ENDOCITOSE E DEGRADAÇÃO DOS COMPLEXOS ALFA 1- ANTITRIPSINA-PROTEASE POR MEIO DO RECEPTOR DE COMPLEXOS SERPINA-ENZIMA (SEC)


A alfa-1-antitripsina (alfa 1-AT) é similar a outros membros da super-família de inibidores de protease de serina (serpinas) em que esta se submete a rearranjo estrutural durante a formação de complexos inibitórios estabilizados covalentemente com sua enzima correspondente, a elastase do neutrófilo. Recentemente nós demonstramos um receptor de superfície celular abundante de alta afinidade nas células de hepatoma humanas e fagócitos mononucleares humanos as quais reconhecem o domínio específico de conformação do complexo alfa1-AT-elasase bem como de outros complexos enzima-serpina (Perlmutter, D.H., Glover, G.I., Rivetna, M., Schasteen, C.S. e Fallo, R.J.(1990). A ligação ao receptor do complexo serpina-enzima (SEC) ativa uma via de transdução de sinal para aumentar a expressão do gene alfa1-AT e pode ser responsável pela remoção dos complexos serpina-enzima. Neste estudo. Neste estudo, nós mostramos que existe uma internalização dependente de tempo e saturável dos complexos alfa1-AT-elastase e alfa1-AT-tripsina nas células HepG2 de hepatoma humanas. A internalização é mediada pelo receptor SEC (complexo de serpina-enzima) como definido pela inibição pelos peptídeos sintéticos correspondentes aos resíduos 359-374 da alfa1-AT. Análises de eletroforese em gel poliacrilamida de sulfato sódico de dodecila (sulfato sódico de lauril, usado na pasta de dentes) da radioatividade intracelular demonstraram que complexos intactos de alfa1-AT de 75 e 66 quilodáltons foram internalizados. Análises cinéticas da internalização a 37oC mostraram que uma única sub-classe dos complexos 125I-alfa1-AT-tripsina, pré-ligados às células a 4oC, desapareceram da superfície celular e acumularam-se intracelularmente dentro de 5 a 15 minutos a 37oC. A concentração intracelular dos complexos radio-etiquetados então decresceu rapidamente coincidentemente com o surgimento de produtos de degradação solúvel em ácido no fluido de cultura extracelular. A degradação intracelular foi inibida pela internalização a 18oC ou pela internalização a 37oC na presença de fracas bases de cloreto de amônio (NH4+CL), primaquina e cloroquina, indicando que a deradação é no lisossomo. Esses resultados indicam que em adição ao seu papel na transdução de sinal, o receptor SEC participa na internalização de todos os complexos alfa1-At-protease para degradação no lisossomo.
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Sendo a elastase do neutrófilo capaz de degradar muitos componentes da matriz do tecido conectivo, pensa-se que seu inibidor alfa1-antitripsina (α1-AT) atua num papel crítico na manutenção da “balança elastase-antielastase” e na regulação da renovação do tecido conectivo. A atividade não contraposta da elastase do neutrófilo provavelmente é a responsável pela doença destrutiva dos pulmões em indivíduos com deficiências herdadas da alfa1-AT e contribui para a lesão dos pulmões em estados de enfermidade (fibrose cística, síndrome da dificuldade respiratória em adultos) associada com inativação da alfa1-AT proteolítica ou oxidativa. A alfa1-AT é o arquétipo de uma família de proteínas, as serpinas, que formam complexos covalentemente estabilizados com suas proteases de serina relacionadas, ou com seus hormônios ligantes relacionados no caso das globulinas ligantes de corticosteróide e hormônio da tireóide. Durante a formação do complexo alfa1-AT-elastase há a inativação da elastase e o rearranjo estrutural da molécula alfa1-AT. Recentemente, nós demonstramos um receptor de superfície celular que reconhece o domínio específico da conformação do complexo alfa1-AT-elastase. O domínio de ligação ao ligante é altamente conservado entre os membros da família das serpinas e o receptor reconhece ao menos três outras serpinas e suas enzimas relacionadas. Por isso nós propusemos o nome receptor SEC (complexo enzima-serpina). A ligação ao receptor SEC media um aumento na expressão do gene alfa1-AT. A especificidade do ligante do receptor SEC é similar à especificidade previamente demonstrada na remoção de complexos serpina-enzima “in vivo”, emergindo a possibilidade de que o receptor SEC está envolvido na remoção/catabolismo dos complexos serpina-enzima. No estudo a seguir, nós mostramos que o receptor SEC media a internalização e a degradação intracelular dos complexos alfa1-AT-elastase e alfa1-AT-tripsina.


RESULTADOS E DISCUSSÃO

A ligação dos complexos 125I-alfa1-AT-Elastase às células HepG2 –
Mono-camadas separadas de células HepG2 foram incubadas por duas horas a 4oC com várias concentrações diferentes de complexos 125I-alfa1-AT-Elastase na ausência ou presença de complexos alfa1-AT-elastase não etiquetados em excesso molar de 100 vezes. Existe ligação específica e saturável, com a metade da saturação máxima em 30 a 40 nM (nano mol= 10-9 M). Complexos alfa1-AT-elastase e Valina 358 recombinantes derivados de levedura e etiquetados com 125I e complexos 125I-tripsina-alfa1-AT-Elastase tinham características de ligação idênticas (dados não mostrados). O grau relativamente alto de ligação não específica nesses experimentos é devido provavelmente à dificuldade da reação no preparado com ligante etiquetado e competidor não etiquetado. Já que a tripsina pôde ser iodada em uma atividade de alta especificidade, retendo ainda sua capacidade de formar um complexo com a alfa1-AT, nós usamos complexos 125I-tripsina-alfa1-AT para experimentos remanescentes.



A especificidade de ligação dos complexos foi examinada adicionalmente por ensaios de ligação competitiva. A ligação dos complexos 125I-tripsina-alfa1-AT foi bloqueada em uma extensão similar por complexos alfa1-AT-elastase não etiquetados, complexos alfa1-AT-tripsina, peptídeo 105Y, mas não pela alfa1-AT nativa ou pelo peptídeo PB154. O peptídeo PB105Y corresponde aos resíduos alfa1-AT 359-374 (SIPPEVKFNKPFVYLI) e o peptídeo PB154 corresponde aos resíduos alfa1-AT 375-394 (IEQNTKSPLFMGKVVNPTQK). Esses dados indicam que a alfa1-AT no complexo com cada uma das proteases de serina elastase de neutrófilo ou tripsina pancreática têm idênticas características de ligação. Esses dados também mostram que ao menos parte do domínio correspondente à sequência do peptídeo sintético PB105Y constitui o domínio de ligação ao receptor do complexo alfa1-AT-protease.



A ligação do complexo 125I-alfa1-AT-elastase é similar à ligação de 125I-peptídeo PB105Y. Existe ligação específica e saturável de 105Y com metade da saturação máxima a 40 nano mol. Análises de gráficos de Scatchard (representação da concentração do ligante unido dividida pela concentração do ligante livre, contraposta ao ligante unido), como mostrado numa publicação prévia, prevê um Kd de 40 nM e 4,5xIo5 de receptores de membrana por célula. Há um grau muito baixo de ligação não específica porque um único peptídeo é usado como ligante etiquetado e competidor não etiquetado. A especificidade de ligação do peptídeo PB105Y é similar àquela dos complexos 125I-alfa1-AT-elastase. A ligação 125I-peptídeo PB105Y está bloqueada pelo peptídeo PB105Y não etiquetado, complexos 125I-alfa1-AT-elastase não etiquetados, mas não pela alfa1-AT nativa, elastase nativa ou peptídeo PB154. A ligação do 125I-peptídeo PB105Y também está bloqueada por complexos alfa1-AT-tripsina não etiquetados (dados não mostrados).



A captura e internalização dos Complexos-

Depois nós investigamos o destino dos complexos serpina-enzima ligados na superfície e examinamos a possibilidade de os complexos serem internalizados por células HepGP. As células HepGP foram incubadas a 37oC com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT por diferentes intervalos de tempo. O fluido de cultura celular foi coletado e as monocamadas de células enxaguadas e então incubadas a 4oC com solução salina protegida de fosfato (com pouco fosfato?) contendo a proteinase K para remover ligantes ligados à superfície. Há internalização dos complexos etiquetados específica e dependente do tempo. O experimento foi repetido por 60 minutos na ausência ou presença de vários competidores diferentes. Os resultados indicaram que a internalização dos complexos tripsina-alfa1-AT etiquetados é bloqueada por complexos tripsina-alfa1-AT não etiquetados, elastase-alfa1-AT não etiquetados, peptídeo PB105Y, mas não pela Alfa1-AT nativa ou peptídeo PB154. Para determinar a espécie molecular internalizada pelo receptor SEC, as células HepG2 que foram incubadas com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT foram lisadas e parte do lisado celular submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (sulfatoto de sódio dodecil) seguida de auto-radiografia. Os resultados indicaram que complexos de tripsina-alfa1-AT de alto peso molecular de 75 e 66 quilodáltons ficam intactos na ligação de superfície celular e frações internas. Existe uma acumulação dependente de tempo dos complexos etiquetados na fração interna entre 60 e 240 minutos.


Nós também determinamos a distribuição de complexos 125I-tripsina-alfa1-AT durante um único ciclo de endocitose nas células HepG2. As células HepG2 foram incubadas por duas horas a 4oC com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT em concentrações de saturação. As monocamadas celulares foram enxaguadas extensivamente e depois incubadas a 37oC em meio de captação sem nenhum ligante etiquetado para examinar o destino das sub-classes agora pré-ligadas de ligantes etiquetados. Em vários intervalos de tempo diferentes o fluido de cultura celular foi colhido, e as monocamadas celulares foram enxaguadas extensivamente de novo e incubadas a 4oC por uma hora adicional em solução salina protegida de fosfato contendo proteinase K para determinar a captação total, captação resistente à proteinase K (fração interna), e captação sensível à proteinase (fração ligada à superfície). O fluido da cultura celular foi submetido à contagem de cintilação (cintilador é uma substância que emite luz quando atingida por uma substância subatômica ou por raios X ou gama. Stedman) antes e depois da precipitação com ácido para determinar a cinética da dissociação do ligante pré-ligado e a cinética do aparecimento de produtos de degradação do ligante solúvel com ácido, respectivamente. Os resultados mostram que uma vez ligados ao receptor de superfície celular, os complexos de tripsina-alfa1-AT etiquetados desaparecem da superfície celular em 5 a 10 minutos (fração resistente a proteinase ). Durante os próximos 40 minutos a concentração intracelular de complexos tripsina-alfa1-AT etiquetados decresceu coincidentemente com o surgimento de produtos da degradação do ligante no fluido extracelular (ligante extracelular solúvel em ácido). Houve também surgimento de produtos de degradação do ligante em dependência ao tempo no fluido extracelular após as células HepG2 terem sido inclubadas a 37oC com complexos 125I-alfa1-AT-tripsina (dados não mostrados). Isso indica que há deradação de ambos a enzima e seu inibidor. As cinéticas da endocitose e degradação mostrada aqui são similares às previamente descritas em células de hepatoma para complexos de inibidor de ativador de plasminogênio com ativador de plasminogênio de tipo de tecido e para o assialoorosomucóide, um ligante para o receptor da assialoglicoproteína (é uma proteína sem uma porção do ácido siálico; sialo é saliva. Stedman) que também é direcinado ao lisossomo para degradação. Uma via similar tem sido demonstrada recentemente em células U937 para complexos de inibidor 1 de ativador de plasminogênio com a urocinase ativador de plasminogênio.


Finalmente, nós examinamos o efeito da temperatura e bases frágeis na degradação intracelular dos complexos 125I-tripsina-alfa1-AT. Primeiro, as células HepG2 foram incubadas por duas horas com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT em concentrações de saturação a 38 e 18oC. A incubação a 18oC resultou em uma redução de 95,8% na radioatividade solúvel em ácido liberada no fluído extracelular. Em segundo lugar, as células epG2 foram incubadas por duas horas a 37oC com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT na ausência ou presença das bases frágeis. A radioatividade solúvel em ácido no fluido extracelular decresceu em 45,2, 35,8 e 39,3% na presença de cloreto de amônio, primaquina e cloroquina, respectivamente. Esses dados indicam que a degradação dos complexos alfa1-AT-protease requerem a entrega ao ou o tráfego através de compartimentos ácidos. O efeito inibitório da incubação a 18oC sugere adicionalmente que os primeiros compartimentos endossômicos não são o sítio de degradação do complexo. Os dados são mais consistentes com a entrega do ligante ao lisossomo ou compartimentos endossômicos posteriores como um requisito para degradação.


Tomados juntos, os resultados dessas experiências demonstram a internalização mediada pelo receptor e a degradação intracelular de todos os complexos alfa1-AT-protease. Além disso, a ligação competitiva e estudos de captura indicam que a internalização e degradação intracelular de complexos alfa1-AT-protease é mediada pelo receptor SEC. O receptor SEC foi identificado originalmente como um componente da via de transdução de sinal para aumento da expreção do gene alfa1-AT em resposta aos complexos alfa1-AT-elastase. Ele reconhece um domínio dentro da alfa1-AT (os resíduos de 359 a 374) o qual está disponível para ligação ao receptor somente quando a alfa1-AT forma um complexo com a protease de serina ou quando é proteoliticamente modificado por uma combinação de oxidação e protease de serina ou por metaloprotease. O receptor SEC reconhece esse mesmo domínio altamente conservado em outros complexos serpina-enzima, antitrombina III- trombina, catepsina G – alfa1-antiquimiotripsina e em menor extensão inibidor de C1- C1 (obs.: o fator XIII da coagulação tem um domínio de inibidor de C1). Estudos prévios têm sugerido que esses outros complexos serpina-enzima competem pela remoção dos complexos alfa1-AT-protease “in vivo”. Baseados nessa similaridade em especificidade do ligante e nos estudos correntes mostrando a endocitose e a degradação dos complexos alfa1-AT-protease mediada pelos receptores SEC, é altamente aceitável que o receptor SEC esteja envolvido na remoção/catabolismo dos complexos alfa1-AT-protease e outros complexos serpina-enzima.


Acknowledgments-We are grateful to Dr. Harvey Colten

Fonte: http://www.jbc.org/content/265/28/16713.long