Continuação do capítulo "HIV, Tat e Cromatina" de Anne Gatignol
(Tradução de Isabela Matheus)

D. Tat e os Complexos de modelação da Cromatina dependentes de ATP

Dados recentes mostraram que Tat também interage com os complexos de remodelação da cromatina dependentes de ATP. Tat imunoprecipita (OBS.: imunoprecipitação é o fenômeno de agregação de antígenos sensibilizados após a adição de anticorpo específico (precipitina) ao antígeno em solução. Dic.Stedman) com BRM e BRG-1, partes da ATPase do complexo SWI/SNF, e com a INI-1 e β-actina do cerne deste componente. A Tat recruta esses fatores para o LTR do HIV-1 como é demonstrado por imunoprecipitação da cromatina (ChIP – obs.: esta abreviatura será usada novamente no texto) que abrange o nuc 1 da seqüência de DNA. Este dado sugere que a Tat transporta o complexo SWI/SNF para o nucleossomo para logo aumentar suas propriedades transativadoras. A transativação por meio de Tat é reduzida pelo decréscimo de BRM, BRG-1, ou da expressão de INI-1 e aumentada pela expressão em excesso de BRM ou INI-1. A atividade desses três fatores é semelhante em diferentes etapas, visto que BRM interage somente com Tat não acetilada. A INI-1 ativou o LTR EM CINERGIA COM Tat e p300, mas não com a mutação Tat K50, 51R. Os três fatores contribuem para o recrutamento do complexo SWI-SNF para o promotor do HIV, para desestabilização do nuc-1, e para o crescimento da transcrição do HIV-1.

E.Tat e HAT

TIP60 foi originalmente isolada como uma proteína de interação de Tat que estimula a expressão do LTR do HIV-1. Foi demonstrado mais tarde que ela acetila histonas específicas, pertence à sub-família MYST da família HAT, e atua como uma enzima multifuncional. Tat modifica a atividade de TIP60 em MnSOD e media sua ubiquitinação (obs.: ubiquitina é uma proteína pequena de 76 resíduos de aminoacil encontrada em todas as células dos organismos superiores e cuja estrutura sofreu modificação mínima na história evolutiva; é envolvida em , pelo menos, dois processos: modificação da histona e decomposição de proteínas intracelulares. Dic.Stedman) e degradação indicando que a proteína viral interfere com os processos celulares, mas Tip60 não modificou a transativação de Tat. O fator TBP associado (TAFs) TAFII250 é também uma HAT e liga-se à Tat. Essa associação media a repressão por Tat de alguns promotores incluído do complexo MHC de classe I (OBS.: “Os peptídeos gerados em vesículas ácidas ligam-se às moléculas classe II do MHC recentemente sintetizadas, enquanto os peptídeos gerados no citoplasma ligam-se às moléculas classe I do MHC recentemente sintetizadas. “ trecho do capítulo 8 do livro Imunologia, de Eli Benjamini, Richard Coico e Geofrey Sunshine, quarta edição.) Outras HATs ligam-se à Tat, mediam sua acetilação, e aumentam sua atividade transativadora no LTR do HIV-1. São elas : p300/CBP, PCAF e hGCN5.



IV- A Proteína Tat do HIV-1 e suas Modificações

A.A Proteína Tat.

O transativador do HIV-1 Tat é uma proteína de 14kDa codificada por dois éxons. O éxon 1 codifica do 1o ao 72o aminoácido e o éxon 2 codifica do 73o aminoácido ao 86o ou do 73o ao 101o, dependendo das fitas do vírus. A Tat pode ser dividida em cinco domínios:
- domínio 1 (aa 1-20) é localizado no terminal N; mutações nesta região não modificam a transativação em larga extensão;
- domínio 2 : tem sete cisteínas altamente conservadas, o que é importante para a função de Tat;
- domínio 3 (aa 40-48) ou cerne, é essencial para a transativação; nesta região, uma única mutação no K41 aboliu a atividade de Tat (obs.: aa é aminoácido);
- domínio 4 (aa 49-72) contém uma distensão rica em arginina, a qual media a ligação comRNA e a localização nuclear.

Os três primeiros domínios (aa 1-48) representam o domínio de ativação de Tat que funciona como um transativador quando ligado à região IV ou o domínio de ligação RNA/DNA heterólogos. Tat 66 (com 66 aminoácidos) é o suficente para a total transativação. O domínio V, codificado pelo segundo éxon, contribui para a infectividade viral e para outras funções de Tat. Em contraste a outros transativadores conhecidos, Tat atua através de um alvo de RNA chamado TAR localizado na região R do LTR. Para esta função, Tat recruta uma quinase celular que fosforila o CTD (domínio C-Terminal) de RNAPII, o qual dispara a partida da polimerase, a remoção do promotor e o alongamento eficiente. Na transativação do promotor do HIV-1 mediada por Tat, o recrutamento de proteínas celulares e a modificação pós-tradução de Tat por várias enzimas são cruciais para sua função.

B.Proteínas de ligação a Tat

Muitas proteínas de ligação a Tat têm sido isoladas e caracterizadas por seus papéis na transativação mediada por Tat. A interação entre Tat e o TBP, TFIIB, TFIIH, Sp1 e TAF55 sugere um direto envolvimento de TAt nos estágios iniciais da transativação durante a formação do PIC.
O fator melhor caracterizado que liga Tat é o P-TEFb que foi primeiro caracterizado como quinase associada a Tat. P-TEFb é um complexo composto de uma ciclina T e da CDK9. A Tat interage muito fortemente com CycT1 (ciclina T1) mas não com a CDK9. Em contraste, CycT1 interage com ambas Tat e CDK9 para formar o complexo ativo Tat-CycT1-CDK9.
Na ausência de Tat, P-TEFb existe na célula como um grande complexo inativo composto das proteínas 7SK snRNA e MAQ1/HEXIMI. Quando recrutado para o promotor, P‑TEFb fosforila as serinas da RNAPII CTD, a sub-unidade SPT5 da proteína DSIF, e a sub-unidade RD da proteína NELF resultando numa hiperfosforilação da RNAPII CTD por toda parte da transcrição em anlongamento.

C. Modificação de Tat
1. Acetilação de Tat

A ligação de Tat ao RNA de TAR e sua liberação são regulados pela acetilação por HATs. PCAF acetila Tat no K28 (lisina 28), mas esta acetilação libera PCAF de Tat. P300/CBP e hGCN5 acetilam Tat em K50 (lisina 50) e K51. Adicionalmente, o domínio bromo de PCAF liga-se especificamente à Ac50Tat e requer Y47 (tirosina 47) e R53 (arginina 53) em Tat. Ac28Tat tem uma afinidade aumentada por CycT1-CDK9, o qual estimula a ligação do complexo Tat-P-TEFb ao RNA de TAR. Em contraste, Ac50Tat ou o complexo Ac50Tat-CycT1 apresenta uma afinidade diminuída em relação a TAR sugerindo uma liberação do complexo Tat-P-TEFb de TAR.
Tat pode ser também desacetilada pela atividade de HDAC Sirtuin 1 (pesquisar no OMIM). A evidência de que a acetilação de TAt é importante para a transativação chegou do tratamento com inibidores de desacetilação que cinergisam com a função de TAt e as mutações tanto em K28 e K50 que reduzem a transativação de Tat e a replicação do HIV.

2.Fosforilação de Tat

A Tat do HIV-2, mas não a do HIV-1, é fosforilada pela CDK9 que vem a ser autofosforilada sobre o ponto de ligação com Tat. A fosforilação da CDK9 intensifica a lligação de Tat-CycT-CDK9 ao Rna de TAR. Em contraste, um estudo mostra que CDK2 associada com Ciclina E fosforila Tat. Embora a locação precisa do sítio de fosforilação não esteja determinada, ela requer os aminoácidos de 15 a 24 e de 36 a 49 (obs.:de Tat). Um decréscimo na expressão de CDK2 diminui a transcrição do HIV-1 e a produção do vírus. A Tat liga-se a proteína quinase R induzida de interferon (PKR) e inibe sua função como um substrato de competição (OBS.: competição pelo sítio de ligação). Em compensação, a Tat é fosforilada em S62 (serina 62), T 64 (Treonina 64) e S68 (serina 68) pela PKR (proteína quinase R). As mutações nestes sítios reduzem a capacidade de ligação entre Tat e TAR e a transativação do LTR do HIV‑1. Análises mutacionais e expressão decrescida de quinases sugerem uma importância funcional da fosforilação de Tat.

3. Metilação de Tat

A metilação por arginina pela proteína arginina metil metiltransferase (PRMTs) regula varias rotas incllusive de expressão de genes. A PRMT6 interage com e metila a Tat do HIV-1. Essa metilação ocorre na região entre os aminoácidos 49 e 63, a qual contém seis argininas. A expressão excessiva da proteína PRMT6 decresce o nível de LTR do HIV-1 transativada por mediação de Tat, visto que a expressão reduzida da enzima (PRMT6) incentiva a produção viral, sugerindo que a metilação de Tat inibe sua atividade.

4. Ubiqüinização de Tat

Uma proteína ubiquitina ligase, a proto-onco-proteína Hdm2, liga-se à Tat e media sua ubiquitinação nos aminoácidos Lys 71. Entretanto, essa modificação não torna Tat um alvo do proteossomo (ubiquitina) para degradação, mas antes estimula a transativação mediada por Tat.
As diferentes modificações descritas anteriormente, todas têm uma importância funcional na função de Tat para diferentes extensões. Por que a Tat truncada para 66 aminoácidos) mantém toda sua atividade de transativação, modificações no C-Terminal e similares afetam a transativação marginalmente ou indiretamente, mas influenciam primariamente outras funções de Tat. Adiantados estudos sobre estas modificações nas várias funções de Tat ajudarão a elucidar seus papéis específicos, mas alguns tem sido desde já implicados precisamente nas etapas de transativação mediadas por Tat “in vivo”.