-existentes localizados próximo ao sítio de obstrução arterial e por isso próximo ao tecido isquêmico. Embora pouco ou nenhum fluxo ocorra nesses vasos sob condições normais, o declive de pressão criado pela obstrução distante promove sua abertura e o estabelecimento do fluxo. O aumento no fluxo sangüíneo e a deformação da força ativa as células endoteliais, com subseqüente sobre-regulação de moléculas de adesão celular e citocinas e recrutamento de células inflamatórias resultante.

A presente investigação, em conjunção com os dados avaliados na literatura, demonstra que os linfócitos contribuem importantemente para o processo de remodelagem arterial que leva à gênese de vasos colaterais. Após a indução de isquemia, a resposta inflamatória e o desenvolvimento de vasos colaterais são comprometidos em camundongos deficientes em células T CD4+. No sítio de ativo crescimento de vasos colaterais, na ausência das células T CD4+, existe diminuído recrutamento de macrófagos, os quais são determinantes celulares centrais para o crescimento ótimo de vasos colaterais. Essas células localizam-se à volta das colaterais e secretam vários fatores pró-angiogênicos. Nossos resultados sugerem que células T CD8+ são uma das primeiras respondedoras para o estímulo local envolvido no crescimento colateral. Quando essas células infiltram a região de desenvolvimento de colaterais, elas expressam IL-16, a qual contribui para o recrutamento de células mononucleares CD4+ (células T e macrófagos). Essas células, por sua vez, secretam muitas das citocinas que atuam num papel crítico na colaterogênese.