PCR (CONTNUAÇÃO)

FONTE: http://bioisolutions.blogspot.com/2008/07/pcr.html

PCR Animation

VARIAÇÕES NA TÉCNICA BÁSICA DE PCR

PCR ALELO-ESPECÍFICA: Esta técnica de diagnóstico ou clonagem é usada para identificar ou utilizar os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) (diferenças de uma base só no DNA {Tipo mutações pontuais?}). Ela requer conhecimento prévio de seqüencia de DNA, incluindo diferenças entre alelos, e uso de iniciadores cujos finais 3’ cercam o SNP. A amplificação por PCR sob condições estritas é muito menos eficiente na presença de um mal combinador entre o molde e o iniciador, então a amplificação bem aventurada com um iniciador específico para SNP sinaliza a presença do SNP específico em uma seqüência.

REUNIÃO DA PCR OU REUNIÃO DO CICLO DA POLIMERASE (PCA)
A reunião da PCR é uma síntese artificial de seqüências longas do DNA por atuação da PCR em um fundo de longos oligonucleotídeos alternados entre as direções senso e anti-senso, e os segmentos que se sobrepõe determinam a ordem dos fragmentos de PCR dessa forma produzindo seletivamente o produto longo final do DNA. l

PCR ASSIMÉTRICA: PCR assimétrica é usada para amplificar preferencialmente uma fita do DNA original mais do que a outra. Ela é encontrada em uso em alguns tipos de sondagens de seqüenciamento e hibridização onde é necessário ter somente uma das duas fitas complementares. A PCR é efetivada como usualmente, mas com um grande excesso de iniciadores para a fita escolhida. Devido à lenta amplificação (aritmética), depois da reação, após os iniciadores limitantes terem sido esgotados, são necessários ciclos extra de PCR. Uma modificação recente neste processo, conhecida como Linear-After-The-Exponencial-PCR (LATE-PCR), usa um iniciador com limitação a uma temperatura de fusão mais alta (Temperatura de fusãoTm) então o excesso de iniciadores para manter a reação eficiente como a concentração de limitadores de iniciação diminui o meio de reação. (Obs.: I didn’t understand such primer limiting. Eu acho que podem ser iniciadores no limite entre íntros e éxons.)

AMPLIFICAÇÃO DEPENDENTE DE HELICASE: Esta técnica é similar à PCR tradicional, mas usa uma temperatura constante mais do que o ciclismo através de desnaturação e ciclos de fixação/extensão. A DNA helicase, uma enzima que pecipita o DNA, é usada em lugar da desnaturação térmica.

PCR DE PARTIDA QUENTE: Esta é a técnica que reduz amplificações não-específicas durante os estágios da formação inicial da PCR. A técnica pode ser executada manualmente por aquecimento de componentes de reação para a temperatura de fusão (em geral, 95oC) antes da adição da polimerase. Sistemas enzimáticos especializados tem sido desenvolvidos que inibem a atividade da polimerase em temperatura ambiente, tanto pela ligação de um anticorpo ou pela presença de inibidores ligados covalentemente que só se dissociam após etapa de ativação de alta temperatura. A PCR de Partida‑Quente/Final-Frio é conseguida com novas polimerases híbridas que são inativas na temperatura ambiente e são instantaneamente ativadas no prolongamento da temperatura (no aumento da temperatura).

PCR ESPECÍFICA ENTRE SEQÜÊNCIAS (ISSR): um método de PCR para impressão digital em DNA que amplifica as regiões entre algumas repetições de seqüências simples para produzir uma impressão digital única de extensões de fragmentos amplificados.

PCR INVERSA: um método usado para permitir a PCR quando somente uma seqüência interna é conhecida. Esta é especialmente útil na identificação de seqüências flanqueadoras para vários genomas inseridos. Isto envolve uma série de digestões do DNA e ligação própria, resultando em seqüências conhecidas a cada final da seqüência desconhecida.

PCR MEDIADA POR LIGAÇÃO: Este método usa pequenos ligantes de DNA ligados ao DNA de interesse e múltiplos iniciadores fixando-se aos ligantes de DNA; tem sido usada para seqüenciamento de DNA, genoma ambulante, e pegada de DNA (pista de DNA).

PCR DE METILAÇÃO ESPECÍFICA (MSP): o método MSP foi desenvolvido por Stephen Baylin e Jim Herman na Escola de Medicina de Johns Hopkins, e é usado para detectar a metilação de ilhas CpG no genoma em DNA. O DNA é primeiro tratado com sódio bissulfato, o qual converte bases de citosina não metiladas em uracila, a qual é reconhecida por iniciadores de PCR como timina {Obs.: a desaminação da citosina remove o grupo amina da posição 4, e isso a transforma em uracila, que vai parear com adenina ao invés de parear com guanina (do par C-G altera para U-A); a metilação da citosina no carbono 5 a transforma em metilcitosina, que, se for desaminada, tornar-se-á timina, com um oxigênio no lugar da amina.} Duas PCRs são então concluídas no DNA modificado, usando posições de iniciadores idênticas exceto em alguma ilha CpG dentro das seqüências de iniciação. (As ilhas CpG são metiladas e por isso a citosina delas não se converte em uracila.) Nesses pontos, um fixador de iniciação reconhece o DNA com citosinas para amplificar o DNA metilado, e um fixador reconhece o DNA com uracila ou timina para amplificar o DNA não metilado. MSP usando uma qPCR também pode ser executada para obter informação quantitativa, mais do que qualitativa, sobre a metilação.

PCR de INICIADOR MINI: a PCR de iniciador mini usa uma nova polymerase termostável (S-Tbr) que pode ser estendida de pequenos iniciadores (“smalligos”) tão curtos como 9 ou 10 nucleotídeos, a despeito dos aproximadamente 20 nucleotídeos requeridos por Taq. Esse método permite o alvejamento por PCR de regiões que se ligam a iniciadores menores, e é particularmente útil para amplificar (multiplicar) desconhecidas, porém conservadas, seqüências de DNA, tais como as 16S (ou nos eucariotos 18S) genes de rRNA (RNA do ribossomo). O iniciador mini de PCR de 16S rRNA foi usado para caracterizar a matriz de um comunidade microbiótica em crescimento num ambiente extremo, um lago hiper salino em Porto Rico. Naquele estudo, seqüências profundamente divergentes foram descobertas com alta freqüência e incluíam elementos que definiram dois novos níveis de taxa de divisão, sugerindo que a PCR de iniciador mini pode revelar novas dimensões da diversidade microbiana. Através da ampliação do espaço da seqüência que pode ser demandada por iniciadores de PCR, esta técnica pode capacitar novas estratégias de PCR que não são possíveis dentro dos limites dos desenhos de iniciadores impostos por Taq e outras enzimas usadas comumente.

SONDA DE AMPLIFICAÇÃO DEPENDENTE DE LIGAÇÃO MÚLTIPLA (MLPA): permite a múltiplos alvos serem amplificados com somente um único par iniciador, assim permitindo a solução das limitações do PCR múltiplex (de múltiplo complexo) (veja adiante).

PCR DE MÚLTIPLOS COMPLEXOS: o uso múltiplo do estabelecimento de um iniciador único, dentro da mistura de PCR singular para produzir amplicons de vários tamanhos específicos para diferentes seqüências de DNA. Por alvejamento de múltiplos genes de uma vez só, informação adicional pode ser adquirida a partir de uma única corrida de teste que por outro lado requereria várias vezes os reagentes e mais tempo para execução. A fixação de temperaturas para cada um dos iniciadores colocados deve ser otimamente trabalhada corretamente dentro de uma reação singular, e tamanhos dos amplicons, isto é, sua extensão de pares de bases deve ser suficientemente diferente para formar bandas distintas quando visualizadas em gel de eletroforese.

PCR ALOJADA: aumenta a especificidade de amplificação do DNA, por redução de bases devida a amplificação não específica do DNA. Dois estabelecimentos de iniciadores estão sendo usados em duas PCRs sucessivas. Na primeira reação, um par de iniciadores é usado para gerar produtos de DNA, os quais ao lado do alvo almejado, já podem estar consistindo de fragmentos de DNA amplificados não especificamente. Os produtos são então usados numa segunda PCR com uma colocação dos iniciadores cujos sítios de ligação são completamente ou parcialmente diferentes e localizados em 3’ de cada um dos iniciadores usados na primeira reação. A PCR alojada é freqüentemente mais feliz em amplificação especificamente de fragmentos de DNA longos do que a PCR convencional, mas ela requer mais conhecimento detalhado das seqüências alvo.

PCR DE EXTENSÃO SOBREPOSTA: é uma técnica de engenharia genética permitindo a construção de uma seqüência de DNA com uma alteração inserida além do limite de comprimento praticado na extensão do iniciador.


PCR QUANTITATIVA (Q-PCR): é usada para medir a quantidade de um produto de PCR (preferencialmente em tempo real). É o método de escolha para a medição quantitativa da quantidade de partidas do DNA, cDNA ou RNA. Q-PCR é comumente usada para determinar se uma seqüência de DNA está presente em uma amostra e o número dessas cópias na amostra. O método com o mais alto nível de precisão correntemente é a PCR Quantitativa em tempo real. Esta é freqüentemente confundida com a TR-PCR (PCR de Tempo Real) ou RQ-PCR. QRT-PCR ou RTQ-PCR são contrações mais apropriadas. RT-PCR comumente refere-se à PCR de transcrição reversa, a qual é freqüentemente usada em conjunção com a Q-PCR. Métodos QRT-PCR usam corantes fluorescentes, tais como Sybr Green, ou poro de flúor contendo sondas de DNA, tais como TaqMan, para medir a quantidade de produto multiplicado em tempo real.



RT-PCR: (PCR de transcrição reversa) é um método usado para multiplicar, isolar ou identificar uma seqüência conhecida a partir de um RNA celular ou de tecido. A PCR é precedida por uma reação usando a transcriptase reversa para converter RNA para cDNA. A RT-PCR é amplamente usada na expressão de perfil, para determinar a expressão de um gene ou identificar a seqüência de um transcrito de RNA, incluindo a partida da transcrição e sítios de terminação e, se uma seqüência genômica de DNA de um gene é conhecida, para mapear a localização dos éxons e íntros em um gene. O final 5’ de um gene (correspondendo ao sítio de partida de transcrição) é tipicamente identificado por um método de RT-PCR, chamado CORRIDA-PCR, breve para Rápida Amplificação de Extremidades de cDNA.

PCR DE FASE SÓLIDA: abrange muitos métodos, incluindo Amplificação Salpicada (onde as colônias de PCR são derivadas de uma matriz em gel, por exemplo), uma Ponte de PCR (os únicos iniciadores presentes são covalentemente ligados a suportes de superfície sólida), PCR de Fase Sólida convencional (onde a PCR Assimétrica é aplicada na presença de suporte sólido trazendo um iniciador com seqüência combinada de um dos iniciadores aquosos) e uma PCR de Fase Sólida Aumentada (onde a PCR de fase sólida convencional pode ser melhorada por emprego de iniciador de suporte sólido de alta temperatura de fusão com aplicação de uma etapa térmica para favorecer a iniciação de suporte sólido).

PCR DE CAUDA: PCR térmica assimétrica intercalada é usada para isolar seqüências desconhecidas que flanqueiam uma seqüência conhecida. Dentro da seqüência conhecida a PCR de Cauda usa um par de iniciadores alojados com diferentes temperaturas de fixação; um iniciador corrompido é usado para amplificar na outra direção a partir da seqüência desconhecida.

PCR DE MARCAÇÃO DE PONTO: uma variante da PCR que pretende reduzir bases não específicas por redução gradativa da temperatura de fixação na progressão do ciclo da PCR. A temperatura de fixação nos ciclos iniciais é usualmente de poucos graus (3-5oC) aproximadamente a temperatura de fusão dos iniciadores usados, enquanto nos ciclos posteriores, ela esta a poucos graus (3-5oC) abaixo a temperatura de fusão do iniciador. As temperaturas mais altas dão maior especificidade para a ligação do iniciador, e as mais baixas temperaturas permitem amplificação mais eficiente a partir de produtos específicos formados durante os ciclos iniciais.

PAN-AC: este método usa condições isotérmicas para amplificação, e pode ser usado em células vivas.

RÁPIDA CAMINHADA UNIVERSAL: este método permite o aparecimento do genoma e a impressão digital genética usando uma PCR mais específica “dos dois lados” do que as abordagens convencionais de “um lado” (usando somente um iniciador de gene específico e um iniciador geral – o qual pode levar a um ruído no artefato) em virtude de um mecanismo envolvendo a formação de uma estrutura em laço. Derivativos simplificados de UFW são Corrida LaNe (PCR alojada dependente de laço para rápida amplificação das extremidades do DNA genômico, Corrida 5’ La Ne e Corrida 3’ LaNe.