A ATIVAÇÃO DA HEMINA MELHORA A INFECÇÃO POR HIV-1 POR VIA DA INDUÇÃO DA HEME OXYGENASE

Krishnakumar Devadas and Subhash Dhawan

RESUMO

A Hemina [cloreto do heme em que o Fe2+ transformou-se em o Fe3+ , cloro-hemina. Stedman] , um componente critico da hemoglobina, é um ingrediente ativo de uma terapêutica biológica aprovada pela Administração de Alimentos e Medicamentos para o tratamento da porfíria [Obs.: A ferroquelatase, ou heme sintase (18q21.3), a enzima terminal da via da biosíntese do heme, catalisa a inserção do ferro na protoporfirina para formar o heme (omim 612386). A porfíria é um grupo de distúrbios envolvendo a biossíntese do heme, caracterizado pela excreção excessiva de porfirina ou seus precursores; a porfina é o núcleo básico não substituído das porfirinas]. Essa matéria descreve uma função biológica dessa molécula na indução da defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV-1 pela via da indução da heme oxigenase-1 (HO-1). O tratamento de monócitos com hemina inibiu substancialmente a replicação do HIV, como evidenciado pelo RNA viral quase indetectável e células livres da proteína p24 do HIV-1 de maneira dependente da dose. A exposição dessas células à hemina antes da infecção, no momento da infecção ou após a infecção causou uma redução de 90% no DNA do HIV com níveis significativamente baixos da p24 do HIV-1 e efeitos citopáticos associados ao HIV. Além disso, o tratamento com hemina suprimiu significativamente a infecção de monócitos e células T inoculadas com as linhagens com tropismo para R5, X4 e R5X4 (R5 deve ser CCR5 e X4 deve ser CXCR4), e de outros HIV isolados com transcriptase reversa resistente, resistência a azidothymidina (AZT), resistência a ddC/ddl, resistência a nivirapine, e outros. A administração intraperitoneal (peritôneo é uma membrana que recobre a parede abdominal e as vísceras) da hemina por quatro dias pós a infecção por HIV reduziu em seis vezes a carga viral no soro de camundongos SCID diabéticos não obesos reconstituído com células mononucleares do sangue periférico humanas. A supressão da replicação do HIV em células ativadas com hemina foi correlacionada com a indução da HO-1 e foi atenuada por tin protoporfirina (SnPP) IX, um inibidor da atividade da HO-1, sugerindo um papel central dessa enzima endógena na regulação da infecção pelo HIV. A indução da HO-1 induzida pela hemina nas células GHOST co-expressando CCR5, CXCR4 e CD4 foi consistente com a inibição da ativação do promotor do longo terminal de repetição (LTR) dependente de Tat levando à reduzida expressão de GFP. Esses achados sugerem um papel importante da atividade da HO-1 induzida pela hemina como um mecanismo de defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV-1.

INTRODUÇÃO

A hemina é a metade protética para um grande número do proteínas que atuam em papéis essenciais no transporte de oxigênio, função mitocondrial, e uma variedade de vias de transduções de sinais. Ela sobre-regula a heme oxigenase-1 (HO-1), uma enzima intracelular que catalisa a etapa inicial e de limitação da taxa da degradação oxidativa do heme, e gera biliverdina, ferro livre (Fe2+), e monóxido de carbono (CO). Ao longo das décadas passadas, investigações sobre o papel funcional da atividade da HO-1 aumentaram grandiosamente nossa compreensão sobre esta enzima como um mecanismo de defesa celular contra condições relacionadas ao estresse e outras condições patogênicas. Os efeitos benéficos da HO-1 também têm sido relatados em uma variedade de respostas imunes e na inflamação. Em desordens inflamatórias auto-imunes experimentais, tais como a encefalomielite e a colite, as funções protetoras da HO-1 têm-se mostrado associadas com a ativação do sistema imune.

Em adição às condições relacionadas com respostas imunes e inflamatórias, o ciclo de vida do HIV-1 está intimamente associado com a ativação do estado de suas células hospedeiras. A infecção pelo HIV-1 é dependente de uma variedade de fatores do hospedeiro para entrada, transcrição e expressão dos genes virais e é controlada por citocinas e pela maquinaria transcricional do hospedeiro. Embora numerosas reportagens publicadas prévia e recentemente tenham demonstrado múltiplas ações proeminentes da indução da HO-1 em vários processos inflamatórios, seu papel na regulação da infecção pelo HIV-1 não é conhecida. O presente estudo investigou o papel da HO-1 induzida pela hemina como um possível fator de proteção contra a infecção pelo HIV-1. Os achados deste estudo demonstram que o aumento da atividade da HO-1 mediado pela hemina suprime substancialmente a replicação do HIV tanto ‘in vitro’ quanto ‘in vivo’ com nenhum efeito tóxico aparente. Desde 1970, quando foi aprovada pela FDA, a hemina tem sido usada para tratar com sucesso uma variedade de desordens, tais como porfíria aguda, falência de transplante do fígado devida à recorrência de protoporfiria eritropoiética, e talassemia [qualquer tipo de distúrbio no metabolismo da hemoglobina caracterizado por comprometimento na síntese de uma ou mais das cadeias polipeptídicas da globina. Stedman] intermediária com mínimos efeitos colaterais. [Obs.: omim 141900 – Os locus alfa e beta determinam a estrutura de dois tipos de cadeias polipeptídicas na hemoglobina adulta, Hb A. A globina beta mutante que dobra como uma foice causa a anemia da célula em forma de foice (omim 603903). A ausência da cadeia beta causa a talassemia beta zero. Quantidades reduzidas de globina beta detectáveis causam a talassemia beta positiva. Por motivos clínicos, as talassemias beta são divididas em talassemia principal (dependente de transfusão), talassemia intermediária (de severidade intermediária) e talassemia menor (assintomática).]Nossos resultados, por isso, podem proporcionar novas estratégias no desenvolvimento de intervenções terapêuticas potencialmente seguras para o tratamento da infecção por HIV.

RESULTADOS

Químicamente conhecida como cloro-[7,12-diethenyl-3,8,13,17-tetramethyl-21H,23H-porfina-2,18-dipropanoato(2-)-N21,N22,N23,N24]ferro, a hemina representa um componente crítico da molécula de hemoglobina, cuja estrutura é mostrada na figura 1A. As vias de sinalização mediadas pela hemina envolvendo a ativação da HO-1 (heme oxigenase) têm sido implicadas numa variedade de desordens inflamatórias. Todavia, sua função na regulação da infecção por HIV permanece desconhecida. Para examinar o papel da ativação da HO-1 na infecção por HIV, monócitos foram expostos à hemina, infectados com HIV-1, e examinados para a replicação viral. Como mostrado na Figura 1B, o tratamento dos monócitos cultivados com hemina inibiram eficientemente a expressão do RNA viral de modo dependente da dose. Consequentemente, a replicação do HIV-1 foi completamente inibida numa concentração ótima de 100-µM(micro mol). A replicação do HIV-1 permaneceu suprimida ainda quando os monócitos foram infectados com alta MOI, como foi evidenciado pela indetectável produção de p24 do HIV livre na célula mensurada no sétimo dia após a infecção.

O tratamento dos monócitos com hemina 24 horas antes da infecção suprimiu significativamente a expressão do DNA viral (figura A). Os níveis do DNA do HIV em células tratadas com hemina no momento da infecção também estavam substancialmente mais baixos em comparação com controles não tratados. Para determinar a capacidade da hemina suprimir a replicação viral após a entrada, as células foram incubadas com hemina quatro horas após a exposição viral, e o DNA genômico foi analisado para a presença de sequências específicas de env por amplificação por PCR em 24 horas. Os resultados desses experimentos mostram que o tratamento com hemina quatro horas depois da inoculação do HIV, o que fornece tempo suficiente para a entrada viral, também reduziu significativamente a expressão do gene viral. O conjunto de iniciadores usados para a amplificação por PCR foi específico para sequências altamente conservadas do envelope do HIV-1. Os produtos do PCR a partir de DNA ou cDNA de células não infectadas usando-se os mesmos iniciadores foram negativas para bandas do HIV, sugerindo que os produtos amplificados por PCR de células não infectadas por HIV eram altamente específicos. O tratamento de monócitos com hemina 24 horas antes da infecção, no momento da infecção, ou ainda vinte e quatro horas após a infecção (+24h) suprimiu a replicação do HIV (Fig.2B). Esses resultados foram consistentes com uma marcada redução de efeitos citopáticos associados ao HIV em monócitos tratados com hemina 24 horas antes da infecção (-24h), no momento da infecção (0h), ou 24 horas após a infecção (+24h) como mostrado na Fig 2C.

Para determinar se a resposta celular induzida por hemina foi um mecanismo de defesa do organismo para refractariedade das células à infecção pelo HIV e, a partir disso, seria independente do tropismo viral, os monócitos tratados com hemina foram desafiados com viroses X4, R5 e de duplo tropismo R5X4 , e a cultura sobrenadante foi examinada para p24 no sétimo dia após a infecção. Como esperado, na ausência da hemina, os monócitos foram infectáveis com as linhagens virais R5 (92US714 HIV-1 com env do subtipo B, e 93IN101 HIV-1 com env do subtipo C) e R5X4 (92RW009 HIV-1 com env do subtipo A e 92HT596 HIV-1 com env do subtipo B). Entretanto, surpreendentemente, exceto para o HIV-1 92UG046 (HIV-1 env do subtipo D), todas as p24 do HIV estavam praticamente indetectáveis na cultura sobrenadante infectada com as outras duas linhagens virais com tropismo para X4 CMU02 (HIV-1 env de subtipo EA) e 98IN017 (HIV-1 env subtipo C). Todavia, a despeito do tropismo viral, o tratamento com hemina inibiu a infecção de monócitos com todos os HIV-1 isolados testados (Fig.3A). Similarmente, em adição aos vírus isolados adaptados em laboratório, o tratamento com hemina inibiu a replicação do HIV em PBL (deve se linha de células do sangue periférico) infectadas com um vírus resistente a azidothimidina (AZT) contendo uma mutação no aminoácido residual 215Y (tirosina) da transcriptase reversa (HIV-1RTMF/MT-2), uma mutação no aminoácido residual 74V (valina) da transcriptase reversa (HIV-174v/MT-2) gerando resistência ao 2’3’-dideoxi-iosina e ao 2’3’-dedeoci-citidina, um vírus resistente a nevirapuna (N119), bem com um vírus isolado de pacientes com tropismo para X4 92UG029 (HIV-1 env de subtipo A) e linhagens virais com tropismo R5X4 93BR (BRASIL)020 (HIV-1 envelope de subtipo F) (Fig.3B).

Para avaliar se a atividade anti-HIV induzida pela hemina é preservada “in vivo”, camundongos NOD-SCID implantados com células monocitóides de sangue periférico foram inoculados com o HIV-1 (105 TCID50/camundongo) e então, cinco dias depois, administrados com uma dose de 4mg/kg por dia. No sétimo dia, os camundongos foram re-injetados com 105 TCID50/camundongo HIV-1 para assegurar a infecção produtiva. Como mostrado na figura 4, os níveis de p24 do HIV-1 no soro dos camundongos infectados foi detectável no quarto dia, um dia antes da administração da hemina. Quatorze dias após a primeira inoculação o nível de p24 estava seis vezes mais baixo do que o dos controles não tratados (Fi.4). A supressão da replicação do HIV pelo tratamento dos camundongos com hemina foi consistente com a inibição “in vitro” da replicação do HV e a reduzida expressão do gene viral.

A hemina é conhecida por induzir a expressão da HO-1 em uma variedade de tipos celulares. O tratamento de monócitos com hemina induziu a expressão da HO-1 de maneira dependente da dose e do tempo (Fg5A). A indução máxima foi observada quando as células foram incubadas com 100 µM (micro mol) de hemina por 18 horas a 37oC. Esses dados foram consistentes com a supressão da replicação do HIV, como descrito acima. Nenhum efeito citotóxico foi observado nessas concentrações (dados não mostrados). Para determinar a especificidade da atividade da HO-1 induzida por hemina na mediação da atividade anti-HIV, monócitos foram incubados com várias concentrações de SnPP IX (protoporfirina IX), um inibidor da função da HO-1, uma hora antes do tratamento com hemina a 25 µM por uma hora, depois foram infectados com HIV-1, e então examinados enquanto células livres de p-24 do HIV-1 cinco dias após a infecção. Os resultados desse experimento mostrados na figura 5B demonstram que o tratamento com SnPP IX em ótima concentração de 6,25 µM atenuou a inibição da infecção por HIV induzida por hemina, sugerindo que a supressão da infecção do HIV mediada por hemina foi mediada pela indução da HO-1. Uma baixa concentração de hemina (25 µM) foi usada nesses experimentos devido aos efeitos citotóxicos do SnPP em altas concentrações. Em outro conjunto de experimentos, 12,5 µM de SnPP atenuou a supressão da replicação do HIV pela hemina a 50 µM (dados não mostrados). O SnPP é um inibidor competitivo para a atividade da enzima HO-1. Por isso, ele atenuou a atividade da enzima HO-1 sem afetar a expressão da proteína (HO-1) (dados não mostrados).

As células GHOST expressam CD4, R5 bem como co-receptores X4, e o cassette reporter de GFP dependente de Tat. Essas células, por isso, representam um sistema modelo ideal para visualizar a infecção com viroses usando um ou mais co-receptores. Similar aos monócitos, o tratamento das células GHOST com hemina induziu a expressão de HO-1 de modo dependente da dose. Essas células foram infectadas com a linhagem do HIV-1 com tropismo para R5X4 e examinadas por proteína verde fosforescente (GFP) por microscopia de fluorescência. Como mostrado na figura 6B, as células GHOST foram produtivamente infectadas como evidenciado pela expressão da GFP dirigida pelo longo terminal de repetição (LTR) do HIV e evidenciado por efeitos citopáticos associados. O tratamento com hemina suprimiu significativament a indução da expressão da GFP, indicando um baixo nível de replicação do HIV. Nenhuma expressão do GFP por observada nas células não infectadas. Consistentemente com essas observações, o tratamento com hemina reduziu substancialmente os efeitos citopáticos associados ao HIV, e como esperado, tais efeitos não foram observados em células não infectadas (Fig. 6B). A expressão da GFP em células GHOST depende da Tat produzida intracelularmente pela infecção produtiva do HIV.

Para confirmar que a indução da GFP em células infectadas produtivamente foi dirigida pela proteína Tat, células GHOST não infectadas foram pré-tratadas com hemina por 24 horas, eletroporadas com proteína Tat do HIV-1 exógena recombinante e depois examinadas para expressão de GFP. Como mostrado na Fig.6C, a expressão da GFP foi induzida pela proteína Tat ainda na ausência da infecção por HIV. Como observado com células infectadas por HIV, o tratamento com hemina inibiu significativamente a expressão da GFP em células eletroporadas com a proteína Tat exógena. A proteína Tat inativada por calor (delta Tat) ou somente com tampão (uma mistura para manter o pH) não causou a indução da GFP. A viabilidade da célula, determinada por teste de exclusão de azul de tripano [corante para células em cultura e tecidos], após a transfecção da Tat foi maior que 90%. A expressão da GFP foi observada em mais de 80% das células, sugerindo a eficiência da transfecção em mais de 80%. A experiência de fluorescência em células transfectadas tanto com Tat inativadas por calor ou somente por tampão foi substancialmente menor do que a das células transfectadas com a proteína de Tat ativa, proporcionando sustentação adicional para essas observações. Esses resultados proporcionam evidências para a inibição da ativação do promotor do LTR dependente de Tat, levando à redução da expressão da GFP e, dessa forma, replicação reduzida do HIV em células GHOST tratadas com hemina.

DISCUSSÃO

O presente estudo demonstra uma função da atividade da HO-1 como potente fator de defesa do hospedeiro para a infecção por HIV-1. Nossos estudos mostram claramente que a ativação da HO-1 por seu substrato hemina os protegeu contra a infecção por HIV com vários HIV isolados clínicos incluindo alguns dos que desenvolveram resistência às drogas anti-retrovirais convencionais. ‘In vivo’, a administração da hemina em camundongos humanizados NOD-SCID suprimiu substancialmente a replicação do HIV. Esses achados sugerem que o indutor de HO-1, a hemina, é um biológico endógeno potencialmente efetivo na indução da resposta de defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV. Um componenete crítico de uma variedade de proteínas, incluindo a hemoglobina, a hemina tem sido mostrada por exercer numerosas funções biológicas benéficas. Após ter sido aprovada pela FDA, várias formulações da hemina têm sido usadas desde 1970 para tratar a porfíria com sucesso, para controlar a falência do transplante de fígado devido à recorrência de protoporfiria eritopoiética [distúrbio benigno do metabolismo da porfirina causado por uma deficiência da ferroquelatase associada a aumento da excreção fecal de protoporfirina, urina vermelho-púrpura e aumento da protoporfirina IX nas hemácias, plasma e fezes; caracterizada por urticária solar aguda ou eczema solar mais crônico, desenvolve-se rapidamente quando há exposição à luz solar. Stedman.
Obs.: A protoporfirina de tipo III é a principal protoporfirina encontrada na natureza, caracterizada pela presença de quatro grupos metil, dois grupos vinil e duas cadeias laterais de ácido propiônico, um derivado da porfirina que, com o ferro, forma o heme da hemoglobina e os grupos prostéticos da mioglobina, catalase, citocromos, etc. Stedman.] e em pacientes com talassemia intermédia, com efeitos mínimos. Por isso, sujeita a estudos suplementares, a hemina poderia servir como um novo biológico terapêutico para o tratamento da infecção por HIV.

Embora houvesse infectividade do HIV substancialmente mais baixa relativa aos controles não tratados, o DNA do HIV detectável nas células infectadas pré-tratadas com hemina sugerem que e entrada viral foi substancialmente inibida, mas não completamente bloqueada. Similarmente, a exposição da hemina à células pré-inoculadas com HIV também suprimiu a replicação do vírus por mais de 90%. Por isso, a entrada viral reduzida nas células alvo pode não ser o único fator responsável pela supressão da infecção por HIV. Desde a entrada, há múltiplas etapas no ciclo de vida do HIV, tais como integração viral, transcrição reversa, ou supressão da ativação do LTR do HIV, onde a hemina intracelular ou a HO-1 induzida por hemina poderia interferir e retardar a replicação do vírus. A despeito da presença do DNA viral nas células infectadas, a incapacidade do HIV para replicar-se produtivamente sugere fortemente um suposto papel da hemina na inibição de eventos após a entrada. Nossos dados proporcionam uma correlação direta entre a indução da HO-1 e inibição da replicação do HIV em células ativadas com hemina. A atenuação da replicação do HIV suprimida por hemina através do SnPPIX, um inibidor da atividade da HO-1, sustenta mais ainda essa enzima endogenamente indutível como um importante fator na modulação da infecção por HIV.

A infecção com viroses de tropismo duplo, que usam tanto o co-receptor R5 quanto o X4 para entrada, também foram associadas com a depleção das células T e progressão para a AIDS. Nós temos mostrado que o tratamento com hemina inibiu a infecção das células não somente com vírus isolados em laboratório, mas também com vários isolados clínicos, usando múltiplos co-receptores para sua entrada nas células alvo. Em adição, as células tratadas com hemina foram refratárias à infecção com linhagens do HIV mutantes ou resistentes a AZT ou outras drogas. Esses resultados indicam que indiferente ao tropismo viral, as células ativadas com hemina permaneceram protegidas da infecção por todas as linhagens do HIV-1 testadas neste estudo. A maioria das drogas usadas correntemente para o tratamento da infecção por HIV são compostos sintéticos e elicitam efeitos colaterais altamente indesejáveis nos indivíduos infectados com HIV-1. A terapia anti-retroviral altamente ativada (HAART), embora benéfica em suprimir a viremia em indivíduos infectados, pode contribuir para mutantes às drogas após uso prolongado e induzir efeitos metabólicos adversos, tais como lipodistrofia, hipertensão, diabetis mellitus, osteopenia e hiperlipidemia. A síndrome lipodistrófica afeta mais de 60% dos pacientes infectads por HIV tratados com HAART e, por essa razão, está emergindo como uma séria preocupação médica. A indução da resistência do hospedeiro à infecção por HIV pela hemina, um fator endógeno do hospedeiro relatado no presente estudo, poderia proporcionar uma estratégia alternativa atrativa para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para o tratamento da infecção por HIV. Essa abordagem poderia ser potencialmente muito vantajosa, especialmente para o tratamento de infecções com múltiplos isolados do HIV, linhagens recombinantes, e linhagens do HIV resistentes a drogas. Esses achados significativos poderiam ser explorados suplementarmente em outras linhagens virais resistentes a drogas.

Camundongos Hu-NOD-SCID tem sido amplamente aceitos como um modelo válido para estudar a patogênese do HIV e testar drogas anti-retrovirais. Nossos dados demonstram que a administração da hemina suprimiu significativamente a infecção do HIV em camundongos hu-NOD-SCID sem mudanças de comportamento, perda de peso ou outra toxicidade aparente. Esses resultados foram consistentes com achados ‘in vitro’. A dose usada da hemina nesse estudo é tipicamente usada para tratar pacientes com uma variedade de sintomas clínicos. Por isso, o tratamento com hemina pode proporcionar uma terapêutica biológica potencialmente segura. Outros efeitos patogênicos causados pela infecção do HIV em camundongos hu-NOD-SCID e possível atenuação ou reconstituição do sistema imune pelo tratamento com hemina estão sendo explorados e serão objeto de futuros estudos.

Pacientes com AIDS costumam desenvolver vários anomalias hematológicas, tais como anemia, leucopenia, trombocitopenia e alterações na plasticidade das células tronco no microambiente da medula óssea. Essas condições clínicas sugerem que a infecção pelo HIV-1 pode afetar processos envolvidos nos primeiros estágios da hemopoiese ou diferenciação das células-tronco. O último pode ser resultante dos altos níveis de citocinas pró-inflamatórias circulantes nos indivíduos infectados com HIV-1. Recentemente, a indução da HO-1 tem sido mostrada por mediar a resposta anti-inflamatória ‘in vivo’. Assim, é aceitável que a indução da HO-1 pela hemina pode suprimir os efeitos deletérios das citocinas pró-inflamatórias na infecção por HIV.
Correntemente, a hemina é usada com sucesso para o tratamento de porfírias agudas. Por isso, objeto de futuros estudos, o uso limitado desse componente biológico poderia proporcionar potencialmente a conseqüência do benefício clínico com efeitos adversos controlados.

Em conclusão, os achados do presente estudo proporcionam forte evidência para a HO-1 como um novo componente biológico endógeno com atividade anti-HIV. A inibição ‘in vitro’ junto com a atividade supressora do HIV ‘in vivo’ garante que o substrato hemina indutor da HO-1 seja desenvolvido como um agente terapêutico potencial para o tratamento da infecção por HIV-1.

FONTE: http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/176/7/4252