INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL DOS DOMÍNIOS A DO FATOR V DE COAGULAÇÃO SANGUÍEA POR MODELAMENTO MOLECULAR

(Continuação)

B. O. Villoutreix and B. Dahlbäck

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A estrutura da ceruloplasmina humana tem sido desvendada e foi encontrado que seus três domínios A estão arranjados de maneira triangular com cada domínio feito de duas dobras de tipo cupredoxina. Investigações em microscopia eletrônica (EM) têm sido descritas para FV/FVa e FV/FVa ligado a membrana mas uma estrutura em terceira dimensão com resolução atômica foi necessária para compreender mais além as funções de co-fator essenciais do FV/FVa e inativação.

VALIDAÇÃO DO MODELO

A estrutura geral do modelo do FV mostra as características básicas de dobras de tipo cupredoxina. Assim, cada domínio A é feito essencialmente de dois barrilhetes beta. O presente modelo (domínios A1, A2 e A3) pertence a um compartimento de 65 X 75 X 85 Å ( 1 Å = 0,1 nanômetros). Quando desprezado o eixo de três dobras, os três domínios A poderiam encaixar-se em um círculo com diâmetro de aproximadamente 80 a 90 Å. Os três módulos foram testados interativamente e suas estruturas em três dimensões bem como a distribuição dos resíduos hidrofóbicos, polares e carregados foram encontrados de acordo com o padrão do raio X e as características da estrutura da proteína foram conhecidas. No momento, os resíduos que se esperava como carregados em pH neutro são expostos a solvente, ou, se ocultados, envolvidos em interações iônicas e/ou ligação de hidrogênio. Nenhuma divergência estérica severa foi notada durante o processo de modelagem dos domínios A indviduais nem nas interfaces, endossando a qualidade da estrutura.

No modelo de FV todas as inserções/deleções em comparação com a ceruloplasmina são áreas expostas a solvente e estruturas em laço. Sabe-se bem que as estruturas em laço e as inserções são mais difíceis de prever. Longos laços também tendem à flexibilidade, e estruturas de alta resolução são raramente obtidas experimentalmente para essas regiões de uma proteína. Na presença do modelo FV, as áreas mais difíceis de modelar envolveram aproximadamente 40 resíduos fora dos 994 (dos domínios A em estudo) e compreende as regiões dos resíduos 302 a 317, 442 a 446, 1659 a 1673, e 1727 a 1736. A inserção 302 a 317 pode ser construída como um laço estendido ou poderia ter como apresentado aqui, vários resíduos em conformação helicoidal como previsto usando sistemas de rede de trabalho de Perfil de agente neural de Heidelberg. Este segmento contém oito resíduos positivamente carregados e um ácido glutâmico e deveria, assim, ser essencialmente exposto a solvente. Todos esses resíduos carregados nessa região estão expostos a solvente, sugerindo que a conformação selecionada é de razoável precisão. Tal estrutura em hélice poderia ser de fato de importância funcional. Com a conformação selecionada, as regiões dos resíduos de 442 a 446 e de 1658 a 1673 mostram contato favorável com partes remanescentes da proteína ou são expostas apropriadamente a solvente. Na CP, o segmento correspondente aos resíduos de 1727 a 1736 do FV foram perdidos da coluna coordenada mas foram relativamente fáceis de construir.

As pontes dissulfeto têm sido relatadas a respeito da cadeia pesada do FV bovino. Elas estão conservadas na estrutura da CP e correspondem àquelas propostas na figura 1 (C139-C165, C220-C301, C472-C498, C575-C656, C1697-C1723) como encontrado após as análises dos modelos. Tomadas juntos, as observações acima sugerem fortemente que o modelo do FV está correto.

SÍTIO DE LIGAÇÃO A COBRE

Os íons de metal das oxidases azuis (ex.: ceruloplasmina) são divididos em três tipos distinguíveis por espetroscopia, aos quais se refere como de Tipo I (cobre “azul”, com intensa absorção óptica por volta de 600nm), de Tipo II (sem absorção visível) e de Tipo III (absorção de 330 nm). Seis átomos de cobre foram identificados na estrutura cristalina da CP. Três íons de cobre ocupam centros mononucleares enquanto os três íons remanescentes formam um conjunto trinuclear. Na CP, existem três sítios de ligação a cobre de tipo I, dois de tipo III e uma de tipo II. Sabe-se que o FVIII contém um íon de cobre por molécula. Tagliavacca e outros (1997) descobriram depois de experimentos de mutagênese do sítio que o íon de cobre liga-se preferencialmente ao sítio de Tipo I (presente na CP) envolvendo no mínimo o C310 (cisteína 310) do FVIII (C319 na CP e S282 no FV (S é serina)) no domínio A1. Esses autores também mostraram que a ligação do cobre nesses sítios é importante para o dobramento do domínio, para a associação apropriada das subunidades e para a atividade do FVIII/FVIIIa. Baseados nesses dados, nós investigamos o modelo do FVIII e encontramos facilmente o sítio de ligação a cobre proposto experimentalmente. Isso sustenta a precisão da estrutura do FVIII e o fato da ceruloplasmina poder ser usada de modo exato como modelo dos domínios A do FVIII e do FV.

O FV e o FVa bovinos mostraram-se ligar a íons de cobre não tipo I e não tipo III por absorção atômica e espectroscopia de emissão. Além disso, tem –se sugerido que o íon de cobre no FVIII é ligante de diferentes resíduos mais do que o íon de cobre do FV. De fato, quando comparadas as sequências do modelo do FV humano e do FV bovino com a estrutura em raio X da ceruloplasmina, somente um sítio de ligação de cobre está conservado e corresponde ao cobre de tipo II da ceruloplasmina, o qual envolve a H101 (histidina) e H978, enquanto na ceruloplasmina a Y107 (tirosina) e S102 (serina), indiretamente envolvidas na ligação do cobre, são respectivamente a Y91 e a P86 (prolina) do FV. O suspeito sítio de ligação de cobre no modelo do FV é consistente com o estudo relatado por Mann e outros (1984). Um íon de cobre, em ambos o FV e FVIII, poderia contribuir para a estabilidade da estrutura do domínio e para a interface A1/A3.

SÍTIO DE LIGAÇÃO A CÁLCIO

Sabe-se que o cálcio liga-se ao FV bovino e humano e que nem a cadeia pesada, nem a leve sozinhas exibem afinidade significativa para com esse íon de metal. No modelo do FV, uma bolsa de ligação a cálcio pôde envolver todos ou alguns dos seguintes resíduos na interface A1-A3 (perto do sítio de ligação a cobre): E96 (ácido glutâmico), D102 (ácido aspártico), E108, D111, D112. Esses resíduos negativamente carregados são essencialmente conservados nas sequências do FV, da CP e do FVIII bovinas. Entretanto, outras regiões não podem ser elencadas com a informação disponível no presente.

PATOLOGIA BIOESTRUTURAL

A ocorrência da para-hemofilia (deficiência de FV) é pouca, em contraste com a hemofilia A (deficiência do FVIII). Duas mutações nos módulos A do FV foram relatadas até agora. Uma envolvia a substituição A221V no domínio A1 e a segunda , a substituição R506Q dentro do domínio A2.

O plasma de pacientes com a substituição A221V teve reduzidos níveis de antígeno FV e reduzida atividade. A alanina 221 está localizada em um laço e é exposta a solvente, assim, sua substituição por uma valina poderia ser tolerada. No alinhamento de múltiplas sequências apresentado por Pemberton e outros (1997), pode-se ver que essa alanina está conservada na ceruloplasmina e no FV mas é substituída por histidina no FVIII. O problema estrutural potencial devido à substituição de A por V poderia ser a perturbação da ponte de sal parcialmente encoberta entre K304 e E275 e/ou choques estéricos direcionados com E275 e/ou perda da ligação dissulfeto C220-C301. Entretanto, baseados nas análises estruturais do modelo, a ocorrência dessas mutações naturais podem não ser a razão para o fenótipo observado. Seria de interesse explorar suplementarmente o papel dessas mutações “in vitro”.

A arginina 506 está acessível ao solvente e localizada no topo (ponta) de um laço. Ela pode ter uma interação iônica com D504. A mutação R506Q pôde induzir algumas ligeiras mudanças conformacionais mas serão essencialmente desfavoráveis para a interação com a APC em D189 (limitante do número de quimio-tripsinogênio, veja Mather e outros, 1996), localizada na base de especificidade da bolsa. O FV intacto tem sido mostrado como um co-fator, junto com a OS, na inativação do FVIIIa pela APC, enquanto a proteína FV R506Q parece ser muito menos efetiva como um co-fator da APC durante este processo. Quatro hipóteses podem ser geradas aqui: 1) a área R506 liga-se à APC em uma região localizada fora do sítio ativo da enzima, 2) a clivagem da APC na R506 é necessária para a atividade anticoagulante do FV, 3) a área R506 interage com a proteína S, e 4) a área R506 interage com FVIIIa.

LIGAÇÃO A MEMBRANA

U FV recombinante sem o domíno C2 perdeu sua capacidade de ligação à membrana. O FVa também pôde interagir com a superfície fosfolípide por via do domínio A3. Os resíduos FVa bovinos de 1654 a 1752 (1667 a 1765 nos humanos), no domínio A3, poderia ser importante para a interação com fosfolipídeos neutros. Após as análises do modelo de FV, pode ser visto que a maioria desses resíduos do A3 estão escondidos do solvente e pertencem ao cerne hidrofóbico da proteína. Tal peptídeo hidrofóbico poderia interagir com os fosfolipídeos neutros mas por caminho não fisiológico. Os aminoácidos expostos a solvente no modelo de FV pertencentes ao segmento peptídico de 1667 a 1765 exigem aproximadamente K1667 (lisina) a Y1678 (tirosina), Q1724 (glutamina) a E740 (ácido glutâmico) e E1757 a R1765 (arginina). A região de 1724 a 1740 está perto de M1883 e possivelmente perto do domínio C2. Assim, se o domínio A3 do FV se liga à membrana, a região mais aceitável envolve apenas os resíduos de 1724 a 1740, enquanto a região em volta dos resíduos R1765 e T1767 (treonina) não deveriam estar envolvidos nesse processo já que esses resíduos são acessíveis ao FXa e à clivagem pela elastase do neutrófilo humana, respectivamente, na presença de fosfolipídeos. A região dos resíduos de 1667 a 1678 contêm principalmente aminoácidos carregados e não é consistente com o fato de as forças hidrofóbicas terem sido mostradas como essenciais para a interação peptídeo-membrana. Baseados nas análises estruturais do modelo do FV, nós sugerimos que somente o C2 (e possivelmente o domínio C1) interage com a membrana. Os dois domínios C serviriam, em parte, como espaçadores/separadores, posicionando os domínios A na distância apropriada do plano da membrana para a atividade funcional ótima. Tal hipótese é consistente com a representação esquemática da ligação do FVa à membrana, como mostrado pelo estudo de EM (microscopia eletrônica) (Stoylova e outros, 1994) ou investigação em EM de Lampe e outros (1984), que apontam que os componentes da cadeia leve (A3-C1-C2) do FVa ligados à superfície da membrana parecem estar em grande parte externamente aos fosfolipídeos.

Foi relatado que a cadeia pesada do FVa pode ter contato direto com fosfolipídeos neutros e que essa interação não é de natureza iônica. Após análises estruturais dos domínios A, nós sugerimos que a partida do domínio A3 de sua organização triangular dentro da estrutura A1-A2-A3 leva à exposição de cadeias laterais hidrofóbicas que são escondidas nas faces internas de A1-A3 e A2-A3. Após a inativação do FV/FVa pela APC, a interação dos domínios A com a membrana, entretanto, poderiam ser de importância fisiológica.

SÍTIO DE LIGAÇÃO DO FATOR Xa COM PROTEÍNA S

Foi relatado que a PS e o FXa poderiam interagir com os resíduos de 493 a 506 do FVa. Neste peptídeo , os resíduos K499, S500, D504, R505 e R506 estão expostos a solvente no modelo. Interessantemente, a remoção dos resíduos de 683 a 709 do FVa ou a clivagem em R506 pela APC resulta em diminuída interação entre FXa e FVa. Esses dados são consistentes pois a localização dessas duas regiões poderia estar relativamente próxima no espaço (possivelmente entre 10 e 20 Å). Os resíduos de 499 a 506 poderiam interagir com FXa, e esse resultado poderia explicar o efeito protetor do FXa observado na clivagem em R506 pela APC. Interessantemente, os resíduos de 558 a 565 e de 1811 a 1818 do FVIII foram propostos por interagirem com o fator IXa. Os segmentos equivalentes no FV envolvem os resíduos de 502 a 509 e de 1677 a 1682, respectivamente, e a maioria deles é exposta a solvente.

Também foi sugerido que os resíduos de 507 a 520 poderiam estar envolvidos na ligação do FXa. Os resíduos I508 (isoleucina), R510, A511, D513, I514 e E515 são expostos a solvente e poderiam assim ter contato com o FXa. O fato de que o FXa liga-se com dificuldade ao FV intacto e os dados acima sugerem que o domínio B poderia ter contato direto ou indireto com as regiões ao redor de R506.

Dois anticorpos monoclonais dirigidos tanto contra os domínios A1 ou A3 do F inibiram a interação FVa-FXa. Tendo sido proposto que a cadeia leve do FVa ligada à membrana não interage com o FXa, informações adicionais são necessárias de acordo a determinar se os anticorpos reconheceram o sítio de ligação do FXa na superfície do FVa ou se eles inibiram a interação FXa-FVa devido a estorvo estérico. Desde após a inativação do FVa pela APC, o domínio A2 dissocia-se, e, porque nesta situação o FV remanescente não se liga a FXa, é aceitável que áreas chave para contato entre o FVa e o FXa envolvem o domínio A2. Tal hipótese poderia ser investigada em futuro próximo desde que um modelo da estrutura do FXa tenha sido relatado.

Sabe-se que a PS estimula a clivagem do FVa em R306 pela APC e que a PS induz a realocação do sítio ativo da APC a 10 Å de proximidade da superfície da membrana. A distância entre a R306 e a R506 na estrutura modelo é de 35 Å. Entretanto, ainda é muito difícil a visualização do mecanismo exato de ação da PS a partir desses dados. Por outro lado, a PS poderia ligar-se aos resíduos de 499 a 506 e poderia assim contra-atuar o efeito protetor do FXa quanto à clivagem da APC na R506 e orientar a APC para a clivagem ótima na R306. Por outro lado, se a PS liga-se aos resíduos de 499 a 506 do FVa, isso poderia proteger ou afetar significativamente a clivagem na R506, ao mesmo tempo parece que a PS não atua num papel neste sito.

SÍTIOS DE LIGAÇÃO DA PROTROMBINA

A protrombina forma um complexo 1:1 com a cadeia pesada do FVa. Essa interação é de moderada afinidade e independente de cálcio na ausência da superfície de membrana. Entretanto o domínio Gla da protrombina atua num papel na interação protrombina FVa quando os fosfolipídios estão presentes. Após a inativação do FVa pela APC, o domínio A2 dissocia-se e a ligação à protrombina é perdida. Porque dentro do complexo protrombinase (FXa + FVa + fosfolipídeo) o FVa está parcialmente protegido da clivagem pela APC, porém para o sítio R306 e desde que o FXa proteja a clivagem da APC na R506, nós sugerimos que a protrombina tenha interação direta com o domínio A2 do FVa, em áreas margeando a R506 mas diferentes do sítio de ligação do FXa. Possivelmente, como no caso da ligação do FXa, os resíduos de 683 a 709 do FVa poderiam atuar num papel na interação com a protrombina.

O FATOR Xa E AS CLIVAGENS DA ELASTASE DO NEUTRÓFILO

A única clivagem do FXa que pôde ser investigada com o presente modelo de estrutura envolve o resíduo R1765 do FV humano. Esse resíduo é exposto a solvente e tendo sido os experimentos realizados na presença de fosfolipídeos, essa região poderia estar a 80Å da superfície da membrana. A elastase do neutrófilo humana cliva o FVa em A341, I508 e T1767. Esses três sítios de clivagem não são influenciados pela presença de fosfolipídeos, indicando que essas regiões estão localizadas fora da área de ligação a membrana. Esses três resíduos foram achados em laços expostos a solvente no modelo de FV. Esses dados também sustentam a acuidade do modelo da estrutura do FV.

OS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA C ATIVADA E A INATIVAÇÃO DO FV/FVa

A APC parece ligar-se à cadeia leve do FVa por via de um sítio que abrange os resíduos de 1865 a 1874 do FVa. Esses resíduos, entretanto, estão em sua maior parte escondidos dentro do cerne da proteína. Esse peptídeo, considerado inibidor da inativação do FVa pela APC, deveria assim atuar de modo não fisiológico.

O FVa é clivado pela APC nos resíduos R306, R506 e R679 (Kalafatis e outros, 1994b). Esses autores sugeriram que a clivagem pela APC do FVa ligado à membrana na R506 promove a clivagem na R306 e na R679, mas Nicolaes e outros (1995) mostraram que clivagem anterior na R506 não é requerida para a clivagem na R306 após estudos da proteína R506Q. O papel fisiológico da clivagem da APC no resíduo R679 não está bem definido por contraste com as clivagens nas R306 e R506. No momento, Egan e outros (1997) relataram que a clivagem da APC na R679 não contribui para a inativação do FVa. A taxa de clivagem da APC na R506 é aproximadamente 20 vezes mais alta do que na R306. Em adição, como descrito acima, o FXa parece proteger o FVa da clivagem na R506 enquanto a PS tem sido sugerida como intensificadora da clivagem da APC na R306. Também foi relatado que a clivagem do FVa pela APC leva à dissociação do domínio A2, o que então resulta no fator Va intermediário sem atividade. Essa última reação pareceria a dissociação espontânea do domínio A2 do FVIIIa que se segue à ativação pela trombina. [Obs.: Tanto a trombina quanto o fator Xa (FXa) ativam o FV. A ativação está associada à remoção do domínio B da parte remanescente do FV que constitui o FVa. O FVa é composto de uma cadeia pesada de 105 quilodáltons (A1-A2) e de uma cadeia leve de 71/74 quilodáltons (A3-C1-C2), sendo as duas cadeias presas por ligações não covalentes dependentes de cálcio. O FVa é um co-fator da protease de serina FXa, a qual, na presença de íons de cálcio e de uma superfície de membrana fosfolípide (PL) apropriada , intensifica a ativação da protrombina em trombina por várias ordens de magnitude. O complexo FXa-FVa-PL é chamado de complexo protrombinase. O FVIII ativado (FVIII) tem uma função homóloga à do FVa, servindo como um co-fator no complexo tenase (FVIII + FIX) para a enzima fator IXa (FIXa) na ativação do fator X (FX). PMID 12714495 – O FV e o FX ativam a trombina e o FVIII e o FXI ativam o FX.] Finalmente, o FV intacto ligado à membrana parece ser clivado lenta e sequencialmente pela APC nos resíduos R306, R506, R679 e K994. Tais informações sugeririam que ao menos a R506 e a R679 estão direta ou indiretamente protegidas pelo domínio B.

No presente modelo de estrutura, somente a R306 e a R506 do FV podem sem investigadas. A R306 é exposta a solvente e poderia estar localizada dentro de um segmento helicoidal distorcido entre os domínios A1 e A2 ou em uma estrutura em laço mais facilmente flexível. De fato, esse segmento pode submeter-se a mudanças em sua conformação e adotar ambas as conformações, como no caso do laço reativo de serpina. Em todas as situações, os rearranjos estruturais importantes seriam requeridos para a apropriada ancoragem na fenda do sítio ativo da APC. Como mencionado acima, a estrutura secundária prevista indicou que o segmento R306 poderia estar em conformação helicoidal. Tal estrutura de fita seria consistente com o fato de que, após a clivagem pela APC, o domínio A2 se dissocia. A clivagem do peptídio liado em R306 poderia assim liberar energia e promover a dissociação do domínio A2. Entretanto, o R306 deveria estar todo o tempo acessível à APC e a clivagem em R506 não necessária para ganho de acesso à ligação peptídica 306-307 enquanto, todavia, alguma mudança na conformação após a clivagem em R506 poderia facilitar a clivagem em R306. A arginina 306 tem em sua vizinhança direta vários resíduos positivamente carregados (FV resíduos K299, K303, K309, K310, R313) não diretamente contrabalançados por outros negativamente carregados que pudessem atuar num papel durante a clivagem e ligação da APC.

A R506 é exposta a solvente e pode encaixar-se facilmente para dentro da bolsa específica da APC mas alguns rearranjos de conformação no local seriam necessários, a partir de aproximadamente os resíduos P5-P3 e P2’-P5’ , de modo a igualar-se à estrutura canônica necessária para a ótima interação substrato da protease de serina/ inibidor. Os resíduos P2P1P1’ adotam realmente a conformação canônica no presente modelo, e assim, em contraste com o segmento R306, o peptídeo R506 dentro da estrutura nativa do FV/FVa parece mais apropriado para a interação com a fenda do sítio ativo da APC. Vários resíduos descompensadamente positivamente carregados são encontrados na vizinhança direta da R506. Esses envolvem a R316, R320, R400, R501, R505 e R510. O resíduo 506 está localizado entre duas barricas beta dentro do domínio A2, assim, após a clivagem na R506, as mudanças conformacionais são prováveis de ocorrer e poderiam explicar, em parte, a perda de ligação a FXa.

Interessantemente, o FVIIIa é clivado pela APC na R336 e na R562, e esses resíduos são homólogos aos R306 e R506 do FVa respectiamente. Trabalhos suplementares poderiam envolver a comparação dos modelos estruturais do FV e do FVIII junto com a ancoragem da estrutura APC em raio X em seus respectivos sítios de clivagem.

DO FATOR V AO FATOR Va

Investigações em microscopia eletrônica têm-se reportado ao FV, FVa e FVa ligado à membrana. O FVa foi visto como um composto de dois domínios, cada um tendo um diâmetro de aproximadamente 80 Å. O diâmetro geral do presente modelo do FV, quando despreza os pseudo eixos de três dobras, é de aproximadamente 80 a 90 Å. É possível que os três domínios A representem uma das duas esferas vistas no estudo de microscopia eletrônica. Os dois domínios C intoxicando os domínios A de aproximadamente 80 Å com respeito à superfície de membrana poderiam ser consistentes com o diagrama esquemático feito por Lampe e outros (1994). Isso também é possível de acordo com a distância esperada de 70 a 90 Å entre o plano da membrana e a fenda do sítio ativo de proteases como avaliado por transferência de energia fluorescente.
Mosesson e outros (1990) propuseram que o FV intacto tem uma forma retangular/alongada irregular de aproximadamente 100 a 200 Å que ostenta nenhum rearranjo estrutural principal após a liberação do domínio B. A ausência de rearranjo conformacional estaria consistente com o presente modelo de estrutura. Fowler e outros (1990) e Mosesson e outros (1990) sugeriram que as cadeias pesada e leve do FVa formam uma estrutura globular, enquanto o domínio B tem uma estrutura parecida com uma haste estendida projetando-se para fora da estrutura globular do FV intacto. Junto ao fato de que o domínio B tem vinte e cinco sítios em potencial para glicosilação em N e de que várias regiões são sensíveis à proteases, esses dados sugerem que esse domínio deveria tem contato extensivo com o solvente. Foi relatado após medição de transferência de energia de fluorescência para o FVIII intacto que a distância entre os resíduos C528 (domínio A2) e C1858 (domínio A3) está aproximada em 20 Å (de 25 a 30 Å no modelo da estrutura do FVIII). Essa informação também sugere que os domínios A estão em estreito contato antes da ativação.

Esses dados, juntos com o fato de que o FV e o FVa ligam íons de core igualmente bem, e o estudo do presente modelo, sugerem que, após a ativação pela trombina, o domínio B do FV é removido enquanto os três domínios A permanecem em estreito contato. Devido: ao FV intacto ter reduzida afinidade com o FXa, um sítio de ligação do FXa na superfície do FVa dever estar localizado próximo à R506, a APC catalisar o FV intacto bem lentamente, o FV e o FVa terem essencialmente a mesma afinidade para a superfície fosfolípide apropriada, o domínio C2 liga-se à membrana, ao menos a clivagem do FV intacto na R306 pela APC ser dependente de fosfolipídeo, a área da R1765 e da T1767 não estar em contato com o plano da membrana, os resíduos R306, R506 e R1765 terem que ter aproximadamente 80 Å de distância da membrana, e à possibilidade do domínio A3 inteiro não ter interação direta com os fosfolipídeos, nós sugerimos que somente o domínio C2 poderia interagir com a membrana enquanto o domínio B poderia cobrir parcialmente a região da R506 porém deixar a região da R306 mais exposta.

CONCLUSÕES

A qualidade do presente modelo estrutural do FV/FVa é fortemente sustentada já que o trabalho teórico é um grande acordo com os dados experimentais. Numerosas características estruturais e funcionais do FV/FVa foram analisadas e novos experimentos podem ser projetados com base nesse modelo estrutural.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2144041/?tool=pubmed