INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL DOS DOMÍNIOS A DO FATOR V DE COAGULAÇÃO SANGUÍEA POR MODELAMENTO MOLECULAR


B. O. Villoutreix and B. Dahlbäck

RESUMO

O Fator V (FV) é um grande (2.196) cofactor não enzimático na cascata da coagulação com uma organização de domínios (A1-A2-B-A3-C1-C2) similar à do Fator VIII (FVIII). O FV é ativado a fator Va (FVa) pela trombina, a qual cliva fora o domínio B levando a uma estrutura heterodimérica composta da cadeia pesada (A1-A2) e da cadeia leva (A3-C1-C2). A proteína C ativada (APC), junto com seu co-fator proteína S (PS), inibe a cascata da coagulação por via de limitada proteólise do FVa e FVIIIa (a APC cliva o FVa nos resíduos R306, R506 e R579). Os domínios A dos fatores Va e VIIIa compartilham importante identidade de sequência com a proteína ligante de cobre, ceruloplasmina (CP). A estrutura em raio X da CP e os modelos teóricos para o FVIII foram relatados recentemente. Essa informação nos permitiu construir um modelo teórico (de 994 resíduos) para os domínios A dos FV/FVa humanos (resíduos de 1 a 656 e de 1546 a 1883). Análises estruturais do modelo FV indicam que: a) os três domínios A são arranjados de modo triangular como no caso da CP e a organização desses domínios deve permanecer essencialmente a mesma antes e depois da ativação; b) o íon de cobre de tipo II está localizado na interface A1-A3; c) os resíduos R306 e R506 (sítios de clivagem pela APC; R é arginina) são ambos expostos a solvente; d) os resíduos 1667 a 1765 dentro do domínio A3, esperados por interagirem com a membrana, são essencialmente cobertos/escondidos; e) a APC não se liga aos resíduos de 1865 a 1874 do fator FVa. Várias outras feições do fator V/Va, como as mutações R506Q e A221V; fator Xa (FXa) e clivagem pela elastase do neutrófilo humano (HNE); proteína S, protrombina e ligação de FXa também são investigados.

TEXTO

A cascata da coagulação envolve a ativação enzimática seqüencial dos zimogênios de protease de serina, com os co-fatores não enzimáticos, FV e FVIII, como elementos críticos. A trombina cliva a fbrinogênio para gerar a fibrina, o produto final da cascata, o qual estabiliza o coágulo hemostático. O FVa, a forma ativada do FV, serve como um co-fator dentro do complexo da protrombinase (PT), uma maquinaria multi-molecular que aumenta significativamente a geração de trombina. O FV é homólogo ao FVIII e ambas as deficiências de FV e FVIII podem levar a desordens de sangramento severas. O FV circula no sangue como uma glicoproteína de única cadeia de peso molecular 333.000 com pouca ou nenhuma atividade pró-coagulante. A estrutura primária do FV humano foi relatada, e começando pelo terminal N (amina), o FV consiste nos domínios A1, A2, B, A3, C1, e C2. Os domínios A têm cada um aproximadamente 310 resíduos, o domínio B tem aproximadamente 840 resíduos e cada domínio C tem aproximadamente 150 resíduos. O FV é clivado pela trombina no domínio B nas posições R709, R1018 e R1545 para dar surgimento ao co-fator ativo (FVa), o qual é composto de uma cadeia pesada (domínios A1 e A2 e um pequeno segmento do domínio B) e uma cadeia leve (domínios A3-C1-C2). As cadeias pesada e leve são ligadas não covalentemente na presença de íons divalentes de metal.

O complexo PT (protrombinase) consiste da protease de serina FXa, do cofator Va não enzimático, íons de cálcio, e uma superfície apropriada de fosfolipídeos. O Fator Va, dentro do complexo PT serve como um receptor de membrana para o Fator Xa, como um efetor que aumenta a atividade catalítica do FXa para a conversão da protrombina em trombina e como promotor da interação entre a protrpmbina e o complexo protrombinase. O complexo protrombinase é aproximadamente de 300.000 a 1.000.000 de vezes mais eficiente na ativação da protrombina do que o Fator Xa sozinho. O FXa liga-se fracamente ao FV intacto mas parece interagir com relativamente alta afinidade com as cadeias pesada e leve do FVa enquanto a protrombina liga-se somente à cadeia pesada do FVa. Sabe-se que a clivagem da APC na R506 do FVa reduz a afinidade do FVa para FXa sugerindo que a área do R506 tem contato com o FXa. A remoção dos resíduos de 683 a 709 do FVa resulta em diminuída interação do FXa com o FVa e reduz grandiosamente a atividade de co-fator do FVa. Ambos FV e FVa ligam-se com alta afinidade de modo independente do cálcio à membranas que contêm fosfolipídeos negativamente carregados. Tem sido proposto que os domínios C2 e A3 do Fva interagem através de forças iônicas e hidrofóicas, respectivamente, com a superfície da membrana.

A inativação proteolítica do FVa pela APC é uma das reações chave na regulação da formação de trombina. A atividade catalítica da APC é estimulada por um co-fator não enzimático, a proteína S (PS), e fosfolipídeos carregados negativamente. A APC cliva o FVa dentro da cadeia pesada em R306, R506 e R679. Deficiências nas proteínas C e S têm sido associadas com risco aumentado de trombose. Recentemente, Dahlbäck e outros (1993) relataram um novo fator genético de risco para a trombose que envolve uma única mutação pontual no gene FV levando à substituição do resíduo R506 para Q (R é arginina e Q é glutamina). Essa anormalidade do FV (FV-R506Q) é referida como resistente a APC e tem sido caracterizada adicionalmente por vários grupos. A APC foi proposta por interagir com a cadeia leve do FVa com contribuição potencial dos resíduos de 1865 a 1874 enquanto dos resíduos de 493 a 506 do FVa poderiam estar envolvidos na ligação da PS e do FXa. A clivagem da APC na R506 é inibida seletivamente pela presença do FXa enquanto a PS é considerada por contra-atuar na capacidade do FXa de proteger o FVa da clivagem pela APC. A PS parece aumentar a clivagem do FVa na R506 pela APC. A PS também tem uma atividade independente da APC já que inibe diretamente a ativação da protrombina através das interações com FVa e Xa.

Recentemente, uma função anticoagulante da o FV foi relatada. O FV intacto tem sido proposto como um co-fator sinergístico para o sistema PS-APC na degradação do FVIIIa. Tem sido sugerido que uma região do domínio B poderia estimular o inativação do FVIIIa pela APC. Varandi e outros (1996) têm mostrado que o FV-R506Q tem reduzida atividade de co-fator na degradação do FVIIIa quando comparado ao FV de tipo selvagem.

Os três domínios A dos fatores V e VIII são homólogos aos três domínios A da ceruloplasmina, a principal proteína de transporte para o cobre no plasma. Interessantemente, o FV e o FVIII também se ligam a íons de cobre. A ceruloplasmina humana é uma glicoproteína de cadeia singular de 1.046 resíduos de aminoácidos. Ela pertence à uma família de oxidases de cobre azul, com sub-unidades estruturais baseadas no domínio cupredoxina (centros de cobre nas proteínas com diferentes classificações e cores). O dobramendo da cupredoxina é em oito faixas de chave grega beta em forma de barrica que foi observada primeiramente na plastocianina (proteína com função redox e de transferência de elétrons, de cor azul e que difere entre algas, bactérias e eucariotos) e na azurina.

[Figura da azurina retirada do texto reproduzido parcialmente na observação ao final desta seção: ]

A instabilidade do FV e glicosilação heterogênea tem até agora estorvado seu estudo estrutural por cristalografia de raio X. Avanços recentes em química computacional combinada com análises de dados experimentais e clínicos previamente relatados podem proporcionar pistas da função da estrutura. No momento, modelos teóricos para o fator VIII foram recentemente relatados usando o método de construção de modelo comparativo bem estabilizado (Greer, 1990). Na presente investigação, um modelo para os domínios A do FV foi desenvolvido usando-se a estrutura da ceruloplasmina como um molde. Esse modelo permitiu-nos propor mecanismos moleculares para o ponto do complexo FV/FVa de preferência para interações e inativação pela APC.



[Obs1.:

Os centros de cobre nas proteínas foram inicialmente classificados em três tipos. A classificação era baseada principalmente em seus formatos espectroscópicos, particularmente aqueles em absorção eletrônica e espetro de ressonância paramagnética de eletron. Desde a classificação inicial, dois novos centros de cobre, CuA 5,6 and Cuz,7 foram descobertos e caracterizados. Suas estruturas únicas não pertencem a nenhum dos três tipos de centros de cobre e agora aqueles centros formam suas próprias classes.


As proteínas de cobre de tipo 1 são a classe de proteínas que deram origem à denominação de cupredoxinas. As proteínas de cobre de tipo 1 incluem ambas as proteínas com função conhecida de transferir elétrons (plastocianina e rusticianina), e proteínas cujas funções biológicas foram determinadas conclusivamente (stelacianina e plantacianina). Embora essas proteínas com funções desconhecidas não possam ser chamadas cupredoxinas por definição funcional estrita, elas têm sido classificadas como cupredoxinas pois compartilham a mesma estrutura geral de dobramento e sítios de ligação a metal das cupredoxinas. Em adição, muitas proteínas de múltiplos domínios como lacase, ascorbato oxidase e ceruloplasmina contêm múltiplos centros de metal, um dos quais é o cobre de tipo 1. Esses centros de cupredoxina também estão incluídos aqui. Finalmente, ambos os centros CuA na citocromo c oxidase (CCO) e na óxido nitroso redutase (N2OR), e o centro de cobre vermelho na nitrocianin serão discutidos nesse capítulo porque seus centros de metal são estruturalmente relacionados com o centro de cobre de tipo 1 e o domínio de proteína que contém ambos os centros compartilham o mesmo motivo geral das cupredoxinas. O centro CuA também funciona como um agente de transferência de elétrons. Como as ferredoxinas, as quais contém ambos os centros ferro-enxofre dinucleares ou tetanucleares, as cupredoxinas podem incluir tanto centros de cobre mononucleares ou dinucleares e seus sítios de ligação a metal.



As cupredoxinas discutidas neste capítulo compartilham uma estrutura de dobramento geralmente similar, comumente chamada a dobra da cupredoxina. É isto apesar do fato de a homologia seqüencial entre as cupredoxinas variar grandemente, algumas delas são menos que 10% homólogas entre si. O dobramento da cupredoxina é um exemplo do motivo estrutural da proteína chamado chave-grega barrilhada, que é um dos motivos estruturais de proteínas mais comuns compartilhado pelas metaloproteínas (tais como a superóxido dismutase e a hemocianina) bem como pelas não-metaloproteínas (tais como imunoglobulinas e piruvirato cinase). Uma chave-grega barrilhada consiste de seis ou oito fitas antiparalelas com uma ou mais conexões que atravessam o topo ou o fundo do barril, mais frequentemente saltando duas faixas de permeio. A topologia relembra o padrão de uma chave-grega. Os laços conectando faixas diferentes variam em lente e identidade de sequência. Eles também podem ser substituídos por hélices. A dobradura da cupredoxina difere do motivo típico de chave-grega barrilhada em que este contém duas faixas paralelas, entre a sua primeira e terceira faixas e entre a oitava e metade da segunda faixa. A segunda faixa paralela pode formar-se porque, nas cupredoxinas, a segunda faixa está sempre quebrada em duas pequenas fitas separadas de modo que a primeira metade é antiparalela à primeira enquanto a segunda é paralela à oitava. Os centros de cupredoxina sempre residem numa bolsa entre três laços conectando as faixas, com dois desses três laços proporcionando ligantes ao centro de cobre. A despeito da sua proximidade com a superfície da proteína, o centro de cupredoxina é completamente protegido de solventes, uma feição estrutural que é importante para sua função de trasferidor de elétrons pois isso contribui para reduzir a reorganização de energia na transferência de elétron.


Uma característica interessante das cupredoxinas é que os membros dessa família apresentam uma variedade de cores intensas e belas, do azul (plastocianina e azurina), ao verde (plantacianina e algumas nitrito redutases), ao vermelho (nitrosocianina), ao amarelo (alguns modelos de proteínas e compostos com cupredoxina), e ao púrpura (o centro CuA da citocromo c oxidase e da óxido nitroso redutase). Esse arco-íris de cores torna as cupredoxinas agradáveis de se trabalhar e desafiadoras para estudo.


Centros de Cobre Azuis em Enzimas Multicobres e de Múltiplos Domínios

O centro de cobre azul as cupredoxinas também é encontrado em enzimas multicobre e de múltiplos domínios tais como ascorbato oxidase (AO), laccase (Lc), ceruloplasmina humana (Cp), e uma sub-família de nitrito redutase contendo cobre. A nitrito redutase (NiR) catalisa a redução do nitrito (NO2) para óxido nítrico (NO), uma etapa do ciclo de denitrificação biológico. Dois tipos distintos de NiR são conhecidos: o NiR multiheme e o NiR multicobre. O NiR multicobre pode ser classificado adicionalmente como NiRs contendo centro de cobre verde e NiRs contendo centro de cobre azul. As enzimas AO, Lc, e Cp são oxidases que catalisam a redução de quatro elétrons do dióxigênio para água in vitro. O papel funcional preciso de cada uma das proteínas não foi determinado conclusivamente.

A NiR multicobre é um homotrímero, no qual cada monômero contém dois domínios. Por outro lado, a AO e a Lc contêm três domínios enquanto a Cp humana contém seis domínios. Cada domínio dessas enzimas tem uma dobra típica de cupredoxina. O centro de cobre azul reside no primeiro domínio da NiR, o terceiro domínio da AO e da Lc, e o segundo, quarto e sexto domínios da Cp humana. O centro de cobre azul no domínio 1 da NiR, domínio 3 da AO e nos domínios quatro e seis da Cp humana são quase similares ao da plastocianina consistindo de CuII(NHis)2SCysSMet em geometria tetraédrica nivelada. Enquanto a distância do CuII–S_(Met) é menor para o centro de cobre na NiR do que na pastocianina, as distâncias na AO e na Cp são em geral mais longas.


Além disso, a metionina axial ligante no domínio três da Lc e no domínio 2 da Cp é substituída por uma leucina. Essa substituição da metionina com um resíduo de leucina mais hidrofóbico pode ser parcialmente responsável pelos altos potenciais de redução da Lc do polyporus versicolor (um fungo de casca de árvore) bem como o domínio dois de cobre azul da ceruloplasmina humana. O potencial de redução no domínio 2 da ceruloplasmina humana é tão alto que ela está sempre na forma reduzida sob condições fisiológicas e não se espera que atue num papel na função de enzima. Com exceção desse centro redox inativo, outros centros de cobre em oxidases multicobre funcionam por transferência de elétrons a partir de parceiros fisiológicos das oxidases para os centros de cobre trinucleares onde as reações de oxidases têm lugar.

“Electron Transfer: Cupredoxins “ Y. U http://montypython.scs.uiuc.edu/papers/08172_final.pdf - 861 KB,
Obs.: http://www.freepatentsonline.com/7511117.html ]

Fonte: Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2144041/?tool=pubmed