ALFA-1-ANTITRIPSINA (CONTINUAÇÃO)


GENÉTICA MOLECULAR

Lai e outros (1983) clonaram o gene da alfa-1- antitripsina e mostraram que ele contém 3 íntrons na região codificadora do peptídeo. Todas as pessoas mostraram duas bandas distintas (9,6 quilobases e 8,5 quilobases de comprimento) quando o gene clonado foi usado como uma prova de hibridização para analisar o DNA genômico digerido por EcoRI (obs.: uma enzima de restrição cujo corte na dupla fita de DNA não ocorre entre dois dinucleotídeos antiparalelos em ambas as fitas, de forma a criar duas pontas cegas com um par de bases do final, mas sim na ligação sequencial entre um nucleotídeo e outro da mesma fita, e então, nas pontes de hidrogênio que formam os pares de base, produzindo um segmento antiparalelo não emparelhado de nucleotídeos entre o primeiro corte na fita códon e o segundo corte na fita anticódon; cada fita dupla possuirá uma banda com o segmento oposto solto, porém complementar). Análises usando somente o DNA do íntron como prova (sonda) mostraram que o gene autêntico reside num fragmento de 9,6 quilobases. O outro gene pode ser um pseudogene. Veja omim 107410.

Long e outros (1984) proporcioaram a completa sequencia do cDNA do gene PI. A lente genômica do gene é de 10,2 quilobases com uma região codificadora de 1.434 pares de base. O gene tem 4 íntrons; o éxon 1, a porção na ponta 5’ do éxon dois. E da ponta 3’ do éxon 5 não são regiões codificadoras. O primeiro íntron, com 5,3 quilobases de comprimento, contém uma sequencia aberta de leitura para 143 aminoácidos (a qual não parece ser uma região codificadora da proteína atual), e uma sequência da família Alu (uma das sequências de reconhecimento pela enzima de restrição Alu) e uma região de iniciação de pseudo transcrição. Carrell (1986) citou evidências para a existência de dois genes codificadores da alfa-1-antitripsina, embora os achados no plasma sejam compatíveis com a expressão de alelos em um único lócus. Sefton e outros (1989) usaram campo de pulsação em eletroforese em gel para demonstrar que os genes codificadores da alfa-1-antitripsina e da alfa-1-antiquimiotripsina (AACT) estão aproximadamente a 220 quilobases de distância e orientados em direções opostas. Por hibridização em sítio, Ledbetter e outros (1987) localizaram o lócus da AAT no cromossomo 12 do camundongo.

Estudos moleculares em um cromossomo 14 em círculo mostraram que os lócus de IGH e D14S1 estavam perdidos, enquanto o PI estava presente (Keyeux e outros, 1989). Assim, o PI é próximo dos outros dois lócus, uma conclusão que era sustentada por muitos dados anteriores. Um gene não codificador parecido com a alfa-1-antitripsina (PIL; omim 107410) está localizado a 12 quilobases da extremidade 3’ do gene AAT. Billingsley e outros (1989) descobriram que esse gene e os genes PI e AACT são deslocados/ transportados por um único fragmento NarI de 550 quilobases.

Nukiwa e outros (1986) descobriram que no gene Z uma segunda substituição em adição àquela que é responsável pela forma alterada de ácido glutâmico para lisina no aminoácido 342. A última mutação está localizada no éxon 5; a segunda, GTG para GCG, foi localizada no éxon 3 e levou à prevista substituição da alanina por valina como aminoácido residual de número 213. A alteração de valina para alanina no 213 foi encontrada em todos dos 40 haplótipos Z, usando probas de genes oligonucleotídicos sintéticas direcionadas para junto das sequencias mutadas do éxon 3 no gene Z. Além disso, a mutação do éxon 3 eliminou um sítio de restrição para a endonuclease BstEII, permitindo rápida identificação da alteração no DNA genômico. Surpreendentemente, somente 23% dos haplótipos M1 foram encontrados como negativos para o sítio de clivagem pela endonuclease BstEII. Uma nova forma de M1, isto é, M1 (alanina 213), é idêntico ao M1 mas tem uma substituição do aminoácido com focalização isoelétrica ‘silenciosa’. O (haplótipo) M1 tem uma freqüência de 68 a 76%; o M2, de 14 a 20% e o M3, de 10 a 12%. O gene Z representa de 1 a 2% de todos os haplótipos da alfa-1-antitripsina.

Graver e outros (1986) investigaram as bases moleculares do fenótipo da alfa-1-antiripsina nulo-nulo PI. O gene parecia estar intacto sem deleção dicernível ou outra anormalidade estrutural, ainda que não houvesse mRNA produzido detectável. A região promotora da extremidade 5’ também parecia normal. Nenhuma evidência de hipermetilação dos nucleotídeos de citosina na região promotora foi detectada. O defeito poderia ser comparável àqueles em certas formas de talassemia nas quais uma mudança, no sítio de splicing, por exemplo, podem levar à grande redução na produção do mRNA. O fenótipo nulo-nulo é acompanhado de enfisema como os fenótipos ZZ e SZ mas uma importante diferença é que a cirrose e o câncer no fígado não ocorrem no fenótipo nulo-nulo; não há antitripsina anormal produzida que seja excretada com dificuldade pelas células de sua síntese.

Nikiwa e outros (1987) identificaram uma forma nula de alfa-1-antitripsina resultante de uma mutação sem sentido causadora de um código finalizador formada aproximadamente a 44% do terminal N da proteína precursora. Embora as bases moleculares da deficiência da antitripsina fossem totalmente diferentes daquelas no haplótipo Z, as conseqüências fenotípicas eram similares: severa deficiência associada a alto risco de enfisema. Perlino e outros (1987) descobriram que o gene AAT nos macrófagos é transcrito de um promotor específico dos macrófagos localizado aproximadamente a 2000 pares de base acima do promotor específico dos hepatócitos. A transcrição a partir dos dois promotores é mutamente exclusiva; o promotor dos macrófagos é silencioso nos hepatócitos e o promotor nos hepatócitos é silencioso nos macrófagos. Nos macrófagos, dois mRNAs distitntos são gerados por splicing alternativo.

Cox e outros (1987) estudaram as RFLPs associadas com o gene AAT. Eles obtiveram informações de uma extensiva variabilidade expressada pelo conteúdo de informação polimórfica (PIC) como proposto por Botstein e outros (1980). Os tipos de PI e os subtipos M tendiam a estar associados com haplótipos RFLP. Bamforth e Kalsheker (1988) discutiram um raro alelo de Pi nulo que em estado homozigoto leva à enfisema pulmonar nos primeiros anos de vida. Em três famílias, todos os indivíduos afetados apresentaram-se na primeira infância com infecção no peito e dificuldade respiratória, presumivelmente relacionada ao tabagismo passivo. Embora não houvesse AAT detectável, nenhuma deleção parcial ou completa do gene pôde ser detectada.
Por meio de focalização isoelétrica, Weber e Weidinger (1988) descobriram uma variante de PI que eles chamaram PI S (Colônia). Um pai e uma filha eram heterozigotos. As concentrações de alfa-1-antitripsina estavam dentro do limite normal.

Nukiwa e outros (1988) indicaram que aproximadamente 75 alelos AAT foram identificados no nível da proteína e/ou do gene. Os alelos mais comuns são duas formas de M1, com a valina na posição 213 e com alanina na posição 213 (chamadas aqui M1A e M1V).

Hefeez e outros (1992) demonstraram que o gene AAT tem três sítios específicos de iniciação de transcrição acima do único sítio de transcrição específico nos hepatócitos. Os macrófagos usam esses sítios durante a expressão basal e modulada. Células de Hepatoma usam o sítio de iniciação de transcrição específico de hepatócito durante as expressões basal e modulada porém também alteram a transcrição a partir de sítios de iniciação transcricional dos macrófagos durante a modulação pela interleucina 6 (IL-6; omim 147620) mediadora de fase aguda.

Soutoglou e Talianidis (2002) analisaram o recrutamento ordenado dos fatores para o promoter da alfa-1-antitripsina humana em torno da ativação inicial do gene durante a diferenciação do enterócito (células da mucosa intestinal)[ Sintetizando várias citocinas e quimiocinas eles também participam dos mecanismos de defesa imunológica. Além disso, os enterócitos podem agir como células apresentadoras de antígenos para linfócitos TCD4+, expressando moléculas da classe II do MHC. http://www.ufv.br/dbg/biocel/Index_arquivos/Resumos/r2006_1-Glaucia.htm] . Eles descobriram que o complexo de pré-iniciação completo, incluindo a Polimerase II (omim 18060) de RNA fosforilada, estava reunido no promotor muito antes da ativação transcricional. As acetiltransferases de histona CBP (omim 600140) e a P/CAF (omim 602303) foram recrutadas subsquentemente, mas a hiper-acetilação da histona local foi detida/demorada. Após o recrutamento transitório do BRM (omim 600014) homólogo ao Brahma humano, o remodelamento de nucleossomos (histona + a dupla fita enrolada) vizinhos coincidiu com a inciação da transcrição. Soutoglou e Talianidis (2002) concluíram que, nesse promotor, a reconfiguração da cromatina é a etapa definitiva do processo de inciação, atuando após a reunião da maquinaria da Polimerase II.

PAPEL NA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1

Bristol (2001) descobriram que a diminuição da infectividade pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) correlacionava-se significativamente com a diminuída expressão da elastase (HLE, ou ELA2; omim 130130) do linfócito na superfície celular em monócitos, mas não em linfócitos. Os reduzidos níveis do PI correlacionaram-se com aumento da expressão de HLE na superfície celular e aumento da infectividade do HIV.

Bristow e outros (2001) mostraram que a diminuição da carga viral do HIV correlacionava-se com a diminuição do PI em circulação. Além disso, pacientes assintomáticos manifestaram níveis deficientes de Pi ativo. Bristow e outros (2001) notaram que níveis deficientes de PI levaram à doenças degenerativas dos pulmões e sugeriram que a prevenção da deficiência em PI deve prevenir a patofisiologia associada ao HIV.

Usando sub-clones de linhas celulares de monócitos, Bristow e outros (2003) mostraram que a HLE localizava-se na superfície das células, mas não dos grânulos, de clones permissivos para o HIV-1, e localizava-se nos grânulos, mas não na superfície celular de clones não permissivos para o HIV-1. A estimulação de clones não permissivos com lipopolissacarídeo e LBP [omim 151990 – Proteína de ligação a lipopolissacarídeo – A proteína LBP é um reagente de fase aguda durante as infecções por bactérias gram-negativas. Os eucariotos superiores desenvolveram vários mecanismos de proteção contra tais infecções. As bactérias gram-negativas expressam lipopolissacarídeos (endotoxina LPS) em sua parede externa, e os mamíferos respondem rapidamente à presença de LPSs no soro. A LBP, outra reagente de fase aguda, a proteína de aumento da permeabilidade bactericida (BPI; omim 109195), ligam-se ao LPS com alta afinidade. A LBP é feita no fígado durante a fase aguda das infecções e pensa-se que funcione como uma carregadora para a LPS e ajude a controlar as respostas dependentes de monócitos à LPS. Veja CD14 (omim 158120) para informação sobre o complexo LBP/LPS.] acompanhada pelo PI exógeno, induziu a expressão da HLE na superfície celular, resultando na suscetibilidade para infecção por HIV.

Shapiro e outros (2001) mostraram que, em concentrações fisiológicas, a AAT e a CE-2072, um inibidor sintético da elastase do neutrófilo, e a proteinase-3 (PRTN3; omim 177020), inbiram a produção do HIV-1 em linhas celulares monocíticas infectadas, em células mononucleares de sangue fresco infectadas após a etapa de ativação, e em células HeLa permissivas. Análises EMSA indicaram que a AAT suprimiu a ativação do fator de transcrição NKB induzido pelo HIV-1 (veja omim 164011 [ Obs.: A estimulação pela Tat induz a translocação nuclear do fator de transcrição NFKB cuja ativação parece ser necessária para a produção de IL-10. PMID 11833470.
OBS2.: O NFKB foi detectado em vários tipos celulares que expressam citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, moléculas de adesão celular, e algumas proteínas de fase aguda na saúde e em vários estados de enfermidade. O NFKB é ativado por uma ampla variedade de estímulos como citocinas, radicais livres oxidantes, partículas inaladas, irradiação ultravioleta e produtos bacterianos e virais. A ativação inapropriada do NF-kappa-B tem sido ligada à eventos inflamatórios associados a artrite auto-imune, asma, choque séptico, fibrose pulmonar, glomerulonefrite, aterosclerose e AIDS. Em contraste, a completa e persistente inibição do NF-kappa-B tem sido associada diretamente à apoptose, desenvolvimento imune inapropriado e atraso do crescimento celular. Omim 164011]) Em cinco indivíduos com a mutação na AAT de tipo Z (de ácido glutâmico para lisina no ponto 342), o antígeno p24 do HIV-1 aumentou mais de seis vezes em todo o sangue após a infecção com uma linhagem do HIV-1 com tropismo para monócito. Em contraste, não houve aumento significativo no sangue obtido de voluntários saudáveis.

Por sondagem de uma bibioteca de peptídeos gerada de hamofiltrado, Munch e outros (2007) identificaram um peptídeo de 20 aminoácidos a partir da região próxima a C (carboxila) da alfa-1-antitripsina, designada peptídeos inibitório de vírus (VIRPI), com o mais podente inibidor de múltiplas linhagens do HIV-1, incluindo aquelas resistentes à drogas anti-virais. Alterações em alguns resíduos de VIRIP aumentaram sua potência antiviral em 100 vezes. A VIRIP bloqueou a entrada do HI-1 por interação com o peptídeo viral de fusão gp41. Munch e outros (2007) propuseram que a VIRIP pode afetar a progressão da doença em indivíduos infectados por HIV-1.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=107400