DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS T CD4 POSITIVAS

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim

*300292 FORKHEAD BOX P3; FOXP3
Alternative titles; symbols
SCURFINJM2

Gene map locus Xp11.23-q13.3

TEXTO

CLONAGEM

Por combinação genética de alta resolução e mapeamento físico com análise seqüencial de larga escala, Brunkow e outros (2001) identificaram o gene defeituoso em camundongos descamados (camundongos sf). A proteína codificada por este gene, designada Foxp3, é um membro da família de hélice em forma de asas/ou cabeça em forma de garfo de reguladores transcricionais e é altamente conservada em humanos. Nos camundongos sf, uma mutação sem sentido (que gera um códon finalizador) resulta num produto faltando o domínio de cabeça em forma de garfo. Complementação genética demonstrou que o produto da proteína de Foxp3, caspina (scrufin), é essencial para a homeostase imune normal.

Brunkow e outros (2001) compararam as seqüências de aminoácidos da caspina humana e do camundongo com outros membros da família de proteínas cabeça de garfo/hélice em asas/HNF3 e encontraram uma similaridade mais forte com a seqüência do fator 1 rico em glutamina (FOXP3).

Chatila e outros (2000) estabeleceram que a seqüência de leitura aberta de FOXP3 humana, de 1.146 pares de bases, codifica uma proteína deduzida em 381 aminoácidos. Por PCR de uma biblioteca de cDNA de células mononucleares do sangue periférico humano, Smith e outros (2006) clonaram a lente total de FOXP3 e variantes de splicing faltando o éxon 2 ou ambos os éxons 2 e 7. A lente completa da proteína contém 431 aminoácidos. A variante com falta do éxon 2 codifica uma proteína de 396 aminoácidos e a variante sem os éxons 2 e 7, codifica uma proteína de 369 aminoácidos que também carece de uma grande parte do putativo zíper de leucina. Smith e outros (2006) notaram que o camundongo parece carecer das variantes de Foxp3.


FUNÇÃO DO GENE

Devido a similaridades entre a auto-imunidade e a inflamação produzida pela manipulação de células T regulatória (Tr ou Treg) CD25-positiva/CD4-positiva e aquela induzida por defeitos genéticos no gene FOXP3, Hori e outros (2003) investigaram a contribuição de Foxp3 para o desenvolvimento e/ou função das células Tr no camundongo. Análises de PCR de Transcrição Reversa de camundongos normais demonstraram expressão constitutiva estável de Foxp3 que era alta nas células Tr, baixa nas células CD4-positivas/CD25-negativas, e ausente nas células T CD4-negativas/CD8-positivas (veja CD8A; omim 186910). A expressão de Foxp3 transduzido (vindo de outra célula?) nas células CD4-positivas/CD25-negativas transmitiram um fenótipo de Tr nessas células, com baixos níveis de expressão de citocina, comparado com células não transduzidas (que não receberam o Foxp3) ou transduzidas com um único vetor, e altos níveis de CD103, GITR (TNFRSF18), e CTLA4. Células transduzidas também apresentaram atividade supressora de contato célula-célula “in vitro”,assim como a supressão da auto-imunidade e inflamação “in vivo”. Hori e outros (2003) propuseram que a FOXP3 pode ser um gene regulador principal e um marcador mais específico das células Tr (Tregs) do que outras moléculas de superfície celular. Eles também sugeriram que a transdução de FOXP3 poderia ser um modo terapêutico para o tratamento de doenças inflamatórias.

Stock e outros (2004) descreveram um tipo de célula Tr antígeno-específica que desenvolveu-se “in vivo” a partir de células T naive (puras e inocentes) CD4-positivas/CD25-negativas durante uma resposta imune de Th1 polarizada. Essas células Tr foram induzidas por células dendríticas CD8A-positivas, produziram ambos IFNG e IL10, e expressaram o ‘fator líder de transcrição’ de Th1, TBET (TBX21; 604895), bem como ICOS e FOXP3. As células inibiram a hiper-atividade induzida por alérgeno das vias respiratórias de maneira dependente da IL10 nos camundongos. Stock e outros (2004) concluíram que esses células Tr adaptativas estão relacionas com, mas de forma distinta, as células Th1. Eles propuseram que um espectro de tipos de células Tr adaptativas existe, compreendendo as células similares a Th1 e as células similares a Th2 noticiadas previamente que são induzidas pelas células dendríticas CD8A-negativas e expressam o ‘fator líder de transcrição’ de células Th2, GATA3, e FOXP3.

Usando um repórter bi-cistrônico (cistron é a menor unidade do gene associada a uma só função) expressando proteínas fluorescentes vermelhas batidas dentro do lócus Foxp3 endógeno do camundongo, Wan e Flavell (2005) demonstraram que a Foxp3 foi expressada predominantemente em células T CD4-positivas/CD25-positivas, mas também em alguns outros subconjuntos de células T CD4-positivas. A Estimulação de células T CD4 ativadas com TGFB induziu ambas a expressão de Foxp3 e da função supressora de Célula T.


FOXP1, FOXP2, e FOXP3 todos ligam o sítio de ligação a FOX dentro do promotor da IL2, e todos menos FOXP2 suprimem a atividade do promotor de IL2. Entretanto, Bettelli e outros (2005) encontraram que a expressão forçada de FOXP3, mas não de FOXP1 e FOXP2, em células T naive (novas) suprimiram não somente a IL2, mas também a IL4 e IFNG devido a sua habilidade de associar-se fisicamente com e inibir a citocina trans-ativadora de gene NFKB e NFAT. As células T derivadas de camundongos descamados deficientes em Foxp3 tiveram a expressão de Nfat e Nfkb significativamente aumentada, a qual poderia ser baixada para níveis fisiológicos pela compementação do gene FOXP3. A transdução de células T de camundongo auto-reativo especificamente para proteína polipeptídica mielina (PLP1) com FOXP3 eliminou sua habilidade para mediar a encefalomielite auto-imune experimental. Betelli e outros (2005) concluíram que, em adição a serem associadas com a geração de células T regulatórias CD4-positivas/Cd25-positivas, o FOXP3 atua em células T maduras por repressão de NFAT e NFKB.


Allan e outros (2005) encontraram que, em contraste com resultados no camundongo, a super-expressão de FOXP3 sozinha ou junto com um variante de Splice faltando o éxon 2 em células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas resultou em mais baixa proliferação e produção de IL2, mas não no aumento da atividade supressora. Allan e outros (2005) sugeriram que os fatores em adição a FOXP3 são requeridos para o desenvolvimento de células T regulatórias.


O co-polímero I (COP-1) é um polímero casual de quatro aminoácidos (glu, lys, ala e tyr) enriquecido na proteína básica da mielina (MBP) que é usado para tratar a esclerose múltipla (MS). Hong e outros (2005) descobriram que a COP-1 aumentou a expressão de FOXP3 das células T CD4 –positivas do sangue periférico de pacientes de esclerose múltipla e induziu a conversão de células T regulatórias CD4-positivas/CD25-negativas para células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas. A indução de FOXP3 em células T CD4-positivas foi mediada por IFNG (interferão gama omim 147570 - 12q14). Camundongos sem interferão gama exibiram um aumento nas células CD4-positivas/CD25-positivas após o tratamento com COP-I, mas estas células não expressavam Foxp3. Hong e outros (2005) concluíram que COP-I mediava a ativação da expressão de FOXP3 e a conversão das células CD4-positivas/CD25-negativas para células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas requer IFNG.

Smith e outros (2006) descobriram que a super-expressão da lente total de Foxp3 ou das variantes de Foxp3 sem o éxon 2 ou sem ambos os éxons 2 e 7 reduziu a proliferação de células T CD4-positivas e a secreção de citocinas.

Pennington e outros (2006) mostraram que sem nenhum efeito óbvio na seleção mediada pelo receptor de célula T, a diferenciação normal das células T gama-delta em potentes células citolíticas e secretoras de interferão gama é substituída em relação a um fenótipo regulatório conjunto por limitação das células T CD4+/CD8+ progenitoras em influenciar nas primeiras trans em células progenitoras gama-delta. Inesperadamente, Pennington e outros (2006) descobriram que a propensão das primeiras células T com receptores alpha-beta progenitoras diferenciarem-se em células T regulatórias Foxp3 também é regulado em trans por células progenitoras de células T CD4+/CD8+. (Trans pode ser alguma enzima transxxxx? Ou translocação? Trans ao contrário de cis?)


Ono e outros (2007) demonstraram que a transcrição do fator AML1/RUNX1, a qual é cruscialmente requerida para a hematopoiese normal, incluindo o desenvolvimento das células T do timo, ativa a expressão dos genes IL2 e IFN-gama em células T CD4+ convencionais através da ligação a seus respectivos promotores. Em células T (R) naturais, a FOXP3 interage fisicamente com AML1 {Omim, 151385, 21q22.3) O fator de transcrição PEBP2, originalmente identificado como uma proteína de ligação ao intensificador do poliomavírus, é composto de uma sub-unidade alfa, a qual liga-se ao DNA por via do domínio Runt, e uma sub-unidade beta, a qual aumenta a afinidade da sub-unidade alfa para DNA, mas não apresenta nenhuma ligação com DNA em si mesma. AML1, ou RUNX1, é um dos vários genes que codificam a sub-unidade alfa. Somente um gene, CBFB (121360), codifica a sub-unidade beta. A AML1 é um dos mais freqüente alvos de translocações cromossômicas associadas com leucemia (Zhang e outros, 1997)}

Marson e outros (2007) identificaram genes alvo de FOXP3 e noticiaram que muitos destes são chaves moduladoras da ativação e funcionamento das células T. Notavelmente, o predominante, embora não exclusivo, efeito da ocupação de FOXP3 é suprimir a ativação de genes alvo na estimulação da célula T. A supressão de FOXP3 de seus alvos parece ser crucial para a função normal das células T regulatórias, pois variantes sobre-ativas de alguns genes alvo são conhecidas por estarem associadas a doenças auto-imunes.

Zheng e outros (2007) usaram análises de grandes genomas combinando a imuno-precipitação da cromatina com um esboço de telhado em série de genoma do camundongo para identificar as regiões de ligação de Foxp3 para aproximadamente 700 genes e para um microRNA codificado inter-genicamente. Os autores acharam que um grande número de genes ligados a Foxp3 são sobre, ou sub-regulados em células T Foxp3+, sugerindo que o Foxp3 atua tanto como ativador, quanto repressor transcricional. Uma única regulação mediada por Foxp3 no timo afeta, entre outros, genes codificadores de fatores nucleares que controlam a expressão do gene e o remodelamento da cromatina. Em contraste, genes alvo de Foxp3 divididos pelas células T regulatórias do timo e periféricas codificam proteínas da membrana plasmática, assim como proteínas de sinalização celular. Zheng e outros (2007) concluíram que sub-programas transcricionais distintos implementados por Foxp3 estabelecem uma linhagem de células T regulatórias durante a diferenciação e sua competência proliferativa e funcional na periferia.

Zuo e outros (2007) observaram que camundongos fêmeas heterozigotos para mutação em caspina (scurfin) desenvolveram câncer em alta taxa. A maioria dos cânceres eram carcinomas mamários nos quais o alelo de tipo selvagem de Foxp3 estava inativado e Erbb2 estava sobre-expressado. Zuo e outros (2007) descobriram que o Foxp3 reprimia a transcrição do gene Erbb2 por via da interação dos motivos de ligação a DNA da cabeça em garfo com o promotor de Erbb2. A expressão de Foxp3 estava reduzida em 10 linhas celulares de tumor humano comparadas com células epiteliais mamárias normais e uma linha celular não maligna, e nenhuma das linhagens celulares tumorais expressavam transcritos com a lente total de FOXP3.


Zuo e outros (2007) descobriram que carcinomas mamários no camundongo heterozigoto para uma mutação em Foxp3 exibiu aumentada expressão de Skp2. {Omim, 601436, 5p13: o ciclo cellular humano é regulado pela interação de múltiplas proteínas, incluindo as ciclinas (este gênero 123836), quinases dependentes de ciclina (CDKs, este gênero, 123829), e fosfatases. Demetrick e outros (1996) estabeleceram que complexos contendo quinases dependentes de ciclinas, ciclinas, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA ;123836), e várias outras proteínas regulam os principais pontos de transição do ciclo celular nas fronteiras G1/S e G2/M. Em adição a p21 (116899) e PCNA, o complexo ciclina A e quinase inclui uma proteína de 19 quilodáltons (p19, ou SKP1; 601404) e uma proteína de 45 quilo-dáltons (p45, ou SKP2).} A sub-regulação de FOXP3 por pequenos RNA de interferância em células epiteliais mamárias humanas levaram ao aumento da expressão de SKP2. Ensaios de genes repórteres (genes que se comunicam?que estão próxmos?) revelaram que a Foxp3 do camundongo interagiu diretamente com um promotor reprimido de Skp2. Análises de mais de duzentas amostras de cânceres de mama primários revelaram uma correlação inversa entre os níveis de FOXP3 e SKP2. Zuo e outros (2007) concluíram que FOXP3 é um repressor transcriocional de SKP2.}


ESTRUTURA DO GENE

Brunkow e outros (2001) determinaram que os genes FOXP3 do camundongo e o humano contém 11 éxons codificadores. Os limites entre éxons e íntrons são idênticos através das regiões codificadoras dos genes do camundongo e humano.

MAPEAMENTO


Por análise de seqüência genômica, Chatila e outros (2000) mapearam o gene FOXP3 no cromossomo Xp11.23.


GENÉTICA MOLECULAR


Chatila e outos (2000), os quais referiram-se ao gene FOXP3 como JM2, identificaram-no por abordagem de candidatos à posição como sítios aceitáveis de mutações na desordem que eles referiam-se como síndrome da desregulagem alérgica auto-imune (XLAAD) e conhecida por outros como IPEX (304790). Chatila e outros detectaram uma mutação no gene FOXP3 em dois parentes não relacionados.

Wildin e outros (2001) seqüenciaram o gene FOXP3 humano para determinar se a síndrome ligada ao X da imunodesregulação, poliendocrinopatia, e enteropatia (IPEX) {patologia no intestino e no fígado?} é o equivalente humano do camundongo descamado. Eles identificaram uma nova mutação em cada probando (o paciente ou membro da família que a coloca em estudo) de quatro famílias com IPEX. Cada mutação afetava o domínio de cabeça em garfo/hélice em asas da proteína caspina (scurfin), indicando que as mutações podem romper interações críticas no DNA. Em uma quinta família estudada por Wildin e outros (2001) no qual uma forma variante de IPEX mapeou em uma região peri-centromérica do cromossomo X, nenhuma mutação no gene FOXP3 foi encontrada. Um estabelecimento de idade mais tardia, crescendo e empalidecendo no curso clínico, e ocasionalmente compatibilizando com sobreviventes prolongados tem sido noticiada nesta família (Powell e outros, 1982). Isso contrasta com o curso inicial e incessante da doença visto em outras famílias. Wildin e outros (2001) sugeriram que esta quinta família pode abrigar uma mutação não codificadora em FOXP3 que afeta a regulação transcricional ou o splicing do RNA, resultando em um fenótipo médio, dependente do meio ambiente.

Bennett e outros (2001) também identificaram mutações no gene FOXP3 em pacientes IPEX. Eles compararam as mutações em FOXP3 com aquelas em FOXE1 (602617) as quais resultam uma síndrome da tiróide sem geração, e com aquelas no FOXC1 as quais causam má formação do segmento anterior do olho (anomalia de Axenfeld-Rieger).

Bassuny e outros (2003) investigaram o gene FOXP3 com um candidato para a suscetibilidade ao diabetes de tipo I de lócus IDDMX (300136 – diabetes melitus – Xp11). Eles sondaram o gene FOXP3 para micro-satélite e polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) e executaram um estudo de associação entre o gene e o diabetes de tipo I na população japonesa. Um polimorfismo de micro-satélite, (GT)n, foi identificado no íntron O, e uma alelo (GT)15 apresentou uma significativa freqüência mais alta em pacientes com o diabetes de tipo I do que os controles (43,1% versus 32,6%, P=0,0027). A avaliação da atividade promotor/incentivador do polimorfismo (GT)n foi efetuada por ensaio de repórter de luciferase (enzima presentes em determinados organismos luminosos que desencadeiam a oxidação da luciferina que, por sua vez, produzem bioluminescência) dupla. Ima significante diferença na atividade incentivadora entre as repetições dos dinucleotídeos (GT)15 e (GT)16 foi detectada.


Owen e outros (2003) estudaram dois parentes (21 sujeitos no total) com quatro crianças do sexo masculino (três falecidos) e uma menina afetada por IPEX. Em uma das famílias eles encontraram uma nova mutação de tipo sem registro no gene FOXP3. Na segunda família, o lócus de FOXP3 era excluído por recombinação, e nenhuma mutação no FOXP3 foi encontrada. Eles concluíram que seus dados proporcionaram evidência para um lócus autossômico não ligado (ao X), sugerindo heterogeneidade genética.


Bacchetta e outros (2006) estudaram o fenótipo e a função das células T CD4 positivas in vitro e células Tregs CD4-positivas/CD25 (altas) em quatro crianças com IPEX. Análises de citrometria de fluxo demonstraram que a distribuição e expressão de vários marcadores de células T eram comparáveis entre pacientes e doadores normais de controle. As células Tregs dos pacientes mostraram diferentes graus de atividade supressora dependendo da mutação de FOXP3, mas nenhuma das células dos pacientes pode suprimir as células autólogas respondedoras. O defeito foi depois superado com a expansão das células Treg in vitro. Dos quatro pacientes com IPEX, somente 1, que tinha uma mutação no códon 1 que resultava na não expressão da proteína, tinha a transcrição ou tradução de FOXP3 diminuída. Todos os pacientes tinham respostas proliferativas após a estimulação do receptor de célula T (TCR), mas eles não eram capazes de produzir IL2 ou IFNG. Bacchetta e outros (2006) concluíram que as células Treg podem estar presentes em números normais em pacientes com IPEX, mas sua capacidade de suprimir está diminuída dependendo do tipo da mutação, da força do estímulo do TCR, e do genótipo das células T efetoras.



MODELO ANIMAL


Descamação (sf=scurfy) é uma mutação recessiva ligada ao X no camundongo que resulta em letalidade em indivíduos do sexo masculino hemizigotos com 16 a 25 dias após o nascimento, e é caracterizada por sobre-proliferação dos linfócitos T CD4+/CD8-, extensiva infiltração em múltiplos órgãos, e elevação do número de citocinas (Lyon e outros, 1990; Clark e outros ,1999).


Em camundongos expressando o gene Foxp3, Khatti e outros (2001) observaram menos células T. Essas células T remanescentes tiveram respostas proliferativas e citolíticas pobres e pobre produção de IL2, embora o desenvolvimento no timo parecesse normal. Análises histológicas mostraram que os órgãos linfóides periféricos, particularmente os linfonodos, estavam relativamente acelulares. Khatti e outros (2001) concluíram que a atividade excessiva da caspina (scurfin) leva a um estado hipoativo, sugerindo que a caspina (scurfin) atua como um regulador central da atividade das células T.

Através da geração de camundongos deficientes em Foxp3, Fontenot e outros (2003) mostraram que a Foxp3 é requerida para o desenvolvimento de células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas. Em adição, a síndrome autoimune linfoproliferativa similar a IPEX observada em camundongos Foxp3 -/- resultou de uma deficiência nessas célula T regulatórias. Os autores acharam que a expressão ectópica (fora do lugar) de Foxp3 ativou uma função supressora nas células T CD4-positivas/CD25-negativas. Independentemente, Khattri e outros (2003) e Hori e outros (2003) alcançaram conclusões similares.


Wan e Flavell (2007) notaram que indivíduos com doenças de enxerto-versus-hospedeiro, miastenia grave (veja omim 254200) {distúrbio da transmissão neuromuscular caracterizado por fraqueza (miastenia) e fadiga variáveis de alguns músculos voluntários. Dic Stedman}, e esclerose múltipla tem expressão diminuída de FOXP3. Eles geraram um modelo de camundongo no qual a expressão endógena de Foxp3 era atenuada nas células Tr (T regulatórias). Esses camundongos nasceram em uma proporção mendeliana. Fêmeas heterozigóticas eram férteis e fenotipicamente normais, mas machos hemizigotos eram estéreis e anões (os machos são hemizigotos para os genes X e Y porque estes genes não são emparelhados). A maioria dos machos desenvolveu escamação na pele, e quase todos desenvolveram uma condição parecida com blefarite (inflamação das pálpebras). Todos os machos mutantes morreram aos três meses de idade devido a uma agressiva síndrome auto-imune linfoproliferativa, incluindo aumento drástico de auto-anticorpos no soro; entretanto, o desenvolvimento no (do) timo não foi afetado. As atividades imunossupressoras das células T com expressão atenuada de Foxp3 eram quase abolidas in vitro e in vivo, uma vez que sua anergia in vitro era mantida, incluindo desenvolvimento preferencial em células efetoras de tipo Th2 ainda que num ambiente de polarização de células Th-1. Wan e Flavell (2007) concluíram que a expressão diminuída de FOXP3 causa doença imune pela subversão da função supressora das células Tr e convertendo células Tr em células efetoras.


Gavin e outros (2007) estudaram células T do camundongo que transcreveram um alelo nulo para Foxp3 ativamente, mas careciam da proteína Foxp3. Usando análises citométricas de fluxo e de micro-série, eles encontraram que, embora a função de Foxp3 fosse requerida para atividade T regulatória supressora da célula, Foxp3 largamente amplificou e fixou feições moleculares pré-existentes das células Tr. Além disso, a Foxp3 solidificou a estabilidade da linhagem de células Tr por modificar a superfície celular e moléculas de sinalização, incluindo a repressão da fosfodiesterase-3b (PDE3B) dependente de Foxp3. A introdução de PDE3B nas células Tr e a transferência dessas células para camundongos deficientes em células T substancialmente reduziu o número de células Tr. Gavin e outros (2007) propuseram que a expressão reduzida de PDE3B pode ser um marcador único para células Tr.


Para determinar se a disfunção ou falta das células Treg está etiologicamente envolvida na patogênese do camundongo descamado e seu correlato humano, IPEX, Lahl e outros (2007) geraram camundongos transgênicos BAC chamados camundongos de “esgotamento das células T regulatórias” (DEREG) expressando um receptor de toxina da difteria aumentado com a fusão da proteína fluorescente verde sob controle de Foxp3. A injeção da toxina da difteria permitiu a detecção seletiva e eficiente e a depleção (esgotamento) induzível de células Treg Foxp3-positivas sem afetar as células T efetoras Cd25-positivas. Análises histopatológicas mostraram que a injeção da toxina da difteria em camundongos DEREG recém-nascidos removeram as células Treg e levaram ao desenvolvimento de sintomas semelhantes à descamação com aumento do baço, linfadenopatia (qualquer processo patológico que afeta os linfonodos), insulite (inflamação das ilhotas de Langerhans, com infiltração linfocítica, que pode resultar da infecção por vírus e constituir a lesão inicial do diabetes dependente de insulina; dic.Stedman), e severa inflamação da pele. Lahl e outros (2007) concluíram que a ausência das células Treg Foxp3 positivas é suficiente para induzir um fenótipo semelhante à descamação.

Lund e outros (2008) examinaram um papel para as células T regulatórias (Tregs) na infecção da mucosa pelo vírus herpes simplex usando camundongos Foxp3 ativos (knock-in) trazendo sub-conjuntos de Tregs etiquetadas com ambos os receptores da proteína fluorescente verde (GFP) ou da toxina da difteria. Eles observaram uma infecção fatal acelerada com aumento da carga viral na mucosa e no sistema nervoso central após a remoção (ablação, sumiço) das Tregs. Embora a produção aumentada da produção do interferão fosse detectada em linfonodos drenantes nos camundongos deprimidos em Tregs, esta (produção) foi profundamente reduzida no sítio de infecção. Isso foi associado com um atraso na chegada das células natural killer (NK), células dendríticas, e células T para o sítio da infecção e um aumento repentino nos níveis de quimiocinas pró-inflamatórias nos linfonodos drenantes. Lund e outros (2008) concluíram que as Tregs facilitam respostas protetoras primárias para o local da infecção viral por permitir uma entrada oportuna (apropriada) das células imunes dentro de tecidos infectados.