*603035 INTERLEUKIN 16; IL16
Alternative titles; symbols
LYMPHOCYTE CHEMOATTRACTANT FACTOR; LCF
Gene map locus 15q26.1
TEXT
CLONAGEM
Cruikshank e Center (1982) noticiaram a caracterização funcional e bioquímica do fator quimioatrativo dos linfócitos, o qual foi subseqüentemente renomeado interleucina 16. Cruikshank e outros (1994) clonaram um cDNA de IL 16 de 2.2 quilobases, codificando uma proteína de 130 aminoácidos, a partir de uma biblioteca de cDNA de células mononucleares do sangue periférico humano estimuladas por mitógenos. Banet e outros (1996) acharam que o cDNA isolado por Cruikshank e outros (1994) é parte de uma estrutura de leitura aberta (seqüência genética aberta para transcrição) muito mais longa e sugeriram que a proteína IL 16 codificada com 130 aminoácidos é derivada de uma proteína precursora maior, a pró-IL-16. Baier e outros (1997) clonaram cDNAs adicionais de IL-16 usando uma RACE de primer 5 e noticiaram que a pro-IL16 deduzida tem 631 aminoácidos e uma massa molecular calculada em 67 quilodáltons. Análises de Western blot (para proteína) detectaram proteínas de pró-IL 16 de 80 quilodáltons em células lisadas. Os autores mostraram que proteínas pro-IL16 recombinantes são especificamente clivadas em lisados de células CD8+, resultando numa proteína que é menor do que o poli-peptídeo de 130 aminoácidos. Por análises de Northern blot (RNA), eles demonstraram a expressão de um transcrito de IL-16 maior de 2.6 quilobases em tecidos linfáticos.
Ponderando que a análise comparativa de IL16 humana e murina homólogas pode revelar estruturas conservadas que são regiões funcionais-chave dessas citocinas, Keane e outros (1998) clonaram o cDNA de IL-16 murina e encontraram um alto grau de similaridade de aminoácidos entre as proteínas precursoras de IL16 murina e humana. Similaridade mais alta (82.1%) foi encontrada na região C-terminal, a qual é clivada a partir da pró-IL16 para produzir IL16 biologicamente ativa. Outros estudos demonstraram um alto grau de similaridade estrutural e funcional entre a IL16 humana e murina e sugeriram que os aminoácidos no terminal C são críticos para sua função quimioatrativa. Os dados também sugeriram a conservação das estruturas de receptores de IL16 entre as espécies.
FUNÇÃO DO GENE
Cruikshank e outros (1994) declararam que os sinais pró-inflamatórios da citocina IL16 via CD4 induzem respostas quimiotáxicas e imunomodulatórias de linfócitos CD4+, monócitos e eosinófilos.
Bandeira-Melo e outros (2002) mostraram que, na ausência do bloqueio de CD4, IL 16 sinalizaram através de CD4 em eosinófilos de modo dependente da dose e induziram a liberação do leucotrieno C4 (LT – significa leucotrieno e C4 indica que essa substância pode efetuar quatro ligações duplas – LTCA), assim como de eotaxina (CCL11) e RANTES (CCL5). De maneira autócrina (por auto-estimulação), RANTES e otaxina sinalizaram através de seus receptores de membrana, CCR3, e aumentaram a secreção de LTC4 e de IL4 pelos eosinófilos, mas não de IL12.
Lynch e outros (2003) observaram uma resposta migratória preferencial nas células TH1 do camundongo, as quais expressavam CCR5, comparadas com células TH2, as quais expressavam pouca CCR5. Células T de camundongos deficientes em CCR5 foram incapazes de migrar em resposta a IL16. Em células transmitidas com osteosarcoma humano, a presença de CCR5 significativamente aumentou a ligação de IL16 comparada com as células com somente CD4; entretanto, a IL16 não pode ligar a CCR5 sozinha. Lynch e outros (2003) concluíram que o aumento da estimulação de IL16 por CCR5 atua num papel (prescrição, roteiro) na regulação do recrutamento de células TH1 e ativação em sítios de inflamação.
ESTRUTURA DO GENE
Bannet e outros (1999) noticiaram que o gene humano de IL16 de 12.8 quilobases compreende sete éxons e seis íntrons. Eles demonstraram uma similaridade rigorosa entre a estrutura dos genes do camundongo e humano.
MAPEAMENTO
Através de análises de Southern blot e PCR usando um painel de mapeamento de células humanas hibridizadas com as de roedores, Drwinga e outros (1993) determinaram que a IL16 é codificada por uma única cópia do gene no cromossomo 15. Usando uma combinação de mapeamento contendo STS, mapeamento de radiação híbrida, e mapeamento genético, Hudson e outros (1995) refinaram a assinatura em 15q26.1. Por FISH, Bannet e outros (1999) mapearam o gene IL16 do camundongo no cromossomo 7 em uma região apresentando homologia de sintena para a região 15q26.1 humana.
segunda-feira, 29 de setembro de 2008
domingo, 28 de setembro de 2008
LINFÓCITOS TCD8+ REGULAM A RESPOSTA ARTERIOGÊNICA À ISQUEMIA POR INFILTRAÇÃO DO SÍTIO DE DESENVOLVIMENTO DOS VASOS COLATERAIS E RECRUTAMENTO DE CÉLULAS CD4+ MONONUCLEARES ATRAVÉS DA EXPRESSÃO DA INTERLEUCINA 16 (IL-16)
In: http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/113/1/118
EXPERIÊNCIA:
Estudos prévios têm demonstrado que macrófagos e linfócitos T CD4+ atuam em papéis centrais no desenvolvimento colateral. Evidências indiretas sugerem que células TCD8 também tenham um papel. Assim, após a isquemia cerebral aguda, as células T CD8+ infiltram o espaço perivascular e secretam interleucina 16 (IL-16), um potente quimo-atrativo para monócitos e células T CD4+. Nós testamos se os linfócitos T CD8+ contribuem para o desenvolvimento de vasos colaterais e se a falta de células T CD8+ circulando impede a expressão de IL-16, debilitam o recrutamento de células mononucleares CD4+ e reduzem o crescimento de vasos colaterais após a ligação da artéria femoral em camundongos CD8 -/-.
MÉTODOS E RESULTADOS:
Após a excisão cirúrgica da artéria femoral, as imagens de perfusão a laser Doppler demonstraram reduzida recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/- comparados com camundongos C57/BL6 (isquêmicos/ não-isquêmicos do membro no 28o dia, 0.66 + 0.04 versus 0.87 + 0.04, respectivamente; P< 0.01). Isto resultou em maior atrofia do músculo da panturrilha (média de área fibrosa 785+68 versus 1067+69 µm2, respectivamente; P<0.01) e aumentado contingente de tecido fibroso (10.8 +1.2% versus 7+ 1%, respectivamente; P<0.01). Além disso, camundongos CD8 -/- apresentaram reduzida expressão de IL-16 e recrutamento de células T CD4+ reduzido no sítio de desenvolvimento de vasos colaterais. Células T CD8+ exógenas, infundidas aos camundongos CD8 -/- imediatamente após a ligação da artéria femoral, direcionaram-se seletivamente para o membro isquêmico traseiro e expressaram IL-16. A restauração da expressão de IL-16 resultou em significativa infiltração de células CD4 mononucleares do membro isquêmico, recuperação mais rápida do fluxo sangüíneo, e reduzida atrofia/fibrose do músculo traseiro do membro. Quando células T CD8+ deficientes em IL-16 (IL-16 -/-) foram infundidas em camundongos CD8 -/- imediatamente após a ligação da artéria femoral, elas direcionaram-se seletivamente para o membro traseiro isquêmico mas foram incapazes de recrutar células CD4+ mononucleares e não melhoraram a recuperação do fluxo sangüíneo.
CONCLUSÕES:
Esses resultados demonstraram que as células T CD8+ contribuem com muita importância para a fase inicial do desenvolvimento colateral. Após a ligação da artéria femoral, as células T CD8+ infiltram o sítio de crescimento dos vasos colaterais e recrutam as células mononucleares CD4+ através da expressão de IL-16. Nossos estudos proporcionam evidência adicional do papel significativo do sistema imune na modulação do desenvolvimento colateral na resposta à isquemia periférica.
(Circulation.2006; 113:118-124)
Aterosclerose é a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Um dos mecanismos compensatórios envolvidos na resposta ao enfraquecimento do fluxo sangüíneo que segue o desenvolvimento da placa aterosclerótica é a formação de vasos colaterais.
PERSPECTIVAS CLÍNICAS:
Recentemente tem sido mostrado que componentes celulares dos sistemas imune e inflamatório atuam num papel central na modulação do desenvolvimento de vasos colaterais. Em particular, várias investigações têm demonstrado a importância dos monócitos/macrófagos na colaterogênese (angiogênese colateral). Um estudo indicando que camundongos “despidos” (que são deficientes em todos os componentes da população de células T) exibem um pronunciado déficit em respostas colaterais, sugeriu um possível papel dos sub-conjuntos CD4+ e CD8+ na aterogênese colateral. O conceito de que linfócitos T CD4+ atuam tal como um papel (repertório) foi confirmado por recentes demonstrações de que na ausência dos linfócitos T CD4+, as respostas inflamatória e colateral após a indução da isquemia são enfraquecidas.
Estudos de infartos cerebrais em humanos sugerem que linfócitos TCD4+ não são as únicas células T envolvidas na ateriogênese colateral. Assim, dentro das primeiras poucas horas de injúria, células T CD8+ infiltram a periferia dos infartos cerebrais. Uma vez lá, essas células secretam interleucina 16, um potente quimoatrativo para várias células dos sistemas imune e inflamatório, incluindo monócitos e células TCD4. Dados os papéis dos monócitos e dos linfócitos T CD4 no processo da ateriogênese colateral, a presente investigação foi designada para testar a hipótese de que linfócitos T CD8+ são críticos para o desenvolvimento colateral induzido por isquemia e que este efeito é dependente da expressão do quimoatrativo de células imunes IL-16. Neste objetivo, nós usamos um modelo de isquemia do membro traseiro para determinar se a recuperação do fluxo sangüíneo mediada pelo colateral (fluxo) após aguda indução de isquemia está diminuída em camundongos sem CD8 ativa (CD8-/-) em comparação com o camundongo controle de tipo selvagem C57BL/6.
MÉTODOS:
MODELO DE CAMUNDONGO COM ISQUEMIA UNILATERAL DO MEMBRO POSTERIOR (TRASEIRO).
Sob narcose com xilazina [um sedativo hipnótico e anestésico ] (40 mg/kg) e cetamina [anestésico](100mg/kg) intra-muscular, camundongos CD8a-/- e C57BL/6 de doze semanas de idade (Laboratórios Jackson) foram submetidos à ligação cirúrgica da artéria femoral esquerda para criar uma isquemia unilateral do membro traseiro. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado animal do Instituto de Pesquisas Med Star.
IMAGEM DE PERFUSÃO:
Repetidas medições do fluxo sangüíneo do membro posterior na região de interesse (desde a rótula do joelho até o meio do pé) foram obtidas em linha de base, imediatamente pós operatoriamente, e serialmente durante 4 (quatro) semanas com imagem de perfusão a laser Doppler (LDPI) (Instrumentos Moor). A perfusão é expressada como uma razão do membro esquerdo (isquêmico) para o direito (normal). A região de interesse não inclui o pé distante porque essa área é mais sujeita à isquemia nesse modelo de animal (camundongo).
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO DO MEMBRO E DANO ISQUÊMICO IN VIVO:
A avaliação semi-quantitativa de uso diminuído do membro isquêmico e a medida semi-quantitativa do dano isquêmico foram realizados em série.
ANÁLISES DE WESTERN BLOT (transferência de proteínas de um gel de agarose para uma membrana de náilon ou nitrocelusose, onde a proteína procurada pode ser identificada por corantes) E IMUNO-HISTOQUÍMICAS:
Em diferentes pontos de tempo após a cirurgia, os músculos adutores (músculos adutores são os que promovem o alongamento do membro) estavam homogeneizados em mistura de gelo frio, e as proteínas foram extraídas, separadas com SOS-PAGE, e manchadas (tingidas) dentro de nitrocelulose (Invitrogen). Manchas foram incubadas com anticorpos primários (1:250 para anti-IL-16; 1:1000 para α-tubulina; Santa Cruz). Nos mesmos pontos de tempo, os músculos adutores foram seccionados com criostato, fixados em metanol, bloqueados e incubados durante a noite com anticorpos primários (1:50 para anti-IL-16; 1:50 para anti-CD4; Santa Cruz). DAPI foi usado para obter faixas nucleares. Um microscópio óptico (Olympus BX41, Olympus) e um software de Imagem Pro Plus (Media Optronics) foram usados para analisar a infiltração celular.
ANÁLISES HISTOLÓGICAS:
Após a avaliação durante 28 dias completos, os músculos do membro traseiro foram removidos e fixados em formalina. Sobre a coxa anterior, secções foram preparadas e tingidas com solução van Gieson. Somente as artérias foram contadas. Veias foram identificadas como artérias se tinham lâminas elásticas internas contínuas, ao menos uma camada de eixo muscular, e uma área matematicamente derivada maior que 30µm2. O número de artérias presentes em cada coxa foi expressado como a razão do número de artérias para a área superficial do músculo analisado. A partir do gastrocnêmio (panturrilha) , secções foram preparadas e depois tingidas com Sirius vermelho, e a fração volumétrica do colágeno foi determinada. Nas mesmas secções, a área muscular foi calculada e dividida pelo número de fibras musculares presente no campo para obter a média do tamanho da fibra para um campo dado.
EXPERIMENTOS DE RESGATE POR INFUSÃO DE CÉLULAS CD8+ A PARTIR DE CAMUNDONGOS C57BL/6 E CAMUNDONGOS IL-16-/- :
Células mononucleares foram isoladas a partir de baços de camundongos C57BL/6 ou IL-16 -/- (em segundo plano C57BL/6) de idade e gênero correspondentes e separados em frações de CD8+e CD8- com seleção positiva (não sendo por exclusão) por classificação magnética (Miltenyi Biotecnology, Inc).
Na indução de isquemia, 3x 105 células CD8+/IL-16 -/- foram infundidas intra-venosamente em camundongos CD8 ‑/-. Para avaliar o direcionamento de células injetadas, um sub-grupo de camundongos foi injetado com o mesmo número de células classificadas por CFSE [citometria de fluxo com sonda eletrônica](Molecular Probes, Inc). Os animais foram sacrificados serialmente durante 48 horas e músculos foram preparados por detecção de fluorescência. A porcentagem de células marcadas em diferentes campos da infiltração inflamatória foi calculada.
ANÁLISES ESTATÍSTICAS:
Todos os resultados foram apresentados como significado de + (mais ou menos) SEM [microscopia com sondagem eletrônica – scanning electron microscopia]. Um teste T Student emparelhado foi usado para comparar os valores brutos e analisados. REMANOVA foi usado para comparar valores entre os grupos todo o tempo. Um valor de P=0.05 foi considerado significativo.
FLUXO SANGÜÍNEO DO MEMBRO TRASEIRO RECUPERADO APÓS A LIGAÇÃO DA ARTÉRIA FEMORAL
Em camundongos controle, o fluxo sangüíneo foi cortado precipitadamente/acentuadamente após a cirurgia, permaneceu diminuído por três dias, aumentado para 70% do valor no membro não isquêmico por sete dias, e finalmente retornou aos níveis próximos do normal ao final do acompanhamento. Uma redução similar do fluxo sangüíneo do membro posterior ocorreu em camundongos CD8 -/-, mas em contraste com os camundongos controle, a recuperação do fluxo foi marcadamente atenuada. Comparado com C57BL/6, o fluxo em camundongos CD8-/- foi significativamente menor no terceiro dia, uma diferença persistente em cada um dos pontos de tempo subseqüentes (7o, 14 o e 28 o dias); o fluxo nunca atingiu mais do que 65% daquele medido no membro contra-lateral. Em camundongos controle, o uso ativo do pé direito cortado significativamente após a cirurgia permaneceu diminuído por sete dias, e gradualmente retornou para os níveis próximos do normal em 28 dias (contagem de enfraquecimento locomotor, 0.23 + 0.16). Uma redução abrupta similar no uso ativo do membro posterior ocorreu nos camundongos CD8-/-, mas a recuperação foi marcadamente atenuada no sétimo dia (contagem de enfraquecimento da atividade locomotora 1.7+ 0.18; P<0.05> 0.05) e resultou em uma aumentada incidência de auto-amputações menores pelo 28o dia. Ao final do estudo, animais CD8-/- apresentaram uma significativa redução na densidade das artérias colaterais no alto da coxa do membro traseiro operado em comparação com os camundongos C57BL/6 (0.33 + 0.02 versus 0.44 + 0.04 artérias > 300µm2/mm2 de área muscular; P < 0.05). Nenhuma diferença foi observada nos membros não operados.
CONDIÇÃO DE SAÚDE DO ANIMAL APÓS A ISQUEMIA DO MEMBRO TRASEIRO INDUZIDA CIRURGICAMENTE
Os camundongos CD8-/- podem ser mais suscetíveis do que os de tipo selvagem à infecções sobrepostas resultantes da cirurgia, as quais afetam sua capacidade de recuperação. Para excluir essa possibilidade, pelo menos enquanto relacionadas a infecções bacterianas, nós cultivamos espécies do músculo isquêmico no sétimo dia após a cirurgia. Nenhum crescimento bacteriano foi detectado em cada grupo. Assim, a incidência aumentada de necrose tecidual no membro isquêmico de camundongos CD-/- não pode ser atribuída à gangrena séptica. Mais do que isso, os camundongos CD8-/- exibiram durante o acompanhamento o mesmo ganho de peso que os camundongos C57BL/6, demonstrando uma ausência de qualquer efeito principal da cirurgia na saúde geral desses camundongos.
In: http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/113/1/118
EXPERIÊNCIA:
Estudos prévios têm demonstrado que macrófagos e linfócitos T CD4+ atuam em papéis centrais no desenvolvimento colateral. Evidências indiretas sugerem que células TCD8 também tenham um papel. Assim, após a isquemia cerebral aguda, as células T CD8+ infiltram o espaço perivascular e secretam interleucina 16 (IL-16), um potente quimo-atrativo para monócitos e células T CD4+. Nós testamos se os linfócitos T CD8+ contribuem para o desenvolvimento de vasos colaterais e se a falta de células T CD8+ circulando impede a expressão de IL-16, debilitam o recrutamento de células mononucleares CD4+ e reduzem o crescimento de vasos colaterais após a ligação da artéria femoral em camundongos CD8 -/-.
MÉTODOS E RESULTADOS:
Após a excisão cirúrgica da artéria femoral, as imagens de perfusão a laser Doppler demonstraram reduzida recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/- comparados com camundongos C57/BL6 (isquêmicos/ não-isquêmicos do membro no 28o dia, 0.66 + 0.04 versus 0.87 + 0.04, respectivamente; P< 0.01). Isto resultou em maior atrofia do músculo da panturrilha (média de área fibrosa 785+68 versus 1067+69 µm2, respectivamente; P<0.01) e aumentado contingente de tecido fibroso (10.8 +1.2% versus 7+ 1%, respectivamente; P<0.01). Além disso, camundongos CD8 -/- apresentaram reduzida expressão de IL-16 e recrutamento de células T CD4+ reduzido no sítio de desenvolvimento de vasos colaterais. Células T CD8+ exógenas, infundidas aos camundongos CD8 -/- imediatamente após a ligação da artéria femoral, direcionaram-se seletivamente para o membro isquêmico traseiro e expressaram IL-16. A restauração da expressão de IL-16 resultou em significativa infiltração de células CD4 mononucleares do membro isquêmico, recuperação mais rápida do fluxo sangüíneo, e reduzida atrofia/fibrose do músculo traseiro do membro. Quando células T CD8+ deficientes em IL-16 (IL-16 -/-) foram infundidas em camundongos CD8 -/- imediatamente após a ligação da artéria femoral, elas direcionaram-se seletivamente para o membro traseiro isquêmico mas foram incapazes de recrutar células CD4+ mononucleares e não melhoraram a recuperação do fluxo sangüíneo.
CONCLUSÕES:
Esses resultados demonstraram que as células T CD8+ contribuem com muita importância para a fase inicial do desenvolvimento colateral. Após a ligação da artéria femoral, as células T CD8+ infiltram o sítio de crescimento dos vasos colaterais e recrutam as células mononucleares CD4+ através da expressão de IL-16. Nossos estudos proporcionam evidência adicional do papel significativo do sistema imune na modulação do desenvolvimento colateral na resposta à isquemia periférica.
(Circulation.2006; 113:118-124)
Aterosclerose é a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Um dos mecanismos compensatórios envolvidos na resposta ao enfraquecimento do fluxo sangüíneo que segue o desenvolvimento da placa aterosclerótica é a formação de vasos colaterais.
PERSPECTIVAS CLÍNICAS:
Recentemente tem sido mostrado que componentes celulares dos sistemas imune e inflamatório atuam num papel central na modulação do desenvolvimento de vasos colaterais. Em particular, várias investigações têm demonstrado a importância dos monócitos/macrófagos na colaterogênese (angiogênese colateral). Um estudo indicando que camundongos “despidos” (que são deficientes em todos os componentes da população de células T) exibem um pronunciado déficit em respostas colaterais, sugeriu um possível papel dos sub-conjuntos CD4+ e CD8+ na aterogênese colateral. O conceito de que linfócitos T CD4+ atuam tal como um papel (repertório) foi confirmado por recentes demonstrações de que na ausência dos linfócitos T CD4+, as respostas inflamatória e colateral após a indução da isquemia são enfraquecidas.
Estudos de infartos cerebrais em humanos sugerem que linfócitos TCD4+ não são as únicas células T envolvidas na ateriogênese colateral. Assim, dentro das primeiras poucas horas de injúria, células T CD8+ infiltram a periferia dos infartos cerebrais. Uma vez lá, essas células secretam interleucina 16, um potente quimoatrativo para várias células dos sistemas imune e inflamatório, incluindo monócitos e células TCD4. Dados os papéis dos monócitos e dos linfócitos T CD4 no processo da ateriogênese colateral, a presente investigação foi designada para testar a hipótese de que linfócitos T CD8+ são críticos para o desenvolvimento colateral induzido por isquemia e que este efeito é dependente da expressão do quimoatrativo de células imunes IL-16. Neste objetivo, nós usamos um modelo de isquemia do membro traseiro para determinar se a recuperação do fluxo sangüíneo mediada pelo colateral (fluxo) após aguda indução de isquemia está diminuída em camundongos sem CD8 ativa (CD8-/-) em comparação com o camundongo controle de tipo selvagem C57BL/6.
MÉTODOS:
MODELO DE CAMUNDONGO COM ISQUEMIA UNILATERAL DO MEMBRO POSTERIOR (TRASEIRO).
Sob narcose com xilazina [um sedativo hipnótico e anestésico ] (40 mg/kg) e cetamina [anestésico](100mg/kg) intra-muscular, camundongos CD8a-/- e C57BL/6 de doze semanas de idade (Laboratórios Jackson) foram submetidos à ligação cirúrgica da artéria femoral esquerda para criar uma isquemia unilateral do membro traseiro. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidado animal do Instituto de Pesquisas Med Star.
IMAGEM DE PERFUSÃO:
Repetidas medições do fluxo sangüíneo do membro posterior na região de interesse (desde a rótula do joelho até o meio do pé) foram obtidas em linha de base, imediatamente pós operatoriamente, e serialmente durante 4 (quatro) semanas com imagem de perfusão a laser Doppler (LDPI) (Instrumentos Moor). A perfusão é expressada como uma razão do membro esquerdo (isquêmico) para o direito (normal). A região de interesse não inclui o pé distante porque essa área é mais sujeita à isquemia nesse modelo de animal (camundongo).
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO DO MEMBRO E DANO ISQUÊMICO IN VIVO:
A avaliação semi-quantitativa de uso diminuído do membro isquêmico e a medida semi-quantitativa do dano isquêmico foram realizados em série.
ANÁLISES DE WESTERN BLOT (transferência de proteínas de um gel de agarose para uma membrana de náilon ou nitrocelusose, onde a proteína procurada pode ser identificada por corantes) E IMUNO-HISTOQUÍMICAS:
Em diferentes pontos de tempo após a cirurgia, os músculos adutores (músculos adutores são os que promovem o alongamento do membro) estavam homogeneizados em mistura de gelo frio, e as proteínas foram extraídas, separadas com SOS-PAGE, e manchadas (tingidas) dentro de nitrocelulose (Invitrogen). Manchas foram incubadas com anticorpos primários (1:250 para anti-IL-16; 1:1000 para α-tubulina; Santa Cruz). Nos mesmos pontos de tempo, os músculos adutores foram seccionados com criostato, fixados em metanol, bloqueados e incubados durante a noite com anticorpos primários (1:50 para anti-IL-16; 1:50 para anti-CD4; Santa Cruz). DAPI foi usado para obter faixas nucleares. Um microscópio óptico (Olympus BX41, Olympus) e um software de Imagem Pro Plus (Media Optronics) foram usados para analisar a infiltração celular.
ANÁLISES HISTOLÓGICAS:
Após a avaliação durante 28 dias completos, os músculos do membro traseiro foram removidos e fixados em formalina. Sobre a coxa anterior, secções foram preparadas e tingidas com solução van Gieson. Somente as artérias foram contadas. Veias foram identificadas como artérias se tinham lâminas elásticas internas contínuas, ao menos uma camada de eixo muscular, e uma área matematicamente derivada maior que 30µm2. O número de artérias presentes em cada coxa foi expressado como a razão do número de artérias para a área superficial do músculo analisado. A partir do gastrocnêmio (panturrilha) , secções foram preparadas e depois tingidas com Sirius vermelho, e a fração volumétrica do colágeno foi determinada. Nas mesmas secções, a área muscular foi calculada e dividida pelo número de fibras musculares presente no campo para obter a média do tamanho da fibra para um campo dado.
EXPERIMENTOS DE RESGATE POR INFUSÃO DE CÉLULAS CD8+ A PARTIR DE CAMUNDONGOS C57BL/6 E CAMUNDONGOS IL-16-/- :
Células mononucleares foram isoladas a partir de baços de camundongos C57BL/6 ou IL-16 -/- (em segundo plano C57BL/6) de idade e gênero correspondentes e separados em frações de CD8+e CD8- com seleção positiva (não sendo por exclusão) por classificação magnética (Miltenyi Biotecnology, Inc).
Na indução de isquemia, 3x 105 células CD8+/IL-16 -/- foram infundidas intra-venosamente em camundongos CD8 ‑/-. Para avaliar o direcionamento de células injetadas, um sub-grupo de camundongos foi injetado com o mesmo número de células classificadas por CFSE [citometria de fluxo com sonda eletrônica](Molecular Probes, Inc). Os animais foram sacrificados serialmente durante 48 horas e músculos foram preparados por detecção de fluorescência. A porcentagem de células marcadas em diferentes campos da infiltração inflamatória foi calculada.
ANÁLISES ESTATÍSTICAS:
Todos os resultados foram apresentados como significado de + (mais ou menos) SEM [microscopia com sondagem eletrônica – scanning electron microscopia]. Um teste T Student emparelhado foi usado para comparar os valores brutos e analisados. REMANOVA foi usado para comparar valores entre os grupos todo o tempo. Um valor de P=0.05 foi considerado significativo.
FLUXO SANGÜÍNEO DO MEMBRO TRASEIRO RECUPERADO APÓS A LIGAÇÃO DA ARTÉRIA FEMORAL
Em camundongos controle, o fluxo sangüíneo foi cortado precipitadamente/acentuadamente após a cirurgia, permaneceu diminuído por três dias, aumentado para 70% do valor no membro não isquêmico por sete dias, e finalmente retornou aos níveis próximos do normal ao final do acompanhamento. Uma redução similar do fluxo sangüíneo do membro posterior ocorreu em camundongos CD8 -/-, mas em contraste com os camundongos controle, a recuperação do fluxo foi marcadamente atenuada. Comparado com C57BL/6, o fluxo em camundongos CD8-/- foi significativamente menor no terceiro dia, uma diferença persistente em cada um dos pontos de tempo subseqüentes (7o, 14 o e 28 o dias); o fluxo nunca atingiu mais do que 65% daquele medido no membro contra-lateral. Em camundongos controle, o uso ativo do pé direito cortado significativamente após a cirurgia permaneceu diminuído por sete dias, e gradualmente retornou para os níveis próximos do normal em 28 dias (contagem de enfraquecimento locomotor, 0.23 + 0.16). Uma redução abrupta similar no uso ativo do membro posterior ocorreu nos camundongos CD8-/-, mas a recuperação foi marcadamente atenuada no sétimo dia (contagem de enfraquecimento da atividade locomotora 1.7+ 0.18; P<0.05> 0.05) e resultou em uma aumentada incidência de auto-amputações menores pelo 28o dia. Ao final do estudo, animais CD8-/- apresentaram uma significativa redução na densidade das artérias colaterais no alto da coxa do membro traseiro operado em comparação com os camundongos C57BL/6 (0.33 + 0.02 versus 0.44 + 0.04 artérias > 300µm2/mm2 de área muscular; P < 0.05). Nenhuma diferença foi observada nos membros não operados.
CONDIÇÃO DE SAÚDE DO ANIMAL APÓS A ISQUEMIA DO MEMBRO TRASEIRO INDUZIDA CIRURGICAMENTE
Os camundongos CD8-/- podem ser mais suscetíveis do que os de tipo selvagem à infecções sobrepostas resultantes da cirurgia, as quais afetam sua capacidade de recuperação. Para excluir essa possibilidade, pelo menos enquanto relacionadas a infecções bacterianas, nós cultivamos espécies do músculo isquêmico no sétimo dia após a cirurgia. Nenhum crescimento bacteriano foi detectado em cada grupo. Assim, a incidência aumentada de necrose tecidual no membro isquêmico de camundongos CD-/- não pode ser atribuída à gangrena séptica. Mais do que isso, os camundongos CD8-/- exibiram durante o acompanhamento o mesmo ganho de peso que os camundongos C57BL/6, demonstrando uma ausência de qualquer efeito principal da cirurgia na saúde geral desses camundongos.
(contiuação de LINFÓCITOS TCD8+ REGULAM A RESPOSTA ARTERIOGÊNICA À ISQUEMIA POR INFILTRAÇÃO DO SÍTIO DE DESENVOLVIMENTO DOS VASOS COLATERAIS E RECRUTAMENTO DE CÉLULAS CD4+ MONONUCLEARES ATRAVÉS DA EXPRESSÃO DA INTERLEUCINA 16 (IL-16)
In: http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/113/1/118)
EFEITO DA RECONSTITUIÇÃO DAS CÉLULAS CD8+ EM CAMUNDONGOS CD8-/- SUJEITADOS À ISQUEMIA DO MEMBRO TRASEIRO:
Imediatamente após a cirurgia infundimos intravenosamente nos camundongos CD8-/- células T CD8+ purificadas derivadas do baço de camundongos controle (do grupo CD8+). As células CD8+ exógenas direcionaram-se seletivamente para áreas de infiltração de células inflamatórias do membro traseiro isquêmico. Nenhuma célula CD8+ exógena foi encontrada infiltrando fibras musculares do membro traseiro colateral. O fluxo sangüíneo ao entorno (fora do centro) diminuiu nos camundongos CD8-/- que receberam infusão de células CD8+ purificadas (grupo tratado com CD8+) em comparação com os camudongos que receberam esplenócitos (células do baço) CD8- (grupo tratado com CD8-). Durante o acompanhamento, em todos os pontos de tempo, a recuperação do fluxo sangüíneo nos camundongos do grupo tratado com CD8+ foi similar àqueles camundongos de tipo selvagem C57BL/6. Esses camundongos exibem reduzido dano isquêmico, como observado por diminuída aparência do membro e reduzido enfraquecimento locomotor.
EXTENSÃO DO DANO ISQUÊMICO FORA DO MEMBRO:
Para confirmar os resultados derivados de dados LDPI (Imagem de Perfusão a Laser Doppler) e da análise patológica do desenvolvimento de vasos colaterais, nós procedemos a uma estimativa/avaliação adicional independente do dano isquêmico dos membros traseiros operados por análise da extensão de fibrose/atrofia do músculo gastrocnêmio (da panturrilha). O exame de necropsia do músculo da barriga da perna 28 dias após a cirurgia revelou um conteúdo pronunciado de tecido mais fibrótico (10.8 + 1.2% versus 6.6 + 1.3%; P<0.01) e aumentada atrofia da fibra muscular em CD8-/- comparados com camundongos de tipo selvagem C57BL/6 (indica área de fibra, 785 + 68 versus 1067 + 69 m2; P<0.01). Além disso, a melhora na recuperação do fluxo sangüíneo do membro traseiro observada no grupo tratado com CD8+ foi associada com reduzida fibrose muscular e atrofia. Nenhuma diferença de fibrose/atrofia foi detectada no âmbito do músculo entre os grupos originais de camundongos CD8-/- e camundongos tratados com CD8-.
RESPOSTAS DE INFLAMAÇÃO TECIDUAL À ISQUEMIA:
Nós examinamos o músculo adutor do membro operado 48 horas após a ligação da artéria. Manchas de hematoxilina (corante usado em histologia para núcleos e cromossomas celulares, estrias musculares transversais e células eterocromafins; a substância cristalina contendo o corante hematoxylon campechianum (pau de Campeche) do qual é extraído com éter) e de eosina (derivado de fluoresceína usado como corante ácido fluorescente para coloração e concentrações citoplasmáticas em histologia) revelaram diferentes números de leucócitos inflamatórios nos camundongos de tipo selvagem versus camundongos CD8-/-. Em particular, o número de leucócitos CD4+ infiltrantes era mais baixo em camundongos CD8-/- do que nos camundongos de tipo selvagem. Além disso, nos animais de controle, a IL-16 foi induzida após a ligação da artéria femoral e foi expressada no sítio de infiltração da célula mononuclear. Em contraste, a expressão da IL-16 após a isquemia foi reduzida nos camundongos CD8-/-.
A DEFICIÊNCIA DE IL-16 DIMINUIU A CAPACIDADE DE CÉLULAS CD8+ EXÓGENAS RESTITUÍREM A RECUPERAÇÃO DO FLUXO SANGÜÍNEO EM CAMUNDONGOS CD8-/- :
Em camundongos CD8-/-, a expressão de IL-16 no músculo isquêmico foi observada no sítio de infiltração da célula exógena em dois dias após a ligação da artéria femoral e de infusão de células CD8+. A co-localização de CFSE e sinal fluorescente de IL-16 demonstrou que, em camundongos reconstituídos CD8-/-, as células CD8+ exógenas expressam L-16. Em 48 horas após a ligação da artéria femoral, no membro isquêmico de camundongos CD8-/- tratados com células CD8+, a expressão de IL-16 foi quase igual àquela observada nos camundongos de tipo selvagem C57Bl/6. A presença dessa citocina está associada com um aumentado número de leucócitos infiltrantes nos membros isquêmicos de camundongos CD8-/- tratados com células CD8+ comparados com camundongos tratados com células CD8-. Finalmente, quando as células T CD8+ deficientes em IL-16 foram infundidas em camundongos CD8 -/- após a ligação da artéria femoral, elas seguiram para o membro traseiro isquêmico (dados não apresentados), mas nós não observamos um aumento no recrutamento de células mononucleares CD4+ para os membros traseiros isquêmicos. Essa inibição do recrutamento de células CD4+ está associada com a falta de capacidade para resgatar a recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/- e atrofia muscular mais pronuncada e fibrose do membro isquêmico (dados não mostrados).
DISCUSSÃO:
Os principais achados de nosso estudo são:
1) Desenvolvimento colateral em resposta à isquemia é enfraquecido em camundongos CD8-/- comparados aos camundongos de tipo selvagem C57BL/6 de controle;
2) Camundongos CD8-/- têm reduzida expressão de IL-16 após a ligação da artéria femoral e diminuída resposta inflamatória no sítio de crescimento dos vasos colaterais;
3) Células T CD8+ purificadas derivadas do baço, quando infundidas em camundongos CD8-/-, localizam-se seletivamente no membro isquêmico, recrutam células CD4+ mononucleares, e aumentam a recuperação do fluxo sangüíneo; e
4) A habilidade das células T CD8+ para regular respostas inflamatórias e recuperação do fluxo sangüíneo após a isquemia é dependente da expressão de IL-16.
Um dos importantes pontos ao final do nosso estudo está baseado na avaliação do fluxo no membro por expressão de LDPI (Doppler). O fluxo estimado de LDPI correlaciona-se bem com a perfusão estimada de microsfera e o número e tamanho da segunda e terceira geração de artérias colaterais bifurcadas/ramificadas. (Obs.: microsferas são diminutos glóbulos de material radio-marcado como albumina macro-carregada, medindo cerca de 15 mícrons.) De acordo com esses dados baseados em LDPI, nós encontramos que o número de artérias colaterais aumentaram significativamente no membro operado dos camundongos de tipo selvagem, mudanças que eram marcadamente atenuadas nos camundongos CD8-/-.
O reduzido desenvolvimento de vasos colaterais observado nos camundongos CD8-/- correlaciona-se com um enfraquecimento funcional mais prolongado e mais severo do membro, uma aumentada incidência de necrose isquêmica, e uma aumentada incidência de auto-amputação. Como um parâmetro independente da severidade de injúria isquêmica em camundongos CD8-/-, nós avaliamos a histologia do músculo da panturrilha quatro semanas após a ligação da artéria femoral. Nesses animais, um determinado tamanho de fibra muscular era marcadamente reduzido comparado com o camundongo de tipo selvagem uma mudança associada com aumento de fibrose muscular.
As diferenças de fluxo entre o camundongo de tipo selvagem e o depletado (CD8-/-) provavelmente superam o limite do fluxo da viabilidade tecidual (pertencem àquele cujas células morrerão). Assim, a diminuição do fluxo em camundongos CD8-/-, embora relativamente pequena, provavelmente contribui para as grandes mudanças que nós observamos na atrofia muscular e na fibrose.
Para provar definitivamente que o desenvolvimento diminuído do fluxo colateral que nós observamos no camundongo CD8-/- era causado por um suprimento deficiente de células T CD8+, nós procedemos a um experimento de resgate no qual nós infundimos células T CD8+ purificadas derivadas do baço em camundongos CD8-/-. As células T CD8+ direcionaram-se seletivamente para o sítio ativo do desenvolvimento colateral, restauraram a recuperação do fluxo para níveis observados nas linhagens parentais de tipo selvagem, e preservou a estrutura muscular da panturrilha, como demonstrado por uma redução da atrofia e fibrose.
Quando nós avaliamos o padrão de resposta inflamatória nos membros isquêmicos de animais CD8-/-, nós observamos que o número global de células mononucleares infiltrando o interstício entre as fibras musculares era mais baixo do que o visto em camundongos de tipo selvagem C57BL/6J. Em particular, o número de células CD4+ infiltrantes foi reduzido em 50%.
IL-16 é um potente quimioatrativo para várias células imunes tais como monócitos, eosinófilos e células dendríticas. Similarmente, a IL-16 tem sido caracterizada como um ligante natural para CD4, através da qual ela induz a resposta migratória nas células T CD4+. A IL-16 também é provável como reguladora do recrutamento e ativação de células TH-1 em sítios de inflamação tais como aqueles de crescimento ativo de vasos colaterais. Quando nós acompanhamos a expressão de IL-16 após a ligação da artéria femoral dos músculos adutores, nós observamos uma falta de indução dessa citocina nos camundongos CD8-/-. De relevância, dentro das primeiras horas de isquemia, as células CD8+ infiltraram a periferia de infartos cerebrais e secretaram IL-16.
Em nossos experimentos, as células TCD8+ de camundongos IL-16 -/- não melhoraram a recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/-, indicando que Il-16 é um possível efetor neste processo. A falta do efeito no fluxo sangüíneo também foi associada com um reduzido recrutamento de células mononucleares CD4+ no sítio de desenvolvimento de vasos colaterais demonstrando assim a importância do papel desta citocina nas fases iniciais da resposta inflamatória à isquemia periférica.
Os colaterais são origem, ao menos em parte, de vasos pré-existentes localizados próximo ao sítio de obstrução arterial e por isso próximo ao tecido isquêmico. Embora pouco ou nenhum fluxo ocorra nesses vasos sob condições normais, o declive de pressão criado pela obstrução distante promove sua abertura e o estabelecimento do fluxo. O aumento no fluxo sangüíneo e a deformação da força ativa as células endoteliais, com subseqüente sobre-regulação de moléculas de adesão celular e citocinas e recrutamento de células inflamatórias resultante.
A presente investigação, em conjunção com os dados avaliados na literatura, demonstra que os linfócitos contribuem importantemente para o processo de remodelagem arterial que leva à gênese de vasos colaterais. Após a indução de isquemia, a resposta inflamatória e o desenvolvimento de vasos colaterais são comprometidos em camundongos deficientes em células T CD4+. No sítio de ativo crescimento de vasos colaterais, na ausência das células T CD4+, existe diminuído recrutamento de macrófagos, os quais são determinantes celulares centrais para o crescimento ótimo de vasos colaterais. Essas células localizam-se à volta das colaterais e secretam vários fatores pró-angiogênicos. Nossos resultados sugerem que células T CD8+ são uma das primeiras respondedoras para o estímulo local envolvido no crescimento colateral. Quando essas células infiltram a região de desenvolvimento de colaterais, elas expressam IL-16, a qual contribui para o recrutamento de células mononucleares CD4+ (células T e macrófagos). Essas células, por sua vez, secretam muitas das citocinas que atuam num papel crítico na colaterogênese.
In: http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/113/1/118)
EFEITO DA RECONSTITUIÇÃO DAS CÉLULAS CD8+ EM CAMUNDONGOS CD8-/- SUJEITADOS À ISQUEMIA DO MEMBRO TRASEIRO:
Imediatamente após a cirurgia infundimos intravenosamente nos camundongos CD8-/- células T CD8+ purificadas derivadas do baço de camundongos controle (do grupo CD8+). As células CD8+ exógenas direcionaram-se seletivamente para áreas de infiltração de células inflamatórias do membro traseiro isquêmico. Nenhuma célula CD8+ exógena foi encontrada infiltrando fibras musculares do membro traseiro colateral. O fluxo sangüíneo ao entorno (fora do centro) diminuiu nos camundongos CD8-/- que receberam infusão de células CD8+ purificadas (grupo tratado com CD8+) em comparação com os camudongos que receberam esplenócitos (células do baço) CD8- (grupo tratado com CD8-). Durante o acompanhamento, em todos os pontos de tempo, a recuperação do fluxo sangüíneo nos camundongos do grupo tratado com CD8+ foi similar àqueles camundongos de tipo selvagem C57BL/6. Esses camundongos exibem reduzido dano isquêmico, como observado por diminuída aparência do membro e reduzido enfraquecimento locomotor.
EXTENSÃO DO DANO ISQUÊMICO FORA DO MEMBRO:
Para confirmar os resultados derivados de dados LDPI (Imagem de Perfusão a Laser Doppler) e da análise patológica do desenvolvimento de vasos colaterais, nós procedemos a uma estimativa/avaliação adicional independente do dano isquêmico dos membros traseiros operados por análise da extensão de fibrose/atrofia do músculo gastrocnêmio (da panturrilha). O exame de necropsia do músculo da barriga da perna 28 dias após a cirurgia revelou um conteúdo pronunciado de tecido mais fibrótico (10.8 + 1.2% versus 6.6 + 1.3%; P<0.01) e aumentada atrofia da fibra muscular em CD8-/- comparados com camundongos de tipo selvagem C57BL/6 (indica área de fibra, 785 + 68 versus 1067 + 69 m2; P<0.01). Além disso, a melhora na recuperação do fluxo sangüíneo do membro traseiro observada no grupo tratado com CD8+ foi associada com reduzida fibrose muscular e atrofia. Nenhuma diferença de fibrose/atrofia foi detectada no âmbito do músculo entre os grupos originais de camundongos CD8-/- e camundongos tratados com CD8-.
RESPOSTAS DE INFLAMAÇÃO TECIDUAL À ISQUEMIA:
Nós examinamos o músculo adutor do membro operado 48 horas após a ligação da artéria. Manchas de hematoxilina (corante usado em histologia para núcleos e cromossomas celulares, estrias musculares transversais e células eterocromafins; a substância cristalina contendo o corante hematoxylon campechianum (pau de Campeche) do qual é extraído com éter) e de eosina (derivado de fluoresceína usado como corante ácido fluorescente para coloração e concentrações citoplasmáticas em histologia) revelaram diferentes números de leucócitos inflamatórios nos camundongos de tipo selvagem versus camundongos CD8-/-. Em particular, o número de leucócitos CD4+ infiltrantes era mais baixo em camundongos CD8-/- do que nos camundongos de tipo selvagem. Além disso, nos animais de controle, a IL-16 foi induzida após a ligação da artéria femoral e foi expressada no sítio de infiltração da célula mononuclear. Em contraste, a expressão da IL-16 após a isquemia foi reduzida nos camundongos CD8-/-.
A DEFICIÊNCIA DE IL-16 DIMINUIU A CAPACIDADE DE CÉLULAS CD8+ EXÓGENAS RESTITUÍREM A RECUPERAÇÃO DO FLUXO SANGÜÍNEO EM CAMUNDONGOS CD8-/- :
Em camundongos CD8-/-, a expressão de IL-16 no músculo isquêmico foi observada no sítio de infiltração da célula exógena em dois dias após a ligação da artéria femoral e de infusão de células CD8+. A co-localização de CFSE e sinal fluorescente de IL-16 demonstrou que, em camundongos reconstituídos CD8-/-, as células CD8+ exógenas expressam L-16. Em 48 horas após a ligação da artéria femoral, no membro isquêmico de camundongos CD8-/- tratados com células CD8+, a expressão de IL-16 foi quase igual àquela observada nos camundongos de tipo selvagem C57Bl/6. A presença dessa citocina está associada com um aumentado número de leucócitos infiltrantes nos membros isquêmicos de camundongos CD8-/- tratados com células CD8+ comparados com camundongos tratados com células CD8-. Finalmente, quando as células T CD8+ deficientes em IL-16 foram infundidas em camundongos CD8 -/- após a ligação da artéria femoral, elas seguiram para o membro traseiro isquêmico (dados não apresentados), mas nós não observamos um aumento no recrutamento de células mononucleares CD4+ para os membros traseiros isquêmicos. Essa inibição do recrutamento de células CD4+ está associada com a falta de capacidade para resgatar a recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/- e atrofia muscular mais pronuncada e fibrose do membro isquêmico (dados não mostrados).
DISCUSSÃO:
Os principais achados de nosso estudo são:
1) Desenvolvimento colateral em resposta à isquemia é enfraquecido em camundongos CD8-/- comparados aos camundongos de tipo selvagem C57BL/6 de controle;
2) Camundongos CD8-/- têm reduzida expressão de IL-16 após a ligação da artéria femoral e diminuída resposta inflamatória no sítio de crescimento dos vasos colaterais;
3) Células T CD8+ purificadas derivadas do baço, quando infundidas em camundongos CD8-/-, localizam-se seletivamente no membro isquêmico, recrutam células CD4+ mononucleares, e aumentam a recuperação do fluxo sangüíneo; e
4) A habilidade das células T CD8+ para regular respostas inflamatórias e recuperação do fluxo sangüíneo após a isquemia é dependente da expressão de IL-16.
Um dos importantes pontos ao final do nosso estudo está baseado na avaliação do fluxo no membro por expressão de LDPI (Doppler). O fluxo estimado de LDPI correlaciona-se bem com a perfusão estimada de microsfera e o número e tamanho da segunda e terceira geração de artérias colaterais bifurcadas/ramificadas. (Obs.: microsferas são diminutos glóbulos de material radio-marcado como albumina macro-carregada, medindo cerca de 15 mícrons.) De acordo com esses dados baseados em LDPI, nós encontramos que o número de artérias colaterais aumentaram significativamente no membro operado dos camundongos de tipo selvagem, mudanças que eram marcadamente atenuadas nos camundongos CD8-/-.
O reduzido desenvolvimento de vasos colaterais observado nos camundongos CD8-/- correlaciona-se com um enfraquecimento funcional mais prolongado e mais severo do membro, uma aumentada incidência de necrose isquêmica, e uma aumentada incidência de auto-amputação. Como um parâmetro independente da severidade de injúria isquêmica em camundongos CD8-/-, nós avaliamos a histologia do músculo da panturrilha quatro semanas após a ligação da artéria femoral. Nesses animais, um determinado tamanho de fibra muscular era marcadamente reduzido comparado com o camundongo de tipo selvagem uma mudança associada com aumento de fibrose muscular.
As diferenças de fluxo entre o camundongo de tipo selvagem e o depletado (CD8-/-) provavelmente superam o limite do fluxo da viabilidade tecidual (pertencem àquele cujas células morrerão). Assim, a diminuição do fluxo em camundongos CD8-/-, embora relativamente pequena, provavelmente contribui para as grandes mudanças que nós observamos na atrofia muscular e na fibrose.
Para provar definitivamente que o desenvolvimento diminuído do fluxo colateral que nós observamos no camundongo CD8-/- era causado por um suprimento deficiente de células T CD8+, nós procedemos a um experimento de resgate no qual nós infundimos células T CD8+ purificadas derivadas do baço em camundongos CD8-/-. As células T CD8+ direcionaram-se seletivamente para o sítio ativo do desenvolvimento colateral, restauraram a recuperação do fluxo para níveis observados nas linhagens parentais de tipo selvagem, e preservou a estrutura muscular da panturrilha, como demonstrado por uma redução da atrofia e fibrose.
Quando nós avaliamos o padrão de resposta inflamatória nos membros isquêmicos de animais CD8-/-, nós observamos que o número global de células mononucleares infiltrando o interstício entre as fibras musculares era mais baixo do que o visto em camundongos de tipo selvagem C57BL/6J. Em particular, o número de células CD4+ infiltrantes foi reduzido em 50%.
IL-16 é um potente quimioatrativo para várias células imunes tais como monócitos, eosinófilos e células dendríticas. Similarmente, a IL-16 tem sido caracterizada como um ligante natural para CD4, através da qual ela induz a resposta migratória nas células T CD4+. A IL-16 também é provável como reguladora do recrutamento e ativação de células TH-1 em sítios de inflamação tais como aqueles de crescimento ativo de vasos colaterais. Quando nós acompanhamos a expressão de IL-16 após a ligação da artéria femoral dos músculos adutores, nós observamos uma falta de indução dessa citocina nos camundongos CD8-/-. De relevância, dentro das primeiras horas de isquemia, as células CD8+ infiltraram a periferia de infartos cerebrais e secretaram IL-16.
Em nossos experimentos, as células TCD8+ de camundongos IL-16 -/- não melhoraram a recuperação do fluxo sangüíneo em camundongos CD8-/-, indicando que Il-16 é um possível efetor neste processo. A falta do efeito no fluxo sangüíneo também foi associada com um reduzido recrutamento de células mononucleares CD4+ no sítio de desenvolvimento de vasos colaterais demonstrando assim a importância do papel desta citocina nas fases iniciais da resposta inflamatória à isquemia periférica.
Os colaterais são origem, ao menos em parte, de vasos pré-existentes localizados próximo ao sítio de obstrução arterial e por isso próximo ao tecido isquêmico. Embora pouco ou nenhum fluxo ocorra nesses vasos sob condições normais, o declive de pressão criado pela obstrução distante promove sua abertura e o estabelecimento do fluxo. O aumento no fluxo sangüíneo e a deformação da força ativa as células endoteliais, com subseqüente sobre-regulação de moléculas de adesão celular e citocinas e recrutamento de células inflamatórias resultante.
A presente investigação, em conjunção com os dados avaliados na literatura, demonstra que os linfócitos contribuem importantemente para o processo de remodelagem arterial que leva à gênese de vasos colaterais. Após a indução de isquemia, a resposta inflamatória e o desenvolvimento de vasos colaterais são comprometidos em camundongos deficientes em células T CD4+. No sítio de ativo crescimento de vasos colaterais, na ausência das células T CD4+, existe diminuído recrutamento de macrófagos, os quais são determinantes celulares centrais para o crescimento ótimo de vasos colaterais. Essas células localizam-se à volta das colaterais e secretam vários fatores pró-angiogênicos. Nossos resultados sugerem que células T CD8+ são uma das primeiras respondedoras para o estímulo local envolvido no crescimento colateral. Quando essas células infiltram a região de desenvolvimento de colaterais, elas expressam IL-16, a qual contribui para o recrutamento de células mononucleares CD4+ (células T e macrófagos). Essas células, por sua vez, secretam muitas das citocinas que atuam num papel crítico na colaterogênese.
terça-feira, 23 de setembro de 2008
600043 SULFOTRANSFERASE, ESTROGEN-PREFERRING; STE
Alternative titles; symbols
ESTROGEN SULFOTRANSFERASE, LIVER; ESTSULT1E1ARYL SULFOTRANSFERASE, INCLUDED
Gene map locus 4q13.1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=600043
TEXTO
A sulfatização (adição de grupos sulfato na forma de ésteres a moléculas preexistentes) é uma via importante na bio‑transformação de hormônios esteróides como estrogênios (são substâncias naturais ou sintéticas que exercem efeitos biológicos característicos dos hormônios estrogênicos, estes produzidos pelo ovário, placenta, testículos e, possivelmente pelo córtex supra-renal, e também por determinadas plantas; eles estimulam as características sexuais secundárias e exercem efeitos sistêmicos como o crescimento e maturação de ossos longos). O fígado humano contém dois tipos diferentes de sulfotransferases, a dehidroepoandrosterona (DHEA) sulfotransferase e a fenol sulfotransferase (STP1). Aksoy e outros (1994) colocaram em teste a possibilidade de que os tecidos humanos contivessem uma ou mais sulfotransferases de estrogênio ortólogas (de mesmo sentido?) para proteínas codificadas por clones de DNA (cDNA) EST que têm sido clonados a partir de outras espécies mamíferas. Eles sucederam à clonagem de um cDNA para EST do fígado humano e estudaram propriedades selecionadas da proteína que este codifica.
O sulfato de estrona (um metabólito do 17β-estradiol - um tipo de estrogênio – comumente encontrado na urina, nos ovários e na placenta; tem atividade biológica muito menor que o hormônio original – sin. hormônio folicular) é a forma predominante de estrogênio encontrado na circulação na mulher e pode assim servir como precursor para estrogênios ativos em tecidos alvo pela remoção do grupo sulfato através da ação da sulfatase esteróide endógena. Bernier e outros (1994) usaram um cDNA codificando a sulfotransferase de estrogênio placentária humana como uma prova para o isolamento de um clone contendo quase toda seqüência genômica. O gene contém nove éxons curtos separados por oito íntrons numa expansão de aproximadamente 7.7 quilobases. Os dois primeiros éxons, chamados éxon 1a e éxon 1b , não são codificados e correspondem a seqüências não traduzidas da extremidade 5’ dos cDNAs de sulfotransferases de estrogênio do cérebro e placenta humanos, respectivamente. A transferência de vetores de genes relacionados com a acetiltransferase cloranfenicol .(cloranfenicol é um antibiótico originado do Streptomyces venezuelae , efetivo contra Staphilococcus aureus, Brucella abortus,bacilo de Friedländer, e os microorganismos da febre tifóide, tifo e da febre maculosa das Montanhas Rochosas; pode haver uma reação grave, resultando em lesão da medula óssea, com agranulocitose e anemia aplásica; a cloranfenicol acetil transferase é uma enzima bacteriana freqüentemente usada como marcador para examinar o controle da expressão de genes eucrióticos.)contendo a seqüência a montante dos éxons 1a e 1b flanqueando a extremidade 5’ para dentro de células de adenocarcinoma adranal indicou que ambas as seqüências possuem atividades promotoras . Os resultados foram interpretados como indicadores de que as espécies aril sulfotransferase do cérebro humano e a sulfotransferase de estrogênio placentário são transcritas a partir de um único gene por alternação dos promotores nos éxons 1a e 1b, respectivamente. Usando DNA a partir de painéis de células somáticas híbridas humanas e de roedores e amplificação do gene por PCR, Bernier e outros (1994) assinaram o gene da sulfotransferase do estrogênio placentária no cromossomo 16. Por outro lado, Her e outros (1995) mapearam o cDNA da sulfotransferase de estrogênio do fígado em 4q13.1 por fluorescência de hibridização em sítio, suerindo que estas podem ser dois genes separados. Eles acharam que o gene STE do fígado expande-se por aproximadamente 20 quilobases e consiste de 8 éxons, ampliando em extensão de 95 para 181 pares de bases. As localizações da maiora de junções de splice éxon-íntron dentro do gene STE foram idêntica àquelas encontradas em um gene ST fenol (STM; OMIM 600641). (O gene STM mapeia no cromossomo 16p11.2. De fato, o STM é o mesmo gene da sulfotransferase de estrogênio placentária mapeada por Bernier e outros (1994) no cromossomo 16 (Weinshilboum, 1995). Em adição, as localizações dos 5 íntros do gene STE foram conservados no gene da sulfotransferase DHEA, a qual é localizada no cromossomo 19. Weinshilboum e outros (1997) revisaram os genes em camundongos correspondendo aos genes de sulfotransferases em humanos. O gene STE está localizado no cromossomo 5 do camundongo.
Weinshilboun e outros (1997) ressaltaram que todos os três genes de STP humanod conhecidos, STP1, STP2 (omim 601292), e STM, são localizados em 16p (no braço curto do cromossomo 16). O STP1 é localizado aproximadamente a 45 quilobases da extremidade 5 para o gene STP2, e os dois genes são alinhados cabeça para cauda. Estes dois genes, por outro lado, são localizados aproximadamente a 100 quilobases telomérica (em direção a porção telomérica do cromossomo?) em relação ao gene para a sulfotransferase monoamina-preferrina (monoamina é uma molécula que contém um grupo amina), STM. Foi especulado que esses 3 genes do STP em 16p originaram-se como o resultado de eventos de duplicação genética mais a recombinação. Um gene se sulotransferase do camundongo, STP, está localizado no cromossomo 7 em uma área sintênica em relação a 16p humana.
MODELO ANIMAL
Tong e outros (2005) geraram camundongos STE-/- e obsevaram trombose placentária e perda fetal espontânea. Este fenótipo foi associado com elevados níveis de estrogênio livre sistemicamente e no fluido amniótico, aumento da expressão do fator tecidual (fator tecidual é selectina?) na placenta, e elevada sensitividade plaquetária para ativação induzida por agonistas fora do corpo. O tratamento de camundongos nulos para STE tanto com um anticoagulante quanto com anti-estrogênio preveniu a perda fetal. Tong e outros (2005) concluíram que o STE é um modulador crítico do estrogênio na placenta e sugeriram que existe uma ligação entre o excesso de estrogênio e a perda fetal trombótica.
Alternative titles; symbols
ESTROGEN SULFOTRANSFERASE, LIVER; ESTSULT1E1ARYL SULFOTRANSFERASE, INCLUDED
Gene map locus 4q13.1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=600043
TEXTO
A sulfatização (adição de grupos sulfato na forma de ésteres a moléculas preexistentes) é uma via importante na bio‑transformação de hormônios esteróides como estrogênios (são substâncias naturais ou sintéticas que exercem efeitos biológicos característicos dos hormônios estrogênicos, estes produzidos pelo ovário, placenta, testículos e, possivelmente pelo córtex supra-renal, e também por determinadas plantas; eles estimulam as características sexuais secundárias e exercem efeitos sistêmicos como o crescimento e maturação de ossos longos). O fígado humano contém dois tipos diferentes de sulfotransferases, a dehidroepoandrosterona (DHEA) sulfotransferase e a fenol sulfotransferase (STP1). Aksoy e outros (1994) colocaram em teste a possibilidade de que os tecidos humanos contivessem uma ou mais sulfotransferases de estrogênio ortólogas (de mesmo sentido?) para proteínas codificadas por clones de DNA (cDNA) EST que têm sido clonados a partir de outras espécies mamíferas. Eles sucederam à clonagem de um cDNA para EST do fígado humano e estudaram propriedades selecionadas da proteína que este codifica.
O sulfato de estrona (um metabólito do 17β-estradiol - um tipo de estrogênio – comumente encontrado na urina, nos ovários e na placenta; tem atividade biológica muito menor que o hormônio original – sin. hormônio folicular) é a forma predominante de estrogênio encontrado na circulação na mulher e pode assim servir como precursor para estrogênios ativos em tecidos alvo pela remoção do grupo sulfato através da ação da sulfatase esteróide endógena. Bernier e outros (1994) usaram um cDNA codificando a sulfotransferase de estrogênio placentária humana como uma prova para o isolamento de um clone contendo quase toda seqüência genômica. O gene contém nove éxons curtos separados por oito íntrons numa expansão de aproximadamente 7.7 quilobases. Os dois primeiros éxons, chamados éxon 1a e éxon 1b , não são codificados e correspondem a seqüências não traduzidas da extremidade 5’ dos cDNAs de sulfotransferases de estrogênio do cérebro e placenta humanos, respectivamente. A transferência de vetores de genes relacionados com a acetiltransferase cloranfenicol .(cloranfenicol é um antibiótico originado do Streptomyces venezuelae , efetivo contra Staphilococcus aureus, Brucella abortus,bacilo de Friedländer, e os microorganismos da febre tifóide, tifo e da febre maculosa das Montanhas Rochosas; pode haver uma reação grave, resultando em lesão da medula óssea, com agranulocitose e anemia aplásica; a cloranfenicol acetil transferase é uma enzima bacteriana freqüentemente usada como marcador para examinar o controle da expressão de genes eucrióticos.)contendo a seqüência a montante dos éxons 1a e 1b flanqueando a extremidade 5’ para dentro de células de adenocarcinoma adranal indicou que ambas as seqüências possuem atividades promotoras . Os resultados foram interpretados como indicadores de que as espécies aril sulfotransferase do cérebro humano e a sulfotransferase de estrogênio placentário são transcritas a partir de um único gene por alternação dos promotores nos éxons 1a e 1b, respectivamente. Usando DNA a partir de painéis de células somáticas híbridas humanas e de roedores e amplificação do gene por PCR, Bernier e outros (1994) assinaram o gene da sulfotransferase do estrogênio placentária no cromossomo 16. Por outro lado, Her e outros (1995) mapearam o cDNA da sulfotransferase de estrogênio do fígado em 4q13.1 por fluorescência de hibridização em sítio, suerindo que estas podem ser dois genes separados. Eles acharam que o gene STE do fígado expande-se por aproximadamente 20 quilobases e consiste de 8 éxons, ampliando em extensão de 95 para 181 pares de bases. As localizações da maiora de junções de splice éxon-íntron dentro do gene STE foram idêntica àquelas encontradas em um gene ST fenol (STM; OMIM 600641). (O gene STM mapeia no cromossomo 16p11.2. De fato, o STM é o mesmo gene da sulfotransferase de estrogênio placentária mapeada por Bernier e outros (1994) no cromossomo 16 (Weinshilboum, 1995). Em adição, as localizações dos 5 íntros do gene STE foram conservados no gene da sulfotransferase DHEA, a qual é localizada no cromossomo 19. Weinshilboum e outros (1997) revisaram os genes em camundongos correspondendo aos genes de sulfotransferases em humanos. O gene STE está localizado no cromossomo 5 do camundongo.
Weinshilboun e outros (1997) ressaltaram que todos os três genes de STP humanod conhecidos, STP1, STP2 (omim 601292), e STM, são localizados em 16p (no braço curto do cromossomo 16). O STP1 é localizado aproximadamente a 45 quilobases da extremidade 5 para o gene STP2, e os dois genes são alinhados cabeça para cauda. Estes dois genes, por outro lado, são localizados aproximadamente a 100 quilobases telomérica (em direção a porção telomérica do cromossomo?) em relação ao gene para a sulfotransferase monoamina-preferrina (monoamina é uma molécula que contém um grupo amina), STM. Foi especulado que esses 3 genes do STP em 16p originaram-se como o resultado de eventos de duplicação genética mais a recombinação. Um gene se sulotransferase do camundongo, STP, está localizado no cromossomo 7 em uma área sintênica em relação a 16p humana.
MODELO ANIMAL
Tong e outros (2005) geraram camundongos STE-/- e obsevaram trombose placentária e perda fetal espontânea. Este fenótipo foi associado com elevados níveis de estrogênio livre sistemicamente e no fluido amniótico, aumento da expressão do fator tecidual (fator tecidual é selectina?) na placenta, e elevada sensitividade plaquetária para ativação induzida por agonistas fora do corpo. O tratamento de camundongos nulos para STE tanto com um anticoagulante quanto com anti-estrogênio preveniu a perda fetal. Tong e outros (2005) concluíram que o STE é um modulador crítico do estrogênio na placenta e sugeriram que existe uma ligação entre o excesso de estrogênio e a perda fetal trombótica.
quarta-feira, 17 de setembro de 2008
*612252 C-TYPE LECTIN DOMAIN FAMILY 9, MEMBER A; CLEC9A
Alternative titles; symbols
DENDRITIC CELL NATURAL KILLER LECTIN GROUP RECEPTOR 1; DNGR1
TEXT - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=612252
DESCRIÇÃO
CLEC9A é um grupo V de receptor similar a lectina C (CTLR) que funciona como um receptor de ativação e é expressada em células de linhagem mielóide (da medula)(Huysamen e outros, 2008).
CLONAGEM
Por análises de seqüência da dectina-1 (CLEC7A/ Dectina-1 é um pequeno receptor membranal de tipo II com uma dobra do domínio extracelular similar a lectina C e um domínio citoplasmático com um imuno-receptor de ativação com motivo baseado em tirosina (ITAM) (Yokota e outros, 2001).) do conjunto no cromossomo 12, Huysamen e outros (2008) identificaram CLEC9A. O CTLR previsto de tipo II transmembranal contém 241 aminoácidos e tem uma massa molecular cauculada de 30 quilodáltons. Tem um domínio de lectina de tipo C (CTLD), seguido por uma região em haste, o domínio transmembranal, e uma cauda citoplasmática com um motivo de ativação baseado em tirosina imuno-receptor (ITAM) [ Motivos de ativação baseados em tirosina (ITAMs) são encontrados em moléculas pertencentes à super-famílias das imunoglobulinas (Ig). A CNAIP é uma protein contend ITAM envolvida na regulação do desenvolvimento de sinalização das células B. A molécula de ativação NFAT, também chamada proteína contendo calcineurina {uma serina-treonina fosfatase cálcio-dependente envolvida na transcrição de sinais das células T; a cascata de reação na qual está inserida é denominada via da calcineurina} e ITAM de ativação localiza-se na região gênica do cromossomo 22q13.2] O CTLD contém seis cisteínas características [cisteínas são ácido amino-3-mercaptopropiônico; o isômero L é encontrado na maioria das proteínas; particularmente abundante nas queratinas], mas carece de resíduos envolvidos com a coordenação de íons de cálcio e de ligação a carbo-hidratos. A região em haste tem duas cisteínas e um sítio de glicosilação ligado a N. Análises de citometria de fluxo, Western blot (RNA), e de deglicosilação mostraram a expressão de superfície de um dímero de CLEC9A glicosilado de 40 e 45 quilodáltons sob condições redutoras. O dímero deglicosilado era aproximadamente de 30 e 35 quilodáltons. PCR-RT detectaram a expressão de CLEC9A na maioria dos tecidos examinados, com altos níveis no cérebro, timo e baço. Análises da distribuição de citometria de fluxo e de PCR-RT (reação em cadeia da polimerase em transcriptase reversa) detectaram a expressão de CLEC9A predominantemente em células dendriticas BDCA3 positivas, mas também num sub-grupo de monócitos. Huysamen e outros (2008) também clonaram a CLEC9A do camundongo, a qual compartilha 53% de identidade em aminoácidos com a CLEC9A humana. A CLEC9A do camundongo foi expressada na superfície celular, mas ao contrário da humana, não era glicosilada e era expressada como um monômero.
FUNÇÃO DO GENE
Huysamen e outros (2008) expressaram a CLEC9A em fibroblastos e macrófagos e demonstraram que a ligação cruzada de CLEC9A levou à internalização do receptor ou endocitose, mas não à fagocitose. Macrófagos com CLEC9A ativa (clec9a-positivos) estimulados com zymosan expressaram TNF (191160) via SYK (600085). Huysamen e outros (2008) concluíram que a CLEC9A é um receptor de ativação.
Nos camundongos, Sancho e outros (2008) demonstraram que CLEC9A, à qual eles chamaram Dngr1, puderam entregar antígenos para células dendríticas CD8a-positivas em vez de apresentação cruzada a MHC de classe I e promoção de imunidade de tumor. Em humanos, eles acharam que a DNGR1 era um receptor endocítico expressado uniformemente em células DC positivas em BDCA3 (que expressam BDCA3).
[obs.: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=606677 - BLOOD DENDRITIC CELL ANTIGEN 2; BDCA2 606677
Células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos críticas para a iniciação de respostas imunes dependentes de células T. As DCs expressam um número de receptores celulares de superfície que freqüentemente sustêm CRDs (domínios de reconhecimento de carboidratos). Verificando um banco de dados EST para seqüências homólogas para o CRD de imuno-receptor de célula dendrítica (DCIR; 605306), seguido de prova de início em 5’ e em 3’, Arce e outros (2001) obtiveram um cDNA codificador de DLEC. Análises de seqüência predisseram que DLEC é uma proteína integral de membrana de 213 aminoácidos de tipo II com um caule citoplasmático no terminal N, uma região transmembranalm uma região de haste extracelular, e um CRD no terminal C. O CRD é 79% idêntico ao de DCIR e tem 3 sítios potenciais de glicosilação em N e um sítio conservado de ligação a cálcio que contém um motivo EPN de ligação a manose (um epímero da glicose). Análises de PCR-RT sugeriram a existência de uma variante por splicing, a DLEC-beta. Análises de northern blot não detectaram a expressão de DLEC em tecidos imunológicos. Análises de PCR-RT detectaram a expressão de DLEC somente em células mononucleares do sangue periférico e células dendríticas imaturas. Análises de northern blot demonstraram que a expressão constitutiva de DLEC em células dendríticas derivadas de monócitos era sub-regulada por maturação com lipopolissacarídeo mas não com fator de necrose tumoral (TNF; 191160).
Por verificação imunológica de células COS (células de ovário de ramster) expressando cDNAs de células dendríticas plasmocitóides (PDCs), Dzionek e outros (2001) obtiveram um cDNA codificador de DLEC, o qual eles designaram BDCA2. Análises de PCR-RT detectaram que a expressão de BDCA2 era restrita a PDCs. Microscopia de imunofluorescência e imunohistoquímica demostraram a expressão de BDCA2 em células do linfonodo e das amígdalas com CD123 (IL3RA; 308385) positivas (expressadas). Análises de PCR-RT sugeriram a existência de 5 variantes de BDCA2 por splicing, cada uma carecendo de 1 ou 2 éxons. Análises de imunoprecipitação e SDS-PAGE mostraram a expressão da proteína BDCA2 com 38 quilodáltons.
Por provocação de anticorpos monoclonais contra células dendríticas do sangue com CD4 ativas purificadas imunomagneticamente, Dzionek e outros (2000) identificaram 3 antígenos BDC: BDCA2, BDCA3 e BDCA4 (NRP1; 602069). Em sangue humano fresco, a expressão de BDCA2 e BDCA4 foi estritamente confinada às células dendriticas do sangue plasmocitóides CD123-brilhantes/CD11C (ITGAX;151510)-negativas, mas ao contrário daquelas BDCs, BDCs BDCA3-positivas careciam da expressão de BDCA1 (CD1C,188340; CD2, 186990; e vários receptores Fc, veja 146790).]
Alternative titles; symbols
DENDRITIC CELL NATURAL KILLER LECTIN GROUP RECEPTOR 1; DNGR1
TEXT - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=612252
DESCRIÇÃO
CLEC9A é um grupo V de receptor similar a lectina C (CTLR) que funciona como um receptor de ativação e é expressada em células de linhagem mielóide (da medula)(Huysamen e outros, 2008).
CLONAGEM
Por análises de seqüência da dectina-1 (CLEC7A/ Dectina-1 é um pequeno receptor membranal de tipo II com uma dobra do domínio extracelular similar a lectina C e um domínio citoplasmático com um imuno-receptor de ativação com motivo baseado em tirosina (ITAM) (Yokota e outros, 2001).) do conjunto no cromossomo 12, Huysamen e outros (2008) identificaram CLEC9A. O CTLR previsto de tipo II transmembranal contém 241 aminoácidos e tem uma massa molecular cauculada de 30 quilodáltons. Tem um domínio de lectina de tipo C (CTLD), seguido por uma região em haste, o domínio transmembranal, e uma cauda citoplasmática com um motivo de ativação baseado em tirosina imuno-receptor (ITAM) [ Motivos de ativação baseados em tirosina (ITAMs) são encontrados em moléculas pertencentes à super-famílias das imunoglobulinas (Ig). A CNAIP é uma protein contend ITAM envolvida na regulação do desenvolvimento de sinalização das células B. A molécula de ativação NFAT, também chamada proteína contendo calcineurina {uma serina-treonina fosfatase cálcio-dependente envolvida na transcrição de sinais das células T; a cascata de reação na qual está inserida é denominada via da calcineurina} e ITAM de ativação localiza-se na região gênica do cromossomo 22q13.2] O CTLD contém seis cisteínas características [cisteínas são ácido amino-3-mercaptopropiônico; o isômero L é encontrado na maioria das proteínas; particularmente abundante nas queratinas], mas carece de resíduos envolvidos com a coordenação de íons de cálcio e de ligação a carbo-hidratos. A região em haste tem duas cisteínas e um sítio de glicosilação ligado a N. Análises de citometria de fluxo, Western blot (RNA), e de deglicosilação mostraram a expressão de superfície de um dímero de CLEC9A glicosilado de 40 e 45 quilodáltons sob condições redutoras. O dímero deglicosilado era aproximadamente de 30 e 35 quilodáltons. PCR-RT detectaram a expressão de CLEC9A na maioria dos tecidos examinados, com altos níveis no cérebro, timo e baço. Análises da distribuição de citometria de fluxo e de PCR-RT (reação em cadeia da polimerase em transcriptase reversa) detectaram a expressão de CLEC9A predominantemente em células dendriticas BDCA3 positivas, mas também num sub-grupo de monócitos. Huysamen e outros (2008) também clonaram a CLEC9A do camundongo, a qual compartilha 53% de identidade em aminoácidos com a CLEC9A humana. A CLEC9A do camundongo foi expressada na superfície celular, mas ao contrário da humana, não era glicosilada e era expressada como um monômero.
FUNÇÃO DO GENE
Huysamen e outros (2008) expressaram a CLEC9A em fibroblastos e macrófagos e demonstraram que a ligação cruzada de CLEC9A levou à internalização do receptor ou endocitose, mas não à fagocitose. Macrófagos com CLEC9A ativa (clec9a-positivos) estimulados com zymosan expressaram TNF (191160) via SYK (600085). Huysamen e outros (2008) concluíram que a CLEC9A é um receptor de ativação.
Nos camundongos, Sancho e outros (2008) demonstraram que CLEC9A, à qual eles chamaram Dngr1, puderam entregar antígenos para células dendríticas CD8a-positivas em vez de apresentação cruzada a MHC de classe I e promoção de imunidade de tumor. Em humanos, eles acharam que a DNGR1 era um receptor endocítico expressado uniformemente em células DC positivas em BDCA3 (que expressam BDCA3).
[obs.: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=606677 - BLOOD DENDRITIC CELL ANTIGEN 2; BDCA2 606677
Células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos críticas para a iniciação de respostas imunes dependentes de células T. As DCs expressam um número de receptores celulares de superfície que freqüentemente sustêm CRDs (domínios de reconhecimento de carboidratos). Verificando um banco de dados EST para seqüências homólogas para o CRD de imuno-receptor de célula dendrítica (DCIR; 605306), seguido de prova de início em 5’ e em 3’, Arce e outros (2001) obtiveram um cDNA codificador de DLEC. Análises de seqüência predisseram que DLEC é uma proteína integral de membrana de 213 aminoácidos de tipo II com um caule citoplasmático no terminal N, uma região transmembranalm uma região de haste extracelular, e um CRD no terminal C. O CRD é 79% idêntico ao de DCIR e tem 3 sítios potenciais de glicosilação em N e um sítio conservado de ligação a cálcio que contém um motivo EPN de ligação a manose (um epímero da glicose). Análises de PCR-RT sugeriram a existência de uma variante por splicing, a DLEC-beta. Análises de northern blot não detectaram a expressão de DLEC em tecidos imunológicos. Análises de PCR-RT detectaram a expressão de DLEC somente em células mononucleares do sangue periférico e células dendríticas imaturas. Análises de northern blot demonstraram que a expressão constitutiva de DLEC em células dendríticas derivadas de monócitos era sub-regulada por maturação com lipopolissacarídeo mas não com fator de necrose tumoral (TNF; 191160).
Por verificação imunológica de células COS (células de ovário de ramster) expressando cDNAs de células dendríticas plasmocitóides (PDCs), Dzionek e outros (2001) obtiveram um cDNA codificador de DLEC, o qual eles designaram BDCA2. Análises de PCR-RT detectaram que a expressão de BDCA2 era restrita a PDCs. Microscopia de imunofluorescência e imunohistoquímica demostraram a expressão de BDCA2 em células do linfonodo e das amígdalas com CD123 (IL3RA; 308385) positivas (expressadas). Análises de PCR-RT sugeriram a existência de 5 variantes de BDCA2 por splicing, cada uma carecendo de 1 ou 2 éxons. Análises de imunoprecipitação e SDS-PAGE mostraram a expressão da proteína BDCA2 com 38 quilodáltons.
Por provocação de anticorpos monoclonais contra células dendríticas do sangue com CD4 ativas purificadas imunomagneticamente, Dzionek e outros (2000) identificaram 3 antígenos BDC: BDCA2, BDCA3 e BDCA4 (NRP1; 602069). Em sangue humano fresco, a expressão de BDCA2 e BDCA4 foi estritamente confinada às células dendriticas do sangue plasmocitóides CD123-brilhantes/CD11C (ITGAX;151510)-negativas, mas ao contrário daquelas BDCs, BDCs BDCA3-positivas careciam da expressão de BDCA1 (CD1C,188340; CD2, 186990; e vários receptores Fc, veja 146790).]
terça-feira, 9 de setembro de 2008
300133 VON HIPPEL-LINDAU BINDING PROTEIN 1; VBP1
Alternative titles; symbols
PREFOLDIN 3; PFDN3
Gene map locus Xq28
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300133
Tradução amadorística.:
A syndrome Von Hippel-Lindau é associada com mutações no gene VHL[Gene map locus 3p26-p25. Através de posicionamento de clonagem , Latif e outros (1993) identificaram o gene VHL supressor de tumor. O gene codifica uma proteína de 213 aminoácidos com um domínio prognosticado de repetições ácidas encontrado na glicoproteína pró-cíclica de superfície de membrana do Trypanosoma brucei {o trypanosoma é um gênero de protozoários flagelados que possuem corpo fusiforme com uma membrana ondulante em um dos lados, um único flagelo anterior e um cinetoplasma; são parasitas do plasma de muitos vertebrados (sendo alguns patogênicos), e via de rera possuem um hospedeiro intermediário, um invertebrado hematófago, como sanguessuga, carrapato ou inseto; as espécies patogênicas causam tripanossomíase no homem e várias outras doenças nos animais domésticos. T.brucei é uma especial atualmente dividida em três subespécies: 1) bruceibrucei, que causa magana na África, provoca doença fatal em camelos eqüinos, cães e gatos e crônica em ;suínos, gado bovino, carneiros e cabras; 2) brucei gambiense que causa tripanossomíase gambiense no homem, transmitido pela mosca tsé-tsé, Glossina palpalis; 3) brucei rhodesiens, que causa tripanossomíase rodesiense, transmitido pela mosca tsé-tsé, especialmente Glossina palpalis. Obs.: o trypanososma cruzi é o causador da doença de Chagas.} Os autores identificaram dois transcritos de mRNA expressados amplamente de aproximadamente 6 e 6.5 quilobases.] O Gene VHL codifica um supressor de tumor. Usando um ensaio de 2 leveduras híbridas para filtrar proteínas que interagem com VHL, Tsuchiya e outros (1996) identificaram cDNAs de células B codificando uma proteína que eles chamaram de VBP1(proteína de ligação a VHL-1). Os autores usaram estudos de imuno-precipitação e análises Western para demonstrar que VHP1 forma complexos com VHL-1 in vivo. Por imuno-cito-localização em células de mamíferos expressando uma ou ambas as proteínas, Tsuchiya e outros (1996) acharam que VHL atua como uma chaperone (acompanhante) molecular que carrega VBP1 de grânulos peri-nucleares para o núcleo do citoplasma.
Brinke e outros (1996) reportaram a presença de uma nova inversão no gene do fator VIII em gêmeos monozigóticos (gêmeos originados de um único óvulo) hemofílicos. Brinke e outros (1996) notaram que esta nova inversão cria duas unidades de transcrição híbridas. Uma dessas é formada pelo promotor e o primeiro éxon do fator VIII e seqüências novas. Brinke e outros (1997) determinaram que essas novas seqüências eram parte do gene VBP1. O gene VBP1 contém seis éxons e expande-se ao todo por 30 quilo-bases. Análises de Northern blot (RNA) revelaram que o VBP1 é ubiquamente expressado como um mRNA de 1.7 quilobases e um mRNA de 5.0 quilobases muito enfraquecedor. Por análises de extensão de primer (iniciador), Brinke e outros (1997) acharam que existem dois sítios de iniciação de transcrição maior e menor. Brinke e outros (1997) clonaram cDNAs do VBP1 homólogo do camundongo. As seqüências protéicas do VBP1 do camundongo e humano são idênticas.
Por análises de uma YAC (levedura) os contendo, Brinke e outros (1997) mapearam o gene VBP1 em Xq28, de 100 a 150 quilo-bases distantes do gene do fator VIII.
Hemberger e outros (1999) usaram o cDNA de VBP1 murino para investigar a expressão do mRNA de VBP1 no camundongo por hibridização em sítio e análises de Northern blot. Em estágios fetais entre nove e dezoito dias de gestação, o VBP1 foi expressado principalmente no sistema nervoso central, retina, e fígado. Em adição, no dia doze, alta expressão foi observada na região labiríntica (labirinto: qualquer região com várias estruturas anatômicas com inúmeros canais ou células inter-comunicantes) da placenta. Em placentas de estágio mais avançado, a expressão de VBP1 foi, entretanto, consideravelmente reduzida. Análises de Northern blot de tecidos adultos de camundongo mostraram que VBP1 foi ubiquamente expressada. Análises em sítio de vários tecidos adultos mostraram que na maioria dos tecidos os transcritos eram igualmente distribuídos. No cérebro, olho, rins e intestino, entretanto, VBP1 foi expressada em específicos tipos de células. No cerebelo e vários tumores de pacientes VHL, não puderam ser detectadas diferenças consistentes nos níveis de expressão de VBP1 entre tumores característicos da doença de von Hippel-Lindau e o tecido normal. O mapeamento do gene de VBP1 murino revelou uma localização cromossômica conservada entre o camundongo e o humano em uma região homóloga à Xq28 humana.
Clifford e outros (1999) não puderam demonstrar nenhuma mutação em VBP1 em 89 casos esporádicos de carcinoma celular renal.
Alternative titles; symbols
PREFOLDIN 3; PFDN3
Gene map locus Xq28
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300133
Tradução amadorística.:
A syndrome Von Hippel-Lindau é associada com mutações no gene VHL[Gene map locus 3p26-p25. Através de posicionamento de clonagem , Latif e outros (1993) identificaram o gene VHL supressor de tumor. O gene codifica uma proteína de 213 aminoácidos com um domínio prognosticado de repetições ácidas encontrado na glicoproteína pró-cíclica de superfície de membrana do Trypanosoma brucei {o trypanosoma é um gênero de protozoários flagelados que possuem corpo fusiforme com uma membrana ondulante em um dos lados, um único flagelo anterior e um cinetoplasma; são parasitas do plasma de muitos vertebrados (sendo alguns patogênicos), e via de rera possuem um hospedeiro intermediário, um invertebrado hematófago, como sanguessuga, carrapato ou inseto; as espécies patogênicas causam tripanossomíase no homem e várias outras doenças nos animais domésticos. T.brucei é uma especial atualmente dividida em três subespécies: 1) bruceibrucei, que causa magana na África, provoca doença fatal em camelos eqüinos, cães e gatos e crônica em ;suínos, gado bovino, carneiros e cabras; 2) brucei gambiense que causa tripanossomíase gambiense no homem, transmitido pela mosca tsé-tsé, Glossina palpalis; 3) brucei rhodesiens, que causa tripanossomíase rodesiense, transmitido pela mosca tsé-tsé, especialmente Glossina palpalis. Obs.: o trypanososma cruzi é o causador da doença de Chagas.} Os autores identificaram dois transcritos de mRNA expressados amplamente de aproximadamente 6 e 6.5 quilobases.] O Gene VHL codifica um supressor de tumor. Usando um ensaio de 2 leveduras híbridas para filtrar proteínas que interagem com VHL, Tsuchiya e outros (1996) identificaram cDNAs de células B codificando uma proteína que eles chamaram de VBP1(proteína de ligação a VHL-1). Os autores usaram estudos de imuno-precipitação e análises Western para demonstrar que VHP1 forma complexos com VHL-1 in vivo. Por imuno-cito-localização em células de mamíferos expressando uma ou ambas as proteínas, Tsuchiya e outros (1996) acharam que VHL atua como uma chaperone (acompanhante) molecular que carrega VBP1 de grânulos peri-nucleares para o núcleo do citoplasma.
Brinke e outros (1996) reportaram a presença de uma nova inversão no gene do fator VIII em gêmeos monozigóticos (gêmeos originados de um único óvulo) hemofílicos. Brinke e outros (1996) notaram que esta nova inversão cria duas unidades de transcrição híbridas. Uma dessas é formada pelo promotor e o primeiro éxon do fator VIII e seqüências novas. Brinke e outros (1997) determinaram que essas novas seqüências eram parte do gene VBP1. O gene VBP1 contém seis éxons e expande-se ao todo por 30 quilo-bases. Análises de Northern blot (RNA) revelaram que o VBP1 é ubiquamente expressado como um mRNA de 1.7 quilobases e um mRNA de 5.0 quilobases muito enfraquecedor. Por análises de extensão de primer (iniciador), Brinke e outros (1997) acharam que existem dois sítios de iniciação de transcrição maior e menor. Brinke e outros (1997) clonaram cDNAs do VBP1 homólogo do camundongo. As seqüências protéicas do VBP1 do camundongo e humano são idênticas.
Por análises de uma YAC (levedura) os contendo, Brinke e outros (1997) mapearam o gene VBP1 em Xq28, de 100 a 150 quilo-bases distantes do gene do fator VIII.
Hemberger e outros (1999) usaram o cDNA de VBP1 murino para investigar a expressão do mRNA de VBP1 no camundongo por hibridização em sítio e análises de Northern blot. Em estágios fetais entre nove e dezoito dias de gestação, o VBP1 foi expressado principalmente no sistema nervoso central, retina, e fígado. Em adição, no dia doze, alta expressão foi observada na região labiríntica (labirinto: qualquer região com várias estruturas anatômicas com inúmeros canais ou células inter-comunicantes) da placenta. Em placentas de estágio mais avançado, a expressão de VBP1 foi, entretanto, consideravelmente reduzida. Análises de Northern blot de tecidos adultos de camundongo mostraram que VBP1 foi ubiquamente expressada. Análises em sítio de vários tecidos adultos mostraram que na maioria dos tecidos os transcritos eram igualmente distribuídos. No cérebro, olho, rins e intestino, entretanto, VBP1 foi expressada em específicos tipos de células. No cerebelo e vários tumores de pacientes VHL, não puderam ser detectadas diferenças consistentes nos níveis de expressão de VBP1 entre tumores característicos da doença de von Hippel-Lindau e o tecido normal. O mapeamento do gene de VBP1 murino revelou uma localização cromossômica conservada entre o camundongo e o humano em uma região homóloga à Xq28 humana.
Clifford e outros (1999) não puderam demonstrar nenhuma mutação em VBP1 em 89 casos esporádicos de carcinoma celular renal.
domingo, 7 de setembro de 2008
193300 VON HIPPEL-LINDAU SYNDROME; VHL
Alternative titles; symbols
VON HIPPEL-LINDAU SYNDROME, MODIFIERS OF, INCLUDED
Gene map locus 11q13, 3p26-p25
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=193300
Um sinal (#) é usado nesta entrada pois a síndrome de von Hippel-Lindau é causada pela mutação no gene VHL.
Evidências sugerem que variação no gene da ciclina D1 (CCND1) no cromossomo 11q13 pode modificar o fenótipo.
DESCRIÇÃO
A syndrome von Hippel-Lindau (VHL) é uma síndrome de predisposição ao câncer dominantemente herdada em família, predispondo a uma variedade de neoplasmas malignos e benignos, mas freqüentemente na retina, cerebelo e hemangioblastoma espinhal, carcinoma das células renais (RCC), feocromocitoma (cromafinoma funcional, geralmente benigno, derivado de células do tecido medular supra-renal e caracterizado pela secreção de catecolaminas, resultando em hipertensão arterial, que pode ser paroxística e associada a episódios de palpitação, cefaléia, náuseas, dispnéia, ansiedade, palidez e sudorese profusa. O feocromocitoma freqüentemente é hereditário, não apenas em facomas como a doença de von Hippel-Lindau, neurofibromatose e neoplasia endócrina familiar, mas também como um defeito isolado [MIM 171300] como um traço autossômico dominante.) e tumores pancreáticos.
Neumann e Wiestler (1991) classificaram VHL como tipo 1 (sem feocromocitoma) e de tipo 2 (com feocromocitoma). Brauch e outros (1995) subdividiram adicionalmente o VHL de tipo 2 em tipo 2A (com feocromocitoma) e 2B (com feocromocitoma e carcinoma das células renais). Hoffman e outros (2001) notaram que o VHL de tipo 2C refere-se a pacientes com feocromocitoma isolado sem hemangioblastoma ou carcinoma das células renais.(Hemangioblastoma: neoplasia benigna que, freqüentemente, surge no cerebelo, constituída por células endoteliais formadoras de vasos capilares e por células do estroma; tumor de crescimento lento que afeta primariamente indivíduos de meia-idade; incidência aumentada na doença de von Hippel-Lindau. Sin. Angioblastoma.)
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
As feições cardinais da síndrome de von Hippel-Lindau são angiomas (angioma é tumefação ou tumor decorrente da proliferação, com ou sem dilatação, dos vasos sangüíneos (hemangioma) ou linfáticos (linfangioma) da retina e hemangioblastoma do cerebelo. Hemangioma do cordão espinal também tem sido observado.O feocromocitoma ocorre em alguns pacientes. A combinação de hipertensão com angioma pode levar à hemorragia subaracnóide (sob a membrana aracnóide.) { Aracnóide-máter, Sin.: máter. Cranial aracnóide matter: a porção da aracnóide que se localiza dentro da cavidade craniana e circunda o cérebro é a porção craniana do espaço subaracnóide. Em vários locais está relativamente afastada da pia-máter, criando as cisternas cranianas subaracnóides. Aracnóde máter.: uma membrana fibrosa, delicada, que forma a porção média dos três revestimentos do sistema nervoso central. Na vida a aracnóide (especificamente a camada de células de barreira aracnóide) está tenuamente ligada à dura-máter externamente adjacente (especificamente as células da borda dural) e não existe espaço natural na interface dura-aracnóide. Dessa maneira, em uma punção espinal, a dura-máter e a aracnóide são penetradas simultaneamente, como uma camada única. A separação da aracnóide da dura-máter (geralmente através da camada de células da borda dural) pode resultar de processos traumáticos ou patológicos que criam o que é comumente, porém de forma incorreta, denominado hematoma subdural. A aracnóide é assim chamada por causa de seus filamentos delicados em forma de teia de aranha, que se estende desde sua superfície profunda, através do líquor do espaço subaracnóide, até a pia máter. Aracnóide espinhal máter: a porção da aracnóide que se situa dentro do canal vertebral e que circunda a medula espinal e a porção vertebral do espaço subaracnóide. Estende-se desde o forrame magno, acima, até o nível vertebral S2. Como a medula espinal termina no nível vertebral L2, ocorre uma ampla separação entre a aracnóide e a pia-máter, a cisterna lombar, cheia de líquido cefalorraquidiano, na qual está suspensa a cauda eqüina. } Tumores renais similares a hipernefroma (hipernefróide é semelhate ou do tipo da glândula supra-renal) ocorrem em alguns pacientes. Policitemia (aumento acima do normal do número de hemácias no sangue) pode ser devida tanto ao hemangioblastoma do cerebelo ou ao hipernefroma. Hemangiomas das adrenais (próximo ou sobre o rim; glândula supra-renal ou adrenal, ou tecido produto dela separado), pulmões e fígado, e múltiplos cistos do pâncreas e rins têm sido observados em alguns casos.
Embora existam muitas notícias anteriores desta síndrome (veja História em OMIM: 171300), Melmon e Rosen (1964) introduziram o termo síndrome ‘von Hippel-Lindau’ e descreveram um grande parentesco com características múltiplas desta desordem. A condição do aneurisma arteriovenoso da retina e do mesencéfalo {no adulto o mesencéfalo é caracterizado pela conformação única de sua lâmina do teto, composta pelo par de colículos superiores e inferiores bilaterais e pelo grande par de proeminências dos pilares do cérebro em sua superfície ventral. Ao corte transversal, seu canal pérvio, o aqueduto do mesencéfalo, é circundado por um anel proeminente de substância cinzenta pobre em fibras mielinizadas; a substância cinza perieaquedural é unida ventral e lateralmente pelo tegmento mesencefálico rico em mielina, e coberta dorsalmente pela lâmina do teto mesencefálico. Grupos celulares proeminentes do mesencéfalo incluem os núcleos motores dos nervos troclear e oculomotor, o núcleo vermelho e a substância negra.} com nevo facial{ nevo é : 1) malformação circuscrita da pele, especialmente quando colorida por hiperpigmentação ou por vascularidade aumentada; o nevo pode ser predominantemente epidérmico, anexial (no tecido anexo?), melanocítico, vascular ou mesodérmico ou pode consisitir numa proliferação mista desses tecidos;2) proliferação localizada benigna de células formadoras de melanina na pele, presente por ocasião do nascimento ou que aparece no início da vida; alguns tipos: nevo vascularis = hemangioma capilar, nevo venoso =formado por uma placa de vênulas dilatadas, nevo displástico = nevo com diâmetro de mais de 5 mm e bordas irregulares, indistintas ou chanfrada (com arestas), de cor preto-acastanhada e róseo-avermelhada mista que ao microscópio trata-se de melanócitos intra-epidérmicos de localização basal e dispersos, com núcleos hipercromáticos maiores do que os dos ceratinócitos basais; quando múltiplos e associados a u histórico familiar de melanoma, implicam em risco de tranformação maligna.} descrito por Bonnet e outros (1938) e por Wyburn-Mason (1943), está sob certo relacionamento para com esta condição. Câncer renal metastásico ocorre em alguns casos (Kranes e Balogh ,1966). Goldberg e Duke (1968) examinaram os olhos de um homem negro de 51 anos de idade afetado cuja mãe faleceu de tumor cerebral aos 26 anos. O mesmo caso foi descrito por McKusick e outros (1961). Em adição para a associação a tumores do cérebro e da medula adrenal que ocorrem em neurofibromatores e na doença de von Hippel-Lindau, tumores cerebrais às vezes produzem hipertensão paroxística (paroxismo é espasmo ou convulsão) similar àquela do feocromocitoma. Catecolaminas {pirocatecóis com uma cadeia lateral alquilamina (alcano contendo um grupamento –NH2, no lugar do átomo H; p. ex. etilamina); são exemplos de interesse bioquímico: epinefrina, norepinefrina e L-dopa) urinárias são normais em tais casos (Cameron e Doig, 1970).
Cistos e tumores hipernefróides (semelhante a ou do tipo da glândula supra-renal) do epidídimo têm sido descritos em pacientes VHL (Grossman e Melmon, 1972). Pacientes homens podem ter cistadenoma (neoplasia histologicamente benigna, derivada do epitélio glandular, na qual são formados acúmulos císticos de secreções retidas; em alguns casos partes consideráveis da neoplasia, ou mesmo toda a massa, podem ser císticas) papilar (relativo a, semelhante a ou formado por papilas; estas, estruturas semelhantes a um mamilo pequeno) do epidídimo, um tumor incomum que é bilateral quando ocorre na doença de von Hippel-Lindau e nãoé familiar quando unilateral (Price, 1971). A experiência de Lamiell (1987) diferiu, entretanto; sete dos vinte e um homens afetados em um parentesco tinham uma massa epididimal e cinco dessas eram unilaterais. Tsuda e outros (1976) observaram a ocorrência de cistadenoma papilar bilateral do epidídimo em três irmãos com a síndrome VFL. Os cistadenomas papilares bilaterais do nítido ligamento, presumivelmente de origem mesonéfrica {mesonefro: um dos três órgãos excretores que aparecem na evolução dos vertebrados. Em embriões jovens de mamíferos o mesonefro é bem desenvolvido e funciona brevemente até o estabelecimento do metanefro, o rim definitivo; em embriões mais velhos, o mesonefro sofre regressão como órgão excretor, mas seu sistema ductal é mandido no homem como epidídimo e ducto deferente.}, é o provável tumor homólogo das mulheres (Erbe, 1978).
Na doença de von Hippel-Lindau com feocromocitoma, Atuk e outros (1979) noticiaram hipercalcemia (concentração anormalmente elevada de compostos de cálcio no sangue circulante; termo comumente utilizado para indicar uma concentração elevada de íons de cálcio no sangue) a qual foi corrigida em todos pela remoção do tumor. Em vários pacientes, o feocromocitoma antedatava o desenvolvimento de lesões da retina. Fishman e Bartholomew (1979) descreveram três pacientes aparentados com visível envolvimento de pancreático. Um teve insuficiência pancreática exócrina. Em um extensiva afecção parental, Fill e outros (1979) encontraram células de carcinoma renal em 16 dos 42 casos e carcinoma do pâncreas em 4 dos 42.
Griffiths e outros (1987) encontraram notícias de 6 pacientes com a syndrome de von Hippel-Lindau, feocromocitoma, e ilhas de células tumorais. Onze pacientes adicionais apresentaram feocromocitoma e ilhas de células de tumor. Nenhum paciente com a síndrome de von Hippel-Lindau tinham tumor carcinóide {carcinoma é qualquer das neoplasias malignas derivadas de células epiteliais, principalmente glandulares (adenocarcinoma) ou escamosos; o tipo de câncer mais comum}, o que é uma característica de neurofibromatose com feocromocitoma [veja Neurofibromatose de tipo I (162200) é causada pela mutação no gene da neurofribromina. É o tipo mais comum de neurofibromatose ocasionando tumores cutâneos e subcutâneos. Embora a neurofibromatose de tipo I tenha sido chamada neurofibromatose periférica, ela tem sido associada com tumors do sistema nervosa central, o que inclui astrocitomas das vias visuais, ependimomas (epêndima é a membrana celular que reveste o canal central da medula espinal e os ventrículos cerebrais; ependimoma é um glioma derivado de células epedimárias relativamente indiferenciadas que representa cerca de 1 a 3% de todas as neoplasias intracranianas; glioma é qualquer neoplasia derivada de um dos diferentes tipos de células que formam o tecido intersticial do cérebro, da medula espinal, da glândula pineal, da neuro-hipófise e da retina; glia é sinônimo de neuróglia: elementos celulares não-neuronais dos sistemas nervoso central eperiférico, estão invariavelmente interpostas entre os neurônios e os vasos sangüíneos que suprem o sistema nervoso; acredita-se que tenham funções metabólicas importantes), meningiomas (neoplasia benigna de origem aracnóide) e alguns tumores neuroectodérmicos (neuroéctoderma é a região que, no desenvolvimento embrionário, forma o cérebro e a medula espinal, a crista neural que se transforma nas células nervosas e neurilema ou células de Shwaan do sistema nervoso periférico)]. Nenhum caso de neurofibromatose tinha ilhas de células tumorais. Em Cardiff, Wales, vinte pacientes com hemangioblastoma do cerebelo foram vistos entre 1972 e 1985. Em oito destes, Huson e outros (1986) subseqüentemente estabeleceram o diagnóstico da doença de von Hippel-Lindau. Embora o diagnóstic não fosse previamente considerado, em retrospectiva, sete dos oito casos foram conhecidos por estarem no risco da síndrome.
Jennings e outros (1988) demonstraram a utilidade de estudos familiais na determinação de lesões assintomáticas requerendo tratamento, tais como o carcinoma de células renais. Eles também noticiaram a ocorrêcia de um hamartoma {malformação focal que se assemelha a uma neoplasia, macroscópica e até microscópicamente, mas que resulta do desenvolvimento defeituoso em determinado órgão; composto de uma mistura anormal de elementos teciduais ou de proporção anormal de um único elemento, que cresce na mesma velocidade que os componentes normais, não tende a causar compressão dos tecidos adacentes (ao contrário da neoplasia)} mesenquimal {mesênquima: 1) uma agregação de células mesenquimais ou fiboblásticas;2) tecido conjuntivo embrionário primordial que consiste em células mesenquimais; geralmente de forma estrelada sustentadas pela geléia interlaminar}no cordão espermático nesta desordem. Lamiell e outros (1989) identificaram 43 membros afetados de um grande parentesco, os quais foram excepcionais por ausência de feocromocitoma e eritrocitemia (eritrocitemia = policitemia, aumento de hemácias no sangue), para mais cistos pancreáticos e renais e malignidades, e por um pouco de febre nos olhos e lesões do sistema nervoso central. O adenocarcinoma renal bilateral foi encontrado pré-sintomaticamente em 5 sujeitos joven que tiveram nefrectomia bilateral e hemodiálise. Três sobreviveram a longo prazo após os transplantes renais. Cinco mambros da família tiveram malignidade pancreática.
Horbach e outros (1989) sugeriram que a combinaão do feocromocitoma adrenal e o carcinoma de células renais ipsolateral (do mesmo lado) pode representar uma forma frustrada da doença von Hippel-Lindau.
Neumann e Wiestler (1991) encontraram uma notória tendência para aglomeração familial de feições particulares da doença de VHL. Ambas angiomatose retinal e hemangioblastoma do sistema nervoso central ocorreram na maioria das famílias, enquanto a ocorrência das lesões renais e/ou cistos pancreáticos foram mutualmente exclusivas com feocromocitoma. Os autores interpretaram esses achados como indicativos de que o lócus de VHL é complexo, com a existência de diferentes mutações em diferentes famílias ou a ocorrênciade lesões genéticas adicionais que cooperam com o gene de VHL no cromossomo 3p. Eles sugeriram uma seqüência linear de características como a seguir: feocromocitoma, angiomatose retinal, hemangioblastoma do sistema nervoso central, lesões renais, cistos pancreáticos e cistadenoma epididimal.
No curso da avaliação de 41 famílias dos Estados Unidos e Canadá com esta desordem, Glenn e outros (1991) acharam uma grande família com um fenótipo distintivo: a manifestação mais comum da doença era o eocromocitoma ocorrendo em 57% (27 de 47) dos membros afetados; poucos (4 dos 47) tinham hemagioblatomas espinal ou cerebelar sintomáticos; nenhum membro afetado da família tinha carcinoma das células renais ou cistos pancreáticos. Análises genéticas demonstraram, entretanto, que a desordem nesta família estava ligada aos mesmos marcadores encontrados por serem ligados à VHL típica. As observações são claramente relevantes para as descrições de famílias com feocromocitoma ‘puro’ (171300); eles podem ser instâncias do alelismo no lócus do VHL. {Obs.: PHEOCHROMOCYTOMA Gene map locus 1p36.2, 11q23, 10q11.2, 5p13.1-p12, 3p26-p25, 1p36.1-p35; PERLECAN; PLC - Gene map locus 1p36.1}.
Keel e Klauber (1992) descreveram o carcinoma nas células renais em um menino de 16 anos, provavelmente o exemplo mais jovem noticiado de hipernefroma na doença de VHL.
Lenz e outros (1992) demonstraram que a produção e norepinefrina (hormônio catecolamínico cuja forma natural é D, apesar de a forma L exibir alguma atividade; a ase é considerada o mediador adrenergético pós-ganglionar, atuando sobre receptores alfa e beta; é armazenada em grânulos cromfins na medula supra-renal, em quantidades muito menores que a epinefrina, e secretada em resposta à hipotensão e ao estresse físico; em contraste com a epinefrina, exerce pouco efeito sobre o músculo liso e o brônquio, processos metabólicos e deito cardíaco, porém possui efeitos vasoconstritores pronunciados e é utilizada farmacologicamente como vasopressor, primariamente na forma do sal bitartarato; sin. noradrenaline, levarterenol) no feocromocitoma adrenal na doença de von Hippel-Lindau pode produzir a síndrome clínica de hipertensão associada com severa hipocaliemia (ou hipopotassemia é a concentração anormalmente baixa de íons de potássio no sangue circulante que pode causar vacuolização do citoplasma das células epiteliais tubulares renais, com comprometimento da capacidade de concentração urinária e acidificação, achatamento da onda T no eletrocardiograma e fraqueza muscular) e hiperaldestorenismo (aldosterona é o hormônio produzido pela zona do córtex supra-renal; sua principal ação é facilitar a troca de potássio por sódio no túbulo renal distal, levando à reabsorção de sódio e à perda de potássio e hidrogênio; é o principal mineralocorticóide) hiperreninêmico (?). O hiperaldosteronismo hiperreninêmico foi rapidamente melhorado por bloqueio-beta e foi completamente revertido pela remoção do tumor.
Davies e outros (1994) descreveram uma mulher de 65 anos de idade que era uma portadora obrigatória do gene para a doença de von Hippel-Lindau. Seu pai, dois irmãos, duas irmãs e três filhos tinham hemangioblastoma e carcinomas renais. O exame cuidadoso da mulher demonstrou somente um pequeno cisto renal benigno. Tais cistos são muito comuns na população em geral. Por isso, o portador obrigatório do gene pode não exibir nenhuma característica da doença acima da idade dos 60 anos.
Usando um regitro de composição do VHL no noroese da Inglaterra em 1990 contendo informações de 83 pessoas afetadas, Maddock e outros (1996) estudaram estatísticas populacionais, cacterísticas clínicas, idade no momento da manifestação, e sobrevivência. A principal idade de manifestação dos primeiros sintomas foi aos 26.25 anod, com hemangioblastoma cerebelar sendo a manifestação apresentada mais comum (34,9% dos casos). A principal idade de diagnóstico do VHL era de 30,87 anos. Ao todo, 50 pacientes (60,2%) desenvolveram um hemangioblastoma cerebelar, e 12 (14,5%) um feocromocitoma. A principal idade para óbito foi de 40,9 anos com hemangioblastoma cerebelar sendo a causa mais comum (47.7% das mortes). Em adição aos 83 sujeitos clinicamente afetados, Maddock e outros (1996) identificaram 3 portadores obrigatórios que eram considerados por serem livres de lesões nos extensivos testes de verificação. No registro do câncer baseado regionalmente, 14% de todos os hemangioblastomas do sistema nervoso central eram achados por ocorrer como parte da doença de VHL, porém investigações para o VHL em casos aparentemente esporádicos pareceram terem sido limitadas.
Os tumores do saco endolinfático (ELSTs) são altamente vascularizados, benignos, mas localmente neoplasmas agressivos do sistema endolinfático que freqüentemente destroem o osso temporal circundante (osso temporal: um grande osso irregular situado na base e no lado do crânio, consiste em três partes, escamosa, timpânica e petrosa, que estão distintas ao nascimento; a parte petrosa contém o órgão vestibulococlear; o osso articula-se com os ossos esfenóide, parietal, occipital e zigomático, e , através de uma articulação sinovial, com a mandímbula.)
Lonser e outros (2004) descreveram três casos da doença de von Hippel-Lindau que ilustraram as seguintes características do tumor do saco endolinfático: perda mórbida da audição devido a tumor microscópico radilogicamente indetectável no saco ou duto endolinfático; sintomas iniciais causados por hemorragia, hidropsia (acúmulo de líquido aquoso e claro em qualquer cavidade ou tecido) endolinfática, ou ambos; uma origem no duto ou saco endolinfático; e a evidência molecular de uma associação com a doença de von Hippel-Lindau. A ressecção cirúrgica completa dos tumores do saco endolinfático é curativa e pode ser desempenhada com a preservação da audição e alívio dos sintomas vestibulares.
Butman e outros (2007) noticiaram 35 pacientes VHL com ELSTs; 3 tinham tumores bilaterais. A idade principal de início do sintoma foi de 31 anos (num raios e 11 para 63 anos). Em adição à perda auditiva, zumbido e vertigem, outras características incluíram corpulência auricular, dor auricular e fraqueza do nervo facial. Estudos detalhados de CT e MRI demonstraram que 7 (18%) ouvidos tinham invasão da cápsula auricular, o que foi sempre associado com a perda da audição. Tumores com invasão da cápsula auricular eram maiores (2,2 cm) do que aqueles sem invasão da cápsula (1,2 cm). Entretanto, não havia uma associação significativa entre o tamanho do tumor e a perda da audição. Hemorragia intralabirintina (parte interna do ouvido) foi detectada em 79% dos ouvidos com perda súbita da audição. Butman e outros (2007) concluíram que a perda auditiva associada com ELSTs podem resultar da invasão da cápsula auricular, hemorragia intralabirintina ou hidropsia endolinfática.
James (1998) entabularam notícias de quatro mulheres com VHL e amplo cistadenoma papilar de ligamento publicadas entre 1988 e 1994 (Gersell e King, 1988; Funk e Heiken, 1989; Korn e outros 1990; Gaffey e outros; Karsdorp e outros 1994) e adicionaram um quinto caso. Estes eram cistos mesosalpinge [a parte do ligamento largo que reveste a tuba uterina (de Falópio)], os quais são o equivalente dos cistos do epidídimo no homem. Os cistos eram unilaterais em três dos cnco casos. Eles ocorreram ao longo do curso todo do duto mesonéfrico, no encerramento para o ovário, sobre as tubas uterinas, e perto do fórnice vaginal em um resto do duto Gartner (a contrapartida feminina do duto do epidídimo). Ao todo, 3 dos pacientes tiveram cistos renais e carcinoma das células renais bilaterais. No paciente noticiado por Korn e outros (1990), a verificação para VHL após os cistadenomas papilares foi diagnosticada durante o acompanhamento da cirurgia. O cisto unilateral no paciente reportado por Gaffey e outros (1994) foi precedido pelo achado de um tumor papilar médio no ouvido. A apresentação combinada de cistadenoma mesonéfrico e tumor do ouvido foi notada em notícias de cistos no epidídimo no homem (Price, 1971). Gaffey e outros (1994) sugeriram que o tumor no ouvido e o tumor adnexo (anexo) podem representar uma das principais manifestações viscerais do VHL.
Fukino e outros (2000) descreveram uma família japonesa com VHL na qual dois dos três membros afetados desenvolveram aguda oclusiva hidrocefalia (acúmulo de líquido cefalorraquidiano, resultando em dilatação dos ventrículos cerebrais e elevação da pressão intracraniana) que necessitaram de cirurgia emergencial para manobra ou drenagem ventricular. Em ambos os casos, a oclusão do canal cerebroespinal foi causada por hemangioblastoma cerebelar. Os dois pacientes com hidrocefalia eram irmãs com oito e desenove anos no momento do desenvolvimento da hidrocefalia obstrutiva. Elas herdaram VHL de sua mãe, que também sofreu de hemangiolastoma cerebelar requerendo cirurgia assim como angioma retinal.
McCabe e outros (2000) descreveram as características clínicas, associação com a doença de von Hippel-Lindua, e a acuidade visual resultante de paciente com hemangioma capilar justapapilar, no ou em adjacência ao nervo optico. Devido à sua localização, um hamartoma (malformação parecido com neoplasia macroscópica ou microscopicamente) nas lesões pode potencialmente ser diagnosticado equivocadamente como papiledema, papilite, neovascularização coróidal (túnica vascular média do olho situada entre o epitélio pigmentar e a esclerótica), ou coróidite. Foram descritas as formas endofítica (relativa a um tumor invasivo) e exofítica (designa uma neoplasia ou lesão que cresce fora da superfície epitelial) e séssil (que possui ampla base de fixação). Em acompanhamento de longo prazo, a acuidade visual geralmente melhorou. Pacientes com VHL e hamangioma justapapilar , mais frequentemente apresentados em idade jovem, tiveram tumores com um padrão de crescimento endofítico, e tiveram múltiplos tumores bilaterais. O tratamento do tumor com fotocoagulação a laser resultou em acuidade visual variável conseqüente nos pacientes relatados.
Raja e outros (2004) ralataram que o brilho externo da radioterapia (EBRT) era uma opção útil no tratamento de hemangiomas retinais secundários para doença de VHL que progrediu a despeito da terapia padrão. EBRT levou à melhora da acuidade visual, redução no volume do tumor e estabilização da separação na maioria dos pacientes tratados.
Eisenhofer e outros (2001) examinaram os mecanismos ligando diferentes fenótipos bioquímicos e clínicos de feocromocitoma em MEN2 (omim 171400) e VHL para delinear diferenças na expressão da tirosina hidroxilase (TH Tirosina hidroxilase está envolvida na conversão da fenilalanina em dopamina. Como uma enzima de limitação de taxa na síntese de catecilaminas, a tirosina hidroxilase tem um papel-chave na fisiologia dos neurônios adrenergéticos relativo a células nervosas ou fibras do sistema nervoso autônomo que empregam a norepinefrina como seu neurotransmissor), a enzima limitante da taxa em síntese de catecolaminas, e da feniletalonamina N-metiltransferase (PNMT 171190), a enzima que converte a norepinefrina em epinefrina (adrenalina, uma catecolamina que é o principal neuro-hormônio da medula supra-renal da maioria das espécies; também é secretada por neurônios) Sinais e sintomas do feocromocitoma, catecolaminas e metanefinas (catabólitos da epinefrina encontrado, junto com a normetanefrina, na urina e em alguns tecidos, resultante da ação da catecol-O-metiltrasferase sobre a epinefrina) do plasma, e neuroquímica de células tumorais e expressão de TH e PNMT foram examinadas e 19 pacientes de MEN2 e 30 pacientes de VHL com feocromocitomas adrenais. Os pacientes de MEN2 eram mais sintomáticos e tinham maior incidência de hipertensão (principalmente paroxístico [paroxismo = convulsão ou espasmo súbito]) e concentrações mais altas de metanefrinas no plasma, porém paradoxalmente concentrações totais mais baixas de catecolaminas, do que os pacientes de VHL. Todos os pacientes de MEN2 tiveram elevadas concentrações plasmáticas do metabólito da epinefrina metanefrina, enquanto os pacientes de VHL apresentaram aumentos específicos no metabólito da norepinefrina, a normetanefrina. As diferenças sobre uma apresentação clínica foram largamente explicadas por conteúdos teciduais totais mais baixos de catecolaminas e expressão de TH e estoques insgnificantes de epinefrina e expressão de PNMT em feocrmocitomas de VHL do que em pacientes de MEN2.
Taouli e outros (2003) discutiram achados em imagem abdominal, incluindo imagens pictóricas, de mais de 150 pacientes com a síndrome de VHL. Os achados mais comuns eram massas renais e pancreáticas.
Num estudo prospective de 406 pacientes de VHL de 199 famílias vistos em uma instituição num período de 12 anos, Chew (2005) encontrou que 205 dos pacientes tinham enolvimento ocular. Pacientes com completa deleção do gene VHL eram menos propensos a ter envolvimento ocular do que aqueles cm deldeção parcial, mutações de sentido trocado e sem sentido (9% x 45%; p menor que 0.0001). Chew (2005) identificou uma feição ocular não relatada previamente, neovascularização retinal, em 17 pacientes. Chew (2005) também encontrou 11 casos de hemangiblastoma intraorbital/intracranial, previamente relatado por ser raro na VHL, contabilizando para 5.3% de todas as lesões de tratamento da vista no grupo de estudo.
Em excisão cirúrgica de hemangioblastomas retinais associados com a doença de vonHipel-Lindau, Liang e outros (2007) demonstraram altos níveis de mRNA de VEGF (192240) e CXCR4 (162643) e da proteína, porém baixos níveis de CXCL12 (SPD1- 600835). A expressão aumentada de VEGF e CXCR4 também foi detectada nos hemangioblastomas mais ativos.
Alternative titles; symbols
VON HIPPEL-LINDAU SYNDROME, MODIFIERS OF, INCLUDED
Gene map locus 11q13, 3p26-p25
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=193300
Um sinal (#) é usado nesta entrada pois a síndrome de von Hippel-Lindau é causada pela mutação no gene VHL.
Evidências sugerem que variação no gene da ciclina D1 (CCND1) no cromossomo 11q13 pode modificar o fenótipo.
DESCRIÇÃO
A syndrome von Hippel-Lindau (VHL) é uma síndrome de predisposição ao câncer dominantemente herdada em família, predispondo a uma variedade de neoplasmas malignos e benignos, mas freqüentemente na retina, cerebelo e hemangioblastoma espinhal, carcinoma das células renais (RCC), feocromocitoma (cromafinoma funcional, geralmente benigno, derivado de células do tecido medular supra-renal e caracterizado pela secreção de catecolaminas, resultando em hipertensão arterial, que pode ser paroxística e associada a episódios de palpitação, cefaléia, náuseas, dispnéia, ansiedade, palidez e sudorese profusa. O feocromocitoma freqüentemente é hereditário, não apenas em facomas como a doença de von Hippel-Lindau, neurofibromatose e neoplasia endócrina familiar, mas também como um defeito isolado [MIM 171300] como um traço autossômico dominante.) e tumores pancreáticos.
Neumann e Wiestler (1991) classificaram VHL como tipo 1 (sem feocromocitoma) e de tipo 2 (com feocromocitoma). Brauch e outros (1995) subdividiram adicionalmente o VHL de tipo 2 em tipo 2A (com feocromocitoma) e 2B (com feocromocitoma e carcinoma das células renais). Hoffman e outros (2001) notaram que o VHL de tipo 2C refere-se a pacientes com feocromocitoma isolado sem hemangioblastoma ou carcinoma das células renais.(Hemangioblastoma: neoplasia benigna que, freqüentemente, surge no cerebelo, constituída por células endoteliais formadoras de vasos capilares e por células do estroma; tumor de crescimento lento que afeta primariamente indivíduos de meia-idade; incidência aumentada na doença de von Hippel-Lindau. Sin. Angioblastoma.)
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
As feições cardinais da síndrome de von Hippel-Lindau são angiomas (angioma é tumefação ou tumor decorrente da proliferação, com ou sem dilatação, dos vasos sangüíneos (hemangioma) ou linfáticos (linfangioma) da retina e hemangioblastoma do cerebelo. Hemangioma do cordão espinal também tem sido observado.O feocromocitoma ocorre em alguns pacientes. A combinação de hipertensão com angioma pode levar à hemorragia subaracnóide (sob a membrana aracnóide.) { Aracnóide-máter, Sin.: máter. Cranial aracnóide matter: a porção da aracnóide que se localiza dentro da cavidade craniana e circunda o cérebro é a porção craniana do espaço subaracnóide. Em vários locais está relativamente afastada da pia-máter, criando as cisternas cranianas subaracnóides. Aracnóde máter.: uma membrana fibrosa, delicada, que forma a porção média dos três revestimentos do sistema nervoso central. Na vida a aracnóide (especificamente a camada de células de barreira aracnóide) está tenuamente ligada à dura-máter externamente adjacente (especificamente as células da borda dural) e não existe espaço natural na interface dura-aracnóide. Dessa maneira, em uma punção espinal, a dura-máter e a aracnóide são penetradas simultaneamente, como uma camada única. A separação da aracnóide da dura-máter (geralmente através da camada de células da borda dural) pode resultar de processos traumáticos ou patológicos que criam o que é comumente, porém de forma incorreta, denominado hematoma subdural. A aracnóide é assim chamada por causa de seus filamentos delicados em forma de teia de aranha, que se estende desde sua superfície profunda, através do líquor do espaço subaracnóide, até a pia máter. Aracnóide espinhal máter: a porção da aracnóide que se situa dentro do canal vertebral e que circunda a medula espinal e a porção vertebral do espaço subaracnóide. Estende-se desde o forrame magno, acima, até o nível vertebral S2. Como a medula espinal termina no nível vertebral L2, ocorre uma ampla separação entre a aracnóide e a pia-máter, a cisterna lombar, cheia de líquido cefalorraquidiano, na qual está suspensa a cauda eqüina. } Tumores renais similares a hipernefroma (hipernefróide é semelhate ou do tipo da glândula supra-renal) ocorrem em alguns pacientes. Policitemia (aumento acima do normal do número de hemácias no sangue) pode ser devida tanto ao hemangioblastoma do cerebelo ou ao hipernefroma. Hemangiomas das adrenais (próximo ou sobre o rim; glândula supra-renal ou adrenal, ou tecido produto dela separado), pulmões e fígado, e múltiplos cistos do pâncreas e rins têm sido observados em alguns casos.
Embora existam muitas notícias anteriores desta síndrome (veja História em OMIM: 171300), Melmon e Rosen (1964) introduziram o termo síndrome ‘von Hippel-Lindau’ e descreveram um grande parentesco com características múltiplas desta desordem. A condição do aneurisma arteriovenoso da retina e do mesencéfalo {no adulto o mesencéfalo é caracterizado pela conformação única de sua lâmina do teto, composta pelo par de colículos superiores e inferiores bilaterais e pelo grande par de proeminências dos pilares do cérebro em sua superfície ventral. Ao corte transversal, seu canal pérvio, o aqueduto do mesencéfalo, é circundado por um anel proeminente de substância cinzenta pobre em fibras mielinizadas; a substância cinza perieaquedural é unida ventral e lateralmente pelo tegmento mesencefálico rico em mielina, e coberta dorsalmente pela lâmina do teto mesencefálico. Grupos celulares proeminentes do mesencéfalo incluem os núcleos motores dos nervos troclear e oculomotor, o núcleo vermelho e a substância negra.} com nevo facial{ nevo é : 1) malformação circuscrita da pele, especialmente quando colorida por hiperpigmentação ou por vascularidade aumentada; o nevo pode ser predominantemente epidérmico, anexial (no tecido anexo?), melanocítico, vascular ou mesodérmico ou pode consisitir numa proliferação mista desses tecidos;2) proliferação localizada benigna de células formadoras de melanina na pele, presente por ocasião do nascimento ou que aparece no início da vida; alguns tipos: nevo vascularis = hemangioma capilar, nevo venoso =formado por uma placa de vênulas dilatadas, nevo displástico = nevo com diâmetro de mais de 5 mm e bordas irregulares, indistintas ou chanfrada (com arestas), de cor preto-acastanhada e róseo-avermelhada mista que ao microscópio trata-se de melanócitos intra-epidérmicos de localização basal e dispersos, com núcleos hipercromáticos maiores do que os dos ceratinócitos basais; quando múltiplos e associados a u histórico familiar de melanoma, implicam em risco de tranformação maligna.} descrito por Bonnet e outros (1938) e por Wyburn-Mason (1943), está sob certo relacionamento para com esta condição. Câncer renal metastásico ocorre em alguns casos (Kranes e Balogh ,1966). Goldberg e Duke (1968) examinaram os olhos de um homem negro de 51 anos de idade afetado cuja mãe faleceu de tumor cerebral aos 26 anos. O mesmo caso foi descrito por McKusick e outros (1961). Em adição para a associação a tumores do cérebro e da medula adrenal que ocorrem em neurofibromatores e na doença de von Hippel-Lindau, tumores cerebrais às vezes produzem hipertensão paroxística (paroxismo é espasmo ou convulsão) similar àquela do feocromocitoma. Catecolaminas {pirocatecóis com uma cadeia lateral alquilamina (alcano contendo um grupamento –NH2, no lugar do átomo H; p. ex. etilamina); são exemplos de interesse bioquímico: epinefrina, norepinefrina e L-dopa) urinárias são normais em tais casos (Cameron e Doig, 1970).
Cistos e tumores hipernefróides (semelhante a ou do tipo da glândula supra-renal) do epidídimo têm sido descritos em pacientes VHL (Grossman e Melmon, 1972). Pacientes homens podem ter cistadenoma (neoplasia histologicamente benigna, derivada do epitélio glandular, na qual são formados acúmulos císticos de secreções retidas; em alguns casos partes consideráveis da neoplasia, ou mesmo toda a massa, podem ser císticas) papilar (relativo a, semelhante a ou formado por papilas; estas, estruturas semelhantes a um mamilo pequeno) do epidídimo, um tumor incomum que é bilateral quando ocorre na doença de von Hippel-Lindau e nãoé familiar quando unilateral (Price, 1971). A experiência de Lamiell (1987) diferiu, entretanto; sete dos vinte e um homens afetados em um parentesco tinham uma massa epididimal e cinco dessas eram unilaterais. Tsuda e outros (1976) observaram a ocorrência de cistadenoma papilar bilateral do epidídimo em três irmãos com a síndrome VFL. Os cistadenomas papilares bilaterais do nítido ligamento, presumivelmente de origem mesonéfrica {mesonefro: um dos três órgãos excretores que aparecem na evolução dos vertebrados. Em embriões jovens de mamíferos o mesonefro é bem desenvolvido e funciona brevemente até o estabelecimento do metanefro, o rim definitivo; em embriões mais velhos, o mesonefro sofre regressão como órgão excretor, mas seu sistema ductal é mandido no homem como epidídimo e ducto deferente.}, é o provável tumor homólogo das mulheres (Erbe, 1978).
Na doença de von Hippel-Lindau com feocromocitoma, Atuk e outros (1979) noticiaram hipercalcemia (concentração anormalmente elevada de compostos de cálcio no sangue circulante; termo comumente utilizado para indicar uma concentração elevada de íons de cálcio no sangue) a qual foi corrigida em todos pela remoção do tumor. Em vários pacientes, o feocromocitoma antedatava o desenvolvimento de lesões da retina. Fishman e Bartholomew (1979) descreveram três pacientes aparentados com visível envolvimento de pancreático. Um teve insuficiência pancreática exócrina. Em um extensiva afecção parental, Fill e outros (1979) encontraram células de carcinoma renal em 16 dos 42 casos e carcinoma do pâncreas em 4 dos 42.
Griffiths e outros (1987) encontraram notícias de 6 pacientes com a syndrome de von Hippel-Lindau, feocromocitoma, e ilhas de células tumorais. Onze pacientes adicionais apresentaram feocromocitoma e ilhas de células de tumor. Nenhum paciente com a síndrome de von Hippel-Lindau tinham tumor carcinóide {carcinoma é qualquer das neoplasias malignas derivadas de células epiteliais, principalmente glandulares (adenocarcinoma) ou escamosos; o tipo de câncer mais comum}, o que é uma característica de neurofibromatose com feocromocitoma [veja Neurofibromatose de tipo I (162200) é causada pela mutação no gene da neurofribromina. É o tipo mais comum de neurofibromatose ocasionando tumores cutâneos e subcutâneos. Embora a neurofibromatose de tipo I tenha sido chamada neurofibromatose periférica, ela tem sido associada com tumors do sistema nervosa central, o que inclui astrocitomas das vias visuais, ependimomas (epêndima é a membrana celular que reveste o canal central da medula espinal e os ventrículos cerebrais; ependimoma é um glioma derivado de células epedimárias relativamente indiferenciadas que representa cerca de 1 a 3% de todas as neoplasias intracranianas; glioma é qualquer neoplasia derivada de um dos diferentes tipos de células que formam o tecido intersticial do cérebro, da medula espinal, da glândula pineal, da neuro-hipófise e da retina; glia é sinônimo de neuróglia: elementos celulares não-neuronais dos sistemas nervoso central eperiférico, estão invariavelmente interpostas entre os neurônios e os vasos sangüíneos que suprem o sistema nervoso; acredita-se que tenham funções metabólicas importantes), meningiomas (neoplasia benigna de origem aracnóide) e alguns tumores neuroectodérmicos (neuroéctoderma é a região que, no desenvolvimento embrionário, forma o cérebro e a medula espinal, a crista neural que se transforma nas células nervosas e neurilema ou células de Shwaan do sistema nervoso periférico)]. Nenhum caso de neurofibromatose tinha ilhas de células tumorais. Em Cardiff, Wales, vinte pacientes com hemangioblastoma do cerebelo foram vistos entre 1972 e 1985. Em oito destes, Huson e outros (1986) subseqüentemente estabeleceram o diagnóstico da doença de von Hippel-Lindau. Embora o diagnóstic não fosse previamente considerado, em retrospectiva, sete dos oito casos foram conhecidos por estarem no risco da síndrome.
Jennings e outros (1988) demonstraram a utilidade de estudos familiais na determinação de lesões assintomáticas requerendo tratamento, tais como o carcinoma de células renais. Eles também noticiaram a ocorrêcia de um hamartoma {malformação focal que se assemelha a uma neoplasia, macroscópica e até microscópicamente, mas que resulta do desenvolvimento defeituoso em determinado órgão; composto de uma mistura anormal de elementos teciduais ou de proporção anormal de um único elemento, que cresce na mesma velocidade que os componentes normais, não tende a causar compressão dos tecidos adacentes (ao contrário da neoplasia)} mesenquimal {mesênquima: 1) uma agregação de células mesenquimais ou fiboblásticas;2) tecido conjuntivo embrionário primordial que consiste em células mesenquimais; geralmente de forma estrelada sustentadas pela geléia interlaminar}no cordão espermático nesta desordem. Lamiell e outros (1989) identificaram 43 membros afetados de um grande parentesco, os quais foram excepcionais por ausência de feocromocitoma e eritrocitemia (eritrocitemia = policitemia, aumento de hemácias no sangue), para mais cistos pancreáticos e renais e malignidades, e por um pouco de febre nos olhos e lesões do sistema nervoso central. O adenocarcinoma renal bilateral foi encontrado pré-sintomaticamente em 5 sujeitos joven que tiveram nefrectomia bilateral e hemodiálise. Três sobreviveram a longo prazo após os transplantes renais. Cinco mambros da família tiveram malignidade pancreática.
Horbach e outros (1989) sugeriram que a combinaão do feocromocitoma adrenal e o carcinoma de células renais ipsolateral (do mesmo lado) pode representar uma forma frustrada da doença von Hippel-Lindau.
Neumann e Wiestler (1991) encontraram uma notória tendência para aglomeração familial de feições particulares da doença de VHL. Ambas angiomatose retinal e hemangioblastoma do sistema nervoso central ocorreram na maioria das famílias, enquanto a ocorrência das lesões renais e/ou cistos pancreáticos foram mutualmente exclusivas com feocromocitoma. Os autores interpretaram esses achados como indicativos de que o lócus de VHL é complexo, com a existência de diferentes mutações em diferentes famílias ou a ocorrênciade lesões genéticas adicionais que cooperam com o gene de VHL no cromossomo 3p. Eles sugeriram uma seqüência linear de características como a seguir: feocromocitoma, angiomatose retinal, hemangioblastoma do sistema nervoso central, lesões renais, cistos pancreáticos e cistadenoma epididimal.
No curso da avaliação de 41 famílias dos Estados Unidos e Canadá com esta desordem, Glenn e outros (1991) acharam uma grande família com um fenótipo distintivo: a manifestação mais comum da doença era o eocromocitoma ocorrendo em 57% (27 de 47) dos membros afetados; poucos (4 dos 47) tinham hemagioblatomas espinal ou cerebelar sintomáticos; nenhum membro afetado da família tinha carcinoma das células renais ou cistos pancreáticos. Análises genéticas demonstraram, entretanto, que a desordem nesta família estava ligada aos mesmos marcadores encontrados por serem ligados à VHL típica. As observações são claramente relevantes para as descrições de famílias com feocromocitoma ‘puro’ (171300); eles podem ser instâncias do alelismo no lócus do VHL. {Obs.: PHEOCHROMOCYTOMA Gene map locus 1p36.2, 11q23, 10q11.2, 5p13.1-p12, 3p26-p25, 1p36.1-p35; PERLECAN; PLC - Gene map locus 1p36.1}.
Keel e Klauber (1992) descreveram o carcinoma nas células renais em um menino de 16 anos, provavelmente o exemplo mais jovem noticiado de hipernefroma na doença de VHL.
Lenz e outros (1992) demonstraram que a produção e norepinefrina (hormônio catecolamínico cuja forma natural é D, apesar de a forma L exibir alguma atividade; a ase é considerada o mediador adrenergético pós-ganglionar, atuando sobre receptores alfa e beta; é armazenada em grânulos cromfins na medula supra-renal, em quantidades muito menores que a epinefrina, e secretada em resposta à hipotensão e ao estresse físico; em contraste com a epinefrina, exerce pouco efeito sobre o músculo liso e o brônquio, processos metabólicos e deito cardíaco, porém possui efeitos vasoconstritores pronunciados e é utilizada farmacologicamente como vasopressor, primariamente na forma do sal bitartarato; sin. noradrenaline, levarterenol) no feocromocitoma adrenal na doença de von Hippel-Lindau pode produzir a síndrome clínica de hipertensão associada com severa hipocaliemia (ou hipopotassemia é a concentração anormalmente baixa de íons de potássio no sangue circulante que pode causar vacuolização do citoplasma das células epiteliais tubulares renais, com comprometimento da capacidade de concentração urinária e acidificação, achatamento da onda T no eletrocardiograma e fraqueza muscular) e hiperaldestorenismo (aldosterona é o hormônio produzido pela zona do córtex supra-renal; sua principal ação é facilitar a troca de potássio por sódio no túbulo renal distal, levando à reabsorção de sódio e à perda de potássio e hidrogênio; é o principal mineralocorticóide) hiperreninêmico (?). O hiperaldosteronismo hiperreninêmico foi rapidamente melhorado por bloqueio-beta e foi completamente revertido pela remoção do tumor.
Davies e outros (1994) descreveram uma mulher de 65 anos de idade que era uma portadora obrigatória do gene para a doença de von Hippel-Lindau. Seu pai, dois irmãos, duas irmãs e três filhos tinham hemangioblastoma e carcinomas renais. O exame cuidadoso da mulher demonstrou somente um pequeno cisto renal benigno. Tais cistos são muito comuns na população em geral. Por isso, o portador obrigatório do gene pode não exibir nenhuma característica da doença acima da idade dos 60 anos.
Usando um regitro de composição do VHL no noroese da Inglaterra em 1990 contendo informações de 83 pessoas afetadas, Maddock e outros (1996) estudaram estatísticas populacionais, cacterísticas clínicas, idade no momento da manifestação, e sobrevivência. A principal idade de manifestação dos primeiros sintomas foi aos 26.25 anod, com hemangioblastoma cerebelar sendo a manifestação apresentada mais comum (34,9% dos casos). A principal idade de diagnóstico do VHL era de 30,87 anos. Ao todo, 50 pacientes (60,2%) desenvolveram um hemangioblastoma cerebelar, e 12 (14,5%) um feocromocitoma. A principal idade para óbito foi de 40,9 anos com hemangioblastoma cerebelar sendo a causa mais comum (47.7% das mortes). Em adição aos 83 sujeitos clinicamente afetados, Maddock e outros (1996) identificaram 3 portadores obrigatórios que eram considerados por serem livres de lesões nos extensivos testes de verificação. No registro do câncer baseado regionalmente, 14% de todos os hemangioblastomas do sistema nervoso central eram achados por ocorrer como parte da doença de VHL, porém investigações para o VHL em casos aparentemente esporádicos pareceram terem sido limitadas.
Os tumores do saco endolinfático (ELSTs) são altamente vascularizados, benignos, mas localmente neoplasmas agressivos do sistema endolinfático que freqüentemente destroem o osso temporal circundante (osso temporal: um grande osso irregular situado na base e no lado do crânio, consiste em três partes, escamosa, timpânica e petrosa, que estão distintas ao nascimento; a parte petrosa contém o órgão vestibulococlear; o osso articula-se com os ossos esfenóide, parietal, occipital e zigomático, e , através de uma articulação sinovial, com a mandímbula.)
Lonser e outros (2004) descreveram três casos da doença de von Hippel-Lindau que ilustraram as seguintes características do tumor do saco endolinfático: perda mórbida da audição devido a tumor microscópico radilogicamente indetectável no saco ou duto endolinfático; sintomas iniciais causados por hemorragia, hidropsia (acúmulo de líquido aquoso e claro em qualquer cavidade ou tecido) endolinfática, ou ambos; uma origem no duto ou saco endolinfático; e a evidência molecular de uma associação com a doença de von Hippel-Lindau. A ressecção cirúrgica completa dos tumores do saco endolinfático é curativa e pode ser desempenhada com a preservação da audição e alívio dos sintomas vestibulares.
Butman e outros (2007) noticiaram 35 pacientes VHL com ELSTs; 3 tinham tumores bilaterais. A idade principal de início do sintoma foi de 31 anos (num raios e 11 para 63 anos). Em adição à perda auditiva, zumbido e vertigem, outras características incluíram corpulência auricular, dor auricular e fraqueza do nervo facial. Estudos detalhados de CT e MRI demonstraram que 7 (18%) ouvidos tinham invasão da cápsula auricular, o que foi sempre associado com a perda da audição. Tumores com invasão da cápsula auricular eram maiores (2,2 cm) do que aqueles sem invasão da cápsula (1,2 cm). Entretanto, não havia uma associação significativa entre o tamanho do tumor e a perda da audição. Hemorragia intralabirintina (parte interna do ouvido) foi detectada em 79% dos ouvidos com perda súbita da audição. Butman e outros (2007) concluíram que a perda auditiva associada com ELSTs podem resultar da invasão da cápsula auricular, hemorragia intralabirintina ou hidropsia endolinfática.
James (1998) entabularam notícias de quatro mulheres com VHL e amplo cistadenoma papilar de ligamento publicadas entre 1988 e 1994 (Gersell e King, 1988; Funk e Heiken, 1989; Korn e outros 1990; Gaffey e outros; Karsdorp e outros 1994) e adicionaram um quinto caso. Estes eram cistos mesosalpinge [a parte do ligamento largo que reveste a tuba uterina (de Falópio)], os quais são o equivalente dos cistos do epidídimo no homem. Os cistos eram unilaterais em três dos cnco casos. Eles ocorreram ao longo do curso todo do duto mesonéfrico, no encerramento para o ovário, sobre as tubas uterinas, e perto do fórnice vaginal em um resto do duto Gartner (a contrapartida feminina do duto do epidídimo). Ao todo, 3 dos pacientes tiveram cistos renais e carcinoma das células renais bilaterais. No paciente noticiado por Korn e outros (1990), a verificação para VHL após os cistadenomas papilares foi diagnosticada durante o acompanhamento da cirurgia. O cisto unilateral no paciente reportado por Gaffey e outros (1994) foi precedido pelo achado de um tumor papilar médio no ouvido. A apresentação combinada de cistadenoma mesonéfrico e tumor do ouvido foi notada em notícias de cistos no epidídimo no homem (Price, 1971). Gaffey e outros (1994) sugeriram que o tumor no ouvido e o tumor adnexo (anexo) podem representar uma das principais manifestações viscerais do VHL.
Fukino e outros (2000) descreveram uma família japonesa com VHL na qual dois dos três membros afetados desenvolveram aguda oclusiva hidrocefalia (acúmulo de líquido cefalorraquidiano, resultando em dilatação dos ventrículos cerebrais e elevação da pressão intracraniana) que necessitaram de cirurgia emergencial para manobra ou drenagem ventricular. Em ambos os casos, a oclusão do canal cerebroespinal foi causada por hemangioblastoma cerebelar. Os dois pacientes com hidrocefalia eram irmãs com oito e desenove anos no momento do desenvolvimento da hidrocefalia obstrutiva. Elas herdaram VHL de sua mãe, que também sofreu de hemangiolastoma cerebelar requerendo cirurgia assim como angioma retinal.
McCabe e outros (2000) descreveram as características clínicas, associação com a doença de von Hippel-Lindua, e a acuidade visual resultante de paciente com hemangioma capilar justapapilar, no ou em adjacência ao nervo optico. Devido à sua localização, um hamartoma (malformação parecido com neoplasia macroscópica ou microscopicamente) nas lesões pode potencialmente ser diagnosticado equivocadamente como papiledema, papilite, neovascularização coróidal (túnica vascular média do olho situada entre o epitélio pigmentar e a esclerótica), ou coróidite. Foram descritas as formas endofítica (relativa a um tumor invasivo) e exofítica (designa uma neoplasia ou lesão que cresce fora da superfície epitelial) e séssil (que possui ampla base de fixação). Em acompanhamento de longo prazo, a acuidade visual geralmente melhorou. Pacientes com VHL e hamangioma justapapilar , mais frequentemente apresentados em idade jovem, tiveram tumores com um padrão de crescimento endofítico, e tiveram múltiplos tumores bilaterais. O tratamento do tumor com fotocoagulação a laser resultou em acuidade visual variável conseqüente nos pacientes relatados.
Raja e outros (2004) ralataram que o brilho externo da radioterapia (EBRT) era uma opção útil no tratamento de hemangiomas retinais secundários para doença de VHL que progrediu a despeito da terapia padrão. EBRT levou à melhora da acuidade visual, redução no volume do tumor e estabilização da separação na maioria dos pacientes tratados.
Eisenhofer e outros (2001) examinaram os mecanismos ligando diferentes fenótipos bioquímicos e clínicos de feocromocitoma em MEN2 (omim 171400) e VHL para delinear diferenças na expressão da tirosina hidroxilase (TH Tirosina hidroxilase está envolvida na conversão da fenilalanina em dopamina. Como uma enzima de limitação de taxa na síntese de catecilaminas, a tirosina hidroxilase tem um papel-chave na fisiologia dos neurônios adrenergéticos relativo a células nervosas ou fibras do sistema nervoso autônomo que empregam a norepinefrina como seu neurotransmissor), a enzima limitante da taxa em síntese de catecolaminas, e da feniletalonamina N-metiltransferase (PNMT 171190), a enzima que converte a norepinefrina em epinefrina (adrenalina, uma catecolamina que é o principal neuro-hormônio da medula supra-renal da maioria das espécies; também é secretada por neurônios) Sinais e sintomas do feocromocitoma, catecolaminas e metanefinas (catabólitos da epinefrina encontrado, junto com a normetanefrina, na urina e em alguns tecidos, resultante da ação da catecol-O-metiltrasferase sobre a epinefrina) do plasma, e neuroquímica de células tumorais e expressão de TH e PNMT foram examinadas e 19 pacientes de MEN2 e 30 pacientes de VHL com feocromocitomas adrenais. Os pacientes de MEN2 eram mais sintomáticos e tinham maior incidência de hipertensão (principalmente paroxístico [paroxismo = convulsão ou espasmo súbito]) e concentrações mais altas de metanefrinas no plasma, porém paradoxalmente concentrações totais mais baixas de catecolaminas, do que os pacientes de VHL. Todos os pacientes de MEN2 tiveram elevadas concentrações plasmáticas do metabólito da epinefrina metanefrina, enquanto os pacientes de VHL apresentaram aumentos específicos no metabólito da norepinefrina, a normetanefrina. As diferenças sobre uma apresentação clínica foram largamente explicadas por conteúdos teciduais totais mais baixos de catecolaminas e expressão de TH e estoques insgnificantes de epinefrina e expressão de PNMT em feocrmocitomas de VHL do que em pacientes de MEN2.
Taouli e outros (2003) discutiram achados em imagem abdominal, incluindo imagens pictóricas, de mais de 150 pacientes com a síndrome de VHL. Os achados mais comuns eram massas renais e pancreáticas.
Num estudo prospective de 406 pacientes de VHL de 199 famílias vistos em uma instituição num período de 12 anos, Chew (2005) encontrou que 205 dos pacientes tinham enolvimento ocular. Pacientes com completa deleção do gene VHL eram menos propensos a ter envolvimento ocular do que aqueles cm deldeção parcial, mutações de sentido trocado e sem sentido (9% x 45%; p menor que 0.0001). Chew (2005) identificou uma feição ocular não relatada previamente, neovascularização retinal, em 17 pacientes. Chew (2005) também encontrou 11 casos de hemangiblastoma intraorbital/intracranial, previamente relatado por ser raro na VHL, contabilizando para 5.3% de todas as lesões de tratamento da vista no grupo de estudo.
Em excisão cirúrgica de hemangioblastomas retinais associados com a doença de vonHipel-Lindau, Liang e outros (2007) demonstraram altos níveis de mRNA de VEGF (192240) e CXCR4 (162643) e da proteína, porém baixos níveis de CXCL12 (SPD1- 600835). A expressão aumentada de VEGF e CXCR4 também foi detectada nos hemangioblastomas mais ativos.
terça-feira, 2 de setembro de 2008
Soroconversão e atividade citotóxica/supressora em hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=8324903
AVALIAÇÃO FENOTÍPICA E FUNCIONAL DOS LINFÓCITOS TCD8+/S6F1+ EM INDIVÍDUOS HEMOFÍLICOS COM INFECÇÃO POR HIV-1
F.Cavallin, A.Traldi & Zambello (1993)
Sumário
Neste estudo nós investigamos a distribuição do antígeno S6F1, um epítopo do antígeno associado à função linfocitária, nos linfócitos TCD8+ em uma série de pacientes de hemofilia sendo 15 HIV-1+ e 20 HIV-1-. Anticorpos monoclonais (MoAbs) reconhecedores do antígeno S6F1 têm sido alegados por distinguir entre células killer efetoras (brilhantemente marcadas S6F1+ ) e células supressoras (marcadas em escuro S6F1+) dentro da população CD8+ linfóide. Em adição, nós tentamos encontrar a co-relação entre a síntese espontânea de imunoglobulina in vitro de linfócitos do sangue periférico de pacientes e o padrão de expressão de S6F1. Embora o número total de células duplamente positivas CD8+/S6F1+ fosse similar em ambos os pacientes hemofílicos portadores de HIV-1+ e não portadores de HIV-1 (HIV-1-), um aumento significante na população de CD8+/S6F1+ brilhante versus escuro foi documentada nos infectados por HIV-1 com respeito a hemofílicos HIV-1- (proporção de brilhante/opaca 3.97 + 0.61 versus 0.75 + 0.1, respectivamente, P<0.005). Esse achado foi co-relacionado com um aumento significativo da produção espontânea de imunoglobulna in vitro em sujeitos HIV-1 + comparado com hemofílicos controle (P<0.005). Linfócitos CD8+ purificados de sujeitos HIV-1+ apresentaram reduzida atividade supressora na produção de imunoglobulina induzida por mitógeno (substâncias que estimulam a mitose e a transformação de linfócitos como lectinas, concanavalina A, ou derivadas de patógenos como estreptococos). Tomados em conjunto, esses dados sugerem que a infecção por HIV-1 favorece a geração de células brilhantes para CD8+/S6F1+ com suposta função citotóxica associadas, levando a uma progressiva redução no número de linfócitos supressores CD8+/S6F1+ opacos. Este fenômeno pode contribuir para a hipergamaglobulinemia policlonal presente nos pacientes hemofílicos HIV-1+. (Hipergamaglobulinemia é o aumento de globulinas gama no plasma como ocorre freqüentemente em doenças infecciosas crônicas.)
INTRODUÇÃO
É bem sabido que hemofílicos representam um grupo de risco para a infecção por HIV-1, em conseqüência do fato de que os indivíduos afetados são freqüentemente obrigados a receber produtos derivados do sangue, os chamados fatores VIII e IX. Nesses sujeitos, assim como para outros indivíduos pertencentes ao grupo de risco para infecção por HIV-1, a soro-conversão é geralmente associada com considerável aumento dos níveis de linfócito CD8 + circulante comparado a pacientes soronegativos. Em particular, vários estudos têm mostrado que o número absoluto de células TCD8+ eleva-se progressivamente da soro-conversão durante os primeiros 6 meses, com aumento não-adicional ocorrendo durante os dois ou três anos seguintes. A diminuição dos linfócitos CD8+ paraleliza com o desenvolvimento total da AIDS.
A população de linfócitos TCD8+ contém células supressoras e citotóxicas. Essas distinções são principalmente baseadas no uso de ensaios funcionais. Em adição, diferentes marcadores têm sido gerados para caracterizar os subgrupos CD8+. Entre eles, um anticorpo monoclonal recentemente produzido reconhecedor de um epítopo do antígeno 1 (LFA-1) associado a linfócito, chamado antígeno S6F1, tem sido alegado por distinguir entre células killer efetoras e supressoras dentro dos linfócitos T CD8+. De fato, a expressão fenotípica do antígeno SF1 nas células CD8+ apresentam uma positividade bimodal (indicando uma curva de freqüência caracterizada por dois picos), permitindo a discriminação de células S6F1+ brilhantemente manchadas, com suposta função citotóxica e células S6F1+ opacas, com atividade supressora associada à produção de imunoglobulinas por linfócitos B. Como estudos in vitro e in vivo com relação à resposta de linfócitos B de indivíduos infectados com HIV-1 tâm revelado uma hiper-ativação generalizada de células B, o presente estudo foi encarregado de determinar o relacionamento entre a expressão do antígeno S6F1 nos linfócitos T CD8+ e a produção espontânea de imunoglobulina in vitro a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) numa série de sujeitos hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-.
PACIENTES E MÉTODOS
Pacientes
Três grupos de sujeitos foram estudados:
1) 15 pacientes hemofílicos para o anticorpo do HIV-1 (com 15-43 anos, média de 29 anos), pertencendo ao estágio III ou IV da classificação Walter Reed, 14 estavam incluídos no primeiro grupo. Todos eles tinham recebido previamente os concentrados de fator VIII ou IX ou crio-precipitados (precipitado que se forma quando um material solúvel é resfriado, principalmente em relação ao precipitado que se forma no plasma sangüíneo normal que foi submetido à precipitação por frio e que é rico em FVIII.) sobre 500 U/kg por ano. Nenhum deles recebeu somente crio-precipitados.
2) 20 sujeitos hemofílicos HIV-1- (de idade entre 13 e 24 anos, média de 23 anos). Esses sujeitos foram usualmente tratados com crio-precipitados de fator VIII e IX, embora alguns indivíduos também recebessesm concentrados (abaixo de 100 U/kg por ano).
3) 20 sujeitos doadores de sangue de idade alternada.
Sorologia do HIV-1
Amostras de como foram ensaiadas para anticorpos contra o HIV-1 usando um ELISA comercial e a soro-positividade foi confirmada por Western blot.
Análises Fenotípicas
Células do sangue periférico foram manchadas com um painel de MoAbs conjugados diretamente com PE (RD1) ou FITC, incluindo anti-CD3 (T3), anti-CD4(T4), e anti-CD8(T8) para definir linfócitos T e seus sub-conjuntos; anti-CD19(B4) para identificar células B; e anti-CD56 (NKH-1) para reconhecer células natural killer (NK CD3-/CD56+). Todos estes anticorpos foram obtidos de Coulter Immunology (Hialeah, FL). A combinação de anti-CD8 e MoAbs IgG2 (Coulter) foram usados para definir uma ligação não-específica de MoAbs sob estudo para análise da tipificação de células ativadas fluorescentes. Marcadores foram montados /organizados para incluir mais do que 98% dos linfócitos manchados de controle. As células foram analisadas usando um citômetro de fluxo Epic 751 (Coulter) equipado com um computador MDAPS. Dez mil (10.000) células portando o típico amontoado de linfócitos foram marcadas /registradas.
Condição de Cultura da Célula
PBMC (células mononucleares do sangue periférico) foram isoladas através de um gradiente Ficoll-Hypaque e lavadas duas vezes em PBS. As células foram cultivadas em RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) com 10% de soro de feto de bezerro (FCS; Flow Laboratories, Costa Mesa, CA) e 1% de streptomicina/penciclina. Culturas triplicadas de 1x106 PBMC/ml foram incubadas em 24 placas de fundo razo ( Costar, Cambridge, MA) por sete (07) dias numa atmosfera de 37oC com 5% de CO2; depois as supernadantes foram coletadas, filtradas num filtro de 0.25 µm (micrômetro= 10-6m)(Millipore, Bedford,MA) e estocadas a -80oC antes do uso.
Avaliação de liberação de imunoglobulinas na cultura supernadante.
O total de imunoglobulinas na cultura supernadante foi examinado usando-se um método ELISA. Resumidamente, placas microtitre (Coster) foram revestidas com anti-imunoglobulina (IgG + IgA + IgM; Dako, Copenhagen, Denmark) , anticorpos policlonais em 0.015 carbonato de sódio M amenizado de PH 9.6 a 4oC durante a noite. As culturas de supernadantes foram diluídas 1:10 em RPMI contendo 10% de FCS, também, adicionadas e incubadas por 3 horas na temperatura ambiente. Após a lavagem, anticorpos anti-imunoglobulina humana conjugados com peroxidase em meio contendo 10% de FCS e 0.5% de Tween 20 (Sigma Chemichal CO, ST Louis, MO) foram adicionados em cada qual e as placas foram incubadas no escuro por 20 minutos a 37oC. A reação foi então parada pela adição de 2M H2SO4 e a concentração foi lida em 492nm.
Purificação dos Linfócitos CD8+
As amostras de 8 hemofílicos HIV-1+ e 10 hemofílicos HIV-1-, pacientes em estudo, foram enriquecidas para linfócitos CD8 usando uma versão modificada do método previamente descrito. A suspensão de células foi inicialmente diminuída de células aderentes por incubação por 45 minutos em louça plástica Petri a 37o em uma atmosfera de 95% de ar 5% de CO2. Os linfócitos CD8+ foram purificados adicionalmente por remoção de linfócitos CD4+, CD19+ e CD16+ usando microsferas (glóbulos de material radio-marcado como albumina macro-carregada medindo cerca de 15 mícrons) magnéticas revestidas com IgG anti-camundongo (Dynakads, Dynal, Noway) de acordo com o método já mencionado. Rapidamente, após a incubação (45 min a 4oC) das células em suspensão obtidas como acima (descrito) com anti-CD4 (GKT4, Ortho, Raritan, NJ), anti-CD19 (Leu-12, Becton Dickinson, Mountain View, CA) e anti- CD16 (Leu-11a, Becton Dicleinson) MoAbs, 40x106 contas (unidades?) foram incubadas com 10x106 células/ml por 30 minutos a 4oC sob contínua e lenta rotação. As células agregando-se em roseta (em forma de rosa) revestidas com contas de anticorpo foram então isoladas e removidas por aplicação de um sistema magnético na parede externa dos tubos de teste por 2 minutos. Seguindo este procedimento de múltiplas etapas de seleção negativa, mais do que 97% das células estavam viáveis quando testadas pelo teste de exclusão de azul de tripano (corante azo-ácido usado para coloração vital do sistema reticulo-endotelial, túbulos uriníferos e células em cultura de tecido) e mais de 90% expressavam o antígeno CD8.
A Atividade Supressora dos Linfócitos CD8+
Para acessar a atividade supressora dos linfócitos CD8+, culturas triplicadas de 2x105 PBMC de doadores normais foram co-cultivadas com populações de 5x104 linfócitos enriquecidos com CD8+ de pacientes hemofílicos HIV-1+ ou HIV-1- na presença de 1% de mitógeno (substância que estimula a mitose) (PWM) (Sigma) em 24 placas (Costar) por 7 dias a 37oC em atmosfera com 5% de CO2. Essas doses e tempos foram previamente demonstradas por induzir a máxima produção de imunoglobulina por doadores normais de PBMC. A porcentagem de síntese de imunoglobulina de supressão foi calculada de acordo com a fórmula seguinte: porcentagem de imunolobulina de supressão= (1 – produção de imunoglobulina em presença de células CD8+/produção de imunoglobulina na ausência de células CD8+) x100.
Análises Estatísticas
Todos os dados foram expressados como meio-termo + S.E.M. Comparações os grupos foram feitas usando o teste Wilcoxon ordem de soma. Co-relações entre coeficientes foram calculadas usando análise de co-relação de ordem de Spearman. Um valor de P < 0.05 foi aceito como significativo.
Resultados
A tabela I apresenta os resultados das análises fenotípicas. O número de linfócits CD3+ estava reduzido nos pacientes HIV-1+ em relação aos hemofílicos HIV-1-. Linfócitos CD8+ estavam significativamente aumentados nos hemofílicos comparados com doadores normais; nenhuma diferença foi observada entre indivíduos HIV-1+ e HIV-1-.Análises de corante duplos demonstraram que mais de 95% das CD8+ expressam o antígeno CD3, indicando a origem T dos linfócitos CD8+ em pacientes hemofílicos. As células CD4+ foram grandemente reduzidas nos pacientes infectados com HIV-1 comparados aos hemofílicos HIV-1- e controles normais. Ambos os linfócitos CD56+ e CD19+ foram significativamente reduzidos nos sujeitos HIV-1+ comparados aos hemofílicos HIV-1-.
Embora o número de linfócitos CD8+ expressando o antígeno S6F1 fosse comparável em ambos os grupos hemofílicos, a proporção de linfócitos CD8+/S6F1+ luminosos versus CD8+/S6F1+ opaco foi significativamente diferente. De fato, a maioria dos linfócitos CD8+ nos indivíduos HIV-1+ expressavam o antígeno S6F1 em alta densidade (proporção de luminosos/opacos de 3.97 + 0.61), enquanto a população de CD8+ de pacientes HIV-1- apresentou uma razão de luminosos/opacos consistente com a de indivíduos normais (0.75 + 0.10 versus 1.02 + 0.08, P,NS). A figura 1 mostra o padrão típico de expressão do antígeno S6F1 numa representação de hemofílicos HIV-1+, HIV-1- e controles saudáveis. (Obs.: Os hemofílicos HIV-1+ apresentam muitíssimos S6F1 brilhosos e pouquíssimos opacos; os hemofílicos HIV-1- apresentam poucos brilhosos e muitos opacos e os controles saudáveis apresentam poucos brilhosos e muitíssimos opacos.)
Como mostrado na tabela 2, a síntese espontânea de imunogloulina in vitro aumentou significativamente em pacientes HIV-1+ comparados com pacientes HIV-1- e controles. Em adição, uma forte correlação positiva foi demonstrada entre a produção de imunoglobulina e a razão de CD8+/S6F1+ brilhosa/opaca (P<0.0001), indicando um decréscimo relevante da atividade supressora em pacientes HIV-1+. De acordo com esses dados, as células CD8+ purificadas de sujeitos HIV-1+ (mais do que 60% CD8+/S6F1+ brilhosas) apresentaram marcadamente reduzida a atividade supressora em produção de imunoglobulinas em células B normais dirigida por PWM comparada com células CD8+ de hemofílicos HIV-1-.
Discussão
Neste estudo nós demonstramos que os linfócitos T CD8+ expressam o antígeno S6F1 em alta densidade nos pacientes hemofílicos HIV-1+. Este achado foi fortemente co-relacionado com um aumento espontâneo de produção da imunoglobulina in vitro.
Independentemente de infecção por HIV-1, o número de linfócitos CD3+ CD8+ é normalmente aumentado em pacientes hemofílicos em comparação com a população normal. Esse achado é principalmente relacionado ao fardo antigênico (concentrados de fator VIII) que os sujeitos hemofílicos recebem usualmente como terapia anti-hemorrágica devido à sua condição clínica. Entretanto, a expressão do antígeno S6F1 apresenta diferente comportamento, de acordo com a soro-conversão para o HIV-1. De fato, um aumento consistente na população de CD8+/S6F1+ brilhosos pode ser documentada somente em pacientes infectados com HIV-1, enquanto os hemofílicos HIV-1- apresentam proporção de CD8/S6F1 brilhante/opaca consistente com aquela dos indivíduos saudáveis. Estes resultados indicam que uma co-relação direta existe entre a soro-conversão do HIV-1 e a alta expressão do antígeno S6F1 nas células T CD8+.
Estudos diferentes têm demonstrado que linfócitos CD8+ apresentam um perfil fenotípico peculiar durante a infecção do HIV-1. Uma redução de linfócitos CD8+ corados opacamente (pertencendo ao sub-conjunto NK) tem sido relatado em associação com o progressivo aumento de linfócitos CD8+ corados brilhantemente (pertencendo à linhagem T). Além disso, a proporção de linfócitos T CD8+ co-expressando CD38, CD57 e HLA-DR é aumentada nos sujeitos infectados com HIV-1, e tem sido sugerido que este parâmetro correlaciona-se com a progressão da doença.
Desde que as células brilhantes para CD8+/S6F1+ têm sido relatadas por serem citotóxicas in vitro, e incluem o sub-conjunto específico reativo contra células infectadas pelo HIV-1, nossos dados são consistentes com a possibilidade de que a infecção viral induz um deslocamento junto ao desenvolvimento de linfócitos citotóxicos CD8+. De acordo com este achado, poderia ser sugerido que o número de células CD8+/S6F1+ opacas com atividade supressora torna-se marcadamente reduzido.
Para verificar se a alta proporção de células CD8+/S6F1+ brilhantes/opacas poderia estar associada com uma reduzida atividade supressora in vitro, nós testamos a produção espontânea de imunoglobulina em hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-. Nossos dados demonstraram que um aumento marcado da síntese de imunoglobulina in vitro pode ser demonstrado somente em indivíduos HIV-1+. Embora dados similares tenham sido noticiados por diferentes autores, a interpretação deste fenômeno é ainda controverso. De fato, achados experimentais indicam que tanto uma deficiência mediada pelo HIV-1 de linfócitos B, de cooperação com células B e TCD4+, uma atividade assessória deficiente de monócitos, ou a combinação dessas possibilidades pode ser observada nos indivíduos HIV-1+. Nossos resultados sugerem que a redução progressiva do sub-conjunto CD8+/S6F1+ opaco com atividade supressora deve representar um mecanismo adicional envolvido na aumentada produção de imunoglobulina in vitro. Além disso, nós proporcionamos evidência de uma abafada capacidade de suprimir a síntese de imunoglobulinas dirigida por PWM in vitro por linfócitos CD8+ purificados (a maioria expressando o antígeno S6F1 brilhantemente) em hemofílicos HIV-1+. Finalmente, a demonstração de que alguns casos raros de hemofílicos HIV-1+ com uma razão normal de CD8+/S6F1+ brilhante/opaca apresenta uma produção espontânea de imunoglobulina in vitro consistente com indivíduos HIV-1-, mais confirmam esta interpretação, (F.Cavallin, observações pessoais.)Embora o relacionamento que nós documentamos entre o aumento de linfócitos CD8+/S6F1+ brilhantemente corados e a alta liberação espontânea de imunoglobulinas seja um achado in vitro, é interessante especular que um fenômeno similar deve tomar espaço in vivo. Mais estudos são necessários para testar esta possibilidade.
Em contraste, os dados referidos neste estudo indicam que a soro-conversão para o HIV-1 está associada com o aumento do número de células brilhantes para CD8+/S6F1 e uma redução dos linfócitos CD8+/S6F1+ opacos nos sujeitos hemofílicos. Essa mudança fenotípica está co-relacionada com uma síntese alterada in vitro de imunoglobulina, indicando que a redução do potencial supressor (linfócitos CD8+/S6F1+ opacos) devem estar envolvidos nos mecanismos que levam à super-síntese de imunoglobulinas durante a infecção por HIV-1.
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=8324903
AVALIAÇÃO FENOTÍPICA E FUNCIONAL DOS LINFÓCITOS TCD8+/S6F1+ EM INDIVÍDUOS HEMOFÍLICOS COM INFECÇÃO POR HIV-1
F.Cavallin, A.Traldi & Zambello (1993)
Sumário
Neste estudo nós investigamos a distribuição do antígeno S6F1, um epítopo do antígeno associado à função linfocitária, nos linfócitos TCD8+ em uma série de pacientes de hemofilia sendo 15 HIV-1+ e 20 HIV-1-. Anticorpos monoclonais (MoAbs) reconhecedores do antígeno S6F1 têm sido alegados por distinguir entre células killer efetoras (brilhantemente marcadas S6F1+ ) e células supressoras (marcadas em escuro S6F1+) dentro da população CD8+ linfóide. Em adição, nós tentamos encontrar a co-relação entre a síntese espontânea de imunoglobulina in vitro de linfócitos do sangue periférico de pacientes e o padrão de expressão de S6F1. Embora o número total de células duplamente positivas CD8+/S6F1+ fosse similar em ambos os pacientes hemofílicos portadores de HIV-1+ e não portadores de HIV-1 (HIV-1-), um aumento significante na população de CD8+/S6F1+ brilhante versus escuro foi documentada nos infectados por HIV-1 com respeito a hemofílicos HIV-1- (proporção de brilhante/opaca 3.97 + 0.61 versus 0.75 + 0.1, respectivamente, P<0.005). Esse achado foi co-relacionado com um aumento significativo da produção espontânea de imunoglobulna in vitro em sujeitos HIV-1 + comparado com hemofílicos controle (P<0.005). Linfócitos CD8+ purificados de sujeitos HIV-1+ apresentaram reduzida atividade supressora na produção de imunoglobulina induzida por mitógeno (substâncias que estimulam a mitose e a transformação de linfócitos como lectinas, concanavalina A, ou derivadas de patógenos como estreptococos). Tomados em conjunto, esses dados sugerem que a infecção por HIV-1 favorece a geração de células brilhantes para CD8+/S6F1+ com suposta função citotóxica associadas, levando a uma progressiva redução no número de linfócitos supressores CD8+/S6F1+ opacos. Este fenômeno pode contribuir para a hipergamaglobulinemia policlonal presente nos pacientes hemofílicos HIV-1+. (Hipergamaglobulinemia é o aumento de globulinas gama no plasma como ocorre freqüentemente em doenças infecciosas crônicas.)
INTRODUÇÃO
É bem sabido que hemofílicos representam um grupo de risco para a infecção por HIV-1, em conseqüência do fato de que os indivíduos afetados são freqüentemente obrigados a receber produtos derivados do sangue, os chamados fatores VIII e IX. Nesses sujeitos, assim como para outros indivíduos pertencentes ao grupo de risco para infecção por HIV-1, a soro-conversão é geralmente associada com considerável aumento dos níveis de linfócito CD8 + circulante comparado a pacientes soronegativos. Em particular, vários estudos têm mostrado que o número absoluto de células TCD8+ eleva-se progressivamente da soro-conversão durante os primeiros 6 meses, com aumento não-adicional ocorrendo durante os dois ou três anos seguintes. A diminuição dos linfócitos CD8+ paraleliza com o desenvolvimento total da AIDS.
A população de linfócitos TCD8+ contém células supressoras e citotóxicas. Essas distinções são principalmente baseadas no uso de ensaios funcionais. Em adição, diferentes marcadores têm sido gerados para caracterizar os subgrupos CD8+. Entre eles, um anticorpo monoclonal recentemente produzido reconhecedor de um epítopo do antígeno 1 (LFA-1) associado a linfócito, chamado antígeno S6F1, tem sido alegado por distinguir entre células killer efetoras e supressoras dentro dos linfócitos T CD8+. De fato, a expressão fenotípica do antígeno SF1 nas células CD8+ apresentam uma positividade bimodal (indicando uma curva de freqüência caracterizada por dois picos), permitindo a discriminação de células S6F1+ brilhantemente manchadas, com suposta função citotóxica e células S6F1+ opacas, com atividade supressora associada à produção de imunoglobulinas por linfócitos B. Como estudos in vitro e in vivo com relação à resposta de linfócitos B de indivíduos infectados com HIV-1 tâm revelado uma hiper-ativação generalizada de células B, o presente estudo foi encarregado de determinar o relacionamento entre a expressão do antígeno S6F1 nos linfócitos T CD8+ e a produção espontânea de imunoglobulina in vitro a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) numa série de sujeitos hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-.
PACIENTES E MÉTODOS
Pacientes
Três grupos de sujeitos foram estudados:
1) 15 pacientes hemofílicos para o anticorpo do HIV-1 (com 15-43 anos, média de 29 anos), pertencendo ao estágio III ou IV da classificação Walter Reed, 14 estavam incluídos no primeiro grupo. Todos eles tinham recebido previamente os concentrados de fator VIII ou IX ou crio-precipitados (precipitado que se forma quando um material solúvel é resfriado, principalmente em relação ao precipitado que se forma no plasma sangüíneo normal que foi submetido à precipitação por frio e que é rico em FVIII.) sobre 500 U/kg por ano. Nenhum deles recebeu somente crio-precipitados.
2) 20 sujeitos hemofílicos HIV-1- (de idade entre 13 e 24 anos, média de 23 anos). Esses sujeitos foram usualmente tratados com crio-precipitados de fator VIII e IX, embora alguns indivíduos também recebessesm concentrados (abaixo de 100 U/kg por ano).
3) 20 sujeitos doadores de sangue de idade alternada.
Sorologia do HIV-1
Amostras de como foram ensaiadas para anticorpos contra o HIV-1 usando um ELISA comercial e a soro-positividade foi confirmada por Western blot.
Análises Fenotípicas
Células do sangue periférico foram manchadas com um painel de MoAbs conjugados diretamente com PE (RD1) ou FITC, incluindo anti-CD3 (T3), anti-CD4(T4), e anti-CD8(T8) para definir linfócitos T e seus sub-conjuntos; anti-CD19(B4) para identificar células B; e anti-CD56 (NKH-1) para reconhecer células natural killer (NK CD3-/CD56+). Todos estes anticorpos foram obtidos de Coulter Immunology (Hialeah, FL). A combinação de anti-CD8 e MoAbs IgG2 (Coulter) foram usados para definir uma ligação não-específica de MoAbs sob estudo para análise da tipificação de células ativadas fluorescentes. Marcadores foram montados /organizados para incluir mais do que 98% dos linfócitos manchados de controle. As células foram analisadas usando um citômetro de fluxo Epic 751 (Coulter) equipado com um computador MDAPS. Dez mil (10.000) células portando o típico amontoado de linfócitos foram marcadas /registradas.
Condição de Cultura da Célula
PBMC (células mononucleares do sangue periférico) foram isoladas através de um gradiente Ficoll-Hypaque e lavadas duas vezes em PBS. As células foram cultivadas em RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) com 10% de soro de feto de bezerro (FCS; Flow Laboratories, Costa Mesa, CA) e 1% de streptomicina/penciclina. Culturas triplicadas de 1x106 PBMC/ml foram incubadas em 24 placas de fundo razo ( Costar, Cambridge, MA) por sete (07) dias numa atmosfera de 37oC com 5% de CO2; depois as supernadantes foram coletadas, filtradas num filtro de 0.25 µm (micrômetro= 10-6m)(Millipore, Bedford,MA) e estocadas a -80oC antes do uso.
Avaliação de liberação de imunoglobulinas na cultura supernadante.
O total de imunoglobulinas na cultura supernadante foi examinado usando-se um método ELISA. Resumidamente, placas microtitre (Coster) foram revestidas com anti-imunoglobulina (IgG + IgA + IgM; Dako, Copenhagen, Denmark) , anticorpos policlonais em 0.015 carbonato de sódio M amenizado de PH 9.6 a 4oC durante a noite. As culturas de supernadantes foram diluídas 1:10 em RPMI contendo 10% de FCS, também, adicionadas e incubadas por 3 horas na temperatura ambiente. Após a lavagem, anticorpos anti-imunoglobulina humana conjugados com peroxidase em meio contendo 10% de FCS e 0.5% de Tween 20 (Sigma Chemichal CO, ST Louis, MO) foram adicionados em cada qual e as placas foram incubadas no escuro por 20 minutos a 37oC. A reação foi então parada pela adição de 2M H2SO4 e a concentração foi lida em 492nm.
Purificação dos Linfócitos CD8+
As amostras de 8 hemofílicos HIV-1+ e 10 hemofílicos HIV-1-, pacientes em estudo, foram enriquecidas para linfócitos CD8 usando uma versão modificada do método previamente descrito. A suspensão de células foi inicialmente diminuída de células aderentes por incubação por 45 minutos em louça plástica Petri a 37o em uma atmosfera de 95% de ar 5% de CO2. Os linfócitos CD8+ foram purificados adicionalmente por remoção de linfócitos CD4+, CD19+ e CD16+ usando microsferas (glóbulos de material radio-marcado como albumina macro-carregada medindo cerca de 15 mícrons) magnéticas revestidas com IgG anti-camundongo (Dynakads, Dynal, Noway) de acordo com o método já mencionado. Rapidamente, após a incubação (45 min a 4oC) das células em suspensão obtidas como acima (descrito) com anti-CD4 (GKT4, Ortho, Raritan, NJ), anti-CD19 (Leu-12, Becton Dickinson, Mountain View, CA) e anti- CD16 (Leu-11a, Becton Dicleinson) MoAbs, 40x106 contas (unidades?) foram incubadas com 10x106 células/ml por 30 minutos a 4oC sob contínua e lenta rotação. As células agregando-se em roseta (em forma de rosa) revestidas com contas de anticorpo foram então isoladas e removidas por aplicação de um sistema magnético na parede externa dos tubos de teste por 2 minutos. Seguindo este procedimento de múltiplas etapas de seleção negativa, mais do que 97% das células estavam viáveis quando testadas pelo teste de exclusão de azul de tripano (corante azo-ácido usado para coloração vital do sistema reticulo-endotelial, túbulos uriníferos e células em cultura de tecido) e mais de 90% expressavam o antígeno CD8.
A Atividade Supressora dos Linfócitos CD8+
Para acessar a atividade supressora dos linfócitos CD8+, culturas triplicadas de 2x105 PBMC de doadores normais foram co-cultivadas com populações de 5x104 linfócitos enriquecidos com CD8+ de pacientes hemofílicos HIV-1+ ou HIV-1- na presença de 1% de mitógeno (substância que estimula a mitose) (PWM) (Sigma) em 24 placas (Costar) por 7 dias a 37oC em atmosfera com 5% de CO2. Essas doses e tempos foram previamente demonstradas por induzir a máxima produção de imunoglobulina por doadores normais de PBMC. A porcentagem de síntese de imunoglobulina de supressão foi calculada de acordo com a fórmula seguinte: porcentagem de imunolobulina de supressão= (1 – produção de imunoglobulina em presença de células CD8+/produção de imunoglobulina na ausência de células CD8+) x100.
Análises Estatísticas
Todos os dados foram expressados como meio-termo + S.E.M. Comparações os grupos foram feitas usando o teste Wilcoxon ordem de soma. Co-relações entre coeficientes foram calculadas usando análise de co-relação de ordem de Spearman. Um valor de P < 0.05 foi aceito como significativo.
Resultados
A tabela I apresenta os resultados das análises fenotípicas. O número de linfócits CD3+ estava reduzido nos pacientes HIV-1+ em relação aos hemofílicos HIV-1-. Linfócitos CD8+ estavam significativamente aumentados nos hemofílicos comparados com doadores normais; nenhuma diferença foi observada entre indivíduos HIV-1+ e HIV-1-.Análises de corante duplos demonstraram que mais de 95% das CD8+ expressam o antígeno CD3, indicando a origem T dos linfócitos CD8+ em pacientes hemofílicos. As células CD4+ foram grandemente reduzidas nos pacientes infectados com HIV-1 comparados aos hemofílicos HIV-1- e controles normais. Ambos os linfócitos CD56+ e CD19+ foram significativamente reduzidos nos sujeitos HIV-1+ comparados aos hemofílicos HIV-1-.
Embora o número de linfócitos CD8+ expressando o antígeno S6F1 fosse comparável em ambos os grupos hemofílicos, a proporção de linfócitos CD8+/S6F1+ luminosos versus CD8+/S6F1+ opaco foi significativamente diferente. De fato, a maioria dos linfócitos CD8+ nos indivíduos HIV-1+ expressavam o antígeno S6F1 em alta densidade (proporção de luminosos/opacos de 3.97 + 0.61), enquanto a população de CD8+ de pacientes HIV-1- apresentou uma razão de luminosos/opacos consistente com a de indivíduos normais (0.75 + 0.10 versus 1.02 + 0.08, P,NS). A figura 1 mostra o padrão típico de expressão do antígeno S6F1 numa representação de hemofílicos HIV-1+, HIV-1- e controles saudáveis. (Obs.: Os hemofílicos HIV-1+ apresentam muitíssimos S6F1 brilhosos e pouquíssimos opacos; os hemofílicos HIV-1- apresentam poucos brilhosos e muitos opacos e os controles saudáveis apresentam poucos brilhosos e muitíssimos opacos.)
Como mostrado na tabela 2, a síntese espontânea de imunogloulina in vitro aumentou significativamente em pacientes HIV-1+ comparados com pacientes HIV-1- e controles. Em adição, uma forte correlação positiva foi demonstrada entre a produção de imunoglobulina e a razão de CD8+/S6F1+ brilhosa/opaca (P<0.0001), indicando um decréscimo relevante da atividade supressora em pacientes HIV-1+. De acordo com esses dados, as células CD8+ purificadas de sujeitos HIV-1+ (mais do que 60% CD8+/S6F1+ brilhosas) apresentaram marcadamente reduzida a atividade supressora em produção de imunoglobulinas em células B normais dirigida por PWM comparada com células CD8+ de hemofílicos HIV-1-.
Discussão
Neste estudo nós demonstramos que os linfócitos T CD8+ expressam o antígeno S6F1 em alta densidade nos pacientes hemofílicos HIV-1+. Este achado foi fortemente co-relacionado com um aumento espontâneo de produção da imunoglobulina in vitro.
Independentemente de infecção por HIV-1, o número de linfócitos CD3+ CD8+ é normalmente aumentado em pacientes hemofílicos em comparação com a população normal. Esse achado é principalmente relacionado ao fardo antigênico (concentrados de fator VIII) que os sujeitos hemofílicos recebem usualmente como terapia anti-hemorrágica devido à sua condição clínica. Entretanto, a expressão do antígeno S6F1 apresenta diferente comportamento, de acordo com a soro-conversão para o HIV-1. De fato, um aumento consistente na população de CD8+/S6F1+ brilhosos pode ser documentada somente em pacientes infectados com HIV-1, enquanto os hemofílicos HIV-1- apresentam proporção de CD8/S6F1 brilhante/opaca consistente com aquela dos indivíduos saudáveis. Estes resultados indicam que uma co-relação direta existe entre a soro-conversão do HIV-1 e a alta expressão do antígeno S6F1 nas células T CD8+.
Estudos diferentes têm demonstrado que linfócitos CD8+ apresentam um perfil fenotípico peculiar durante a infecção do HIV-1. Uma redução de linfócitos CD8+ corados opacamente (pertencendo ao sub-conjunto NK) tem sido relatado em associação com o progressivo aumento de linfócitos CD8+ corados brilhantemente (pertencendo à linhagem T). Além disso, a proporção de linfócitos T CD8+ co-expressando CD38, CD57 e HLA-DR é aumentada nos sujeitos infectados com HIV-1, e tem sido sugerido que este parâmetro correlaciona-se com a progressão da doença.
Desde que as células brilhantes para CD8+/S6F1+ têm sido relatadas por serem citotóxicas in vitro, e incluem o sub-conjunto específico reativo contra células infectadas pelo HIV-1, nossos dados são consistentes com a possibilidade de que a infecção viral induz um deslocamento junto ao desenvolvimento de linfócitos citotóxicos CD8+. De acordo com este achado, poderia ser sugerido que o número de células CD8+/S6F1+ opacas com atividade supressora torna-se marcadamente reduzido.
Para verificar se a alta proporção de células CD8+/S6F1+ brilhantes/opacas poderia estar associada com uma reduzida atividade supressora in vitro, nós testamos a produção espontânea de imunoglobulina em hemofílicos HIV-1+ e HIV-1-. Nossos dados demonstraram que um aumento marcado da síntese de imunoglobulina in vitro pode ser demonstrado somente em indivíduos HIV-1+. Embora dados similares tenham sido noticiados por diferentes autores, a interpretação deste fenômeno é ainda controverso. De fato, achados experimentais indicam que tanto uma deficiência mediada pelo HIV-1 de linfócitos B, de cooperação com células B e TCD4+, uma atividade assessória deficiente de monócitos, ou a combinação dessas possibilidades pode ser observada nos indivíduos HIV-1+. Nossos resultados sugerem que a redução progressiva do sub-conjunto CD8+/S6F1+ opaco com atividade supressora deve representar um mecanismo adicional envolvido na aumentada produção de imunoglobulina in vitro. Além disso, nós proporcionamos evidência de uma abafada capacidade de suprimir a síntese de imunoglobulinas dirigida por PWM in vitro por linfócitos CD8+ purificados (a maioria expressando o antígeno S6F1 brilhantemente) em hemofílicos HIV-1+. Finalmente, a demonstração de que alguns casos raros de hemofílicos HIV-1+ com uma razão normal de CD8+/S6F1+ brilhante/opaca apresenta uma produção espontânea de imunoglobulina in vitro consistente com indivíduos HIV-1-, mais confirmam esta interpretação, (F.Cavallin, observações pessoais.)Embora o relacionamento que nós documentamos entre o aumento de linfócitos CD8+/S6F1+ brilhantemente corados e a alta liberação espontânea de imunoglobulinas seja um achado in vitro, é interessante especular que um fenômeno similar deve tomar espaço in vivo. Mais estudos são necessários para testar esta possibilidade.
Em contraste, os dados referidos neste estudo indicam que a soro-conversão para o HIV-1 está associada com o aumento do número de células brilhantes para CD8+/S6F1 e uma redução dos linfócitos CD8+/S6F1+ opacos nos sujeitos hemofílicos. Essa mudança fenotípica está co-relacionada com uma síntese alterada in vitro de imunoglobulina, indicando que a redução do potencial supressor (linfócitos CD8+/S6F1+ opacos) devem estar envolvidos nos mecanismos que levam à super-síntese de imunoglobulinas durante a infecção por HIV-1.
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