Estrutura, Expressão de Regulação do Genoma do HIV
(Tradução com observações)

Structure, Expression, and Regulation of the HIV Genome
HIV InSite Knowledge Base ChapterNovember 2000
Thomas J. Hope, PhD, The Salk InstituteDidier Trono, MD, The Salk Institute

http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-01-02


Introdução

A forma integrada do HIV-1, também conhecida como pró-vírus, e uma lente de aproximadamente 9.8 quilibases. Ambas as extremidades do pró-vírus são flanqueadas por uma seqüência repetitiva conhecida como os longos terminais de repetição (LTRs). Os genes do HIV estão localizados na região central do DNA pró-viral e codifical ao menos nove proteínas (figura 1). Essas proteínas são divididas em três classes:

1. As principais proteínas estruturais, Gag, Pol e Env (obs.:env contém as seqüências da GP120 e da GP41);

2. As proteínas regulatórias, Tat e Ver;

3. As proteínas assessórias, Vpu,Vpr, Vip e Nef.

A primeira parte do capítulo revisa as proteínas virais individualmente e suas funções. A segunda parte discute fatores que regulam a transcrição e o processamento do mRNA viral.



PROTEÍNAS VIRAIS E SUAS FUNÇÕES

PROTEÍNAS ESTRUTURAIS

GAG

Os genes de gag dão origem a uma proteína precursora de Gag com 55 quilodáltons (de massa), também chamada de p55, a qual é expressada de um mRNA não processado por splicing. Durante a tradução, o terminal N (a extremidade que apresenta NH2 ,grupo amina, livre, em sentido oposto à extremidade que apresenta COOH, carboxila,livre) de p55 é miristolado (?) {ácido miristoleico é um ácido graxo insaturado de 14 carbonos, com uma ligação dupla entre os carbonos 9 e 10; é o análogo de 14 carbonos de ácido oléico} disparando sua associação com o aspecto citoplasmático das membranas celulares. A poli-proteína Gag associada à membrana recruta duas cópias do genoma viral de RNA junto a outras proteínas virais e celulares que disparam o brotamento da partícula viral a partir da superfície de uma célula infectada. {Obs.: o RNA viral para produção de novos vírions é exportado do núcleo celular em partes que precisam ser reunidas no citoplasma}. Após o brotamento, a p55 é clivada por uma protease codificada pelo vírus (um produto do gene Pol) durante o processo da maturação viral em quatro pequenas proteínas designadas MA (matrix[p17]), CA (capsid[p24]), NC (nucleocapsídeo [p9]), e p6.
O polipeptídeo MA é derivado do terminal N, miristolado , da extremidade de p55. A maioria das moléculas MA permanecem coladas na superfície interna da camada dupla lipídica do vírion, estabilizando esta partícula. Um subconjunto de MA é recrutado dentro das camadas profundas do vírion onde tornam-se parte do complexo que escolta o DNA viral para o núcleo. Essas moléculas MA facilitam o transporte nuclear do genoma viral pois um sinal cariofílico na MA é reconhecido pela maquinaria de importação nuclear. Esse fenômeno permite ao HIV infectar células que não estejam em divisão, uma propriedade incomum para um retro-vírus.
A proteína p24 (CA) forma o cerne cônico das partículas virais. A ciclofilina A tem sido demonstrada por interagir com a região p24 de p55 levando à sua incorporação para dentro das partículas virais. A interação entre Gag e ciclofilina A é essencial pois a ruptura dessa interação pela ciclosporina A inibe a replicação viral.
{ Obs.: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=123840
A ciclofilina A (também designada como peptidil-prolil cis/ trans isomerase A ou PPIA, CYPA, CYPH.Obs.: assim sendo, um peptídico com grupamento prolina cis/trans, sendo cis- prefixo itálico que significa deste lado, oposto de trans- ; em química orgânica, uma forma de isomerismo geométrico em que grupos funcionais semelhantes estão fixados no mesmo lado do plano que inclui dois átomos de carbono fixos, estes grupamentos são cis -; e sendo prolina ácido pirrolidina-2-carboxílico; o L-isômero é encontrado em proteínas, principalmente os colágenos) é um membro da classe de proteínas imunofilinas (proteínas receptoras de alta afinidade no citoplasma, que se combinam com agentes imunossupressores, resultando em inibição da rotamase e, nas células T, em interrupção da ativação celular) que possuem todas atividade de peptidil-prolil cis/trans isomerase (isomerase é uma classe de enzimas que catalisam a conversão de uma substância numa forma isomérica, formas que são idênticas quanto à composição percentual mas que diferem quanto a posição de um ou mais átomos nas moléculas, ou quanto a suas propriedades físico-químicas) e, por este motivo, acredita-se que estejam envolvidas no entrelaçamento/junção protéica e ou transporte intra-celular de proteínas. Luban e outros (1993) mostraram que a ciclofilina A liga-se à proteína Gag do HIV-1. Essa interação pode ser inibida pelo imuno supressor ciclosporina A e também, de modo não imuno-supressor , a ciclofilina A ligada a derivativos da ciclosporina A, os quais também foram apresentados por exibir pitente atividade anti-HIV. Assim, a ciclofilina A pode ter uma função essencial na replicação do HIV-1.
Pushkarsky e outros (2001) identificaram CD147 (BSG) como um receptor para CYPA extra-celular. Eles acharam que CD147 aumentou a infecção por HIV-1 através da interação com CYPA incorporada nos vírions. A CYPA associada aos vírus co-imuno-precipitou com CD147 de células infectadas, e anticorpos para CD147 inibiram a entrada do HIV-1. Viroses cuja replicação não requer CYPA são resistentes ao efeito iniidor de anti-CD147. Pushkarsky e outros (2001) concluíram que a entrada o HIV-1 depende de uma interação entre a CYPA associada ao vírus e CD147 em células alvo.
Towers e outros (2003) demonstraram que a senditividade do HIV-1 a fatores de transcrição é modulada por CYPA. Em certas células primatas não-humanas, a interação da proteína do capsídeo do HIV-1(CA) com CYPA é essencial para a restrição: a infectividade do HIV-1 é aumentada mais de 100 vezes pela ciclosporina A, um inibidor competitivo da interação, ou por alguma mutação na proteína CA do HIV-1 que rompa a ligação com CYPA. Inversamente, o rompimento da interação CA-CYPA em células humanas revela que a CYPA protege o HIV-1 do fator de restrição Ref-1. Towers e outros (2003) concluíram que seus achados sugerem que o HIV-1 tem cooptado proteínas das células hospedeiras para neuralizar fatores de restrição expressados por células humanas e essa adaptação pode conferir sensibilidade à restrição em outros hospedeiros. }

A região NC de Gag é responsável por um reconhecimento específico chamado sinal de empacotamento do HIV. O sinal de empacotamento consiste de quatro estruturas em laço perto do final 5’ do RNA viral, e é suficiente para mediar a incorporação de um RNA heterólogo (relativo a elementos citológicos ou histológicos que ocorrem onde normalmente não são encontrados; ex.: o soro do cavado é heterólogo ao soro do coelho) dentro dos vírions. A NC liga-se ao sinal de empacotamento através de interações mediadas por dois motivos de dedos de zinco. A NC também facilita a transcrição reversa.

O a região do poli-peptídeo p6 media interações entre p55 (Gag) e a proteína assessória Vpr, levando à incorporação do Vpr dentro de vírions que estão se reunindo. A região p6 também contém um domínio chamado domínio tardio o qual é requerido para a liberação de vírions brotantes de uma célula infectada.



PRECURSOR DE GAG-POL

A protease viral (Pro), integrase (IN), RNase H, e transcriptase reversa (RT) são sempre expressadas dentro do contexto de uma fusão das proteína Gag-Pol. O precursor Gag-Pol (p160) é gerado por um evento de mudança da estrutura ribossômica, a qual é disparada por um motivo de RNA de atividade cis (uma seqüência de hepta-nucleotídeo seguida de um pequeno talo em laço na região distante do RNA de Gag). Quando os ribossomos encontram este motivo, eles alteram aproximadamente 5% do tempo para a estrutura de leitura de pol sem interrupção na tradução. A freqüência da estrutura de deslocamento ribossomal explica porque a Gag e a precursora Gag-Pol são produzidas em uma proporção de 20:1.

Durante a maturação viral, a protease codificada viral cliva o polipeptídio Pol para fora de Gag e rapidamente digere este para separar as atividades de protease (p10), RT (p50), RNaseH (p15), e integrase (p31). Essas clivagens não ocorrem com eficiência, por exemplo, grosseiramente 50% da proteína RT permanece ligada à RNaseH como um polipeptídeo único (p65).




Pro

A protease do HIV-1 é uma protease aspartil (radical aminoacil do ácido aspártico) que atua como um dímero. A atividade de protease é requerida para a clivagem das poli-proteínas precursoras de Gag e Gag-Pol durante a maturação do vírion como descrito anteriormente. A estrutura tri-dimensional do dímero da protease está sendo determinada. O conhecimento dessa estrutura tem levado a uma classe de drogas direcionadas para inibição da função da protease do HIV.


RT

O gene Pol codifica a Transcriptase Reversa. Pol tem atividades dependentes de RNA e dependents de DNA. Durante o processo da transcrição reversa, a polimerase produz uma cópia de DNA em fita dupla do dímero da fita singular do RNA genômico presente no vírion. A RNase H remove o molde original de RNA da primeira fita de DNA, permitindo a síntese da fita complementar de DNA. O DNA viral pode ser completamente sintetizado dentro de seis horas após a entrada viral, embora o DNA possa permanecer não integrado por períodos prolongados. Muitos elementos de ação cis no RNA viral são requeridos para a geração do DNA viral. Por exemplo, o elemento TAR, uma pequena estrutura de fita em laço de RNA localizada na extremidade 5’ dos RNAs virais e contendo o sítio de ligação para Tat, é requerida para a iniciação da transcrição reversa. A espécie funcional predominante da polimerase é um heterodímero de p65 e p50. Todos os genes produtos de Pol podem ser encontrados dentro do capsídio de vírions do HIV-1 livres. Porque a polimerase não contém uma atividade de revisão (correção), a replicação é propensa a erros e introduz vários pontos de mutação dentro de cada nova cópia do genoma viral. A estrutura em cristal da Transcriptase Reversa do HIV-1 tem sido determinada.



Integrase (In)

A proteína IN media a inserção do HIV pró-viral de DNA dentro do DNA genômico da célula infectada. Esse processo é mediado por três funções distintas da integrase. A primeira, uma atividade de exonuclease apara (corta fora) dois nucleotídeos a partir de cada extremidade 3’ da fita dupla de DNA viral. Então, uma atividade de endonuclease de fita dupla cliva o DNA do hospedeiro no sítio de integração. Finalmente, a atividade de ligase gera uma ligação covalente única em cada extremdade do DNA pró-viral. Acredita-se que enzimas celulares restaurem o sítio de integração. Nenhum tipo de energia exógena, tal como ATP, é requerida para esta reação. A acessibilidade ao DNA cromossômico dentro da cromatina, mais do que as seqüências específicas de DNA, parece influenciar a escolha de sítios de integração. (Observar a atividade da endonuclease emerim : O gene EMD codifica uma proteína ubíqua, a emerim, que é achada ao longo da borda nuclear de muitos tipos de células e é um membro da família de proteínas associadas à lamina nuclear. Jacque e Stevenson (2006) examinaram a suscetibilidade à infecção de macrófagos primários pelo HIV-1 seguinte ao silenciamento de laminas nucleares e várias proteínas associadas a lamina mediado por pequenos RNAs de interferência. Eles acharam que o silenciamento de emerin e BAF impediu a infecção por HI-1, mas não o vírus da leucemia murina, através do impedimento da integração do vírus dentro do DNA do hospedeiro. Análises de imuno-precipitação da cromatina identificaram a emerim e a BAF como co-fatores cooperativos do HIV-1, e análises de mutação mostraram que o cDNA viral não se associa a BAF deficiente do sítio de ligação a emerim ou à emerim sem o domínio LEM. Jacque e Stevenson (2006) concluíram que o cDNA do HIV-1, à entreda no núcleo, precisa interagir com a emerim para contactar a cromatina, e eles sugeriram que moléculas que impedem essa interação devem promover a infecção abortiva do HIV-1 em uma célula. OMIM - 300384) Sítios de torção do DNA dentro da cromatina são assim “locais quentes” para integração, ao menos “in vitro”. É possível promover a integração dentro de regiões específicas do DNA pela fusão da integrase a proteínas de ligação a seqüências específicas do DNA. A integração preferencial a regiões de cromatina abertas (ativas para transcrição) pode facilitar a expressão do pró-vírus. Genes virais não são expressados eficientemente a partir do DNA pró-viral não integrado.


ENV

Os 160 quilo-dáltons de Env (gp160) são expressados de um mRNA processado por splicing uma única vez. Primeiro sintetizado no retículo endoplasmático, o Env migra através do complexo de Golgi onde este sofre glicosilação com adição de um complexo de 25 a 30 cadeias de carbo-hidratos ligado ao lado N, que são adicionados nos resíduos de asparaginase (asparginase é uma β-amina do ácido aspártico [HOOC-CH2-CH-NH2)-COOH], o L-isômero é um aminoácido nutricionalmente não essencial que ocorre em proteínas, um diurético). A glicosilação de Env é requerida para a infectividade. Uma protease cliva a gp160 para gerar gp41 e gp120. A metade da gp41 contém o domínio transmembranal de Env, enquanto agp 120 é localizada na superfície das células infectadas e dos vírions atraés de interações não covalentes com gp41. A Env existe como um trímero na superície de células infectadas e vírions.

Interações entre o HIV e o receptor viral, CD4, são mediadas através de domínios específicos da gp 120. A estrutura da gp 120 tem sido determinada recentemente. A metade de gp120 tem nove ligações dissulfídicas intra-cadeia altamente conservadas. Também estão presentes na gp 120 cinco regiões hiper-variáveis, designadas de V1 até V5, cujas seqüêcias de aminoácidos podem variar grandemente entre os HIV-1 isolados. Uma dessas regiões, chamada laço de V3, não está envolvida na ligação a CD4, mas é mais um determinante importante para o tropismo do HIV-1 tanto para a linhagem para linfócitos T ou para macrófagos primários. Seqüências dentro do laço V3 interagem com os co-receptores do HIV CXCR4 e CCR5, os quais pertencem à família dos receptores de citocinas e determinam parcialmente a suscetibilidade dos tipos de células para dadas linhagens virais. O laço V3 também é o principal alvo para anticorpos neutralizantes que bloqueiam a infectividade do HIV-1. A metade de gp120 também interage com a proteína DC-SIGN ( obs.:lectina C) a qual é expressada na superfície das células dendríticas. A interação com a DC-SIGN aumenta a eficiência da infecção das células T CD4 positivas. Além disso, acredita-se que a DC-SIGN pode facilitar a transmissão pela membrana mucosa pelo transporte do HIV para os tecidos linfóides. A metade de gp41 contém um domínio fusogênico no terminal N que media a fusão das membranas viral e celular, dessa forma permitindo a entrega dos componentes internos do vírion dentro do citoplasma de células recém-infectadas. Uma nova classe de terapêuticas anti-virais, as quais impedem a fusão da membrana, estão apresentando promessas em testes clínicos .

[Obs.: OMIM 300017 – Filamin A; Xq28- Usando análises de leveduras duplamente híbridas e ensaios de abatimento, Jimenez-Baranda e outros (2007) demonstraram que o receptor do vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, CD4, e os co-receptores do HIV-1 CCR5 e CXCR4 interagiram com FLNA (finamina) , a qual regulou a aglomeração dos receptores do do HIV-1 na superfície celular. A ligação de gp120 do HIV-1 aos receptores induziu uma inativação da transitória da fosforilação da cofilina (OMIM 601442) através de um mecanismo dependente de RHOA-ROCK (omim 165390 e 601702). O bloqueio da interação de FLNA com CD4 e/ou os co-receptores inibiu a ativação de gp120 induzida por RHOA e a inativação da cofilina. Jimenez-Baranda e outros (2007) concluíram que FLNA é uma proteína adapatadora que liga os receptors do HIV-1 à maquinaria de remodelação do esqueleto de actina, possivelmente facilitando a infecção pelo vírus.]



PROTEÍNAS REGULATÓRIAS

TAT

A tat é um transativador transcricional que é essencial para a replicação do HIV-1. As formas longas de Tat de 72 e de 101 aminoácidos são expressadas por mRNAs submetidos a muitos procedimentos de splicing precocemente ou mRNAs que passaram por processo incompleto de splicing tardio, respectivamente. Ambas as formas funcionam como ativadores transcricionais e são encontradas dentro dos núcleos ou nucléolos de células infectadas. A Tat é uma proteína de ligação a RNA, diferente dos fatores de transcrição convencionais que interage com DNA. A tat liga-se a uma estrutura de pequeno talo em laço, conhecida como elemento de reação de trans-ativação (TAR), que está licalizado na extremidade 5’ dos RNAs de HIV. A ligação de Tat ocorre em conjunção com proteínas celulares que contribuem para os efeitos de Tat. A ligação de Tat com TAR ativa a transcrição a partir do LTR do HIV em ao menos 1000 vezes.

O mecanismo de funcionamento de Tat tem sido elucidada recentemente. A Tat atua principalmente para promover a fase de alongamento (transcrição da extensão do genoma, a lente) da transcrição do HIV-1, assim os transcritos de lente completa podem ser produzidos. Na ausência da expressão de Tat, o HIV gera curtos transcritos primários (maiores do que 100 nucleotídeos). A estimulação do alongamento da polimerase é efetivado pelo recrutamento de uma quinase deserina que fosforila o domínio terminal carboxila (terminal-C : CTD) da RNA polimerase II. Essa quinase, a qual é conhecida como CDK9, é parte de um complexo que liga-se diretamente a Tat. A função de Tat requer um co-fator celular, conhecido como ciclina T, o qual facilita o reconhecimento da região do laço de TAR pelo complexo Ciclina T- Tat. O levantamento celular da liberação de Tat por células infectadas tem sido observado, embora o impacto deste fenômeno na patogênese seja desconhecido. Tat tem sido mostrada por ativar a expressão de um número de genes celulares incluindo o fator de necrose tumoral beta, e o fator de transformação de crescimento beta, e por regular para menos a expressão de genes incluindo bcl-2 e a citocina MIP-1 alfa.



Rev

A Rev é uma proteína de 13 quilo-dáltons, de ligação a seqüências específicas de RNA. Produzidas a partir de mRNAs fartamente submetidos a procedimentos de splicing, a Rev atua para induzir a transição da fase inicial à fase final de expressão dos genes do HIV. A Rev, a qual é codificada por dois éxos, acumula-se dentro do núcleo e do nucléolo de células infectadas. A Rev liga-se a uma região de base 240 da estrutura secundária do complexo de RNA, chamada elemento de reação de Rev (RRE), que jaz dentro do segundo íntron do HIV. A Rev liga-se a uma “bolha” dentro de uma hélice de fita dupla de RNA contendo um par de bases G-G não Watson-Crick. Essa estrutura, conhecida como sítio de ligação de alta afinidade a Rev, está localizado na região de RRE conhecida como haste em laço 2.

A ligação de Rev à RRE facilita a exportação de RNAs virais, que passaram por processo incompleto de splicing ou RNAs não processados por splicing, do núcleo celular para o citoplasma. Normalmente, os RNAs contém íntrons (isto é, RNA não processados por splicing ou não spliceados) são retidos no núcleo. Altos níveis de expressão de Rev podem levar à exportação de tantos RNAs virais contendo íntros que a quantidade de RNA disponível para splicing completo fica diminuída, o que, por outro lado, reduz os níveis de expressão de Ver. Dessa forma, essa capacidade de Revpara diminuir a taxa de processo de splicing de RNA viral gera um retorno negativo do circuito pelo qual os níveis de expressão de Rev são regulados escassamente.
A Rev tem sido apresentada contend ao todo três domínios funcionais. Um RNA rico em arginina media interações com RRE. Um domínio de multimerização é requerido para o funcionamento de Rev. Rev é crida por existir como um tetrâmero homogêneo em solução. Rev também contém um domínio efetor, o qual é um sinal específico de exportação nuclear (NES). A exportação do RNA viral por Rev ocorre através de uma via tipicamente usada pelos pequenos RNAs nucleares (snRNAs) e o RNA ribossômico 5s mais do que a via normal para mRNAs celulares. A exportação por Rev é mediada através de interações com o receptor NES conhecido como CRM1. NES mutantes de Rev são dominantes negativos. A inibição é causada pela formação do multímeros não funcionais entre o NES mutante e os monômeros de tipo selvagem de Ver. Ver é absolutamente requerida para a replicação do HIV-1: as pró-viroses que não têm a função de Ver são transcricionalmente ativas, mas não expressam os derradeiros genes virais e assim não produzem vírions.


PROTEÍNAS ASSESSÓRIAS

Em adição aos genes gag, pol e env contidos em todas as retroviroses, e os genes regulatórios tat e Rev, o HIV-1 contém quatro genes adicionais: nef, vif, vpr e vpu., codificadores das também chamadas proteínas assessórias. O HIV-2 não contém o vpu, mas a despeito disso, contém outro gene, vpx. As proteínas assessórias não são absolutamente requeridas para a replicação viral em todos so sistemas “in vitro”, mas representam fatores de virulência críticos “in vivo”. A Nef é expressada a partir de mRNAs multiplamente processados por splicing e é, por isso, independente de Rev. Em contraste, Vpr, Vpu e Vif são o produto de mRNAs processados por splicing incompleto, e assim são expressados somente durante a tardia fase de infecção dependente de Rev, a partir de mRNAs processados uma única vez por splicing. A maioria das pequenas proteínas assessórias do HIV tem múltiplas funções como descrito adiante.


Nef (um acrônimo para fator negativo) é uma proteína miristolada de 27 quilo-dáltons que é codificada por um único éxon que se extende dentro do LTR da extremidade 3’. Nef, um gene prematuro do HIV, é a primeira proteína viral a acumular-se em níveis detectáveis numa célula após a infecção pelo HIV-1. Seu nome é uma conseqüência das primeiras notícias afirmando a a atividade transcricional regulada para menos de Nef do LTR do HIV-1. Não é de longa data que se acredita, entretanto, que a Nef tenha um efeito direto na expressão do gene do HIV. A Nef tem sido apresentada por ter múltiplas atividades, incluindo a regulação para menos da expressão de CD4 na superfície celular, a perturbação da ativação das células T e a estimulação da infectividade do HIV.

A Nef atua pós-trancricionalmente no decréscimo da expressão de superfície da CD4, o receptor primário do HIV. A Nef aumenta a taxa de endocitose e degradação lisossômica da CD4. A cauda citoplasmática de CD4, a em particular uma seqüência repetida de di-leucina contida em sua região próxima à membrana, é a chave para o efeito de Nef sobra a CD4. A regulação para menos da CD4 parece ser vantajosa para a produção viral pois um excesso de CD4 na superfície celular tem sido considerada por inibir a incorporação de Env e o vírion em ascensão. A Nef também regula para menos a expressão do MHC de classe I, não obstante para um grau menor. A regulação para menos do MHC de classe I diminui a eficiência da morte de células infectadas pelo HIV por células T citotóxicas.

A Nef perturba a ativação da célula T. Estudos sobre a linhagem de células T Jurkat indicaram que a expressão de Nef tem um efeito negativo na indução da transcrição do fator NF-kappa B (OMIM 300248 – NEMO;Xq28: Yamaoka e outros (1998) caracterizaram uma linhagem de células mutantes , 5R, originalmente isoladas como uma variante irrelevante dos fibroblastos Rat-1 transformados pela proteína Tax do vírus da leucemia das células T humanas de tipo 1(HTLV-1). A linha de células 5R não respondeu a nenhum dos estímilos de ativação de NF-kappa-B (NFKB 164011) testados. Usando uma abordagem de complementação genética, Yamaoka e outros (1998) clonaram um componente da quinase do complexo I-kappa-B que eles denominaram NEMO para “ modulador essencial para NF-kappa-B” de células 5R. O cDNA de NEMO, de 2.8 quilo-bases, codifica uma proteína de 412 aminoácidos que á acídica, rica em ácido glutâmico e resíduos de glutamina (cada 13%), e contém um motivo de zipper de leucina nos aminoácidos 315 a 342. Yamaoka e outros (1998) determinaram que o fenótipo defeituoso da scéluls 5R resultava da ausência da proteína NEMO. A NEMO também complementou a linha de células mutantes 1.3E, na qual o NFKB não é ativado em resposta a grande estado de estimulação.) e na expressão de IL-2 (OMIM 308380: A IL2 afeta o crescimento e a diferenciação das células T, células B,células matadoras naturais (NKiller), células gliomas (células do tecido intersticial do cérebro, da medula espinal, da neuro-hipófise, da glêndula pineal e da retina) e células de linhagem monocítica após a específica interação com seus receptores. O receptor de IL2 (IL2R) consiste de duas sub-unidades (IL2RA e IL2RB). Takeshita e outros (1992) identificaram uma terceira sub-unidade, a cadeia gama, e isolaram o correspondente cDBA a partir de uma linhagem de células T umanas. A proteína deduzida em 369 aminoácidos tem uma massa molecular de 39.9 quilo-dáltons e apresenta similaridade seqüencial com membros da família de receptores de citocina. Análises de Northern blot (RNA) detectaram um transcrito de mRNA dominante de 1.8 quilo-bases nas células T e B humanas; um Segundo transcrito de mRNA de 3.6 quilo-bases também foi detectado. Nenhum transcrito de mRNA de IL2RG foi detectado em células humanas não linfóides, taiscomo pró-monócitos, células epiteliais ou hepatócitos). Em contraste, resultados obtidos em camundongos trangênciso em Nef revelaram que a Nef leva à elevada sinalização de células T. A expressão de uma molécula quimérica de CD8-Nef em células Jurkat teve tanto efeito positivo quanto negativo dependendo da localização celular da molécula Nef híbrida. Quando a proteína CD8-Nef acumulou-se no citoplasma, existia um bloqueio na sinalização normal através do receptor de célula T. Quando a quimera CD8-Nef foi expressada em altos níveis na superfície celular, entretanto, a ativação espontânea seguida por apoptose foi detectada. Juntas, essas observações sugerem que a Nef pode exercer efeitos pleiomórficos ( de mais numeroso morfismo) na ativação de células T dependendo do contexto da expressão. Consistente com esse modelo, a Nef tem sido encontrada em associação com várias quinases celulares diferentes que estão presentes nos linfócitos T auxiliares.

A Nef também estimula a infectividade de vírions do HIV. As partículas do HIV-1 produzidas na presença de Nef podem ser mais do que dez vezes mais infecciosas do que vírions produzidos na ausência de Nef. A Nef está empacotada dentro dos vírions, onde é clivada pela protease viral durante a maturação. A importância deste evento, entretanto, não está clara. Vírions produzidos na ausência de Nef são menos eficientes para a síntese de DNA pró-viral, embora a Nef não pareça influenciar diretamente o processo da transcrição reversa. A regulação para menos de CD4 e o efeito da infectividade do vírion por Nef são geneticamente distintos como demonstrado por certas mutações que afetam somente uma dessas duas atividades.

Existe uma evidência genética convincente de que a proteína Nef do vírus da imuno-deficiência síma é absolutamente requerido para o crescimento de altos títulos e o típico desenvolvimento da doença em animais adultos. É possível, entretanto, para mutantes de SIV com Nef defeituosa causar a doença e animais recém-nascidos. Além disso, os vírions defeituosos em Nef ainda causam a doença similar à AIDS em animais infectados embora o começo seja atrasado.


Vpr

A proteína Vpr é incorporada dentro de partículas virais. Aproximadamente 100 cópias de Vpr estão associadas com cada vírion. A incorporação de Vpr dentro de vírions é mediada através de interções específicas com a região terminal em carboxila de p55 Gag, a qual corresponde a p6 na proteína processada proteoliticamente.

A Vpr desempenha um papel na habilidade do HIV para infectar células que não estejam em divisão por facilitar a localização nuclear do complexo de pré-integração (PIC). A Vpr está presente no PIC. Entretanto, mais do que prender sinais adicionais de localização nuclear ao PIC, a Vpr pode atuar como um fator de transporte nucleo-citoplasmático por prender diretamente o genoma viral no poro nuclear. Consistente com este modelo, a Vpr expressada em células é encontrada associada com o poro nuclear e pode ser bioquimicamente demonstrada ligando-se a componentes do complexo do poro nuclear. A Vpr também pode bloquear a divisão celular. Células que expressam Vpr acumulam-se (multiplicam-se) na fase G2 do ciclo celular . A expressão de Vpr tem sido mostrada por prevenir a ativação do complexo p34cdc2/ciclina B, o qual é um regulador do ciclo celular importante para a entrada na fase de mitose. De acordo com isso, a expressão de um mutante ativo de p34cdc2, constitutivamente, impede a multiplicação de células induzida por Vpr na fase G2 do ciclo celular.

A Vpr também tem sido mostrada por interagir com a proteína celular uracil-DNA glicosilase (UNG). As conseqüências biológicas desse fenômeno ainda tem de ser determinadas. Outra enzima envolvida com a modificação de desóxi-uracil (dUTP), desóxi-uracil fosfatase (dUTPase), é expressada por duas lentiviroses que não contêm o gene vpr: o vírus da anemia infecciosa eqüina e o vírus da imuno-deficiência felina. Acredita-se que a dUTPase esgota a dUTP dentro da célula assim impedindo as conseqüências nocivas da incorporação de dUTP no DNA viral.


[Obs.: OMIM 601266 dUTPase; 15q15-q21.1 : Desoxiuridina trifosfato nucleotideohidrolase (dUTPase) hidrolisa dUTP para formar dUMP e pirofosfato. Mutações na dUTPase de E.Coli levaram ao aumento dos níveis de dUTP e a níveis incomuns de incorporação de dUMP no DNA durante a replicação e reparo o que, por outro lado, causa a fragmentação do DNA e a morte celular (Lindahl, 1982; El-Hajj e outros, 1998). Possivelmente por esta razão, mutações nulas de dUTP em leveduras são letais. Uma segunda função de dUTPase é proporcionar dUMP para a síntese de timidilato (timidilato sintase é uma enzima que catalisa a conversão de desoxiuridina 5’- monofosfato em timidina 5’-monofosfato, em que o grupamento metil provém do N5,N10 – metilenotetraidrofolato.) Canman e outros (1992,1994) mostraram que níveis aumentados de de dUTPase em algumas linhagens de células cancerígenas contribuem para sua resistência ao inibidor de timidina sintase fluorodesoxiuridina (FUdR).

McIntosh e outros (1992) clonaram duas dUTP pirofosfatases funcionais a partir da expressão do cDNA de uma biblioteca por complementação genética em E.coli. Os dois cDNAs de diferentes tamanhos cada um contendo um único longo ORF (open reading frame: fase de leitura aberta) codificando um polipeptídeo de 141 aminoácidos com uma massa molecular calculada em 16.6 quilo-dáltons. A proteína humana compartilha 35% de homologia com a dUTPase de E.coli e 53% com a enzima do Saccharomyces cerevisiae. McIntosh e outros (1992) detectaram a expressão do gene de dUTPase numa variedade de tecidos.Devido a seu possível papel essencial na replicação do DNA, os autores sugeriram que quimioterápicos poderiam ser designados para alvejar a dUTPase em cânceres humanos. ]


Vpu

O polipeptídeo de 16 quilo-dáltons Vpu é uma fosfoproteína integral de membrana que está localizada primariamente no lado interno das membranas celulares. A Vpu é expressada a partir do mRNA que tamém codifica env. Vpu é traduzido a partir desse mRNA em níveis dez vezes mais baixos que Env porque o códon de iniciação da tradução de Vpu não é eficiente. As duas funções de Vpu, a modulação para menos de CD4 e o intensificação da liberação de vírions, podem ser geneticamente separadas.
Em células infectadas pelo HIV, complexos formam-se entre o receptor viral, CD4, e a proteína do envelope viral no retículo endoplasmático causando a captura de ambas as proteínas para dentro desse compartimento. A formação de complexos Env-CD4 intracelular interfere dessa forma com a reunião do vírion (Obs.:o RNA formado no núcleo para gerar novos vírions é transportado em partes e depois unido no citoplasma da célula para formar o vírion, seguindo-se a isso o empacotamento das fitas duplas de RNA no capsídio.) A Vpu libera o envelope viral pelo disparo da degradação de moléculas CD4 complexadas com Env mediado por ubiqüitina.
A Vpu também aumenta a liberação do HIV a partir da superfície de uma célula infectada. Na ausência de Vpu, um grande número de vírions pode ser visto colado à superfície de células infectadas.


Vif

A Vif é um polipeptídeo de 23 quilo-dáltons que é essencial para a replicação do HIV em linfóctos do sangue periférico, macrófagos, e certas linhagens celulares. Na maioria das linhagens celulares, a Vif não é requerida, sugerindo que essas células podem expressar uma proteína que pode complementar a função de Vif. Essas linhagens celulares são chamadas permissivas para Vif mutantes do HIV. Vírions gerados em células permissivas podem infectar células não permissivas porém os vírus produzidos subseqüentemente não são infecciosos.
Estudos complementares indicam que é possível restaurar a infectividade do HIV mutante em Vif por expressão de Vif em células produtoras, mas não em células alvo. Esses resultados indicam que Vif precisa estar presente durante a reunião (das seqüências de RNA que formarão o) do vírion. A Vif está incorporada dentro de vírions do HIV. Este fenômeno, entretanto, precisa ser não-específico pois a Vif também é incorporada dentro de retroviroses heterólogas tais como a virose da leucemia murina. Estudos produzindo HIV a partir de heterocárions (células contendo diversos núcleos no interior de um citoplasma comum, geralmente resultante da fusão artificial de duas células de espécies diferentes) geraradas pela fusão de células permissivas e não permissivas revelaram que as células não permissivas contém uma ocorrência natural de fatores anti-virais que é dominado por Vif. Sustentações adicionais para o modelo de que Vif está cointrariando um fator anti-viral celular chega através da observação de que proteínas de Vif de diferentes lentiviroses são específicas para espécies. Até o momento, a Vif do HIV pode modular a infectividade do HIV-2 e de SIV em células humanas enquanto a proteína Vif de SIV não funciona em células humanas. Essa observação sugere que fatores celulares, mais do que componentes virais, são alvejados por ação de Vif. As fitas de HIV defeituosas em Vif podem entrar nas células mas não podem sintetizar eficientemente o DNA pró-viral. Não está claro se o defeito de Vif afeta a transcrição reversa por si, o des-revestimento viral, ou a estabilidade geral do complexo de nucleoproteínas viral. Os vírions mutantes em Vif têm cernes de nucleoproteínas impropriamente compilados como foi revelado por análises de microscopia eletrônica.

Regulação da Expressão do Gene do HIV
A regulação da expressão do gene do HIV é completada por uma combinação de fatores celulares e virais. A expressão do gene do HIV é regulada em ambos os níveis transcricional e pós-transcricional. Os genes do HIV podem ser divididos em genes precoces de tardios. OS genes precoces, tat, ver, e nef, são expressados de maneira independente de Ver. Os mRNAs codificadores dos últimos genes, gag, pol, env, vpr, vpu e vif, requerem Rev de acordo a serem localizados citoplasmaticamente e expressados.

TRANSCRIÇÃO DO GENOMA PRÓ-VIRAL

A transcrição do HIV é mediada por um único promotor no LTR da extremidade 5’. A expressão a partir do LTR 5’ gera um transcrito primário de 9 quilo-dáltons que tem potencial para codificar todos os nove genes do HIV. O transcrito primário é grosseiramente mais curto que o pró-vírus em 600 bases. O transcrito primário pode ser submetido a splicing dentro de uma das mais de 30 espécies de mRNA ou compilado sem maior modificação em partículas virais (para servir como genoma viral em RNA)
Os LTRs são compostos de três sub-regiões designadas U3, R e U5. Essas regiões são nomeadas devido a sua localização dentro do transcrito primário do HIV. A região U3 (para uma única seqüência em 3’) está aproximadamente em 450 pares de base (bp) na lente (extensão) e é localizado no final 5’ de cada LTR. A região U3 contém a maioria dos elementos de ação cis em DNA, os quais são sítios de ligação para fatores de transcrição celulares. A região central de cada LTR contém a região de 100 pares de base R (de seqüências repetidas). A transcrição começa nas primeiras bases da região R e a poliadenilação ocorre imediatamente após a última base de R (a poliadenilação é a adição de adeninas na extremidade 3’ de um transcrito primário). A região U5 (para a seqüência única em 5’) está em 180 pares de base da lente e contém o sítio de ligação a Tat e seqüências compiladoras do HIV. O final 3’ de U5 é definido pela locação de um sítio de ligação de tRNA lysyl (tRNA do aminoácido lisina). O tRNA lysyl atua como um ponto de iniciação para a transcrição reversa.





REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO

O LTR doHIV contém sítios de ligação a DNA para vários fatores de transcrição celulares. As chaves entre os sítios de ligação ao DNA requeridas para a ativação da transcrição do pró-vírus do HIV são aquelas para a família NF-kappa B de fatores de transcrição. Dois sítios adjacentes a NF-kappa B estão presentes na região U3 do LTR do HIV-1. A proteína NF-kappa B permite ao vírus ser reativo à ao estado de ativação das células T infectadas. A estimulação do receptor de células T (TCR) causa a forma inativa de NF-kappa B, localizado no citoplasma, para ser translocado para dentro do núcleo onde induz a expressão de uma série de genes específicos de ativação das células T. A NF-kappa B e a subseqüente ativação da transcrição do HIV também pode ser induzida pelas citocinas fator de necrose tumoral alfa (TNF alfa) e interleucina-1 (IL-1). O LTR do HIV também contém sítios de ligação para os fatores de transcrição indutíveis NF-AT e AP-1. Lef e NF-At são todos fatores específicos de células T. Os sítios de ligação SP-1 são essenciais para o funcionamento do promotor do HIV.
A ativação inicial do LTR do HIV é uma conseqüência de fatores de transcrição celulares constitutivos e indutíveis. A ativação do LTR por fatores de transcrição celular leva primariamente a geração de transcritos curtos. Esses transcritos curtos são causados em parte por um elemento localizado a jussante a partir do sítio de iniciação da transcrição (mais para o lado 3’), conhecido com o indutor dos transcritos curtos (IST). Alguns transcritos completos, entretanto, são gerados e permitem a produção da proteína Tat. A proteína Tat então atua num papel chave na ativação de manutenção de altos níveis de transcrição a partir do DNA pró-viral.



PROCESSO DE SPLICING DE mRNA e LOCALIZAÇÃO CELULAR
O transcrito primário do HIV-1 contém múltiplos sítios doadores de Splice (Obs.:sítios de splice em 5’, um par de bases a GT é cortado no final de um éxon e início de um íntron, e levado até uma base A formando uma alça num sítio próximo a um par de bases AG contido neste íntron a jussante, no sentido 5’ para 3’; o par de bases AG é cortado e o íntron é removido do mRNA; todo o processo ocorre dentro dos spliceossomos, complexos de snRNP - pequenas ribonucleoproteínas nucleares que carregam snRNAs – pequenos RNAs nucleares) e aceptores (Obs.: sítios de Splice em 3’, onde se conclui a alça), os quais podem ser processados para produzir mais de 30 mRNAs alternativos. Muitos dos mRNAs são policistrônicos ; isto é, eles contém uma fase de leitura aberta de mais de uma proteína. Os mRNAs policistrônicos expressam tipicamente um único produto gênico. A escolha da fase de leitura aberta é governada pela eficiência do códon de iniciação e a proximidade do códon de iniciação ao final 5’ (por onde começa a leitura das seqüências na maioria dos casos). Os mRNAs do HIV-1 ocorrem em classes de três tamanhos:

1. RNA não processado por splicing: O transcrito primário de 9 quilo-bases não processado por splicing pode ser expressado para gerar as proteínas precursoras de Gag e Gag-Pol ou ser empacotados dentro de vírions servindo como RNA genômico.

2. RNA processado por splicing incompleto. Esses mRNAs usam os sítios doadores de splicing localizados mais perto do final 5’ do genoma de RNA do HIV em combinação com algum dos aceptores de splicing localizado na região central do vírus. Esses RNAs podem expressar potencialmente Env, Vif, Vpu, Vpr e a forma de Tat com um único éxon. Esses mRNAs heterogêneos têm o comprimento de 4 a 5 quilo-bases e retêm o segundo íntron do HIV.


3. RNA fartamente processado por splicing. Esses mRNAs são processados por splicing em ambos os íntrons do HIV e têm potencial para expressar Ver, Nef e a forma de Tat em dois éxons, Esses mRNAs heterogêneos não requerem a expressão da proteína Ver.
Normalmente, RNAs contend íntrons precisam ser completamente processados por splicing antes de que possam sair do núcleo. Essa regulação é essencial pois previne a translação de seqüências intrônicas contidas em mRNAs parcialmente processados por splicing. A proteína Rev liga-se aos RNAs virais e retém as seqüências intrônicas, e direciona sua exportação do núcleo. Essa exportação permite a RNAs virais não convencionais um desvio dos “pontos de controle” de splicing de RNA. Os mRNAs virais muito processados por splicing saem do núcleo usando a via de exportação seguida pela maioria dos mRNAs celulares. Níveis iniciais de Ver são necessários para a exportação de mRNAs do HIV que contêm íntrons, explicando por que aqueles codificam os produtos dos genes mais tardios. Em contraste, as proteínas codificadas pelos mRNAs fartamente spliceados, Nef, Tat, e Ver, podem ser produzidas imediatamente, e são então os primeiros produtos do gene viral.