(continuação de "Interação da Proteína Tat do HIV-1 com Heparina")

PAPEL DA DESSULFATIZAÇÃO SELETIVA NA INTERAÇÃO COM Tat

(Obs.: ID deve ser abreviação de ‘dose infectante’.)

Para avaliar o papel dos grupos sulfato de heparina específicos na interação com Tat, heparinas não marcadas seletivamente dessulfatizadas foram avaliadas por sua capacidade de competir com as heparinas marcadas com H pela ligação com GST-Tat imobilizada em contato com gotas de agarose de glutationa. Como mostrado na figura 4A, seletivas heparinas dessulfatizadas -2-O, heparina dessulfatizada-6-0, e heparinas dessulfatizadas N/acetiladas N mostram uma significativa redução em sua capacidade de competir pela ligação com GST-Tat (ID50 > 330μM) quando comparadas com a heparina convencional (ID50 = 10µM). Além disso, a dessulfatização total O- aboliu completamente a capacidade da heparina interagir com Tat. Finalmente, uma mistura de heparinas dessulfatizadas 2-O-, -6-o e dessulfatizadas N/acetiladasN, cada uma em concentração de 110μM (concentração total de heparinas = 330 μM), inibe a ligação de heparinas marcadas com H a GST-Tat imobilizada por somente 30%. Tomados juntos, os dados sugerem que ao menos alguns grupos -2-O, -6-O, e sulfatos-N Têm que estar organizados na mesma cadeia de heparina para permitir uma interação ótima com a GST-Tat.
Para confirmar a necessidade dos grupos sulfato 2-O-, 6-O- e N- para a ótima interação de Tat com heparina, heparinas convencionais e seletivamente dessulfatizadas foram conjugadas a gel de sefarose . A capacidade da fusão protéica GST-Tat ligar-se a diferentes colunas de heparina-sefarose foi então avaliada (veja “Procedimentos Experimentais” para mais detalhes). Como mostrado na figura 5A, GST-Tat liga-se a heparinas convencionais imobilizadas onde esta elui em 1,5M de NaCl. Um perfil de eluição similar foi obtido quando Tat foi carregada em contato com a coluna após a clivagem da fusão protéica GST-Tat por trombina. É interessante notar que sob as mesmas condições experimentais, o fator prototípico de ligação a heparina, bFGF, eluiu das colunas a 2,2M de NaCl. Em contraste, GST recombinante sem Tat e a fusão protéica GST-Tat desnaturada por calor não se ligou a gotas de heparina-sefarose e eluiu com o fluxo através da coluna. Esses dados indicam que a alta afinidade da interação de GST-Tat com heparinas imobilizadas reflete a capacidade de ligação da heparina à metade Tat e ocorre somente quando a proteína está presente na própria conformação nativa.
Concordando com os estudos de competição por ligação, a fusão protéica GST-Tat não ligou-se a heparinas totalmente –O-dessulfatizadas , 2-O-dessulfatizadas, -O-dessulfatizadas, e dessulfatizadasN/acetiladasN quando carregadas a 0,15M NaCl. Em contraste, bFGF ainda ligou-se a diferentes heparinas dessulfatizadas, embora, de acordo com observações prévias em diferentes sistemas experimentais, com uma reduzida afinidade, sendo eluídos em concentrações de NaCl atingindo de 0,9 a 1,5M. Concluindo, os dados confirmam o pré-requisito de grupos sulfato 2-O-, 6-O- e grupos sulfato N para interação de heparina com Tat, de alta afinidade e ótima.
As heparinas dessulfatizadas seletivamente foram então avaliadas por sua capacidade de inibir a atividade trans-ativadora do LTR exercida pela fusão protéica GST-Tat nas células HL3T1. Como esperado a partir dos estudos de competição por ligação, as heparinas totalmente ‑O‑dessulfatizadas apresentaram uma capacidade muito limitada (ID50 = 10 μM) em inibir a atividade trans-ativadora de GST, quando comparadas com a heparina convencional (ID50 = 0,8 μM). Um decréscimo significativo da atividade antagonista da heparina também foi causada pela dessulfatização 2-O-seletiva (ID50 =100 μM). Surpreendentemente, heparinas dessulfatizadas 6-O- ou dessulfatizadas N/acetiladas N inibiram significativamente a atividade transativadora de GST-Tat, em aparente contraste com sua reduzida atividade nos estudos de competição pela ligação.

EFEITOS DO PESO MOLECULAR NAS INTERAÇÕES DE Tat

A influência do tamanho da cadeia de heparina na interação com os GST-TAt imobilizados foi investigada por ensaios de competição de ligação. Heparinas de massa molecular muito baixas não marcadas (3,0 e 2,1 quilo-dáltons) foram comparadas com a heparina convencional (13.6 quilo-dáltons) por sua capacidade de competir com heparinas marcadas com H pela ligação com GST-Tat‑glutationa‑agarose. Quando as diferentes moléculas de heparina foram comparadas com uma base molar, a capacidade das heparinas de massa molecular muito baixas de interagir com a GST‑Tat imobilizada foi dramaticamente reduzida (ID50 igual a 10.200, e 330 μM para heparinas de 13,6; 3,0 e 2,1 quilo-dáltons, respectivamente). De acordo com estes estudos de competição por ligação, heparinas de 3,0 e 2,1 quilo-dáltons apresentaram reduzida capacidade de inibir a atividade transativadora do LTR exercida pela fusão protéica GST-Tat nas células HL3T1 (ID50 igual a 50-100 μM comparadas com 1,0 μM para heparinas convencionais de 13,6 quilo-dáltons).
Para selecionar componentes de alta afinidade presentes no preparado de heparina de moléculas de massa molecular muito baixa, a heparina de 3,0 quilo-dáltons foi fracionada por afinidade cromatográfica a GST-Tat. Uma coluna de 200 μl de GST-Tat‑glutationa-agarose foi carregada com amostra de 100 μg, lavada extensivamente, e eluída com um lavado de 3,0M NaCl. Quinze por cento (15%) da amostra carregada em contato com a coluna foi recuperada na fração de 3,0M de NaCl. Eletroforese em gel de policrilamida (polímero ramificado de acrilamida usado na eletroforese em gel) confirmaram que a fração de ligação a Tat na heparina tinha uma massa molecular média de aproximadamente 3,0 quilo-dáltons (dados não mostrados). Quando as frações ligadas e não-ligadas foram avaliadas por sua capacidade de inibir a atividade transativadora de GST-Tat, a fração ligada foi aproximadamente 20 vezes mais potente do que o composto parecido e > 1000 vezes mais efetiva do que a fração não‑ligada. Assim, a atividade inibidora da fração ligada a Tat parece ser também mais alta d que o esperado de acordo com sua concentração relativa em heparinas parecidas, sugerindo que moléculas não-ligadas no preparo inicial podem interferir com a interação Tat-heparina e/ou com a transativação do LTR. Experimentos adicionais são necessários para esclarecer este ponto. Em conclusão, os dados demonstraram que a afinidade cromatográfica (afinidade cromatográfica é onde o absorvente tem uma afinidade química única por um determinado componente da solução de passagem. Sin. coluna de passagem) pode ser usada para isolar cadeias de oligossacarídeos de heparina de massa molecular muito baixa com potente atividade antagônica a Tat.

DISCUSSÃO

Esta é a primeira caracterização bioquímica das interações entre HIV-Tat com heparina/sulfato de heparan. A composição de dissacarídeos, grau de sulfatização, e arranjo das cargas ao longo da cadeis de polissacarídeo são todas importantes em determinar a capacidade de um glicosaminoglicano ligar-se à proteína Tat e inibir sua atividade transativadora. Compostos com carga de baixa densidade, tais como o polissacarídeo K5 e o ácido hialurônico, não interagem com Tat. Também, uma diferente capacidade de ligação é mostrada por glicosaminogliconos pouco sulfatados com uma taxa similar de SO3-/COO- mas que diferem na conformação de sua espinha dorsal (deve ser a estrutura primária?) e distribuição de carga (heparan sulfato versus dermatan sulfato e sulfatos de crondroitina). Finalmente, as dessulfatizações 2-O-, 6-O- ou N seletivas todas impedem a interação Tat-heparina “in vitro” indicando que grupos sulfato 2-O-, 6-O- e N nas heparinas/sulfato de heparan são requeridos para ligações de alta afinidade a Tat. Unidades de dissacarídeo contendo grupos sulfato 2-O-, 6-O- e N estão predominantemente presentes na heparina e em menor extensão no sulfato de heparan. Isso parece estar em conformidade com a capacidade ligeiramente reduzida dos sulfatos de heparina ligarem-se a GST-Tat imobilizadas em ensaios de competição de ligação. O fator angiogênico de ligação a heparina, bFGF, liga-se avidamente a uma região pentassacarídica composta de tais unidades repetidas de dissacarídeos, embora apenas grupos sulfato N e um único grupo sulfato 2-O- sejam essenciais para a interação com bFGF enquanto os grupos sulfato 2-O- remanescentes e grupos sulfato 6-O- na estrutura pentassacarídica são redundantes. Em contraste, grupos sulfato 6‑O- são principalmente envolvidos na interação com o fator de crescimento de hepatócitos. Esses achados sugerem que diferentes citocinas de ligação a heparina/sulfato de heparan podem ligar-se a licosaminoglicanos sulfatados de maneira distinta e possivelmente específica. Embora seqüências de ligação específicas ao fator possam estar escondidas na heparina devido a seu alto grau de sulfatização, a grande heterogeneidade na estrutura do sulfato de heparan permite um formato/ofício mais refinado das regiões de ligação seletivas que pode influenciar a atividade biológica e a bio-avaliabilidade de fatores de crescimento de ligação a heparina/sulfato de heparan, incluindo a proteína Tat. Essa possibilidade é exemplificada pela transferência das propriedades do proteoglicano de sulfato de heparan (HSPG) na superfície celular de um fenótipo ligante a bFGF para ligante a FGF ácido em células neuronais murinas durante o desenvolvimento embrionário.

Estudos prévios têm mostrado que a interação da heparina com bFGF depende do peso/massa molecular dos polissacarídeos e que uma seqüência pentassacarídica representa o sítio de ligação mínimo para bFGF. Aqui, usando preparados de heparina com diferentes pesos moleculares médios, nós observamos que a afinidade da heparina para a proteína Tat diminui com a redução do tamanho do polissacarídeo. Conseqüentemente, uma reduzida capacidade de inibir a atividade trans-ativadora da Tat extracelular também foi encontrada. Embora nenhuma tentativa tenha sido feita para determinar o tamanho mínimo requerido para ligação com Tat, nós demonstramos que o funcionamento de heparinas com peso molecular muito baixo por afinidade cromatográfica a Tat isolam uma sub-população de cadeias de oligossacarídeos que retém a capacidade de ligar-se a Tat e inibir sua atividade trans-ativadora com alta potência. Estudos adicionais estão em progresso em nosso laboratório para caracterizar essa sub-população e para determianar a estrutura mínima de ligação.

As heparinas dessulfatizadas-N/acetiladas-N e dessulfatizadas em 6-O- retiveram a capacidade de inibir a atividade trans-ativadora de Tat embora tivessem perdido a habilidade de ligarem-se a Tat com alta afinidade. Isso sugere que a inibição da trans-ativação do LTR pode requerer somente interações parciais entre a Tat e a heparina/sulfato de heparan. Alternativamente, múltiplas interações com a superfície celular podem estar envolvidas na inibição da atividade trans-ativadora do LTR do HIV pela heparina. A Tat extracelular liga-se a integrina e Flk-1/KDR (é um receptor para ponto de inserção de uma quinase de tirosina para fator de crescimento; OMIM 191306) na superfície celular e a heparina tem sido noticiada por afetar a capacidade dos ligantes a ligarem-se a seus receptores. Observações similares têm sido feitas para interações de heparina com bFGF. Neste sistema, a cadeia de polissacarídeos mais longa do que a seqüência mínima de ligação a bFGF são requeridas para a modulação da atividade biológica do fator de crescimento. Em adição, os grupos 6-O- sulfato atuam num papel na formação do receptor do complexo ternário bFGF-heparina-FGF embora não estejam envolvidos na interação com bFGF.

Nossos estudos sobre as propriedades bioquímicas das quimeras GST-Tat demonstraram que as formas de 1 éxon e de 2 éxons de Tat exercem a mesma atividade trans-ativadora e são similarmente inibidos pela heparina. Eles também ligam-se a heparina/heparan sulfato com a mesma afinidade quando imobilizados em contato com colulas de agarose de glutationa (dados não mostrados). Em contraste com o aparentemente dispensável segundo éxon, várias observações pontuam para um papel dos resíduos de aminoácidos de 49 a 57 do primeiro éxon de Tat na interação de Tat com heparina. Este altamente carregado e básico domínio é crítico em ambas as atividades trans-ativadora e estabilizadora da proteína e tem sido implicado na interação de Tat com integrina αvβ5. Peptídeos que cercam o domínio básico de Tat induzem o crescimento e a migração das células endoteliais em cultura, potencializam a captura de Tat e a trans-ativação, e ativam os receptores de quinase de tirosina (quinase que fosforila resíduos de tirosina). O alinhamento do domínio com outros fatores de ligação a heparina proporcionam uma seqüência consensual rude para a interação de heparina com resíduos de Arg e Lys em conjuntos. Estudos de mutagênese de sítio direcionada da proteína Tat serão necessários para validar esta hipótese.

Tat é um potente trans-ativador essencial para a replicação viral. Ela pode ser liberada das células infectadas e entrar em novas células em uma forma ativa, onde estimula a atividade transcricional do LTR do HIV. Esse mecanismo pode explicar a explosão de replicação associada com as fases iniciais da infecção por HIV, onde a replicação sincronizada dos vírions tomam lugar. Tat também parece ter um número de efeitos biológicos aparte da trans-ativação do LTR os quais podem ser responsáveis por algumas síndromes associadas à AIDS. A expressão do gene HIV-1 Tat em camundongos transgênicos resulta em lesões angiogênicas na pele e aumento de incidência de adeno-carcinomas, linfomas e hepatocarcinomas. Tat é um fator de crescimento para as células derivadas do sarcoma de Kaposi e para as células endoteliais e exerce atividade angiogênica ‘in vivo’. A Tat pode atuar num importante papel na metástase tumoral, possivelmente por modulação da produção da protease por células transformadas. Finalmente a Tat parece mediar as afecções neurológicas que freqüentemente ocorrem na AIDS possivelmente como conseqüência de um efeito tóxico direto sobre os neurônios, ou ativação anormal do endotélio no sistema nervoso central.

Essas observações indicam que a interferência farmacológica das interações Tat-HS podem ser um alvo para o bloqueio de patologias associadas à AIDS, incluindo o sarcoma de Kaposi, e possivelmente a replicação do HIV por si mesmo. A este respeitos, é interessante notar que os polissacarídeos sulfatados, incluindo heparina e sulfato de dextran, tem sido noticiados por seus efeitos inibidores da infecção por HIV ‘in vitro’. Polissacarídeos sulfatados podem agir no nível da ligação viral e penetração na célula hospedeira e previnem a interação de gp120 com CD4. Nossos dados emergem a possibilidade de que polissacarídeos sulfatados possam inibir a replicação do HIV também por inibição da atividade de Tat. Tat tem sido recentemente proposta como um alvo específico para a vacina contra a AIDS. Essa observação suporta fortemente o potencial de uso de antagonistas de Tat na infecção por HIV. Assim a elucidação das bases moleculares da interação Tat-heparina (e heparan sulfato) ajudarão a sintetizar sacarídeos análogos com feitios especificamente designados para terapias farmacológicas.


Fonte : Interaction of HIV-1 Tat Protein with Heparin

ROLE OF THE BACKBONE STRUCTURE, SULFATION, AND SIZE*
(Received for publication, November 14, 1996, and in revised form, January 16, 1997)

Marco Rusnati, Daniela Coltrini, Pasqua Oreste‡, Giorgio Zoppetti‡, Adriana Albini§,
Douglas Noonan§, Fabrizio d’Adda di Fagagna¶, Mauro Giacca¶, and Marco Prestai