O HIV-1 Liga-se Preferencialmente a Receptores Coligados Temporariamente com a Elastase na Superfície Celular.



RESUMO

A elastase do leucócito humano (HLE) interage com a glicoproteína (gp) 41 do HIV-1, sugerindo uma função receptora não enzimática para a HLE no contexto do HI-1. A HLE é encontrada localizada na superfície celular, mas não nos grânulos (partícula semelhante a um grão; exemplos: a) os grânulos alfa, semelhantes a bastões ou filamentosos são encontrados em vários tipos de células, principalmente nas plaquetas onde contêm proteínas secretoras como o fibrinogênio, a fibronectina, a trombospondina e o vWF; b) grânulos específicos dos leucócitos, basófilos, eosinófilos e neutrófilos em oposição aos grânulos azurófilos não específicos; c) grânulo de zimogênio encontrado nas células acinares do pâncreas. Stedman) em clones permissivos ao HIV-1, e nos grânulos, mas não na superfície celular em clones não permissivos ao HIV-1. A ligação do HIV-1 e a infectividade apresenta dependência à dose do ligante natural da HLA, o inibidor de proteinase alfa1, ( 1antitripsina, 1PI). As quimiocinas impedem, enquanto a 1PI promove, a coligação da HLE com os receptores canônicos do HIV. A recente demonstração de que a diminuição do RNA viral está significativamente correlacionado com a diminuição da 1PI em indivíduos soropositivos está consistente com um modelo no qual a HLE e a 1PI podem servir como um co-receptor para o HIV e co-fator, respectivamente, e participar potencialmente na patofisiologia da progressão da doença do HIV.

INTRODUÇÃO

Entende-se que a entrada e a fusão do HIV-1 envolvem uma interação inicial entre a glicoproteína do envelope, gp120, e a CD4 na superfície celular. Essa interação expõe um sítio dentro da gp120 que então interage com um co-receptor (isto é, CCR5 ou CXCR4), induzindo uma mudança na conformação dentro da porção gp41 do envelope viral; este conjunto de eventos resulta na inserção do domínio de fusão da gp41 para dentro da membrana celular. A expressão dos receptores de quimiocina específicos na superfície celular e a CD4 são necessários, mas não suficientes, para conferir a permissividade ao HIV-1. A resistência celular à infectividade ao HIV pode ser devida à falência na fusão e entrada, sugerindo que essa restrição associada à diferenciação seja devida a um fator positivo ou negativo.

A comparação entre os sub-clones não permissivos ao HIV e sub-clones U937 permissivos ao HIV revelou uma relativa equivalência entre a CD4 e a CXCR4 na superfície celular e uma falta de CCR5. Uma diferença notável foi que os sub-clones não permissivos, mas não os permissivos, expressaram detectáveis proteinases associadas à grânulos, a catepsina G (CatG) e a elastase do leucócito humano (HLE). Essas mesmas proteinases são conhecidas por estarem associadas à superfície celular em certas situações e por ligarem proteínas do envelope do HIV-1, mas em associação com a dupla camada lipídica, a atividade enzimática e a detecção de antígenos estão ausentes ou comprometidas. Isso sugere que as proteinases associadas à membrana podem exibir funções de receptor não enzimáticas e que a localização, mais do que a expressão do gene, deverá ter impacto na permissividade ao HIV-1.

Tradicionalmente, a atividade de proteinase da HLE tem sido caracterizada nos ambientes aquosos, e os lipídeos da superfície celular são conhecidos por influenciar negativamente sua atividade catalítica além de respaldar uma função não enzimática para a HLE da membrana plasmática. De fato, as ações primárias da HLE na superfície celular e da catepsina G envolvem a adesão, quimiotaxia, e mobilização de células-tronco. As HLE associadas aos grânulos translocam-se rapidamente para a superfície celular em resposta a muitos agonistas (aqueles que se ligam a receptores) incluindo o lipopolissacarídeo (LPS) endotoxina da bactéria, sugerindo que esses sinais de ativação rapidamente mobilizam a HLE para a superfície celular na ausência de síntese celular. Os domínios precisos na HLE que permitem sua associação com a membrana plasmática não são completamente conhecidos, entretanto, o domínio da alfa-1-antitripsina ( 1PI) que inicia a quimiotaxia foi identificado como penta-peptídeo escondido dentro de sua região terminal C. Os pentapeptídeos hidrofóbicos correspondentes encontrados em vários outros inibidores de protease de serina contêm um par de resíduos fenilalanina que compartilham o motivo FXFXX ou FXXFX, onde X representa os aminoácidos hidrofóbicos V,L,I ou M. A identificação de um pentapeptídeo tendo um motivo similar dentro do domínio de fusão da gp41 do HIV-1 (FLGFL) e outras viroses humanas levou à descoberta de uma interação ligante-receptor entre a gp41 e o HLE receptor de 1PI.

Nos pacientes HIV-1 soropositivos, a carga viral está correlacionada com os níveis circulantes de 1PI. Neste estudo, 100% dos pacientes na categoria assintomática da doença manifestaram níveis deficientes de 1PI. Além disso, a infectividade in vitro foi mostrada como altamente correlacionada com a HLE de superfície celular (y2 = 0,81, P= 0,01). Indivíduos com a forma herdada de deficiência em 1PI, especialmente do sexo masculino, são notavelmente suscetíveis à infecções respiratórias. Assim, a deficiência em 1PI adquirida durante a infecção pode ser um mecanismo responsável em parte pela presença da enfisema, patologia pulmonar, e estabelecimento de infecções oportunistas conforme a progressão da doença do HIV-1. A descoberta de que a expressão anormal da quimiocina correspondia à resistênica ao HIV-1 precipitou a identificação dos receptores da quimiocina durante a entrada do HIV-1. A relação entre a 1PI e a doença do HIV-1 sugeriu a participação potencial de um co-receptor adicional cognato para a 1PI. A relação física entre proteinases, inibidores de proteinases e receptores de quimiocina não foram examinados previamente.

RESULTADOS

Diferentes compartimentos sub-celulares ocupados pela HLE em sub-clones permissivos ao HIV-1 e sub-clones U937 não permissivos.

O exame TEM imunohistoquímico de sub-clones U937 revelou a HLE associada com a membrana plasmática nos clones 10 permissivos ao HIV-1. A HLE associada à membrana plasmática nunca foi vista em clones17 não permissivos ao HIV-1 não estimulados (dados não mostrados). Ao invés disso, a HLE foi encontrada em conjuntos no clone 17 associada com corpos de formas irregulares lembrando grânulos. intracitoplasmáticos e densos em elétrons. A localização da HLE em um compartimento interno no clone 17 foi confirmada por CLSM (dados não mostrados). Conjuntos de HLE intracitoplasmáticos nunca foram vistos no clone 10 permissivo. A proteína catepsina G de controle positivo foi encontrada no local das mesmas estruturas que a HLE nos clones 10 e 17, enquanto a NFKB foi encontrada na localidade do citoplasma e da mitocôndria em ambos os clones equivalentemente (dados não mostrados). A descoberta da HLE residindo em estruturas de tipo grânulos em células não permissivas e na superfície celular em células permissivas sugeriu que esses clones tinham sido detidos em diferentes estágios de diferenciação.

A endotoxina LPS, um glicolipídeo encontrado em bactérias Gram-negativas, produz múltiplos efeitos nas células incluindo a liberação da HLE associada ao grânulo, o qual torna-se ligado à membrana plasmática. A liberação do grânulo é mediada pela interação da LPS com dois diferentes receptores de sinalização incluindo a CD14 e as integrinas beta-2 CD11a/CD18, CD11b/CD18, e CD11c/CD18. No plasma, a LBP (proteína ligante de lipopolissacarídeo) facilita a ligação do receptor aos monômeros do LPS por sua ação como proteína de transferência e lipídeo. Quando o clone 17 não permissivo foi estimulado com a presença de LPS e LBP, a HLE foi visualizada por TEM em transporte dos grânulos para a superfície celular, o citoplasma e o espaço extracitoplasmático. Esses resultados sugerem que em resposta ao LPS, a liberação dos grânulos permita a associação da HLE à membrana plasmática na ausência da síntese da proteína.

A análise dos co-receptores do HIV-1 por citometria de fluxo na presença ou ausência da estimulação por LPS foi comparada usando-se três cores de fluorescência. Como esperava-se que a densidade da HLE fosse baixa ou não detectável, o clone 10 permissivo ao HIV-1 foi examinado com ou sem anti-CD4 como um controle de pigmentação. Surpreendentemente, a HLE foi grandemente aumentada quando o clone 10 interagiu primeiro com anticorpos específicos para CD4 e específicos para HLE em seguida; a HLE não foi detectada quando a ordem foi invertida. A explicação para as diferenças na detecção da HLE na superfície de células soltas na presença ou ausência de anti-CD4 não é conhecida, mas evidências sugerem um papel potencial do remodelamento da membrana ou auto-degradação. Em contraste, a ordem de ligação do co-receptor teve influência insignificante na intensidade da fluorescência da CD4 ou da CXCR4. A estimulação do clone 17 não permissivo com a LPS teve pouca ou nenhuma influência na densidade da CD4 ou da CXCR4; entretanto, a expressão da HLE aumentou. Além disso, como com o clone 10, a ordem de ligação ao receptor influenciou a detecção da HLE, mas não da CD4 ou da CXCR4. A expressão relativamente idêntica da HLE induzida por LPS com ou sem LBP é interpretada como resultado dos fatores no soro contido no tecido do meio de cultura meio de cultura do.

A Ligação da HLE com o Domínio de Fusão do HIV-1.

As associações constantes de proteínas solúveis são convencionalmente medidas em 0,15 M de NaCl, pH7,2, para acomodar comparações entre proteínas competindo pelo mesmo ligante solúvel e produzir valores na escala de 106M-1. Para otimizar a ligação de proteínas não solúveis, as associações constantes podem ser determinadas por modificação do sal, pH ou temperatura. Embora uma constante determinada em 0,5 M de NaCl a 0oC não seja diretamente comparável a uma constante determinada em 0,15 M de NaCl a 25oC, cada constante é válida e definitiva para as condições sob as quais a afinidade está mensurada. Nós achamos previamente que a solução salina hipertônica (0,5 M NaCl) pode ser usada para limitar interações iônicas não específicas entre receptores de superfície celular e o pentapeptídeo hidrofóbico FLGFL, representativo do domínio de fusão do HIV-1. Usando essas condições para análises de Scatchard, nós demonstramos a existência de um único receptor (Kassoc = 1x103 M-1) nas células T linfoblastóides CEM para o FLGFL. Por inibição competitiva, o receptor foi identificado como a HLE (HLE IC100 = 8.0 mM, 1PI IC100 = 8.1 mM com uma razão de HLE/ 1PI = 0.99 a IC100).

Esses resultados podem ser interpretados para dizer que a HLE e a 1PI inibem competitivamente a mesma interação molecular que envolve o FLGFL, mas por diferentes mecanismos. O FLGFL foi mostrado além disso por ligar-se à HLE purificada, sustentando suplementarmente a identidade do receptor do FLGFL com a HLE. Para comparar se a HLE associada à membrana deverá atuar também como um receptor para o domínio de fusão nas células U937, membranas plasmáticas do clone 10 foram isoladas, solubilizadas e iodinizadas (124I-U937) como descrito previamente. A ligação saturável das 125I-U937 com o FLGFL imobilizado foi detectada e as análises de Scatchard sobre a saturação revelaram linearidade. Como nós achamos no uso das células CEM, esses dados sugerem a existência de um único receptor proteináceo (semelhante a uma proteína). A inibição competitiva usando HLE (IC100=77mM) e 1PI (IC100=91mM) sob essas condições revelaram afinidades virtualmente idênticas (Kassoc= 1x103 M-1) e razões de ligação competitiva (HLW/ 1PI=0,85) como determinado por uso das CEM, e isso sugere fortemente que no decurso do estado desdobrado do envelope do HIV-1 e a exposição de um domínio de fusão hidrofóbico, o domínio de fusão do HIV-1 e a HLE participam em uma interação molecular singular.

Respaldando essa hipótese, a HLE visualizada por CLSM usando-se um anticorpo monoclonal foi encontrada à bordo da superfície celular em resposta ao FLGFL solúvel ou a α1PI, mas não em resposta a SDF-1 α ou veículo. Esses resultados sustentam a especificidade da ligação do peptídeo de fusão à HLE e sustentam um papel para a HLE durante a ligação do HIV-1 às células de ambas as linhagens monocíticas e linfocíticas. Sabe-se que a polarização do receptor é induzida por ligação cruzada. Já que a ligação cruzada do receptor pelo pentapeptídeo de fusão do HIV-1 parece não ter ocorrido, a polarização induzida por anti-HLE foi examinada por CLSM para comparação. A HLE foi encontrada em co-polarização com a CXCR4 nas pernas traseiras (deve ser as cadeias de trás) em resposta à ligação cruzada por anti-HLE. A Nistatina é um antibiótico de ligação a colesterol que rompe seletivamente os receptores do HIV-1 residentes em plataformas contendo colesterol e tem sido demonstrada por interferir com a infectividade do HIV-1 in vitro (IC50=4μ M) em células H9, HUT-78 e U937, mas tem pouco efeito ‘in vivo’ exceto contra a candidíase. A co-polarização da HLE e da CXCR4 estimulada pela α1PI foi encontrada em completa anulação por pré-tratamento com 50 µM de Nistatina durante 60 minutos.

A imunolocalização dos receptores nas células sequencialmente incubadas com α1PI e SDF-1α também foi examinada por CLSM. Quando o clone 10 foi estimulado primeiro com α1PI e depois com SDF-1α, a α1PI e a SDF-1α foram encontradas co-polarizadas na superfície celular. A co-polarização pareceu não lembrar o capeamento clássico induzido por ligação cruzada, mas parecia com protrusões da membrana plasmática. Quando o clone 10 foi estimulado primeiro por SDF-1α e depois por α1PI, a α1PI não foi detectável, e a SDF-1α foi detectada em uma seção interna da célula mas não na superfície celular. Esses resultados sustentam a co-associação de receptores na superfície celular para com SDF-1α e α1PI nos clones permissivos ao HIV-1. Cada preparação de inibidor de proteinase é composto de uma única razão de proteína ativa e inativa. Para determinar se os receptores reconhecem formas ativas ou inativas de α1PI, duas preparações de sítio-ativo padronizado de α1PI foram comparadas as quais eram 32,7% e 8,3% ativas. Quando o clone 10 foi estimulado por essas duas preparações em concentrações equivalentes da proteína, uma concentração muito maior do preparado com 8,3% de atividade era requerido do que do preparado com 32,% de atividade, sugerindo que a fração ativa, e não a inativa, da α1PI era reconhecida pelo receptor. A ligação da HLE na superfície celular suficiente para induzir a co-localização da HLE com o CXCR4 sugere que a co-polarização do receptor pode ser essencial para a entrada do HIV-1.

A Infectividade do HIV-1 Aumentada na Presença da α1PI Exógena.

Foi mostrado previamente que a gp120 do HIV-1 induz a co-localização da CD4 e da CXCR4. A co-polarização da HLE e da CXCR4 induzida pela α1PI sugeriu que a α1PI também deve influenciar na infectividade. O clone 10 premissivo ao HIV-1 e o clone 17 não permissivo foram infectados com HIV-1NL4-3 usando-se MOI (momento de inércia?) variadas na ausência ou presença de várias concentrações fisiológicas de 1PI no meio livre do soro. Sabe-se que a α1PI é um quimioatraente que induz a aderência. Para examinar a influência da α1PI sem obliterar o resultado contra as células aderentes, as células foram infectadas e cultivadas nos mesmos reservatórios de uma placa de cultura de tecido de 96 reservatórios. Para comparação, as células foram infectadas em tubos microfuga (centrífuga de microtubo) e transferidas para reservatórios limpos de placa de cultura de tecido de 96 reservatórios, Quando as células foram infectadas, lavadas e livres de vírus, e cultivadas nos mesmos reservatórios de uma placa de cultura de tecido, encontrou-se o pico de atividade da transcriptase reversa aumentando em relação direta à concentração da α1PI. Quando as células foram infectadas em tubos microfuga, lavados livres de vírus e transferidos para reservatórios, existia uma pequena atividade da RT detectável após 12 dias de cultura no meio livre do soro contendo alguma concentração de α1PI. As células não permissivas ao HIV-1 permaneceram não permissivas em todas as condições testadas. A perda da infectividade do HIV-1 nas concentrações mais baixas da α1PI ainda na presença das mais altas MOI demonstra uma dependência da dose de α1PI e sugere que as células infectadas nas microplacas não foram prejudicadas pela inóculo residual. Além disso, qua a dependência da dose de α1PI é identicamente repetida em todas as três MOI e que o decréscimo da MOI produz o esperado decréscimo na infectividade sugere que a α1PI é necessária para a infectividade eficiente do HIV-1 no meio livre do soro e pode estimular a aderência e seleção de populações de células significativa e influenciar a detecção subseqüente da conseqüência da infectividade usando-se ensaios tradicionais de infectividade.. Além disso, os resultados sugerem a hipótese de que a α1PI deve influenciar na infectividade do HIV-1 por sua influência na co-localização do receptor.

Já que a HLE não é expressada constitutivamente na superfície celular do clone 17, considerou-se que a expressão da HLE na superfície celular induzida por LPS poderia conferir permissividade. O clone 17 foi cultivado no meio livre do soro e estimulado com LPS na presença ou ausência de LBP (proteína ligante de lipopolissacarídeo) antes da adição do HIV. As células foram subsequentemente infectadas na presença ou ausência de concentrações fisiológicas da α1PI no meio livre do soro. Na presença de LPS (lipopolissacarídeos) e de LBP, a cinética da aparência e sumiço da atividade da transcriptase reversa em células não permissivas foi similar à das células permissivas. O aspecto atrasado da atividade de RT quando as células foram estimuladas com LPS na ausência da LBP está consistente com a evidência prévia do nível diminuído da formação do monômero na LPS e reconhecimento do receptor do LPS na ausência da LBP. Esses resultados sugerem a expressão na membrana de um co-fator do HIV-1 adicional em resposta ao LPS. Na ausência da α1PI, a atividade detectável de RT não ocorreu nem nas células permissivas ou nas não permissivas sob nenhuma das condições examinadas. Esses resultados sugerem que a α1PI e um receptor de superfície celular são co-fatores do HIV-1 nessas células pró-monocíticas.

Para examinar a possibilidade de que a polarização possa ocorrer durante a entrada do HIV-1, o clone 10 foi incubado a 38oC com o HIV-1NL4-3 infeccioso, e as células foram fixadas e examinadas em vários pontos de tempo por CLSM para a co-localização do HIV-1 e dos co-receptores. O HIV-1 foi detectado usando-se um anticorpo monoclonal com especificidade para os epítopos próximos ao laço V3. Esse anticorpo foi mostrado recentemente por não reconhecer a α1PI em contraste com um anticorpo monoclonal diferente (1C1; Repligen, Cambridge, MA) com especificidade para epítopos próximos ao domínio de fusão do HIV-1. Após a incubação das células com o vírus por 15 minutos, o HIV-1 foi detectado em vários ligações transitórias na superfície da célula co-localizado com CD4, CXCR4 e HLE. O HIV-1 pareceu imiscuir e coalescer (rejuntar) com esses receptores em extensões da membrana plasmática.

Requerimento para a HLE na Superfície Celular Durante a Infecção por HIV-1.

Os dados apresentado até agora sugerem a participação da HLE como um receptor durante a captura e infecção do HIV-1. A ligação da entrada do HIV-1 com a expressão original da CD4 e do clone de DNA do receptor de quimiocina nas células carecendo de sua expressão estabeleceu esse método como o padrão outro para a identificação de receptores do HIV-1. Por outro lado, o silenciamento da expressão do gene provou ser uma ferramenta igualmente poderosa para demonstrar a dependência da entrada do HIV-1 sobre a expressão da CD4. Já que a expressão original do clone de DNA da HLE não é tecnicamente possível até o momento, a importância da HLE durante a entrada do HIV-1 e a infectividade foi examinada pela inibição da expressão da HLE. Oligonucleotídeos anti-senso complementares ao mRNA e pré-mRNA da HLE foram introduzidos no clone 10 permissivo ao HIV1 e cultivados por 48 horas. Oligonucleotídeos anti-senso complementares à globina beta foram usados como controles negativos. As análises através de citometria de fluxo mostraram que células transfectadas com oligonucleotídeos anti-senso específicos para o códon de iniciação ou para o sítio de splicing na extremidade 3’ do éxon 4 da HLE diminuíram a expressão da HLE na superfície em aproximadamente 30% relativamente ao oligonucleotídos de controle da globina beta. Nenhum o oligonucleotídeo anti-senso influenciou a expressão da CXCR4 ou da CD4 na superfície celular.

Células tratadas com oligonucleotídeo foram incubadas com o HIV-1 NL4-3, lavadas livres de vírus, e cultivadas por 48 horas. A presença da fita mínus (Obs.: A fita mínus de decalque de DNA junta a Unidade 3 com a unidade R e a unidade 5 para gerar de novo o Longo Terminal de Repetição durante a síntese em DNA. Embora seja uma etapa fundamental na transcrição reversa o exato mecanismo da transferência do DNA permanece obscuro. A hipótese corrente é que a síntese da fita minus de DNA copia a unidade 5 e R para formar o DNA de forte parada de fita mínus e que a função de RNase H da transcriptase reversa degrada o molde de RNA em híbrido DNA-RNA. O DNA de parada forte da fita minus de fita única contém a região R que é complementar à região R no RNA viral. Usando a complementaridade, o DNA nascente pode hibridizar o RNA viral e o complexo da transcrição reversa pode continuar copiando as sequências nas unidades 3 - http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/hujv75_809.pdf - 2 MB), do DNA de forte parada, o produto inicial da transcriptase reversa seguinte à entrada do HIV-1 foram determinados por amplificação com PCR de células lisadas usando-se pares de iniciadores R/U5 (R é sequência de repetição e U5 é a unidade da ponta 5 porque a replicação ocorre na direção de 5’ para 3’). Como encontrado em havendo expressão da HLE, a fita mínus, o DNA de forte parada estavam diminuídos nas células transfectadas com oligonucleotídeos anti-senso complementares ao códon iniciador da HLE ou ao sítio de splicing na extremidade 3’ do éxon 4. Em contraste, esse DNA foi facilmente detectado nas células transfectadas com os oligonucleotídeos anti-senso complementares à globina beta. Nós concluímos que em adição à CD4 e à CXCR4, a HLE na superfície celular é necessária para a ligação e infecção pelo HIV-1.

DISCUSSÃO

A ligação da HLE da superfície celular pela α1PI, anti-HLE, e peptídeo de fusão do HIV-1 foi mostrada aqui enquanto indutora da co-polarização da HLE, CD4 e receptores de quimiocina. Um modelo está proposto no qual a ligação da HLE induz a conjunção dos receptores do HIV-1, e que esse denso foco de receptores aumenta as probabilidades do denso foco das proteínas do envelope do HIV-1 interagirem com os receptores livres remanescentes. Assim, receptores ocupados por ligantes produzem um aumento tangível nos receptores próximos mais do que produzem interferência estérica (relativa à estrutura da molécula) e diminuída acessibilidade dos receptores do HIV-1. Consistente com esse modelo, a SDF-1 alfa foi encontrada por impedir a conjugação do receptor, e isso sugere que as quimiocinas podem suprimir a infectividade do HIV-1 pela redução dos conjuntos receptores do HIV-1 mais do que pelo bloqueio direto dos receptores como previamente se acreditava. O aumento da α1PI circulante esta correlacionado com o aumento da carga viral na população do HIV-1, sugerindo a hipótese de que a α1PI deve facilitar a ligação e infectividade do HIV-1. Aqui nós mostramos que a atividade da transcriptase reversa produzida pela infectividade do HIV-1 é dependente da α1PI de modo dependente da dose, que a α1PI facilita a co-polarização da HLE com os receptores canônicos do HIV-1, que o HIV-1 vivo liga-se preferencialmente a receptores co-polarizados, e que a ligação do vírus a receptores co-polarizados não ocorre na ausência da α1PI. Nós mostramos adicionalmente que a translocação da HLE dos grânulos para a superfície celular transfere a permissividade ao HIV-1 para células não permissivas e que a inibição do mRNA da HLE diminui proporcionalmente a detecção dos primeiros produtos da transcriptase reversa, a fita mínus, o DNA de forte parada.


Os parâmetros críticos determinantes da cinética da infectividade do HIV-1 foram definidos como concentração viral, número de vírions produzidos por uma célula, e o tempo para o ciclo completo da infecção. Em uma população de células homogêneas, o tempo de pico da atividade de transcriptase reversa produzido pelo clone 10 foi diminuído em dois dias para cada logaritmo de diluição do HIV-1NL4-3, e esses resultados estão consistentes com estudos prévios de cinética. Entretanto, o clone 10 produziu uma atividade de transcriptase reversa insignificante quando as células foram infectadas em meio livre do soro carecendo de α1PI, e a atividade de transcriptase reversa aumentou de modo dependente da dose no aumento da α1PI sugerindo que a α1PI é necessária para a infectividade. A atividade de pico da transcriptase reversa não aumentada pela α1PI sugere que a influência da α1PI no pico dos níveis da transcriptase reversa não está relacionada com o inóculo viral ou tempo de infecção. Ao contrário, esses resultados sugerem que o pico aumentado nos níveis da transcriptase reversa resultou tanto do número aumentado de vírions produzidos por cada célula quanto do número aumentado de células infectadas.

O modo dependente da dose no qual a α1PI influenciou a infectividade do HIV-1 sugeriu um mecanismo dependente do receptor. Os clones U937 permissivos e não permissivos ao HIV-1 diferem com respeito à localização da HLE na superfície celular. Nós achamos que a infectividade do HIV-1 foi permitida quando a HLE liberada dos grânulos foi ligada à superfície celular de clones 17 não permissivos ao HIV-1. Significativamente, a infectividade do HIV-1 no clone 17 também requereu a participação da α1PI, e isso respalda a identidade da HLE como componente liberado dos grânulos correspondentes. Durante a fase aguda da inflamação coincidente com a liberação da HLE estimulada por LPS, a concentração da α1PI aumenta mais de quatro vezes. Neste cenário, a fase aguda de infecções oportunistas poderia produzir o fenômeno da co-polarização do receptor do HIV e dessa forma facilitar o aumento da carga viral.

A evidência de que a gp120 do HIV-1 liga-se à CD4 inclui a demonstração de que a ligação é reversível e saturável, que a introdução da expressão do cDNA da CD4 nas células nulas em CD4 resulta no aumento correspondente na infectividade ao HIV-1, e que o silenciamento da expressão do mRNA da CD4 bloqueia a infectividade pelo HIV-1. Já que a HLE pode residir tanto na superfície celular quanto nos grânulos, e desde que a localização da HLE não seja dependente nem do DNA, nem do mRNA e nem da estrutura da proteína, mas da produção de grânulos pela célula, um processo ainda indefinido, a intrdução do mRNA da HLE em células HLE negativas não é um bom teste para sua função de receptor. O verdadeiro teste é identificar células carentes de HLE na superfície; testar se essas células não são suscetíveis à entrada do HIV-1 na presença da CD4, CCR5, e CXCR4; e determinar se a co-expressão específica da HLE na superfície celular agora recupera a entrada do HIV-1 para dentro dessas células. A ligação reversível e saturável do domínio de fusão do HIV-1 à HLE foi mostrada aqui e algures. Nós demonstramos aqui que a inibição da expressão do mRNA da HLE bloqueia a infectividade do HIV-1 e que o favorecimento da associação da HLE com a membrana plasmática favorece a infectividade do HIV-1. O modelo de Clark da ocupação do receptor estabelece que em adição à reversibilidade, a ligação saturável do ligante ao receptor, a ligação deve produzir uma resposta biologia proporcional ao número de receptores ligados. As evidências apresentadas sugerem que a supressão da expressão da HLE suprime proporcionalmente os produtos primários da transcriptase reversa do HIV-1, e isso sustenta a necessidade da HLE durante da ligação do HIV-1 e as primeiras etapas da infecção consistente com um modelo de entrada do HIV-1 que requer a HLE como um receptor de fusão. Nós achamos previamente que a conseqüência da infectividade viral “in vitro” está correlacioanada com a HLE, mas não com CD4, CXCR4, ou CCR5, e isso sugere que a HLE é potencialmente um receptor de limitação de taxa para a entrada do HIV-1 por um mecanismo envolvendo o fenômeno da co-polarização do receptor.

http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/content/full/102/13/4479