REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR

FONTE:


http://bioisolutions.blogspot.com/2008/07/pcr.html


PCR

A Reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica amplamente usada na biologia molecular. Seu nome deriva de um de seus componentes chave, uma polimerase de DNA usada para amplificar um pedaço de DNA por replicação enzimática “in vitro”. Na progressão da polimerase, o DNA então gerado é usado por si mesmo como um molde para a replicação. Ela põe em movimento uma reação em cadeia na qual o modelo é exponencialmente amplificado. Com o PCR é possível amplificar uma única de várias cópias de um pedaço de DNA através de superando várias ordens de magnitude, gerando milhões ou mais cópias do pedaço de DNA. A PCR pode ser modificada extensivamente para desempenhar uma ampla matriz de manipulações genéticas.

Quase todas as aplicações da PCR empregam uma polymerase de DNA termicamente estável, tais como a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada a partir da bactéria Thermus aquaticus. Essa polimerase de DNA reúne enzimaticamente uma nova fita de DNA a partir de blocos de construção de DNA, os nucleotídeos, usando um DNA de fita singular como molde da síntese de DNA. A vasta maioria dos métodos de PCR usam ciclo térmico, isto é, alternação térmica e resfriamento das amostras de PCR para uma série de etapas definidas por temperatura. Essas etapas térmicas são necessárias para a separação física das fitas (nas temperaturas altas) numa dupla hélice de DNA (DNA fundido) usado como um padrão durante a síntese do DNA (em temperaturas mais baixas) pela DNA polimerase para a amplificação seletiva do DNA alvo. A seletividade do PCR resulta do uso de iniciadores que são complementares à região do DNA alvejado para amplificação sob específicas condições cíclicas térmicas.

Desenvolvida em 1983 por Kary Mullis, a PCR é agora uma técnica comum e freqüentemente usada em pesquisas médicas e biológicas laboratoriais para uma variedade de aplicações. Estas incluem a clonagem de DNA por seqüenciamento, filogenia baseada em DNA, ou análises funcionais dos genes; o diagnóstico de doenças hereditárias, a identificação de impressão digital (usada nas ciências forenses e nos testes de paternidade); e a detecção e diagnóstico de doenças infecciosas.

PRINCÍPIOS E PROCEDIMENTO DO PCR

A PCR é usada para amplificar regiões específicas da fita de DNA (o DNA alvo). Este pode ser um único gene, uma parte de um gene, ou uma seqüência não codificadora de produto genético. A maioria dos métodos de PCR amplificam tipicamente os fragmentos de DNA de mais de 10 quilo bases de pares (dez mil pares de base), embora alguma técnicas permitam a amplificação de fragmentos de quarenta quilo-bases de tamanho (40.000 pares de bases).

Uma composição básica de PCR requer vários componentes e reagentes. Estes componentes incluem:


1)Um molde de DNA que contenha a região do DNA (alvo) a ser amplificado.

2) Dois iniciadores (prímeres), que sejam complementares às regiões fim da linha 5’ (primeiro 5’) e fim da linha 3’ (primeiro 3’) da região do DNA. {Obs.: 5’ é o lado da linha onde fica um grupo fosfato no carbono 5; no DNA, cada nucleotídeo tem uma ponta com um grupo fosfato ligado ao carbono 5 do açúcar que está ligado à base (C,T,A ou G), e no carbono 3, do mesmo açúcar, existe uma hidroxila OH que se liga ao grupo fosfato do açúcar de outra base; isso vai formando uma fila de bases e um DNA de fita singular, ao qual se contrapõe outra fita exatamente inversa, ou seja anti-paralela; uma cadeia sempre tem uma ponta 5 livre e outra 3 livre; a fita de DNA filha é sempre uma cópia no sentido de 5 para 3, mas quando acontece a cópia de DNA para RNA a fita é copiada é a de 3 para 5 e o mRNA sai igual à fita 5’-3’.}

3)A DNA polimerase, tal como a polimerase Taq ou outra polimerase de DNA, em temperatura ótima de 70oC.

4) Desoxinucleosídeos trifosfatos (dNTPs; também comumente e erroneamente chamados desoxinucleotídeos trifosfatos), os blocos de construção a partir dos quais a DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA.

5) Uma solução com tampão {obs.: é uma solução à qual foi acrescentado um tampão; tampão é um ácido e uma base (sal) como H2CO/HCO3- que, quando conjugado numa solução impede a alteração do pH que ocorreria na adição de ácido ou álcali; dessa maneira o pH do sangue e dos líquidos corporais é mantido constante (pH 7,45)}, proporcionando um ambiente químico adequado para a atividade ótima e estabilidade da polimerase de DNA.

6) Cátions divalentes, íons de magnésio ou manganês; geralmente Mg2+ é usado, mas Mn2+ pode ser utilizado para mutagêneses do DNA mediada por PCR, pois concentrações mais altas de Mn2+ aumentam a taxa de erro durante a síntese de DNA.

7) Íons de potássio cátions monovalentes.




O PCR é comumente realizado numa reação de volume de 20-150μl {1µl =10-9 m3 = 1mm3 = 1 milímetro cúbico} em pequenos tubos de reação (volumes entre 0,2 e 0,5 ml = 1/5 e 1/2 cm3 = 200 e 500μl) num ciclo térmico. O ciclo térmico aquece e resfria os tubos de reação para atingir as temperaturas requeridas em cada etapa da reação (veja a seguir). Muitos ciclos térmicos modernos fazem uso do efeito Peltier o qual permite tanto o aquecimento quanto o resfriamento do bloco concebido no tubo de PCR simplesmente por reversão da corrente elétrica. Tubos de reação com paredes finas permitem uma condutividade térmica favorável para permitir o rápido equilíbrio térmico. A maioria dos ciclos térmicos têm tampa aquecida para impedir a condensação no topo do tubo de reação. Ciclos térmicos mais antigos sem a tampa aquecida requerem uma camada de óleo no topo da mistura de reação ou um novelo de cera dentro do tubo.

PROCEDIMENTO

O PCR usualmente consiste de uma série de 20 a 40 alterações de temperatura repetidas chamadas ciclos; cada ciclo consiste tipicamente de 2 a 3 etapas de temperaturas diferentes. O PCR mais comum é realizado com ciclos que têm três etapas de temperatura. A ciclismo é freqüentemente precedido de uma etapa de temperatura única (chamada quente) em uma alta temperatura (>90o), e seguida de uma pressão no final para a expansão do produto final ou breve estocagem. As temperaturas usadas e a extensão de tempo em que são aplicadas em cada ciclo depende da variedade dos parâmetros. Estes incluem a enzima usada para a síntese de DNA, a concentração de íons divalentes de dNTPs na reação, e o desvanecimento da temperatura (Tm) dos iniciadores.

I- Etapa de iniciação: esta etapa consiste de uma reação de calor à temperatura de 94-96oC (ou 98oC se polimerases muito termostáveis forem usadas {obs.: termostável é o que NÃO é facilmente destruído ou alterado pelo calor), a qual é presa por 1 a 0 minutos. Isto só é necessário para polimerases de DNA que requerem ativação por calor por PCR de ativação quente.

II-Etapa de desnaturação: Esta etapa é o primeiro evento de ciclismo regular e consiste no aquecimento da reação a 94-98oC por 20 a 30 segundos. Esta etapa causa a dissolução (descolamento dos pares de base) dos moldes de DNA e dos iniciadores por ruptura das pontes de hidrogênio entre as bases complementares das fitas de DNA, produzindo duas fitas singulares de DNA.

III- Etapa de fixação: A temperatura de reação é reduzida para 50-65oC por 20-40 segundos permitindo o fortalecimento dos iniciadores no molde de DNA de fita única. A temperatura de fortalecimento típica é de aproximadamente 3 a 5 graus Celsius abaixo da Tm usada para os iniciadores. As pontes de hidrogênio estáveis de DNA-DNA só são formadas quando a seqüência iniciadora combina com as seqüências do modelo muito rigidamente. A polimerase liga-se aos moldes dos iniciadores híbridos e começa a síntese de DNA.

IV- Etapa de extensão/alongamento: A temperature nesta etapa depende da polymerase de DNA usada; a polimerase Taq tem sua ótima atividade na temperatura de 75-80oC, e comumente uma temperatura de 72oC é usada com esta enzima. Nesta etapa, a polimerase de DNA sintetiza uma nova fita de DNA complementar à fita de DNA modelo por adição dos dNTPs que são complementares ao modelo na direção 5’ para 3’, condensando o grupo fosfato do carbono 5’ do dNTPs com o grupo hidroxila do carbono 3’ no final da linha nascente (estendendo) a fita de DNA. O tempo de extensão dependa tanto da polimerase de DNA usada quanto da lente do fragmento de DNA a ser amplificado. Como via de regra, em sua temperatura ótima, a polimerase de DNA polimeriza um milhar de bases por minuto. Sob condições ótimas, isto é, se não existirem limitações devido a substratos limitadores ou reagentes, nesta etapa da extensão, a quantidade de DNA alvo é duplicada, levando a uma amplificação exponencial (geométrica) do fragmento de DNA específico.

V- Alongamento final: Esta etapa singular é ocasionalmente executada na temperatura de 70-74oC por 5-15 minutos após o último ciclo da PCR para assegurar que qualquer DNA de fita singular remanescente tenha sido totalmente estendido (copiado).


VI- Efetivação final: Nesta etapa, a temperatura de 4-15oC pode ser empregada por um tempo não definitivo para a estocagem do termo-curto (as seqüências alvo copiadas) da reação.

Para checar se a PCR gerou o fragmento de DNA previsto/desejado (também referido algumas vezes como um amplímero ou amplicom), a eletroforese em gel de agarose é empregada para a separação dos produtos do PCR por tamanho. O(s) tamanho(s) do(s) produto(s) da PCR é (são) determinado(s) por comparação com um DNA líder (um marcador de peso molecular), o qual contém fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos, correm no gel ao lado dos produtos da PCR.

ESTÁGIOS DA PCR

O processo da PCR pode ser dividido em três estágios:

1- Amplificação exponencial: em todo ciclo, a quantidade do produto é dobrada (presumindo-se 100% de eficiência da reação). A reação é muito específica e precisa.

2- Estágio de Estabilização: A reação torna-se lenta de acordo com a perda de atividade da polimerase de DNA e com o consumo de reagentes como dNTPs e os iniciadores os tornam limitados.

3-Período de estabilidade: nenhum produto se acumula mais devido à exaustão dos reagentes e de enzimas.
Otimização da PCR


Na prática, a PCR pode falhar por várias razões, em parte devido à sua sensibilidade à contaminação causando amplificação de produtos de DNA espúrios. Por isso, um número de técnicas e procedimentos tem sido desenvolvidos para otimização das condições da PCR. A contaminação com DNA estranho é abordada com protocolos laboratoriais e procedimentos que separam misturas pré-PCR a partir de DNA contaminante em potencial. Isso usualmente envolve a separação espacial entre áreas de composição da PCR e áreas de para análise e purificação de produtos da PCR, e limpeza completa da superfície de trabalho entre as reações. Técnicas de desenho de iniciadores são importantes no melhoramento do produto da PCR produzindo e evitando a formação de produtos espúrios, e o uso alternado de componentes de preservação do pH ou enzimas de polimerase pode ajudar com a amplificação de regiões problemáticas ou longas do DNA.


Aplicação da PCR: isolamento do DNA genômico

A PCR permite o isolamento de fragmentos de DNA a partir do DNA genômico por amplificação seletiva de uma região específica do DNA. Este uso da PCR acrescenta muitos métodos, tais como a geração de provas de hibridização para hibridização Southern (DNA) e Northern (RNA e proteínas) e clonagem de DNA, as quais requerem grandes quantidades de DNA, representando uma região específica do DNA. A PCR supre essas técnicas com altas quantidades de DNA puro, permitindo análises de amostras de DNA sempre de quantidades muito pequenas de material inicial.

Outras aplicações da PCR incluem o seqüenciamento de DNA para determinar seqüências desconhecidas amplificadas por PCR nas quais um dos iniciadores da amplificação pode ser usado em seqüenciamento Sanger, isolamento de seqüencia de DNA para expedir tecnologias de DNA recombinante envolvendo a inserção de uma seqüência de DNA para dentro de um plasmídio ou material genético de outro organismo. Colônias bacterianas (E.coli) podem ser rapidamente rastreadas por PCR para a construção de vetores de DNA corretos. A PCR também pode ser usada para impressão digital genética; uma técnica forense usada para identificar uma pessoa ou um organismo por comparação experimental de DNAs através de diferentes métodos baseados na PCR.

Alguns métodos de impressão digital por PCR têm alto poder discriminativo e podem ser usados para identificar relacionamentos genéticos entre indivíduos, tais como filiação ou colateralidade, e são usados em teste de paternidade. Essa técnica também pode ser usada para determinar a relação evolutiva entre os organismos.


AMPLIFICAÇÃO E QUANTIDADE DE DNA

Porque a PCR amplifica as regiões do DNA que estão alvejadas, a PCR pode ser usada para analisar quantidades extremamente pequenas de amostra. Isso é freqüentemente decisivo para análises forenses, quando somente um vestígio de quantidade de DNA é avaliável como evidência. A PCR também pode ser usada nas análises de DNA ancestral que têm milhares de anos. Essas técnicas baseadas na PCR têm sido bem sucedidamente utilizadas em animais, tais como o mamute de quarenta milhões de anos, e também no DNA humano, em aplicações que se estendem de análises das múmias do antigo Egito à indentificação do Tsar Russo.

Métodos quantitativos de PCR permitem a estimação da quantidade de uma dada seqüência presente em uma amostra – uma técnica freqüentemente aplicada para determinar níveis de expressão gênica quantitativamente. A PCR de tempo real é uma ferramenta estabelecida para a quantificação do DNA que mensura a acumulação do produto de DNA após cada rodada de amplificação da PCR.


A PCR NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS

A PCR permite o diagnóstico precoce de doenças malignas tais como leucemia e linfomas, que correntemente é o diagnóstico mais desenvolvido nas pesquisas sobre câncer e está realmente sendo usado rotineiramente. Ensaios de PCR podem ser desempenhados diretamente em amostras de DNA genômico para detectar trans-locações específicas em células malignas numa sensitividade que é pelo menos 10.000 vezes maior que as de outros métodos.

A PCR também permite a identificação de microorganismos não cultiváveis ou de crescimento lento tais como as mycobactérias, bactérias anaeróbicas, ou viroses de ensaios em cultura tecidual e modelos animais. As bases para a aplicação da PCR em diagnóstico em microbiologia é a detecção de agentes infecciosos e a discriminação de faixas não-patogênicas de faixas patogênicas em virtude de genes específicos.

O DNA viral pode igualmente ser detectado por PCR. Os iniciadores usados precisam ser específicos para as seqüências alvejadas no DNA de um vírus, e a PCR pode ser usada para análises de diagnóstico ou seqüenciamento de DNA do genoma Viral. A alta sensitividade da PCR permite a detecção do vírus logo após a infecção e sempre antes do estabelecimento da doença. Tal detecção precoce pode proporcionar aos médicos um significativa sonda no tratamento. A quantidade de vírus (carga viral) em um paciente também pode ser quantificada por técnicas quantitativas de DNA baseadas na PCR.