*601055 PLEXIN A1; PLXNA1
Alternative titles; symbols
PLEXIN 1; PLXN1TRANSMEMBRANE PROTEIN NOV; NOV
Gene map locus 3q21-qter

TEXTO

CLONAGEM

Maestrini e outros (1996) identificaram uma nova família de proteínas transmembrana com homologia para a família MRT de receptores de fator de crescimento do hepatócito. A primeira delas, a qual eles chamaram SEX (300022), foi mapeada em Xq28 e encontrada no curso de uma busca por genes previamente desconhecidos no cromossomo X. A proteína transmembrana que eles chamaram NOV foi identificada por um cDNA encontrado em uma biblioteca de cDNA do músculo esquelético e atinge 72% de identidade com SEX. As proteínas desta família contém grandes domínios citoplasmáticos caracterizados por uma seqüência distintiva altamente conservada, a qual eles chamaram do domínio SEX. Assim como os genes SEX e OCT (601054), a NOV é expressada nos tecidos fetais, predominantemente no cérebro. Veja também (601053).

FUNÇÃO DO GENE

Takahashi e outros (1999) encontraram que duas proteínas ligantes de semaforina, plexina-1 (PLXN1) e neuropilina-1 (NRP1;602069), formam um complexo estável. A PLXN1 sozinha não se liga a semaforina-3A (SEMA3A;603961), mas o complexo NRP1/PLXN1 tem mais alta afinidade por SEMA3A do que a NRP1 sozinha. Enquanto a ligação de SEMA3A a NRP1 não altera a morfologia da célula neuronal, a interação de SEMA3A com o complexo NRP1/PLXN1 induziu células aderentes a reunirem-se. A expressão de uma PLNX1 dominante negativa em neurônios sensoriais bloqueou o colapso do crescimento cônico induzido por SEMA3A. O tratamento com SEMA3A levou à redistribuição do crescimento do cone NRP1 e PLXN1 em conjuntos. Assim, os autores concluíram que receptores fisiológicos de SEMA3A consistem dos complexos NRP1/PLXN1.

Usando análises de micro-série e interferência de RNA em camundongos deficientes do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe II e do transativador doMHC de classe II (CIITA; 600005), Wong e outros (2003) encontraram que a Pxna1 era expressada nas células dendríticas (DCs), mas não em outras células imunes, e foi fortemente induzida por CIITA, a qual regula a função de promotor de Plxna1. Plxna1 não foi requerida para ligação de peptídio a MHC, indicando que Plxna1 está envolida em interações célula T –DC, mas não em processamento de antígeno.

MAPEAMENTO

Maestrini e outros (1996) localisaram o gene NOV em 3q21-qter por sondagem de um painel de células somáticas híbridas de humanos e hamster.

NOMENCLATURA

Este gene não está relacionado a NOV, o gene super-expressado no nefroblastoma (164958). Tamagnone e outros (1999) propuseram uma nova nomenclatura paras os genes da família plexina, os quais eles agruparam nas sub-famílias A, B, C e D; o gene PLXN1 foi renomeado para plexina A1 por eles.

*601054 PLEXIN A2; PLXNA2
Alternative titles; symbols
PLEXIN 2; PLXN2TRANSMEMBRANE PROTEIN OCT; OCT
Gene map locus Chr.1

TEXTO

No curso de uma busca por genes previamente desconhecidos no cromossomo X humano, Maestrini e outros (1996) identificaram um cDNA em Xq28 codificando uma proteína transmembrana que eles denominaram SEX (300022). Eles mostraram que a SEX compartilha significativa homologia com o domínio extracelular dos receptores codificados por MET e outros membros da família de receptores do fator de crescimento do hepaatócito (HGF). Três outras seqüências estritamente relacionadas com SEX foram identificadas, uma das quais (designada OCT) foi mostrada por análises de um painel de células somáticas híbridas humanas/hamster por mapear no cromossomo 1. As proteínas codificadas por todos os quatro genes continham grandes domínios citoplasmáticos caracterizados por uma seqüência distintiva altamente conservada que eles chamaram o domínio SEX. Veja também a PLXNB1.

Nomenclatura: Tamagnone e outros (1999) propuseram uma nova nomenclatura para os genes da família plexina, os quais eles agruparam nas sub-famílias A, B, C e D; o gene da PLXN2 foi renomeado para plexina A2 por eles.

*300022 PLEXIN A3; PLXNA3
Alternative titles; symbols
PLEXIN 4; PLXN4TRANSMEMBRANE PROTEIN SEX; SEX
Gene map locus Xq28

TEXTO

Em busca por genes desconhecidos no cromossomo X, Maestrini e outros (1996) identificaram um cDNA em Xq28 codificando uma proteína transmembrana, a qual eles chamaram SEX, com 1.871 aminoácidos. A SEX compartilha significativa homologia com um domínio extracelular dos receptores codificados pelos oncogenes MET (164860), RON (600168), e SEA (165110), isto é, a família de receptores de fator de crescimento de hepatócito (HGF). Sondagens suplementares de bibliotecas de cDNA identificaram três seqüências adicionais rigorosamente relacionadas a SEX; elas foram denominados SEP (601053), OCT(601054), e NOV(601055), e foram localizadas nos cromossomos 3p, Cr1, e 3q, respectivamente, por sondagem de um painel de DNAs de células somáticas híbridas de hamster e humano. As proteínas codificadas por estes genes contém grandes domínios citoplasmáticos caracterizados por uma seqüência altamente conservada distintiva, a qual eles chamaram domínio SEX. Análises de Northern blot revelaram diferente expressão dos genes da família SEX nos tecidos fetal, com SEX, OCT e NOV predominantemente expressados no cérebro, e SEP expressado em níveis mais altos nos rins. Análises de hibridização em sítio revelaram que um homólogo de SEX no camundongo tem um padrão distintivo de expressão no desenvolvimento do sistema nervoso do camundongo, onde este foi encontrado em neurônios pós-mitóticos a partir dos primeiros estágios de diferenciação neuronal (9,5 dias após a fecundação). A proteína SEX (220quilo-dáltons) é glicosilada e exposta na superfície da célula. Maestrini e outros (1996) notaram que, ao contrário dos receptores da família HGF, p220 (SEX), nem a quimera MET-SEX, e nem a TPR-SEX constitutivamente dimerizada apresentaram atividade de cinase de tirosina. Os dados definiram uma família gênica, chamada família SEX pelos autores, envolvida no desenvolvimento de tecidos neuronais e epiteliais que codifica putativos receptores com não esperadas propriedades enzimática e de ligação.

Nomenclatura: Maestrini e outros (1996) estabeleceram que o gene seria nomeado SEX já que está mapeado no braço longo do cromossomo sexual X. Eles estabeleceram mais que as três seqüências relacionadas com SEX seriam chamadas SEP, OCT e NOV, de acordo com os números ordinais seguindo “seis” (six). Tamagnone e outros (1999) propuseram uma nova nomenclatura para os genes da família plexina, os quais eles agruparam nas sub-famílias A, B, C e D; o gene PLXN4 foi renomeado plexina A3 por eles.

*601053 PLEXIN B1; PLXNB1
Alternative titles; symbols
PLEXIN 5; PLXN5TRANSMEMBRANE PROTEIN SEP; SEP
Gene map locus 3pter-p14
TEXTO
CLONAGEM

Maestrini e outros (1996) identificaram um novo gene da família das proteínas transmembrana de receptores do fator de crescimento do hepatócito (HGF) enquanto procuravam por genes ainda não conhecidos em Xq28. Eles chamaram o novo gene de SEX (300022). Eles também encontraram três genes autossômicos de seqüência similar, um dos quais eles designaram como SEP. A seqüência do cDNA (FB7) foi isolada por descoberta acidental a partir de uma bilbioteca de cérebro fetal humano. O gene SEP era expressado em níveis mais altos nos rins fetais. Veja também 601054 e 601055.

FUNÇÃO DO GENE

Tamagnone e outros (1999) noticiaram que o PLXNB1 é um receptor para semaforina SEMA4D transmembrânica, também chamada CD100 (601866).

Swiercz e outros (2002) acharam que a exposição dos neurônios do hipocampo do rato à SEMA4D resultou em colapso de crescimento em cone no axônio. Notando o envolvimento de PLXNB1 e SEMA4D na morfologia do crescimento do cone, ambos Swiercz e outros (2002) e Viks e outros (2002) desempenharam experimentos que documentaram a relocalização de PLXNB1 na membrana plasmática, onde esta pode interagir com SEMA4D, sucedendo a ligação de pequenas GTPases e a mobilização de várias moléculas de sinalização.

Giordano e outros (2002) apresentaram a evidência para a comunicação cruzada entre PLXNB1 e MET (164860) durante o crescimento invasivo nas células epiteliais. A ligação de SEMA4D a PLXNB1 estimulou a atividade de quinase de tirosina de MET, resultando na fosforilação da tirosina de ambos os receptores. Este efeito não foi encontrado em células sem a expressão de MET.

Oinuma e outros (2004) noticiaram que o receptor de SEMA4D, plexina B1 estimulou diretamente a atividade de GTPase de RRAS (165090), um membro da superfamília Ras das pequenas proteínas de ligação a GTP que têm sido implicadas na promoção da adesão celular e crescimento exagerado da inflamação no nervo. Esta atividade requereu a interação da plexina B1 com RND1 (609038), uma pequena proteína de ligação a GTP da família Rho. A sub-regulação da atividade de RRAS pelo complexo B1/RND1 foi essencial para o colapso do crescimento do cone induzido por SEMA4D nos neurônios do hipocampo. Oinuma e outros (2004) concluíram que a plexina B1 media a direção da sinalização repulsiva do axônio induzida por SEMA4D por atuar como uma proteína de ativação de GTPase para RRAS.

MAPEAMENTO

Por sondagem de um painel de células somáticas híbridas de humanos e hamsters, Maestrini e outros (1996) determinaram que o gene SEP mapeia em 3pter-p14.

GENÉTICA MOLECULAR

Wong e outros (2007) identificaram 13 diferentes mutações somáticas no domínio citoplasmático do gene PLXNB1 no tecido de câncer de próstrata (176807). Mutações foram encontradas em 8 (89%) de 9 metastases ósseas de câncer de próstrata. Quarenta por cento dos cânceres de próstrata continham a mesma mutação, e a maioria dos tumores primários apresentaram super-expressão da proteína plexina B1. Estudos da expressão funcional in vitro das três mutações mais comuns mostraram que as proteínas mutantes resutaram no aumento da mobilidade das células, invasão, adesão e extensão de lamelipódio (um véu citoplasmático produzido em todos os lados dos leucócitos polimorfonucleares migratórios) em comparação com a proteína de tipo selvagem. As mutações atuaram por impedirem a ligação de RAC1 (602048) e RRAS e a atividade de GTP. Wong e outros (2007) concluíram que a PLNXB1 desempenha um papel na progressão tumoral e na metástase.


NOMENCLATURA

Tamagnone e outros (1999) propuseram uma nova nomenclatura para os genes da família plexina, os quais eles agruparam nas sub-famílias A, B,C e D; o gene PLNX5 foi renomeado plexina B1 por eles.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez

600005 MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX, CLASS II, TRANSACTIVATOR; MHC2TA
MHC CLASS II TRANSACTIVATORCLASS II TRANSACTIVATOR; C2TA; CIITA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=600005

Gene map locus 16p13
TEXTO

CLONAGEM

A deficiência hereditária do MHC de classe II, ou a síndrome do linfócito descoberto (vazio, desprotegido) de tipo II (209920) ocorre em vários grupos de complementação. Steimle e outros (1993) isolaram um transativador da expressão do gene do MHC de classe II usando uma linhagem celular mutante negativa para MHC de classe II para clonagem da complementação. O gene, o qual eles chamaram CIITA para transativador de classe II restaurou a expressão de todos os isotipos de MHC de classe II em células mutantes e corrigiu completamente o defeito regulatório do MHC de classe II das células dos pacientes com a síndrome do linfócito vazio.
Numa revisão, Mach e outros (1994) estabeleceram que o cDNA de C2TA codifica uma proteína de 1.130 aminoácidos.

Harton e Ting (2000) revisaram a estrutura de CIITA. A expressão de CIITA é regulada por mais de quatro promotores, com expressão constitutiva geralmente resultante dos promotores I e III em células dendríticas e linfócitos B, respectivamente. O promotor IV é responsável pela expressão indutível de IFNG em monócitos/macrófagos. A CIITA tem uma estrutura de domínio de complexo protéico com um domínio ácido no terminal N, seguido por um domínio pro-ser-thr (PST), a GTP-binding site, um domínio de localização nuclear de sinal, e regiões ricas em leucina no terminal C.

FUNÇÃO DO GENE

Numa revisão, Mach e outros (1994) estabeleceram que não há evidência de que a ligação direta de C2TA ao promotor do MHC de classe II tenha sido encontrada, sugerindo que não seja uma proteína de ligação a DNA. O mRNA de C2TA é expressado diferencialmente e pode ser detectado somente em células positivas de HLA de classe II e tecidos. Esta correlação firme sugere que a expressão dos genes de HLA de classe II são, em larga extensão, senão inteiramente, sob controle de C2TA. Mach e outros (1994) referiram-se aos resultados dos experimentos como indicadores de que o gene C2TA é induzido por interferon gama (IFNG) e que C2TA é um mediador essencial da expressão indutível do gene do MHC de classe II.
CIITA é um regulador positivo da transcrição do gene do complexo maior de histocompatibilidade de classe II que é defectivo em um dos cinco grupos de complementação de linhas celulares negativas para o MHC de classe II. Sua região termina N é capaz de ativar a transcrição a partir de um gene repórter quando fundido com um domínio de ligação a DNA. Mahanta e outros (1997) encontraram que a transativação por CIITA foi extremamente sensitiva para uma mutação na proteína de ligação a TATA Box (TBP) que nas leveduras é conhecida por abolir a transcrição mediada por VP16 porém deixa a transcrição basal inalterada. Em geral, o mecanismo de transativação pela CIITA específica de célula B humana foi muito similar àquela mediada pelo transativador VP16 do vírus da herpes nos modos em que foram testados.

Dois dos genes defectivos nos cinco grupos de complementação identificados na síndrome do linfócito vazio de classe II negativo ou em mutantes laboratoriais correspondentes têm sido clonados (Mach e outros, 1996). Um gene codifica RFX5, um membro da família RFX das proteínas de ligação a DNA; o outro, CIITA, codifica uma grande proteína com um domínio ácido de ativação transcricional definido. A última proteína não interage com o DNA. Scholl e outros (1997) demonstraram que RFX5 pode ativar a transcrição somente em cooperação com CIITA. RFX5 e CIITA associam-se para formar um complexo capaz de ativar a transcrição a partir do promotor do complexo maior de histocompatibilidade de classe II. Neste complexo, a especificidade do promotor está determinada pelo domínio de ligação ao DNA de RFX5 e o aparato geral de transcrição é recrutado pelo domínio de ativação ácido de CIITA.
A proteína CIITA contém motivos similares aos encontrados nas proteínas de ligação a GTP. Harton e outros (1999) demonstraram que a CIITA liga-se a GTP, e mutações nestes motivos diminuem sua ligação a GTP e atividade transativadora. A substituição desses motivos com seqüências análogas a partir de Ras (190020) restaura a função de CIITA. A CIITA exibe pequena atividade de GTPase (atividade catalítica de GTP ou atvidade enzimática sobre GTP), já que mutações em CIITA que conferem atividade de GTPase reduzem a atividade transcricional. A ligação de GTP por CIITA está correlacionada com a importação nuclear. Assim, Harton e outros (1999) concluíram que diferente de outras proteínas de ligação a GTP, a CIITA está envolvida na ativação transcricional que usa ligação a GTP para facilitar seu próprio transporte nuclear.

Harton e Ting (2000) revisaram que o papel de CIITA como um regulador líder dos genes do MHC de classe II. Eles notaram que a modulação da expressão de CIITA por patógenos tais como citomegalovírus, micobactéria, clamídia e HIV servem como uma via de escape ao sistema imune.

Zhu e outros (2000) mostraram que a CIITA parece agir como uma proteína de apoio para o reconhecimento do MHC de classe II conservado e boxes promotores de genes relacionados W (ouS), X, e Y, com arranjos helico-espaciais estritos dos elementos promtores X e Y. O elemento X liga-se a RFX (RFX5/RFXANK(603200)-RFXB/RFXAP(601861)) e CREB (123810), enquanto o elemento Y liga-se aNFY/CBF (NFYA (189903), NFYB (189904), e NFYC (605344)). CIITA interage com todos os três principalmente através de suas regiões terminais N.

Raval e outros (2001) noticiaram que a CIITA contém uma atividade de acetiltransferase (AT) que mapeia numa região dentro do terminal N de CIITA, entre os aminoácidos 94 e 132. A atividade AT é regulada pelo domínio de ligação a GTP terminal C e é estimulada por GTP. A transativação mediada por CIITA depende da atividade AT. Adicionalmente, Raval e outros (2001) mostraram que a CIITA ativa o promotor dos genes do MHC de classe II na ausência da TAFII250 funcional (TAF2A).

Masternak e outros (2003) ressaltaram que o promotor próximo ao módulo S-Y pode direcionar o tipo de célula específico e a expressão induzida de IFNG de genes transferidos expressados transitoriamente, mas isto não é suficiente para reproduzir o padrão normal de expressão do MHC de classe II no contexto da cromatina. Existe, em adição, uma região distante que também funciona como um conhecido elemento regulatório como região de controle do lócus (LCR), a qual contém conjuntos de sítios hipersensitivos de Dnase I nas células positivas para MHC de classe II e é requerido para expressar genes de classe II em um padrão celular específico. Masternak e outros (2003) mostraram que a RFXAP e CIITA ligam-se ao LCR e induzem uma acetilação de histona de longo alcance a partir do promotor até 16 quilobases adiante (a montante ou a jusante?), o recrutamento da RNA polimerase II e a síntese de transcritos extragênicos dentro do LCR.

Tosi e outros (2006) encontraram que a infecção de uma linhagem de células B humanas sem a expressão de CIITA com o vírus humano da leucemia de células T (HTLV-2) resultou na replicação viral a menos que as células também fossem transferidas com os 321 aminoácidos do terminal N de CIITA. Análises de mutações definiram uma seqüência mínima dentro do terminal N de CIITA, os resíduos de 64 a 144, que suprimiram a replicação do HTLV-2 por inibição do ativador de transcrição Tax2 viral. Tosi e outros (2006) mostraram que a TAX2 cooperou com CBP (CREBBP) e p300 (EP300), mas não co PCAF, para aumentar a transcrição viral, e eles notaram que a CIITA interage com todos estes três fatores de transcrição. Em adição a CIITA, NFYB e, em menor extensão, NFYA, também inibiram a transativação do promotor de HTLV-2 dependente de Tax-2. Tosi e outros (2006) concluíram que a CIITA pode inibir a função de TAx2, ao menos em parte, atreves do complexo NFY. Eles propuseram que a CIITA tem um papel defensivo duplo contra patógenos: ele aumenta a função de apresentador de antígeno viral e suprime a replicação do HTLV-2 nas células infectadas.

MAPEAMENTO

De acordo com Reith (1997), o gene C2TA tem sido assinado no cromossomo 16.

GENÉTICA MOLECULAR

Em um paciente com a síndrome do linfócito vazio de tipo II, Steimle e outros (1993) identificaram uma mutação de splicing que resultou numa deleção de 24 aminoácidos em C2TA, resultando na perda da função do transativador. Em células RJ2.25, as quais originadas de um linfoma de Burkitt, uma alelo C2TA estava completamente deletado, enquanto em outro alelo um deleção interna removeu a metade da região codificadora. O sítio doador de mutação de splicing foi identificado como uma transição de G para A no sítio doador de Splice na extremidade 3 de um éxon de 72 pares de bases. O éxon saltado em face dessa mutação de sítio de splicing seria esperado. Somente o mRNA C2TA deletado foi expressado e somente o alelo mutado foi detectado no paciente, sugerndo que a mutação tenha sido homozigótica. A complementação total da deficiência de MHC de classe II em linhagens de células a partir destes pacientes com SCID por transferência de cDNA de C2TA ergueu esperanças para a terapia genética nesta desordem; o transplante de medula óssea tinha tido pobre sucesso.

Mach e outros (1994) revisaram o tópico da deficiência de MHC de classe II combinada com imunodeficiência. Em adição à mutação de sítio doador de splicing com o éxon saltado, a homozigosidade para deleção do gene C2TA tem sido demonstrada em outra linhagem celular do grupo de complementação A.

Dziembowska e outros (2002) descreveram 3 novas mutações no gene MHC2TA em três pacientes com a deficiência do MHC de classe II com severa imunodeficiência devida à falta do MHC de classe II. Dois pacientes foram encontrados por serem heterozigotos compostos. No terceiro paciente nenhuma mutação foi encontrada mas o nível do transcrito de CIITA era profundamente diminuído. Este caso foi dito por representar a primeira disfunção descrita do CIITA devidas a supostas mutações nas seqüências regulatórias cis do gene.

A apresentação de antígenos às células T pelas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade é essencial para as respostas imunes adaptativas. Para determinar a exata posição de um gene afetando a expressão das moléculas do MHC, Swanberg e outros (2005) finalmente mapearam um lócus regulador do trato quantitativo do MHC de classe II na microglia previamente definida na ratazana em uma linhagem avançada inter-cruzada. Eles identificaram um pequeno intervalo incluindo o gene MHC2TA e, usando um mapa sobre seis forças inatas combinadas com análises de seqüenciamento e expressão do gene, eles encontraram dois haplótipos de Mhc2ta conservados segregando com os níveis de MHC de classe II. Em humanos, eles encontraram um polimorfismo de a para G no aminoácido 168 no promotor de tipo III do gene MHC2TA por estar associado com suscetibilidade aumentada para artrite reumatóide, esclerose múltipla, e possível infarto do miocárdio, assim como com baixa expressão de MHC2TA após a estimulação dos leucócitos com interferon gama (IFNG). Swanberg e outros (2005) concluíram que os polimorfismos do gene MHC2TA no rato e no homem resultam em expressão e estão associados com suscetibilidade às doenças comuns do complexo com componentes inflamatórios.

MODELO ANIMAL

Usando análises de micro-rede e interferência de RNA em camundongos deficientes em MHC de classe II e CIITA, Wong e outros (2003) encontraram que a Pxna1 era expressada em células dendríticas (DCs), mas não em outras células imunes, e era fortemente induzida por CIITA, a qual regula a função do promotor Plxna1. Plxna1 não foi requerida para ligação do peptídio ao MHC, indicando que a Plxna 1 está envolvoda nas interações célula T-DC, mas não no processamento do antígeno.

http://bioisolutions.blogspot.com/2008/07/how-nad-works.html

How the NAD+ Works


O dinucleotídeo nicotinamida adenina, abreviado NAD+, é uma coenzima encontrada em todas as células vivas. O composto é um dinucleotídeo, já que consiste de dois nucleotídeos juntos através de seus grupos fosfato: com um nucleotídeo contendo um anel de adenosina, e outro contendo nicotinamida.

No metabolismo, NAD+ está envolvido em reações redox (a contradição entre oxidação e redução), carregando elétrons de uma reação para outra. A co-enzima é por isso encontrada em duas formas nas células: NAD+ é um agente oxidante – ela recebe elétrons de outras moléculas e torna-se reduzida, esta reação forma NADH, a qual pode então ser usada com um agente redutor para doar elétrons. Essas reações de transferência de elétrons são a função principal de NAD+. Entretanto, ele também é usada em outros processos celulares, notavelmente como um substrato de enzimas que adicionam ou removem grupos químicos a partir de proteínas, em modificações pós-translacionais. Devido à importância dessas funções, as enzimas envolvidas no metabolismo de NAD+ são alvos para descoberta de drogas.


Nos organismos, NAD+ pode ser sintetizada da matéria prima (de novo, novas NAD) dos aminoácidos triptofano e ácido aspártico. Alternativamente, os componentes das co-enzimas são absorvidos dos alimentos como as vitaminas chamadas niacina. Componentes similares são liberados por reações que quebram as estruturas de NAD+. Esses componentes pré-formados então passam através de uma via de salvamento que os recicla de volta na forma ativa. Alguns NAD+ também são convertidos em nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+); a química desta co-enzima relacionada é similar àquela de NAD+, mas tem diferentes papéis no metabolismo.

A nicotinamida adenine dinucleotídeo é um dinucleotídeo já que consiste de dois nucleotídeos unidos por uma ponte de par de grupos fosfato. Os nucleotídeos consistem de anéis de ribose, um com adenina ligada ao primeiro átomo de carbono (a posição 1’) e o outro com nicotinamida nesta posição. O grupo nicotinamida pode ser ligado em duas orientações neste átomo de carbono anomérico {anômero é uma das moléculas de açúcar que são epímeras [que estão em posição superior] no átomo de carbono (carbono 1 nas aldoses e carbono 2 nas cetoses}, devido a essas duas possíveis estruturas, o composto existe como dois diastereoisômeros (isômeros que não têm a mesma disposição estrutural). É o β-nicotinamida diastereoisômero de NAD+ que é encontrado nos organismos. Estes nucleotídeos. Esses nucleotídeos são unidos juntos por uma ponte de dois grupos fosfato através do carbon 5’.

No metabolismo o composto recebe ou doa elétrons em reações redox. Tais reações (sumarizadas na formula a seguir) envolvem a remoção de dois átomos de hidrogênio do reagente (a substância catalisada) (R), na forma de um íon hidreto (hidrogênio com carga negativa, composto de hidrogênio em que ele assume uma carga negativa formal), e um próton (H+). O próton é liberado na solução, enquanto o redutante RH2 é oxidizado e NAD+ reduzido para NADH por transferência do hidreto para o anel de nicotinamida.

NADH + H+ + RH2 + NAD+ → R

A partir do par de elétrons do hidreto, um elétron é transferido para o nitrogênio carregado positivamente do anel de nicotinamida de NAD+, e o segundo átomo de hidrogênio transferido para o átomo de carbono C4 oposto a este nitrogênio. O ponto central potencial do par redox NAD+/NADH é de -0,32 volts, o qual torna NADH um forte agente redutor. A reação é facilmente reversível, quando NADH reduz outra molécula e é re-oxidizada para NAD+. Isso significa que a co-enzima pode continuar o ciclo entre as formas NAD+ e NADH sem ser consumida.

Na aparência, todas as formas desta co-enzima são pólvora branca amorfa que são higroscópicas (substância capaz de absorver umidade e água) e altamente solúveis em água. Os sólidos são estáveis se estocados secos e no escuro. Soluções de NAD+ são menos coloridas e estáveis por mais ou menos uma semana a 4oC e em pH neutro, mas decompõem rapidamente em ácido ou álcalis. Na decomposição, eles formam produtos que são inibidores de enzimas.

Ambos NAD+ e NADH absorvem fortemente na ultraviolet devido a sua base adenine. Por exemplo, o pico de absorção de NAD+ está em um comprimento de onda de 259 nanômetros (nm), com um coeficiente de extinção de 16.900 M-1cm-1. NADH também absorve em altos comprimentos de onda, com um segundo pico em absorção de UV em 339 nm com um coeficiente de extinção de 6.220 M-1cm-1. Essa diferença na absorção de espectros ultravioleta entre as formas oxidadas e reduzidas das coenzimas em altos comprimentos de onda torna simples mensurar a conversão de uma para outra em ensaios enzimáticos – por mensuração da quantidade de absorção de UV a 340 nanômetros usando um espectrofotômetro (um tipo de microscópio que custa entre 45 e 50.000 dólares).

NAD+ e NADH também diferem em sua fluorescência. NADH em solução tem um pico de emissão em 460 nm e um tempo de vida de fluorescência de 0.4 nanosegundos, enquanto a forma oxidada da coenzima não fluoresce. As propriedades do sinal de fluorescência mudam quando NADH liga-se a proteínas, então estas mudanças podem ser usadas para medir constantes dissociações, as quais são úteis no estudo da cinética da enzima. Essas mudanças na fluorescência também são usadas para medir mudanças no estado redox de células vivas, através de microscopia fluorescente.

*608625 PEPTIDYL-tRNA HYDROLASE 2; PTRH2
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=608625


BCL2 INHIBITOR OF TRANSCRIPTION 1; BIT1

Gene map locus 17q23.1

CLONAGEM

A perda de ligação à matriz extracelular causa a apoptose, um processo conhecido como anoikis. A BCL2 é uma proteína anti-apoptótica que pode proteger as células contra a anoikis. Jan e outros (2004) procuraram por proteínas envolvidas na regulação dependente da adesão celular na anoikis por expressão de um clone para reguladores de BCL2 dependentes da integrina. Eles identificaram BIT1, o qual codifica uma proteína prevista em 179 aminoácidos com uma massa molecular calculada em 27 quilo-dáltons. BIT1 está evolucionariamente conservada da bactéria ao ser humano. Ela contém uma seqüência de localização mitocondrial no terminal N e um domínio de UPF0099 no terminal C. Análises de Northern blot detectaram um transcrito BIT1 de 1 quilodálton expressado proeminentemente nos testículos, próstata, músculo esquelético e fígado, com expressão mais baixa no coração, baço, placenta e cólon. Nenuma expressão significativa foi detectada no timo ou nos leucócitos periféricos. As células humanas dos rins demonstraram somente um traço da expressão de BIT1. A imuno-pigmentação localizou o BIT1 endógeno nas mitocôndrias de céluas HeLa, e análises de imuno-borrão revelaram uma doublet (cópia falsa) de 20 quilo-dáltons nos extratos mitocondriais de células HeLa.

FUNÇÃO DO GENE

Jan e outros (204) mostraram que a BIT1 mitocondrial é liberada no citoplasma durante a apoptse. A BIT1 citoplasmática formou um complexo com AES (600188 – Amino-Terminal Enhancer of Split; Terminal amina intensificador de divisão) e induziu a morte celular com características de apoptose independente de caspase. A ligação celular a fibronectina (135600) neutralizou o efeito apoptótico de BIT1 e AES. O aumento da expressão de BIT1 aumentou a anoikis, enquanto a expressão suprimida a reduziu.

MAPEAMENTO

O Consórcio Internacional de Mapeamento por Radiação Híbrida mapeou o gene PRRH2 no cromossomo 17.

MODELO ANIMAL

Kairouz-Wahabe e outros (2008) atestaram que camundongos nulos para BIT1 nasceram vivos, mas faleceram dentro das duas primeiras semanas de uma síndrome da cria pequena com fraqueza muscular, ataxia (incapacidade de coordenar o movimento muscular, causada com mais freqüência por distúrbios no cérebro ou na medula espinhal;dic.Stedman) e peso diminuído. Fibroblastos embrionários do camundongo cultivados (MEFs) de embriões nulos para Bit-1 foram mais resistentes à morte celular induzida por anoikis do que células de camundongos de tipo selvagem ou ninhadas heterozigotas. Os MEFs (fibroblastos embrionários do camundongo) e os tecidos de camundongos nulos pra Bit-1 exibiram um aumento marcado na fosforilação de ERK (veja ERK2; omim 176948). A expressão derrubada de BIT1 nas células HeLa resultou no aumento da ativação de ERK, e a derrubada parcial de ERK2 reverteu o aumento da resistência aumentada à anoikis dos BIT1 derrubados.

{Obs.: ERK2 é MAPK1: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=176948

ERKs também são conhecidas como proteínas quinases ativadas por mitógeno ou maturação (MAP). Cobb e outros (1991) providenciaram uma revisão. Thomas (1992) deu uma revisada nas quinases MAP e Seger e Krebs (1995) revisaram a cascata de sinalização da quinase MAP.
A quinase MAP ERK2 é amplamente envolvida na transdução de sinal eucariótico. Na ativação, ela se transloca para o núcleo de células estimuladas, onde fosforila alvos nucleares. Khokhlatchev e outros (1998) descobriram que a acumulação nuclear de EPK2 micro-injetada depende de seu estado de fosforilação mais do que de sua atividade ou de componentes a montante de sua via de sinalização. A EPK2 fosforilada forma dímeros com parceiros de ERK2 fosforilados ou não fosforilados. A rupura da dimerização por mutação de ERK2 reduz sua habilidade para acumular-se no núcleo, sugerindo que a dimerização é essencial para sua relocalização normal dependente de ligante. Outros membros da família de quinase MAP também formam dímeros. Khokhlatchev e outros (1998) concluíram que a dimerização é parte do mecanismo de ação da família de quinases MAP.

As viroses influenza A são causas significativas de morbidade e mortalidade no mundo. Vacinas anualmente atualizadas podem prevenir a doença, e anti-virais são tratamento efetivo no começo da doença, quando os sintomas são freqüentemente não-específicos. A replicação viral é sustentada por eventos de sinalização intracelular. Usando U01260, um inibidor de MEK1 (omim: 176872) e MEK2 (omim: 601263), e dessa maneira uma via inibidora de RAF1 (omim 164760)/MEK/ERK (veja Favata e outros (1998)), Pleschka e outros (2001) examinaram a resposta celular para a infecção com influenzaA. U01260 suprimiu ambas as fases de ativação inicial e tardia de ERK após a infecção pelo vírus. A inibição da via de sinalização ocorreu sem diminuição da síntese do RNA viral ou de proteína viral, ou da importação dos complexos ribonucleoproteicos (RNP) virais para o núcleo. Não obstante, U01260 inibiu a sinalização RAF/MEK/ERK e a exportação do RNP viral sem afetar a via de exportação de mRNA celular . Pleschka e outros (2001) propuseram que ER regula um fator celular envolvido na função de exportação nuclear de proteína viral. Eles sugeriram que a aplicação local de inibidores de MEK podem ter efeitos tóxicos somente menores no hospedeiro enquanto inibe a replicação sem dar razão a variantes virais resistentes a drogas.

A toxina letal (LT) do antraz (causada pelo Bacillus anthracis), um fator de virulência crítica do Bacillus anthraxis), é um complexo de fator letal (LF) e antígeno protetor (PA). O PA liga-se ao receptor do antraz (ATR; omim 606410) para facilitar a entrada do fator letal dentro das células. A toxina letal rompe a via de sinalização de MAPK nos macrófagos (Park e outros, 2002). Agrawal e outros (2003) mostraram que, no camundongo, as toxinas letais diminuem a função das células dendríticas (DCs), inibindo a sobre-regulação de moléculas co-estimulatórias, tais como CD40, CD80, e CD86, assim como a secreção de citocina, em resposta à estimulação de lipopolissacarídeos. DCs expostas à toxina letal falharam em estimular células T e B antígeno-específicas in vivo, resultando em significantes reduções do anticorpo IgG circulante. Análises de Western blot indicaram que o fator letal diminui severamente a fosforilação de p38, ERK1 e ERK2. Um cocktail de inibidores de MAPK sintético inibiu a produção da citocina de maneira similar àquela do fator letal. Usando uma forma mutante de fator letal sem o sítio catalítico necessário para a clivagem de MEK1, MEK2 e MEK3 (omim 602314), os ativadores a montante de ERK1, ERK2, e p38, respectivamente, Agrawal e outros (2003) descobriram que a clivagem desses MEKs é essencial para a supressão da função das células dendríticas. Eles propuseram que esse mecanismo pode operar no início da infecção, quando os níveis da toxina letal são baixos, para diminuir a imunidade. Na infecção mais avançada, Agrawal e outros (2003) notaram que a LT (toxina letal) deve ter efeitos inflamatórios bastante diferentes.}

DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS T CD4 POSITIVAS

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim

*300292 FORKHEAD BOX P3; FOXP3
Alternative titles; symbols
SCURFINJM2

Gene map locus Xp11.23-q13.3

TEXTO

CLONAGEM

Por combinação genética de alta resolução e mapeamento físico com análise seqüencial de larga escala, Brunkow e outros (2001) identificaram o gene defeituoso em camundongos descamados (camundongos sf). A proteína codificada por este gene, designada Foxp3, é um membro da família de hélice em forma de asas/ou cabeça em forma de garfo de reguladores transcricionais e é altamente conservada em humanos. Nos camundongos sf, uma mutação sem sentido (que gera um códon finalizador) resulta num produto faltando o domínio de cabeça em forma de garfo. Complementação genética demonstrou que o produto da proteína de Foxp3, caspina (scrufin), é essencial para a homeostase imune normal.

Brunkow e outros (2001) compararam as seqüências de aminoácidos da caspina humana e do camundongo com outros membros da família de proteínas cabeça de garfo/hélice em asas/HNF3 e encontraram uma similaridade mais forte com a seqüência do fator 1 rico em glutamina (FOXP3).

Chatila e outros (2000) estabeleceram que a seqüência de leitura aberta de FOXP3 humana, de 1.146 pares de bases, codifica uma proteína deduzida em 381 aminoácidos. Por PCR de uma biblioteca de cDNA de células mononucleares do sangue periférico humano, Smith e outros (2006) clonaram a lente total de FOXP3 e variantes de splicing faltando o éxon 2 ou ambos os éxons 2 e 7. A lente completa da proteína contém 431 aminoácidos. A variante com falta do éxon 2 codifica uma proteína de 396 aminoácidos e a variante sem os éxons 2 e 7, codifica uma proteína de 369 aminoácidos que também carece de uma grande parte do putativo zíper de leucina. Smith e outros (2006) notaram que o camundongo parece carecer das variantes de Foxp3.


FUNÇÃO DO GENE

Devido a similaridades entre a auto-imunidade e a inflamação produzida pela manipulação de células T regulatória (Tr ou Treg) CD25-positiva/CD4-positiva e aquela induzida por defeitos genéticos no gene FOXP3, Hori e outros (2003) investigaram a contribuição de Foxp3 para o desenvolvimento e/ou função das células Tr no camundongo. Análises de PCR de Transcrição Reversa de camundongos normais demonstraram expressão constitutiva estável de Foxp3 que era alta nas células Tr, baixa nas células CD4-positivas/CD25-negativas, e ausente nas células T CD4-negativas/CD8-positivas (veja CD8A; omim 186910). A expressão de Foxp3 transduzido (vindo de outra célula?) nas células CD4-positivas/CD25-negativas transmitiram um fenótipo de Tr nessas células, com baixos níveis de expressão de citocina, comparado com células não transduzidas (que não receberam o Foxp3) ou transduzidas com um único vetor, e altos níveis de CD103, GITR (TNFRSF18), e CTLA4. Células transduzidas também apresentaram atividade supressora de contato célula-célula “in vitro”,assim como a supressão da auto-imunidade e inflamação “in vivo”. Hori e outros (2003) propuseram que a FOXP3 pode ser um gene regulador principal e um marcador mais específico das células Tr (Tregs) do que outras moléculas de superfície celular. Eles também sugeriram que a transdução de FOXP3 poderia ser um modo terapêutico para o tratamento de doenças inflamatórias.

Stock e outros (2004) descreveram um tipo de célula Tr antígeno-específica que desenvolveu-se “in vivo” a partir de células T naive (puras e inocentes) CD4-positivas/CD25-negativas durante uma resposta imune de Th1 polarizada. Essas células Tr foram induzidas por células dendríticas CD8A-positivas, produziram ambos IFNG e IL10, e expressaram o ‘fator líder de transcrição’ de Th1, TBET (TBX21; 604895), bem como ICOS e FOXP3. As células inibiram a hiper-atividade induzida por alérgeno das vias respiratórias de maneira dependente da IL10 nos camundongos. Stock e outros (2004) concluíram que esses células Tr adaptativas estão relacionas com, mas de forma distinta, as células Th1. Eles propuseram que um espectro de tipos de células Tr adaptativas existe, compreendendo as células similares a Th1 e as células similares a Th2 noticiadas previamente que são induzidas pelas células dendríticas CD8A-negativas e expressam o ‘fator líder de transcrição’ de células Th2, GATA3, e FOXP3.

Usando um repórter bi-cistrônico (cistron é a menor unidade do gene associada a uma só função) expressando proteínas fluorescentes vermelhas batidas dentro do lócus Foxp3 endógeno do camundongo, Wan e Flavell (2005) demonstraram que a Foxp3 foi expressada predominantemente em células T CD4-positivas/CD25-positivas, mas também em alguns outros subconjuntos de células T CD4-positivas. A Estimulação de células T CD4 ativadas com TGFB induziu ambas a expressão de Foxp3 e da função supressora de Célula T.


FOXP1, FOXP2, e FOXP3 todos ligam o sítio de ligação a FOX dentro do promotor da IL2, e todos menos FOXP2 suprimem a atividade do promotor de IL2. Entretanto, Bettelli e outros (2005) encontraram que a expressão forçada de FOXP3, mas não de FOXP1 e FOXP2, em células T naive (novas) suprimiram não somente a IL2, mas também a IL4 e IFNG devido a sua habilidade de associar-se fisicamente com e inibir a citocina trans-ativadora de gene NFKB e NFAT. As células T derivadas de camundongos descamados deficientes em Foxp3 tiveram a expressão de Nfat e Nfkb significativamente aumentada, a qual poderia ser baixada para níveis fisiológicos pela compementação do gene FOXP3. A transdução de células T de camundongo auto-reativo especificamente para proteína polipeptídica mielina (PLP1) com FOXP3 eliminou sua habilidade para mediar a encefalomielite auto-imune experimental. Betelli e outros (2005) concluíram que, em adição a serem associadas com a geração de células T regulatórias CD4-positivas/Cd25-positivas, o FOXP3 atua em células T maduras por repressão de NFAT e NFKB.


Allan e outros (2005) encontraram que, em contraste com resultados no camundongo, a super-expressão de FOXP3 sozinha ou junto com um variante de Splice faltando o éxon 2 em células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas resultou em mais baixa proliferação e produção de IL2, mas não no aumento da atividade supressora. Allan e outros (2005) sugeriram que os fatores em adição a FOXP3 são requeridos para o desenvolvimento de células T regulatórias.


O co-polímero I (COP-1) é um polímero casual de quatro aminoácidos (glu, lys, ala e tyr) enriquecido na proteína básica da mielina (MBP) que é usado para tratar a esclerose múltipla (MS). Hong e outros (2005) descobriram que a COP-1 aumentou a expressão de FOXP3 das células T CD4 –positivas do sangue periférico de pacientes de esclerose múltipla e induziu a conversão de células T regulatórias CD4-positivas/CD25-negativas para células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas. A indução de FOXP3 em células T CD4-positivas foi mediada por IFNG (interferão gama omim 147570 - 12q14). Camundongos sem interferão gama exibiram um aumento nas células CD4-positivas/CD25-positivas após o tratamento com COP-I, mas estas células não expressavam Foxp3. Hong e outros (2005) concluíram que COP-I mediava a ativação da expressão de FOXP3 e a conversão das células CD4-positivas/CD25-negativas para células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas requer IFNG.

Smith e outros (2006) descobriram que a super-expressão da lente total de Foxp3 ou das variantes de Foxp3 sem o éxon 2 ou sem ambos os éxons 2 e 7 reduziu a proliferação de células T CD4-positivas e a secreção de citocinas.

Pennington e outros (2006) mostraram que sem nenhum efeito óbvio na seleção mediada pelo receptor de célula T, a diferenciação normal das células T gama-delta em potentes células citolíticas e secretoras de interferão gama é substituída em relação a um fenótipo regulatório conjunto por limitação das células T CD4+/CD8+ progenitoras em influenciar nas primeiras trans em células progenitoras gama-delta. Inesperadamente, Pennington e outros (2006) descobriram que a propensão das primeiras células T com receptores alpha-beta progenitoras diferenciarem-se em células T regulatórias Foxp3 também é regulado em trans por células progenitoras de células T CD4+/CD8+. (Trans pode ser alguma enzima transxxxx? Ou translocação? Trans ao contrário de cis?)


Ono e outros (2007) demonstraram que a transcrição do fator AML1/RUNX1, a qual é cruscialmente requerida para a hematopoiese normal, incluindo o desenvolvimento das células T do timo, ativa a expressão dos genes IL2 e IFN-gama em células T CD4+ convencionais através da ligação a seus respectivos promotores. Em células T (R) naturais, a FOXP3 interage fisicamente com AML1 {Omim, 151385, 21q22.3) O fator de transcrição PEBP2, originalmente identificado como uma proteína de ligação ao intensificador do poliomavírus, é composto de uma sub-unidade alfa, a qual liga-se ao DNA por via do domínio Runt, e uma sub-unidade beta, a qual aumenta a afinidade da sub-unidade alfa para DNA, mas não apresenta nenhuma ligação com DNA em si mesma. AML1, ou RUNX1, é um dos vários genes que codificam a sub-unidade alfa. Somente um gene, CBFB (121360), codifica a sub-unidade beta. A AML1 é um dos mais freqüente alvos de translocações cromossômicas associadas com leucemia (Zhang e outros, 1997)}

Marson e outros (2007) identificaram genes alvo de FOXP3 e noticiaram que muitos destes são chaves moduladoras da ativação e funcionamento das células T. Notavelmente, o predominante, embora não exclusivo, efeito da ocupação de FOXP3 é suprimir a ativação de genes alvo na estimulação da célula T. A supressão de FOXP3 de seus alvos parece ser crucial para a função normal das células T regulatórias, pois variantes sobre-ativas de alguns genes alvo são conhecidas por estarem associadas a doenças auto-imunes.

Zheng e outros (2007) usaram análises de grandes genomas combinando a imuno-precipitação da cromatina com um esboço de telhado em série de genoma do camundongo para identificar as regiões de ligação de Foxp3 para aproximadamente 700 genes e para um microRNA codificado inter-genicamente. Os autores acharam que um grande número de genes ligados a Foxp3 são sobre, ou sub-regulados em células T Foxp3+, sugerindo que o Foxp3 atua tanto como ativador, quanto repressor transcricional. Uma única regulação mediada por Foxp3 no timo afeta, entre outros, genes codificadores de fatores nucleares que controlam a expressão do gene e o remodelamento da cromatina. Em contraste, genes alvo de Foxp3 divididos pelas células T regulatórias do timo e periféricas codificam proteínas da membrana plasmática, assim como proteínas de sinalização celular. Zheng e outros (2007) concluíram que sub-programas transcricionais distintos implementados por Foxp3 estabelecem uma linhagem de células T regulatórias durante a diferenciação e sua competência proliferativa e funcional na periferia.

Zuo e outros (2007) observaram que camundongos fêmeas heterozigotos para mutação em caspina (scurfin) desenvolveram câncer em alta taxa. A maioria dos cânceres eram carcinomas mamários nos quais o alelo de tipo selvagem de Foxp3 estava inativado e Erbb2 estava sobre-expressado. Zuo e outros (2007) descobriram que o Foxp3 reprimia a transcrição do gene Erbb2 por via da interação dos motivos de ligação a DNA da cabeça em garfo com o promotor de Erbb2. A expressão de Foxp3 estava reduzida em 10 linhas celulares de tumor humano comparadas com células epiteliais mamárias normais e uma linha celular não maligna, e nenhuma das linhagens celulares tumorais expressavam transcritos com a lente total de FOXP3.


Zuo e outros (2007) descobriram que carcinomas mamários no camundongo heterozigoto para uma mutação em Foxp3 exibiu aumentada expressão de Skp2. {Omim, 601436, 5p13: o ciclo cellular humano é regulado pela interação de múltiplas proteínas, incluindo as ciclinas (este gênero 123836), quinases dependentes de ciclina (CDKs, este gênero, 123829), e fosfatases. Demetrick e outros (1996) estabeleceram que complexos contendo quinases dependentes de ciclinas, ciclinas, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA ;123836), e várias outras proteínas regulam os principais pontos de transição do ciclo celular nas fronteiras G1/S e G2/M. Em adição a p21 (116899) e PCNA, o complexo ciclina A e quinase inclui uma proteína de 19 quilodáltons (p19, ou SKP1; 601404) e uma proteína de 45 quilo-dáltons (p45, ou SKP2).} A sub-regulação de FOXP3 por pequenos RNA de interferância em células epiteliais mamárias humanas levaram ao aumento da expressão de SKP2. Ensaios de genes repórteres (genes que se comunicam?que estão próxmos?) revelaram que a Foxp3 do camundongo interagiu diretamente com um promotor reprimido de Skp2. Análises de mais de duzentas amostras de cânceres de mama primários revelaram uma correlação inversa entre os níveis de FOXP3 e SKP2. Zuo e outros (2007) concluíram que FOXP3 é um repressor transcriocional de SKP2.}


ESTRUTURA DO GENE

Brunkow e outros (2001) determinaram que os genes FOXP3 do camundongo e o humano contém 11 éxons codificadores. Os limites entre éxons e íntrons são idênticos através das regiões codificadoras dos genes do camundongo e humano.

MAPEAMENTO


Por análise de seqüência genômica, Chatila e outros (2000) mapearam o gene FOXP3 no cromossomo Xp11.23.


GENÉTICA MOLECULAR


Chatila e outos (2000), os quais referiram-se ao gene FOXP3 como JM2, identificaram-no por abordagem de candidatos à posição como sítios aceitáveis de mutações na desordem que eles referiam-se como síndrome da desregulagem alérgica auto-imune (XLAAD) e conhecida por outros como IPEX (304790). Chatila e outros detectaram uma mutação no gene FOXP3 em dois parentes não relacionados.

Wildin e outros (2001) seqüenciaram o gene FOXP3 humano para determinar se a síndrome ligada ao X da imunodesregulação, poliendocrinopatia, e enteropatia (IPEX) {patologia no intestino e no fígado?} é o equivalente humano do camundongo descamado. Eles identificaram uma nova mutação em cada probando (o paciente ou membro da família que a coloca em estudo) de quatro famílias com IPEX. Cada mutação afetava o domínio de cabeça em garfo/hélice em asas da proteína caspina (scurfin), indicando que as mutações podem romper interações críticas no DNA. Em uma quinta família estudada por Wildin e outros (2001) no qual uma forma variante de IPEX mapeou em uma região peri-centromérica do cromossomo X, nenhuma mutação no gene FOXP3 foi encontrada. Um estabelecimento de idade mais tardia, crescendo e empalidecendo no curso clínico, e ocasionalmente compatibilizando com sobreviventes prolongados tem sido noticiada nesta família (Powell e outros, 1982). Isso contrasta com o curso inicial e incessante da doença visto em outras famílias. Wildin e outros (2001) sugeriram que esta quinta família pode abrigar uma mutação não codificadora em FOXP3 que afeta a regulação transcricional ou o splicing do RNA, resultando em um fenótipo médio, dependente do meio ambiente.

Bennett e outros (2001) também identificaram mutações no gene FOXP3 em pacientes IPEX. Eles compararam as mutações em FOXP3 com aquelas em FOXE1 (602617) as quais resultam uma síndrome da tiróide sem geração, e com aquelas no FOXC1 as quais causam má formação do segmento anterior do olho (anomalia de Axenfeld-Rieger).

Bassuny e outros (2003) investigaram o gene FOXP3 com um candidato para a suscetibilidade ao diabetes de tipo I de lócus IDDMX (300136 – diabetes melitus – Xp11). Eles sondaram o gene FOXP3 para micro-satélite e polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) e executaram um estudo de associação entre o gene e o diabetes de tipo I na população japonesa. Um polimorfismo de micro-satélite, (GT)n, foi identificado no íntron O, e uma alelo (GT)15 apresentou uma significativa freqüência mais alta em pacientes com o diabetes de tipo I do que os controles (43,1% versus 32,6%, P=0,0027). A avaliação da atividade promotor/incentivador do polimorfismo (GT)n foi efetuada por ensaio de repórter de luciferase (enzima presentes em determinados organismos luminosos que desencadeiam a oxidação da luciferina que, por sua vez, produzem bioluminescência) dupla. Ima significante diferença na atividade incentivadora entre as repetições dos dinucleotídeos (GT)15 e (GT)16 foi detectada.


Owen e outros (2003) estudaram dois parentes (21 sujeitos no total) com quatro crianças do sexo masculino (três falecidos) e uma menina afetada por IPEX. Em uma das famílias eles encontraram uma nova mutação de tipo sem registro no gene FOXP3. Na segunda família, o lócus de FOXP3 era excluído por recombinação, e nenhuma mutação no FOXP3 foi encontrada. Eles concluíram que seus dados proporcionaram evidência para um lócus autossômico não ligado (ao X), sugerindo heterogeneidade genética.


Bacchetta e outros (2006) estudaram o fenótipo e a função das células T CD4 positivas in vitro e células Tregs CD4-positivas/CD25 (altas) em quatro crianças com IPEX. Análises de citrometria de fluxo demonstraram que a distribuição e expressão de vários marcadores de células T eram comparáveis entre pacientes e doadores normais de controle. As células Tregs dos pacientes mostraram diferentes graus de atividade supressora dependendo da mutação de FOXP3, mas nenhuma das células dos pacientes pode suprimir as células autólogas respondedoras. O defeito foi depois superado com a expansão das células Treg in vitro. Dos quatro pacientes com IPEX, somente 1, que tinha uma mutação no códon 1 que resultava na não expressão da proteína, tinha a transcrição ou tradução de FOXP3 diminuída. Todos os pacientes tinham respostas proliferativas após a estimulação do receptor de célula T (TCR), mas eles não eram capazes de produzir IL2 ou IFNG. Bacchetta e outros (2006) concluíram que as células Treg podem estar presentes em números normais em pacientes com IPEX, mas sua capacidade de suprimir está diminuída dependendo do tipo da mutação, da força do estímulo do TCR, e do genótipo das células T efetoras.



MODELO ANIMAL


Descamação (sf=scurfy) é uma mutação recessiva ligada ao X no camundongo que resulta em letalidade em indivíduos do sexo masculino hemizigotos com 16 a 25 dias após o nascimento, e é caracterizada por sobre-proliferação dos linfócitos T CD4+/CD8-, extensiva infiltração em múltiplos órgãos, e elevação do número de citocinas (Lyon e outros, 1990; Clark e outros ,1999).


Em camundongos expressando o gene Foxp3, Khatti e outros (2001) observaram menos células T. Essas células T remanescentes tiveram respostas proliferativas e citolíticas pobres e pobre produção de IL2, embora o desenvolvimento no timo parecesse normal. Análises histológicas mostraram que os órgãos linfóides periféricos, particularmente os linfonodos, estavam relativamente acelulares. Khatti e outros (2001) concluíram que a atividade excessiva da caspina (scurfin) leva a um estado hipoativo, sugerindo que a caspina (scurfin) atua como um regulador central da atividade das células T.

Através da geração de camundongos deficientes em Foxp3, Fontenot e outros (2003) mostraram que a Foxp3 é requerida para o desenvolvimento de células T regulatórias CD4-positivas/CD25-positivas. Em adição, a síndrome autoimune linfoproliferativa similar a IPEX observada em camundongos Foxp3 -/- resultou de uma deficiência nessas célula T regulatórias. Os autores acharam que a expressão ectópica (fora do lugar) de Foxp3 ativou uma função supressora nas células T CD4-positivas/CD25-negativas. Independentemente, Khattri e outros (2003) e Hori e outros (2003) alcançaram conclusões similares.


Wan e Flavell (2007) notaram que indivíduos com doenças de enxerto-versus-hospedeiro, miastenia grave (veja omim 254200) {distúrbio da transmissão neuromuscular caracterizado por fraqueza (miastenia) e fadiga variáveis de alguns músculos voluntários. Dic Stedman}, e esclerose múltipla tem expressão diminuída de FOXP3. Eles geraram um modelo de camundongo no qual a expressão endógena de Foxp3 era atenuada nas células Tr (T regulatórias). Esses camundongos nasceram em uma proporção mendeliana. Fêmeas heterozigóticas eram férteis e fenotipicamente normais, mas machos hemizigotos eram estéreis e anões (os machos são hemizigotos para os genes X e Y porque estes genes não são emparelhados). A maioria dos machos desenvolveu escamação na pele, e quase todos desenvolveram uma condição parecida com blefarite (inflamação das pálpebras). Todos os machos mutantes morreram aos três meses de idade devido a uma agressiva síndrome auto-imune linfoproliferativa, incluindo aumento drástico de auto-anticorpos no soro; entretanto, o desenvolvimento no (do) timo não foi afetado. As atividades imunossupressoras das células T com expressão atenuada de Foxp3 eram quase abolidas in vitro e in vivo, uma vez que sua anergia in vitro era mantida, incluindo desenvolvimento preferencial em células efetoras de tipo Th2 ainda que num ambiente de polarização de células Th-1. Wan e Flavell (2007) concluíram que a expressão diminuída de FOXP3 causa doença imune pela subversão da função supressora das células Tr e convertendo células Tr em células efetoras.


Gavin e outros (2007) estudaram células T do camundongo que transcreveram um alelo nulo para Foxp3 ativamente, mas careciam da proteína Foxp3. Usando análises citométricas de fluxo e de micro-série, eles encontraram que, embora a função de Foxp3 fosse requerida para atividade T regulatória supressora da célula, Foxp3 largamente amplificou e fixou feições moleculares pré-existentes das células Tr. Além disso, a Foxp3 solidificou a estabilidade da linhagem de células Tr por modificar a superfície celular e moléculas de sinalização, incluindo a repressão da fosfodiesterase-3b (PDE3B) dependente de Foxp3. A introdução de PDE3B nas células Tr e a transferência dessas células para camundongos deficientes em células T substancialmente reduziu o número de células Tr. Gavin e outros (2007) propuseram que a expressão reduzida de PDE3B pode ser um marcador único para células Tr.


Para determinar se a disfunção ou falta das células Treg está etiologicamente envolvida na patogênese do camundongo descamado e seu correlato humano, IPEX, Lahl e outros (2007) geraram camundongos transgênicos BAC chamados camundongos de “esgotamento das células T regulatórias” (DEREG) expressando um receptor de toxina da difteria aumentado com a fusão da proteína fluorescente verde sob controle de Foxp3. A injeção da toxina da difteria permitiu a detecção seletiva e eficiente e a depleção (esgotamento) induzível de células Treg Foxp3-positivas sem afetar as células T efetoras Cd25-positivas. Análises histopatológicas mostraram que a injeção da toxina da difteria em camundongos DEREG recém-nascidos removeram as células Treg e levaram ao desenvolvimento de sintomas semelhantes à descamação com aumento do baço, linfadenopatia (qualquer processo patológico que afeta os linfonodos), insulite (inflamação das ilhotas de Langerhans, com infiltração linfocítica, que pode resultar da infecção por vírus e constituir a lesão inicial do diabetes dependente de insulina; dic.Stedman), e severa inflamação da pele. Lahl e outros (2007) concluíram que a ausência das células Treg Foxp3 positivas é suficiente para induzir um fenótipo semelhante à descamação.

Lund e outros (2008) examinaram um papel para as células T regulatórias (Tregs) na infecção da mucosa pelo vírus herpes simplex usando camundongos Foxp3 ativos (knock-in) trazendo sub-conjuntos de Tregs etiquetadas com ambos os receptores da proteína fluorescente verde (GFP) ou da toxina da difteria. Eles observaram uma infecção fatal acelerada com aumento da carga viral na mucosa e no sistema nervoso central após a remoção (ablação, sumiço) das Tregs. Embora a produção aumentada da produção do interferão fosse detectada em linfonodos drenantes nos camundongos deprimidos em Tregs, esta (produção) foi profundamente reduzida no sítio de infecção. Isso foi associado com um atraso na chegada das células natural killer (NK), células dendríticas, e células T para o sítio da infecção e um aumento repentino nos níveis de quimiocinas pró-inflamatórias nos linfonodos drenantes. Lund e outros (2008) concluíram que as Tregs facilitam respostas protetoras primárias para o local da infecção viral por permitir uma entrada oportuna (apropriada) das células imunes dentro de tecidos infectados.

TERAPIA GÊNICA: ENGENHARIA MOLECULAR DO FATOR VIII E DO FATOR IX

Fonte: Gene Therapy: molecular engineering of factor VIII and factor IX.
David Lillicrap
In: Textbook of Hemophilia
Edited by Christine A. Lee, Erik E. Berntorp & W. Reith Hoots

RESUMO

O quanto mais nos movemos em direção à era do tratamento genético para a hemofilia, um número de desafios permanecem por ser superados antes de podermos afirmar o sucesso dessas novas abordagens terapêuticas. Embora significativos progressos tenham sido realizados nos termos de testes pré-clínicos da terapia genética para a hemofilia, com o tratamento de sucesso de longo prazo para camundongos e alguns cães hemofílicos, nenhuma melhora fenotípica sustentada foi completada até agora na hemofilia humana. Dois principais obstáculos continuam como uma praga neste campo: a falta de um sistema no qual níveis do fator de coagulação terapêuticos de longo prazo sejam expressados a partir de um trans-gene, e o potencial de incitação da resposta imune ao produto do trans-gene.

CONSEQÜÊNCIAS DAS ESTRATÉGIAS EM GERAL PARA MELHORAR A TERAPIA GÊNICA PARA HEMOFILIA

A despeito do fato de que o conceito de terapia genética substitutiva seja simples, existem, não surpreendentemente, muitas complexidades relacionadas à efetiva entrega e expressão dos trans-genes do fator de coagulação. Assim, enquanto este capítulo enfatizará os benefícios potenciais da modificação do produto trans-gênico por si mesmo, outras abordagens para aumentar a eficácia e a segurança da terapia gênica para a hemofilia também estão sendo desenvolvidas. Isto inclui a investigação de vários sistemas de entrega virais e não-virais, a avaliação dos diferentes sorotipos virais para melhorar as eficiências de transdução (transferência de DNA), e a geração de novos cassetes de expressão do trans-gene e restringí‑los a tecidos de seleção limitada. Embora todas essas abordagens tenham o objetivo comum de melhorar o nível de expressão do trans-gene, e limitar a resposta imunológica ao produto do trans-gene, existem evidências crescentes que indicam que cada combinação de vetor, expressão do cassete (deve ser a fita de DNA com promotor), e trans-gene pode ter seu próprio conjunto distinto de vantagens e limitações.

NOVOS FATORES PARA A TERAPIA GENÉTICA E PRODUÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Embora a possibilidade de intensificação da terapia gênica para a hemofilia através do desenvolvimento de novas moléculas dos fatores VIII (FVIII) e IX (FIX) terem-se tornado um objetivo realizável e excitante, é importante reconhecer que essas mesmas moléculas podem encontrar sua utilização inicial como proteínas recombinantes para terapia de reposição de rotina. O desenvolvimento recente de concentrados de fatores de coagulação recombinante que não têm contato com outras proteínas derivadas do organismo humano, tanto durante a expressão da célula em cultura ou no final da formulação, tem essencialmente removido totalmente o risco virtual de transmissão de agentes infecciosos que continuaram a existir com os concentrados recombinantes das primeira e segunda gerações. Assim, com a avaliabilidade de concentrados muito seguros e puros, o próximo desafio biotecnológico tem sido melhorar o trabalho da natureza e desenvolver moléculas de fator de coagulação com características biológicas e farmacêuticas aumentadas. Existe toda razão para crer que o desenvolvimento dessas proteínas ocorrerá em paralelo para o uso de ambos os protocolos de reposição de proteína e terapia genética.

CARACTERÍSTICAS DA MOLÉCULA PERFEITA DO FATOR DE COAGULAÇÃO

Assim como o desenvolvimento do FVIII recombinante representa um dos primeiros triunfos da tecnologia do cDNA recombinante, existe agora um otimismo crescente de que a engenharia genética possa melhorar no potencial terapêutico dos fatores de coagulação nativos. Conseguir desenvolver proteínas de coagulação com propriedades biológicas aumentadas pressupõe que nós conhecemos o bastante a respeito das relações estruturais e funcionais dessas proteínas para saber como engenheirar estruturas melhoradas. Certamente, nosso conhecimento sobre as estruturas e funções do FVIII e FIX têm progredido notavelmente nas duas décadas passadas, mas nós ainda estamos algo distantes de um completo entendimento dos detalhes estruturais dessas proteínas. Ainda não existe uma estrutura em cristal completa para o FVIII, o papel do domínio B do FVIII (se algum existe) permanece obscuro, e a função precisa de co-fator proporcionada pelo FVIII intrínseca ao complexo tenase ainda não está resolvido. Assim, enquanto algumas tentativas racionais possam ser feitas para melhorar a síntese e as propriedades hemostáticas dessas proteínas, ainda existem algumas complexidades da estrutura que escapam ao nosso entendimento.

EFICIÊNCIA BIOSSINTÉTICA MELHORADA

A primeira área onde reforços têm sido feitos para melhorar essas proteínas são relacionados a mudanças que deverão aumentar a eficiência da biossíntese do fator de coagulação. Ambos o FVIII e FIX submetem-se a um complexo processamento após a tradução (do DNA para o mRNA precursor) e etapas que se seguem à síntese inicial, e existe boa evidência que indica que a eficiência e a precisão desse processo é essencial para o ótimo funcionamento da proteína. Além disso, enquanto modificações tais como a sulfatização do FVIII são requeridas para a atividade funcional plena, interações da proteína nascente com moléculas acompanhantes (chaperones) no retículo endoplasmático regulam a secreção da proteína em um modelo ainda incompletamente compreendido. A geração de linhagens de células que facilitam esses processos ou moléculas recombinantes por engenharia que têm mais qualidade de eficiência biossintética são abordagens biotecnológicas que têm sido realmente perseguidas com algum sucesso.

ATIVIDADE ESPECÍFICA AUMENTADA

A segunda característica funcional que tem atraído a atenção biotecnológica é o potencial de geração de moléculas com atividade pró-coagulante aumentada. Existe uma variedade de abordagens para perseguir tal objetivo, duas das mais eficientes parecem ser o potencial de comparação de seqüências protéicas a partir de outras espécies na qual a atividade hemostática aumentada está observada (isto é, o FVIII canino no qual a atividade de FVIII no plasma é aproximadamente oito vezes mais alta do que nos humanos) ou uma estratégia de substituição de domínios homólogos ou resíduos de proteínas relacionadas.

ESTABILIDADE MELHORADA DA PROTEÍNA

Um significativo problema na entrega de níveis adequados de FVIII para um efeito terapêutico é a extrema instabilidade da proteína. Assim, estratégias para estabilizar a estrutura do FVIIII circulante, e para inibir sua esvaziamento através de proteólise pela proteína C, têm recebido a atenção recente na tentativa de prolongar o seu tempo de vida no plasma.

SOBREVIVÊNCIA INTRA-VASCULAR PROLONGADA

As médias de tempo de vida do FVIII e FIX na circulação são de 12 e 24 horas respectivamente. Assim, regimes profiláticos efetivos para infusão de FVIII têm sido pensados, até muito recentemente, por requererem a administração de tratamentos três vezes por semana. A profilaxia di FIX pode ser administrada duas vezes por semana. Entretanto, o potencial para estender a meia-vida natural das proteínas poderia proporcionar a oportunidade para infusões menos freqüentes da proteína ou, no contexto da terapia gênica, resultaria numa menor requisição da expressão do trans-gene. O conceito tem sido significativamente apoiado pela recente elucidação de um mecanismo de remoção para o FVIII envolvendo duas proteínas amplamente expressadas na superfície celular, as proteínas relacionadas aos receptores de lipoproteína de baixa densidade e proteoglicanos de sulfato de heparan. A interferência com esta via catabólica, a qual também é responsável pela remoção do FIXa, tem sido mostrada por estender a meia-vida do FVIII circulante em experimentos com animais, e assim proporciona uma estratégia potencial para melhorar o protocolo de entrega do FVIII.

IMUNOGENICIDADE REDUZIDA

O desenvolvimento de anticorpos neutralizantes para o FVIII em aproximadamente 25% dos pacientes tratados continua a representar um desafio crítico para o tratamento seguro e efetivo da hemofilia A. A incidência de inibidores na população co hemofilia B é significativamente menor, de aproximadamente 3%. A base molecular para esses eventos imunológicos é discutida em detalhes em outro lugar neste livro, mas é suficiente dizer que os inibidores parecem representar respostas oligoclonais para múltiplos epítopos dentro de domínios específicos da proteína FVIII. Ao longo do tempo, o padrão de reatividade contra estes epítopos pode mudar. Dada esta informação, esforços têm sido feitos para reduzir a imunogenicidade do FVIII através da substituição das regiões ou resíduos de proteínas nativas que parecem ser epítopos imunodominantes.

APERFEIÇOAMENTOS BIOTECNOLÓGICOS DO FATOR VIII

Novas Proteínas do Fator VIII avaliáveis correntemente.

A primeira proteína do FVIII alterada geneticamente, ReFacto, tem sido agora difudida em uso clínico por vários anos. Este produto tem sido gerado sem o domínio B do FVIII, uma região da proteína que é funcionalmente dispensável, ao menos quanto ao que concerne à função concebida do fator VIII. A remoção do domínio B proporciona uma vantagem na biossíntese dessa forma de molécula devido ao aperfeiçoamento da expressão do mRNA do FVIII e, com muito extensão, na secreção melhorada da proteína. Após extensiva avaliação clínica, existe indicação geral de que esta molécula funciona normalmente como um co-fator pró-coagulante, e que ela não é mais imunogênica do que a lente (extensão) total da molécula de FVIII. Entretanto, a molécula com o domínio B deletado (BDD) produz resultados diferentes em ensaios “in vitro” da atividade funcional de FVIII, um fenômeno que tem causado significativa confusão no cenário clínico. Os resultados de ensaios de um estágio com o FVIII BDD podem estar mais baixos que 50% daqueles obtidos com ensaio de FVIII cromogênico. Enquanto o mecanismo para esta discrepância permanece não resolvido, os conteúdos de fosfolipídios do ensaio de um estágio é um dos fatores de influência.
Até agora, a maioria dos estudos de terapia genética tem utilizado a forma BDD do FVIII para tomar vantagem em ambas as melhoras na biossíntese e eficiência associadas com esta molécula e a facilidade do empacotamento do cDNA de um FVIII menor. Entretanto, estudos mais recentes sugerem que a deleção completa do domínio B pode não ser o processo mais efetivo de otimização da secreção do FVIII, e moléculas estão sendo correntemente geradas que têm deleções parciais do domínio B combinadas com mutações que interferem com a ligação do FVIII a chaperones (acompanhantes) tais como proteínas de ligação a imunoglobulinas.

Aumento da Atividade Específica do Co-fator FVIII

Enquanto os detalhes precisos da função do c-fator pró-coagulante de FVIII permanecem por ser elucidadas, o produto de sua atividade pode ser avaliado adequadamente com ensaios de funcionamento do FVIII. Usando estes ensaios e a mensuração dos antígenos de FVIII, a atividade específica de co-fator do FVIII derivada de algumas outras espécies, tal como os cães, pode ser documentada por ser várias vezes mais alta do que a do FVIII humano. Essa observação proporciona o potencial, através de comparações seqüenciais, para desenvolver moléculas de FVIII co função hemostática acrescida. Entretanto, sem mais conhecimento estrutural preciso da função de co-fator da proteína, essa estratégia provavelmente tomará uma considerável quantidade de tempo e efeito para ser produzida.

Terapia Gênica para os Fatores VIII e IX (continuação)

ESTABILIDADE MELHORADA DO FATOR VIII


Após a ativação proteolítica pela trombina, o heterodímero de FVIIIa (FVIII ativado) é rapidamene inativado através de dois processos distintos: uma dissociação espontânea do domínio A2 e a clivagem proteolítica do FVIII por uma proteína C ativada. Na luz da instabilidade do FVIIIa, tentativas tem sido feitas para gerar moléculas estáveis que mantenham a atividade do co-fator por períodos de tempo mais sustentados. Até o presente, duas moléculas assim têm sido produzidas e avaliadas.
{OBS.: O FVIII possui 26 éxons dos quais 24 variam sua extensão em 69 a 262 pares de bases; os éxons maiores são o 14 e o 26. A proteína precursora após splicing tem 2351 aminoácidos. A proteína circulante é dividida em duas cadeias, a pesada e a leve, cada uma constitui um monômero. Da cadeia pesada, fazem parte os domínios A1, A2 e o domínio B. A segunda cadeia é composta pelos domínios A3, C1 e C2. O esquema representativo simplificado é A1-A2- B//A3-C1-C2. }
A primeira forma resistente à inativação do FVIII referida como molécula IR8), envolve a deleção dos resíduos 794-1689 (do aminoácido 794 ao 1689), tanto que o domínio A2 é covalentemente associado à cadeia leve, então impedindo a dissociação espontânea do domínio A2. A molécula IR8 também contém mutações sem sentido {OBS.: que muda o código de um aminoácido para um códon finalizador, em que o polipeptídio perde o segmento no terminal carboxila. T. A Brown} nos sítios de clivagem por trombina e pela proteína C ativada para inibir a inativação proteolítica. Após a expressão em células COS-1, a atividade específica de IR8 foi 5 vezes mais alta do que a do FVIII de tipo selvagem, e a IR8 reteve 38% do pico de atividade co-fatora quatro horas após a exposição à trombina “in vitro”, em contraste com a proteína de tipo selvagem, a qual foi desativada após 10 minutos. Desafortunadamente, enquanto a dissociação espontânea do domínio A2 é impedida pela construção IR8 e a inativação proteolítica é reduzida significativamente, essa molécula também demonstra ligação reduzida em 10 vezes com o fator von Willebrand (vWF) a não ser que a cadeia leve de anticorpo anti-FVIII seja introduzida dentro do sistema.
{OBS.: Tendo em mente as cadeias pesada e leve do FVIII: A1-A2-B//A3-C1-C2, o FVIII possui sítios de interação com trombina em A1,A2,A3 E C2 e sítios para vWF em A3 e em C2 (três sítios); tem sítios para FX e FXa nos domínios A1, A2 e C2. O sítio de clivagem por FXa no terminal carboxila do domínio A1 (arg 336) coincide com a inativação relacionada ao sítio de clivagem por APC (proteína C ativada) e por FIXa. Outros sítios de clivagem por proteína C ativada e por FIXa estão respectivamente em arg 562 e arg 1719. Os fatores VIII e V são glicoproteínas homólogas que servem como co-fatores para a ativação proteolítica de FX e protrombina, respectivamente. Eles têm a organização conservada dos domínios A1,A2,B,A3,C1 E C2. Os domínios A dos fatores V e VIII são homólogos ao domínio A da proteína do plasma de ligação a cobre ceruloplasmina. O cobre tem sido detectado em FVIII e sua presença está associada a sua atividade funcional. Enquanto as seqüências de aminoácidos dos domínios A e C são 40% idênticas entre os fatores V e VIII, existe somente uma limitada homologia entre os seus domínios B. Entretanto, os domínios B de ambas as proteínas tem conservadas as adições de grande número de oligossacarídeos ligados a aspargina assim como grande número de oligossacarídeos ligados a serina/treonina (aminoácidos que contém grupos sulfato), sugerindo que o carbo-hidrato tem um papel na função dos co-fatores.
Os fatores VIII e V também têm um padrão conservado de ligações dissulfeto (sulf é prefixo de enxofre), qualquer substância que esteja ligada ou tenha enxofre ligado nela) nas quais duas ligações dissulfeto ocorrem nos domínios A1 e A2, onde somente o pequeno laço dissulfeto está presente em seus domínios A3 (acho que os domínios A1 e A2 se ligam com A3 por pontes dissulfídicas). Em adição, cada domínio C nos fatores V e VIII conte, uma ligação dissulfeto. Existe um número de resíduos de cisteínas não ligadas por dissulfeto dentro do fator VIII. A formação de ligações dissulfeto ocorre no ambiente oxidante do Retículo Endoplasmático (ER) e é possível que chaperones (acompanhantes) como a proteína dissulfeto isomerase sejam importantes para assegurar a formação de ligação dissulfeto corretamente e que a troca ocorra antes da saída do RE. Fonte: Capítulo 2 do Livro Textbook of Hemophilia, por Randal J. Kaufman.}
A segunda forma estabilizada de FVIII a ser gerada de novo envolve a associação covalente do domínio A2 à cadeia leve do FVIII. Nesse exemplo, uma molécula de FVIII contendo cisteína em 664 e em 1826 foi gerada para ligar os domínios A2 e A3 por via da ligação dissulfeto. Essa molécula é ativada normalmente pela trombina “in vitro”, e retém mais de 90% de sua função co-fatora num tempo em que o FVIII de tipo selvagem apresenta menos de 10% da atividade.

PROLONGAMENTO DA SOBREVIVÊNCIA INTRA-VASCULAR DO FATOR VIII

Estudos noticiados em 1999 por dois laboratórios têm mostrado que o catabolismo de FVIII é mediado, ao menos em parte, pela remoção de proteína através de uma interação com a proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP), uma interação que é facilitada pelos proteoglicanos de sulfato de heparan na superfície celular (HSPGs). A caracterização dos LRP como receptores catabólicos para FVIII representa a primeira documentação da via de limpeza (remoção), e embora o LRP também atue como um receptor para muitos outros ligantes, existe realmente evidências “in vivo” que sustentam um papel fisiológico para o receptor na remoção do FVIII. Com essa informação como base de conhecimento, existem novos projetos em progresso para desenvolver moléculas de FVIII que evadam dessa interação com LRP e assim alcancem uma circulação de tempo prolongado para a proteína.
Três sítios de ligação a LRP têm sido documentados até agora na molécula FVIII: uma região do domínio A2 entre os resíduos 484 e 509, um segundo sítio entre os resíduos 1811 a 1818 no domínio A3, e uma terceira região no extremo terminal C do domínio C2 entre os resíduos 2.303 e 2.332. Um único sítio para ligação a HSPG tem sido documentado no domínio A2. Enquanto o bloqueio da interação de FVIII com LRP tem sido mostrado por prolongar a meia-vida da circulação do FVIII, a geração de novas variantes do FVIII nas quais as interações com LRP são bloqueadas comprovarão o desafio, não menos porque os sítios de ligação a LRP coincidem com região de proteína que ligam-se outros ligantes fisiológicos importantes como FIXa, vWF e fosfolipídios. Finalmente, dependendo do sucesso dessa estratégia, outra complicação de longo termo desta abordagem pode ser a geração de um elevado nível plasmático de FVIII crônico, um fenômeno agora reconhecido como um fator de risco para doenças tromboembólicas.

REDUÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DO FATOR VIII

Comentários gerais concernindo à imunogenicidade do Fator VIII.

O desenvolvimento de inibidores neutralizantes para o fator VIII em aproximadamente 25% dos pacientes de hemofilia A tratados é a conseqüência de um número de fatores, alguns dos quais são moderadamente bem compreendidos e alguns dos quais continuam a nos iludir. Existe agora muito boa evidência que indica que os genótipos de FVIII nulo estão associados com um risco mais alto para geração de inibidores, que também existe uma influência de um número de fatores relacionados ao tratamento, incluindo o tipo de concentrado do FVIII, a intensidade do tratamento, e a co-existência de um estado inflamatório. A mais pertinente dessas discussões é o potencial para alteração da imunogenicidade do FVIII através da introdução de novas mudanças nas seqüências. Existem verdadeiros precedentes para uma uma incidência aumentada de desenvolvimento de inibidores em pacientes tratados com diferentes formas de concentrado derivado do plasma, e, embora não haja uma clara diferença entre a imunogenicidade da maioria dos concentrados derivado do plasma ou recombinantes, existe ainda algum debate sobre essa matéria. A incidência do desenvolvimento de inibidores com o concentrado de domínio B deletado (BDD), ReFacto, parece muito similar a de todos os outros produtos de FVIII.
Com essa base de conhecimentos, está claro que o uso da biotecnologia para criar novas formas de FVIII pode resultar em três conseqüências muito diferentes: uma proteína FVIII com um perfil antigênico similar ao da proteína de tipo selvagem, ou uma nova proteína com ambas as antigenicidades aumentada e diminuída. De fato, uma vez que alguma característica funcional aumentada de FVIII bio-engenheirado pode ser fácil de ser avaliada, o potencial para incitar a formação do inibidor pode ser consideravelmente mais difícil de avaliar.

O DESENVOLVIMENTO DE MOLÉCULAS DE FVIII COM IMUNOGENICIDADE REDUZIDA

Uma quantidade considerável tem sido aprendida sobre os detalhes da resposta imunológica para o FVIII nas duas décadas passadas. Mais importante, a partir do ponto de vista da geração de moléculas com imunogenicidade reduzida, nós agora temos extensa informação relacionada aos epítopos de células B na molécula de FVIII. Os epítopos imunodominantes principais parecem estar localizados do domínio A2 ao domínio C2 da proteína, com as ligações para anticorpos a estes sítios neutralizando FVIII através de mecanismos que incluem a inibição da ligação a FIXa e aos fosfolipídios. Uma terceira, um tanto menos imunorreativa, região da proteína existe no domínio A3.
A estratégia básica para redução da imunogenicidade para o FVIII tem sido introduzir seqüências derivadas do FVIII de outras espécies (porco), as quais não afetam adversamente a função do co-fator mas parecem ser menos antigênicas do que os resíduos correspondentes humanos. Entretanto, enquanto essas moléculas demonstram reduzida atividade cruzada com muitos aloanticorpos (anticorpos para antígenos alógenos) humanos, ainda não está claro como elas serão toleradas pelo sistema imune “in vivo”.
Àparte do potencial de uso de novas formas engenheiradas do FVIII para reduzir a imunogenicidade para esta proteína, existe realmente alguma evidência para sugerir que a terapia genética do FVIII em si mesma poderia ser um método efetivo de indução da tolerância imunológica para o FVIII. O sucesso dessas abordagens será aceitável dependendo do número de fatores, incluindo o sítio e a magnitude da expressão do trans-gene, mas neste estágio do desenvolvimento da terapia genética da hemofilia, existe razão para ser otimista em que esta estratégia proporcionará em última análise uma alternativa para os protocolos de indução de tolerância.

APERFEIÇOAMENTO TECNOLÓGICO DO FATOR IX

Possivelmente devido à reduzida prevalência da hemoflia B, e a mais robusta expressão, meia-vida mais longa, e relativamente mínima imunogenicidade do FIX, tentativas para aumentar a produção e função biológica dessa proteína tem sido limitadas.

Extensiva experiência clínica com o concentrado recombinante de FIX, BeneFIX, tem mostrado que alterações para a modificação pós-transcricional da proteína podem ter significativas conseqüências para o perfil farmacocinético da proteína. Assim, a expressão de trans-genes de FIX a partir de outras células que não os hepatócitos podem estar associadas com limitações similares, e requerem modificações para a proteína trans-gênica superar uma desvantagem biossintética inerente.

A entrega de trans-genes de FIX para o músculo esquelético tem sido comprometida, em alguma extensão, pela ligação de proteínas secretadas para o colágeno IV nos tecidos ao redor. A geração recente de dois FIX mutantes, no códon 5 (de lisina para alanina) e 10 ( de valina para lisina), com reduzida ligação para o colágeno IV tem resultado, num modelo de camundongo hemofílico, em níveis cinco vezes aumentados de FIX circulante e, insuspeitavelmente, um aumento de duas vezes na atividade específica. Similarmente, a entrega do trans-gene de FIX contendo a substituição da arginina pela alanina no códon 338 mediada pelo vetor viral associado à glândula (AAV) tem sido mostrada por resultar em uma proteína com atividade específica sete vezes mais alta. De nota, nenhuma dessas formas variantes do FIX elicitou uma resposta inibidora em camundongos transgênicos tolerantes à forma selvagem do FIX humano.

O FUTURO DA BIOTECNOLOGIA DO FATOR DA COAGULAÇÃO

Existe toda indicação de que o desenvolvimento do FIII e FIX de tipo selvagem recombinantes, e, do FVIII com o domínio B deletado (FVIII BDD), representam somente o início de uma era na qual nós veremos tentativas adicionais para melhoria das proteínas hemostáticas encontradas na natureza. Essas novas proteínas da coagulação verão muito semelhante paralelo no curso do desenvolvimento para uso em reposição de rotina de proteínas exógenas, assim como em testes de terapia genética. Este é o cenário em que as vantagens biossintéticas e funcionais de novas formas de FIII e FIX bio-engenheiradas podem ser o maior benefício como resposta para o problema de longa data dos níveis inadequados de expressão do trans-gene em estudos de terapia genética para a hemofilia. Finalmente, entretanto, como as estruturas da proteína nativa são alteradas para conseguir-se uma função biológica aumentada, sistemas para avaliar o potencial de imunogenicidade dessas novas moléculas serão críticamente importantes se nós estivermos por evitar um aumento da incidência da geração de inibidores.


Fonte: Gene Therapy: molecular engineering of factor VIII and factor IX.
David Lillicrap
In: Textbook of Hemophilia
Edited by Christine A. Lee, Erik E. Berntorp & W. Reith Hoots

605078 TAR DNA-BINDING PROTEIN; TARDBP
TAR DNA-BINDING PROTEIN, 43-KD; TDP43
Gene map locus 1p36.2

(Esta postagem é um exercício de tradução em nível amador .)

Clonagem

HIV-1, o causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), contém um genoma de RNA que produz um DNA integrado no cromossomo durante o ciclo replicativo. A proteína Tat do HIV (veja omim 601409), uma proteína de ativação da trancrição que liga-se à região protuberante de uma estrutura estável de saliência em caule espiralado (laço), TAR RNA, ativa o longo terminal de repetição (LTR) do HIV-1. A Tat ativa o LTR com menos eficiência em células de roedores do que nas células humanas, sugerindo que as proteínas celulares de ligação ao RNA também estão envolvidas na regulação da replicação do HIV. A TAR RNA pode ter em si elementos regulatórios diferentes que atuam num papel modulatório da expressão do gene do HIV-1. Para caracterizar fatores celulares que ligam-se a TAR DNA, Ou e outros (1995) verificaram uma biblioteca de células HeLa (células de carcinoma cervical que são usadas na cultura de vírus) usando uma sonda de TAR RNA e identificaram um cDNA codificando uma proteína de ligação a TAR DNA de 43 quilo-dáltons, TARDBP, a qual eles denominaram TDP43. A TARDBP deduzida em 43 quilo-dáltons contém um domínio de ligação a ribonucleoproteína (RNP) e uma região rica em glicina. Análises de Northern blot (RNA e proeínas) detectaram um transcrito de 2,8 quilo-bases ubíquamente expressado. Análises com SDS-PAGE (acho que é um programa de computador) mostraram que a TARDBP nativa e a recombinante são expressadas como proteínas de 43 quilo-dáltons.


Por análises de bancos de dados e clonagem de cDNA, Wang e outros (2004) determinaram que o gene TARDBP gera ao menos 11 espécies de mRNA por splicing alternativo. O menor transcrito codifica proteínas faltando o domínio rico em glicina, o qual é requerido para a atividade de saltador de éxons de TARDBP.

FUNÇÃO DO GENE

Análises funcionais por Ou e outros (1995) indicaram que a TARDBP não se liga a RNA. Análises de abrandamento em gel seguidas por análises de Western blot {para proteínas}(análises de transferência Western) demonstraram que os motivos de ligação a ribonucleoproteínas de TARDBP ligam-se a motivos ricos em pirimidina de TAR DNA. Uma análise de transcrição “in vitro”, aumentando as quantidades de TARDBP, na presença ou ausência de Tat, diminuíram o nível de transcrição a partir do LTR do HIV-1 mas não a partir do principal promotor de adenovírus tardio.

Usando plasmídios informantes, Wang e outros (2004) determinaram que a deleção do domínio rico em glicina da TARDNP do camundongo resultou em perda de aproximadamente 90% de sua habilidade para ativar o saltador de éxon no gene CFTR.

Mutações no splicing de RNA no gene CFTR são pensadas por levar à disfunção de vários órgãos como pulmões, glândulas sudoríferas, trato genital, intestino e pâncreas, produzindo um complexo de sintomas de fibrose cística (219700). Buratti e outros (2001) mostraram que TDP43 promove o saltamento do éxon 9 do gene CFTR por ligação específica a seqüência de repetição UG no íntron 8 do pré-mRNA de CFTR. Buratti e Baralle (2001) noticiaram a caracterização e as implicações funcionais das propriedades de ligação a RNA de TDP43. Wang e outros (2004) descobriram que a TDP43 do camundongo homóloga à humana também inibe o processo de splicing no éxon 9 do CFTR humano num sistema de mini-gene. Buratti e outros (2004) descreveram experimentos consistentes com o modelo no qual as repetições TG no íntron 8 de CFTR ligam-se a TDP43, e esta proteína, por seu lado, inibe o splicing do éxon 9. Eles sugeriram que seus resultados proporcionam um mecanismo de explicação para a associação dos dados de Groman e outros (2004) e também uma explicação para a capacidade de penetração de fenótipos variáveis das repetições TG. A variabilidade específica dos tecidos e a variabilidade individual na concentração desses fatores inibidores de splicing pode também determinar se um indivíduo desenvolverá multi-sistêmica (CF não clássica) ou doença mono-sintomática (CBAVD).



Neumann e outros (2006) descobriram que as formas de TDP43 hiper-fosforiladas, ubiquinadas e clivadas, conhecidas como TDP43 patológicas, é a principal perturbação protéica na demência frontotemporal ubiqüitina positiva, tau-, e alfa-sinucleína (omim 163890) negativa (FTLD-U) e na ALS (omim 105400) Esclerose Amiotrofica Lateral (Endurecimento de estruturas nervosas por atrofia lateral?). A assinatura do TDP43 patológico na FTLD-U inclui a presença da falha do terminal-C e /ou a clivagem de produtos migrando com aproximadamente 25 quilo-dáltons, uma variante dos 43 quilo-sáltons, e uma sujeição imunorreativa da TDP43 de alto peso molecular. A TDP43 é normalmente localizada primariamente no núcleo, mas Neumann e outros (2006) sugeriram que, sob condições patológicas em FTDL-U, TDP43 é eliminada do núcleo de neurônios ubiqüinados suportando inclusão, em conseqüência de que pode haver uma perda das funções nucleares de TDP43.



Mackenzie e outros (2007) identificaram inclusões citoplasmáticas nas glias (ou neuróglias: células não neuronais dos sistemas nervosos central e periférico) e nos neurônios imunorreativas para TDP43 em 59 casos de ALS esporádico, 26 casos de ALS com demência, e onze casos de ALS familiar SOD1-negativo. A imunifluorescência confirmou a co-localização de TDP43 e ubiqüitina com as inclusões. Em contraste, TDP43 não foi detectada em nenhum dos 15 pacientes com ALS SOD1 positiva. Os autores sugeriram que esses achados representam mecanismos patogênicos diferentes.

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE - PCR

FONTE:


http://bioisolutions.blogspot.com/2008/07/pcr.html


PCR

A Reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica amplamente usada na biologia molecular. Seu nome deriva de um de seus componentes chave, uma polimerase de DNA usada para amplificar um pedaço de DNA por replicação enzimática “in vitro”. Na progressão da polimerase, o DNA então gerado é usado por si mesmo como um molde para a replicação. Ela põe em movimento uma reação em cadeia na qual o modelo é exponencialmente amplificado. Com o PCR é possível amplificar uma única de várias cópias de um pedaço de DNA através de superando várias ordens de magnitude, gerando milhões ou mais cópias do pedaço de DNA. A PCR pode ser modificada extensivamente para desempenhar uma ampla matriz de manipulações genéticas.

Quase todas as aplicações da PCR empregam uma polymerase de DNA termicamente estável, tais como a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada a partir da bactéria Thermus aquaticus. Essa polimerase de DNA reúne enzimaticamente uma nova fita de DNA a partir de blocos de construção de DNA, os nucleotídeos, usando um DNA de fita singular como molde da síntese de DNA. A vasta maioria dos métodos de PCR usam ciclo térmico, isto é, alternação térmica e resfriamento das amostras de PCR para uma série de etapas definidas por temperatura. Essas etapas térmicas são necessárias para a separação física das fitas (nas temperaturas altas) numa dupla hélice de DNA (DNA fundido) usado como um padrão durante a síntese do DNA (em temperaturas mais baixas) pela DNA polimerase para a amplificação seletiva do DNA alvo. A seletividade do PCR resulta do uso de iniciadores que são complementares à região do DNA alvejado para amplificação sob específicas condições cíclicas térmicas.

Desenvolvida em 1983 por Kary Mullis, a PCR é agora uma técnica comum e freqüentemente usada em pesquisas médicas e biológicas laboratoriais para uma variedade de aplicações. Estas incluem a clonagem de DNA por seqüenciamento, filogenia baseada em DNA, ou análises funcionais dos genes; o diagnóstico de doenças hereditárias, a identificação de impressão digital (usada nas ciências forenses e nos testes de paternidade); e a detecção e diagnóstico de doenças infecciosas.

PRINCÍPIOS E PROCEDIMENTO DO PCR

A PCR é usada para amplificar regiões específicas da fita de DNA (o DNA alvo). Este pode ser um único gene, uma parte de um gene, ou uma seqüência não codificadora de produto genético. A maioria dos métodos de PCR amplificam tipicamente os fragmentos de DNA de mais de 10 quilo bases de pares (dez mil pares de base), embora alguma técnicas permitam a amplificação de fragmentos de quarenta quilo-bases de tamanho (40.000 pares de bases).

Uma composição básica de PCR requer vários componentes e reagentes. Estes componentes incluem:


1)Um molde de DNA que contenha a região do DNA (alvo) a ser amplificado.

2) Dois iniciadores (prímeres), que sejam complementares às regiões fim da linha 5’ (primeiro 5’) e fim da linha 3’ (primeiro 3’) da região do DNA. {Obs.: 5’ é o lado da linha onde fica um grupo fosfato no carbono 5; no DNA, cada nucleotídeo tem uma ponta com um grupo fosfato ligado ao carbono 5 do açúcar que está ligado à base (C,T,A ou G), e no carbono 3, do mesmo açúcar, existe uma hidroxila OH que se liga ao grupo fosfato do açúcar de outra base; isso vai formando uma fila de bases e um DNA de fita singular, ao qual se contrapõe outra fita exatamente inversa, ou seja anti-paralela; uma cadeia sempre tem uma ponta 5 livre e outra 3 livre; a fita de DNA filha é sempre uma cópia no sentido de 5 para 3, mas quando acontece a cópia de DNA para RNA a fita é copiada é a de 3 para 5 e o mRNA sai igual à fita 5’-3’.}

3)A DNA polimerase, tal como a polimerase Taq ou outra polimerase de DNA, em temperatura ótima de 70oC.

4) Desoxinucleosídeos trifosfatos (dNTPs; também comumente e erroneamente chamados desoxinucleotídeos trifosfatos), os blocos de construção a partir dos quais a DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA.

5) Uma solução com tampão {obs.: é uma solução à qual foi acrescentado um tampão; tampão é um ácido e uma base (sal) como H2CO/HCO3- que, quando conjugado numa solução impede a alteração do pH que ocorreria na adição de ácido ou álcali; dessa maneira o pH do sangue e dos líquidos corporais é mantido constante (pH 7,45)}, proporcionando um ambiente químico adequado para a atividade ótima e estabilidade da polimerase de DNA.

6) Cátions divalentes, íons de magnésio ou manganês; geralmente Mg2+ é usado, mas Mn2+ pode ser utilizado para mutagêneses do DNA mediada por PCR, pois concentrações mais altas de Mn2+ aumentam a taxa de erro durante a síntese de DNA.

7) Íons de potássio cátions monovalentes.




O PCR é comumente realizado numa reação de volume de 20-150μl {1µl =10-9 m3 = 1mm3 = 1 milímetro cúbico} em pequenos tubos de reação (volumes entre 0,2 e 0,5 ml = 1/5 e 1/2 cm3 = 200 e 500μl) num ciclo térmico. O ciclo térmico aquece e resfria os tubos de reação para atingir as temperaturas requeridas em cada etapa da reação (veja a seguir). Muitos ciclos térmicos modernos fazem uso do efeito Peltier o qual permite tanto o aquecimento quanto o resfriamento do bloco concebido no tubo de PCR simplesmente por reversão da corrente elétrica. Tubos de reação com paredes finas permitem uma condutividade térmica favorável para permitir o rápido equilíbrio térmico. A maioria dos ciclos térmicos têm tampa aquecida para impedir a condensação no topo do tubo de reação. Ciclos térmicos mais antigos sem a tampa aquecida requerem uma camada de óleo no topo da mistura de reação ou um novelo de cera dentro do tubo.

PROCEDIMENTO

O PCR usualmente consiste de uma série de 20 a 40 alterações de temperatura repetidas chamadas ciclos; cada ciclo consiste tipicamente de 2 a 3 etapas de temperaturas diferentes. O PCR mais comum é realizado com ciclos que têm três etapas de temperatura. A ciclismo é freqüentemente precedido de uma etapa de temperatura única (chamada quente) em uma alta temperatura (>90o), e seguida de uma pressão no final para a expansão do produto final ou breve estocagem. As temperaturas usadas e a extensão de tempo em que são aplicadas em cada ciclo depende da variedade dos parâmetros. Estes incluem a enzima usada para a síntese de DNA, a concentração de íons divalentes de dNTPs na reação, e o desvanecimento da temperatura (Tm) dos iniciadores.

I- Etapa de iniciação: esta etapa consiste de uma reação de calor à temperatura de 94-96oC (ou 98oC se polimerases muito termostáveis forem usadas {obs.: termostável é o que NÃO é facilmente destruído ou alterado pelo calor), a qual é presa por 1 a 0 minutos. Isto só é necessário para polimerases de DNA que requerem ativação por calor por PCR de ativação quente.

II-Etapa de desnaturação: Esta etapa é o primeiro evento de ciclismo regular e consiste no aquecimento da reação a 94-98oC por 20 a 30 segundos. Esta etapa causa a dissolução (descolamento dos pares de base) dos moldes de DNA e dos iniciadores por ruptura das pontes de hidrogênio entre as bases complementares das fitas de DNA, produzindo duas fitas singulares de DNA.

III- Etapa de fixação: A temperatura de reação é reduzida para 50-65oC por 20-40 segundos permitindo o fortalecimento dos iniciadores no molde de DNA de fita única. A temperatura de fortalecimento típica é de aproximadamente 3 a 5 graus Celsius abaixo da Tm usada para os iniciadores. As pontes de hidrogênio estáveis de DNA-DNA só são formadas quando a seqüência iniciadora combina com as seqüências do modelo muito rigidamente. A polimerase liga-se aos moldes dos iniciadores híbridos e começa a síntese de DNA.

IV- Etapa de extensão/alongamento: A temperature nesta etapa depende da polymerase de DNA usada; a polimerase Taq tem sua ótima atividade na temperatura de 75-80oC, e comumente uma temperatura de 72oC é usada com esta enzima. Nesta etapa, a polimerase de DNA sintetiza uma nova fita de DNA complementar à fita de DNA modelo por adição dos dNTPs que são complementares ao modelo na direção 5’ para 3’, condensando o grupo fosfato do carbono 5’ do dNTPs com o grupo hidroxila do carbono 3’ no final da linha nascente (estendendo) a fita de DNA. O tempo de extensão dependa tanto da polimerase de DNA usada quanto da lente do fragmento de DNA a ser amplificado. Como via de regra, em sua temperatura ótima, a polimerase de DNA polimeriza um milhar de bases por minuto. Sob condições ótimas, isto é, se não existirem limitações devido a substratos limitadores ou reagentes, nesta etapa da extensão, a quantidade de DNA alvo é duplicada, levando a uma amplificação exponencial (geométrica) do fragmento de DNA específico.

V- Alongamento final: Esta etapa singular é ocasionalmente executada na temperatura de 70-74oC por 5-15 minutos após o último ciclo da PCR para assegurar que qualquer DNA de fita singular remanescente tenha sido totalmente estendido (copiado).


VI- Efetivação final: Nesta etapa, a temperatura de 4-15oC pode ser empregada por um tempo não definitivo para a estocagem do termo-curto (as seqüências alvo copiadas) da reação.

Para checar se a PCR gerou o fragmento de DNA previsto/desejado (também referido algumas vezes como um amplímero ou amplicom), a eletroforese em gel de agarose é empregada para a separação dos produtos do PCR por tamanho. O(s) tamanho(s) do(s) produto(s) da PCR é (são) determinado(s) por comparação com um DNA líder (um marcador de peso molecular), o qual contém fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos, correm no gel ao lado dos produtos da PCR.

ESTÁGIOS DA PCR

O processo da PCR pode ser dividido em três estágios:

1- Amplificação exponencial: em todo ciclo, a quantidade do produto é dobrada (presumindo-se 100% de eficiência da reação). A reação é muito específica e precisa.

2- Estágio de Estabilização: A reação torna-se lenta de acordo com a perda de atividade da polimerase de DNA e com o consumo de reagentes como dNTPs e os iniciadores os tornam limitados.

3-Período de estabilidade: nenhum produto se acumula mais devido à exaustão dos reagentes e de enzimas.
Otimização da PCR


Na prática, a PCR pode falhar por várias razões, em parte devido à sua sensibilidade à contaminação causando amplificação de produtos de DNA espúrios. Por isso, um número de técnicas e procedimentos tem sido desenvolvidos para otimização das condições da PCR. A contaminação com DNA estranho é abordada com protocolos laboratoriais e procedimentos que separam misturas pré-PCR a partir de DNA contaminante em potencial. Isso usualmente envolve a separação espacial entre áreas de composição da PCR e áreas de para análise e purificação de produtos da PCR, e limpeza completa da superfície de trabalho entre as reações. Técnicas de desenho de iniciadores são importantes no melhoramento do produto da PCR produzindo e evitando a formação de produtos espúrios, e o uso alternado de componentes de preservação do pH ou enzimas de polimerase pode ajudar com a amplificação de regiões problemáticas ou longas do DNA.


Aplicação da PCR: isolamento do DNA genômico

A PCR permite o isolamento de fragmentos de DNA a partir do DNA genômico por amplificação seletiva de uma região específica do DNA. Este uso da PCR acrescenta muitos métodos, tais como a geração de provas de hibridização para hibridização Southern (DNA) e Northern (RNA e proteínas) e clonagem de DNA, as quais requerem grandes quantidades de DNA, representando uma região específica do DNA. A PCR supre essas técnicas com altas quantidades de DNA puro, permitindo análises de amostras de DNA sempre de quantidades muito pequenas de material inicial.

Outras aplicações da PCR incluem o seqüenciamento de DNA para determinar seqüências desconhecidas amplificadas por PCR nas quais um dos iniciadores da amplificação pode ser usado em seqüenciamento Sanger, isolamento de seqüencia de DNA para expedir tecnologias de DNA recombinante envolvendo a inserção de uma seqüência de DNA para dentro de um plasmídio ou material genético de outro organismo. Colônias bacterianas (E.coli) podem ser rapidamente rastreadas por PCR para a construção de vetores de DNA corretos. A PCR também pode ser usada para impressão digital genética; uma técnica forense usada para identificar uma pessoa ou um organismo por comparação experimental de DNAs através de diferentes métodos baseados na PCR.

Alguns métodos de impressão digital por PCR têm alto poder discriminativo e podem ser usados para identificar relacionamentos genéticos entre indivíduos, tais como filiação ou colateralidade, e são usados em teste de paternidade. Essa técnica também pode ser usada para determinar a relação evolutiva entre os organismos.


AMPLIFICAÇÃO E QUANTIDADE DE DNA

Porque a PCR amplifica as regiões do DNA que estão alvejadas, a PCR pode ser usada para analisar quantidades extremamente pequenas de amostra. Isso é freqüentemente decisivo para análises forenses, quando somente um vestígio de quantidade de DNA é avaliável como evidência. A PCR também pode ser usada nas análises de DNA ancestral que têm milhares de anos. Essas técnicas baseadas na PCR têm sido bem sucedidamente utilizadas em animais, tais como o mamute de quarenta milhões de anos, e também no DNA humano, em aplicações que se estendem de análises das múmias do antigo Egito à indentificação do Tsar Russo.

Métodos quantitativos de PCR permitem a estimação da quantidade de uma dada seqüência presente em uma amostra – uma técnica freqüentemente aplicada para determinar níveis de expressão gênica quantitativamente. A PCR de tempo real é uma ferramenta estabelecida para a quantificação do DNA que mensura a acumulação do produto de DNA após cada rodada de amplificação da PCR.


A PCR NO DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS

A PCR permite o diagnóstico precoce de doenças malignas tais como leucemia e linfomas, que correntemente é o diagnóstico mais desenvolvido nas pesquisas sobre câncer e está realmente sendo usado rotineiramente. Ensaios de PCR podem ser desempenhados diretamente em amostras de DNA genômico para detectar trans-locações específicas em células malignas numa sensitividade que é pelo menos 10.000 vezes maior que as de outros métodos.

A PCR também permite a identificação de microorganismos não cultiváveis ou de crescimento lento tais como as mycobactérias, bactérias anaeróbicas, ou viroses de ensaios em cultura tecidual e modelos animais. As bases para a aplicação da PCR em diagnóstico em microbiologia é a detecção de agentes infecciosos e a discriminação de faixas não-patogênicas de faixas patogênicas em virtude de genes específicos.

O DNA viral pode igualmente ser detectado por PCR. Os iniciadores usados precisam ser específicos para as seqüências alvejadas no DNA de um vírus, e a PCR pode ser usada para análises de diagnóstico ou seqüenciamento de DNA do genoma Viral. A alta sensitividade da PCR permite a detecção do vírus logo após a infecção e sempre antes do estabelecimento da doença. Tal detecção precoce pode proporcionar aos médicos um significativa sonda no tratamento. A quantidade de vírus (carga viral) em um paciente também pode ser quantificada por técnicas quantitativas de DNA baseadas na PCR.