Continuação do capítulo "HIV, Tat and Chtomatin" de Anne Gatinol
(Tradução de Isabela Matheus)


V- Transativação Mediada por Tat

Um modelo dinâmico in vivo para a transativação mediada por Tat tem que incluir dados da repressão transcricional do LTR do HIV-1 cromatinizado desde o início ao final do alongamento transcricional e o papel de Tat em cada etapa.
A.A produção inicial do mRNa de HIV-1

Após sua entrada na célula, o HIV-1 em RNA é reversamente transcrito para a forma de DNA que se move para o núcleo via complexo de pré-integração e torna-se integrado na cromatina celular. O LTR do HIV-1 integrado é transcripcionalmente inativo devido a formação de nucleossomos como demonstrado na proximidade do promotor. Nucleossomo desdobrado é um pré-requisito para qualquer iniciação transcricional e esse mecanismo é realizado pelos complexos de remodelação da cromatina que modificam as interações entre a histona e o DNA. Esses complexos são tanto ativados por citocinas, por quimiocinas, por vários eventos celulares, ou podem ser recrutados pela proteína Tat após sua produção. Se este primeiro estágio foi alcançado por Tat, Tat teria que ser incorporada para dentro das partículas virais, liberada no citoplasma, e redirecionada para o núcleo para exercer sua atividade. Contudo, a proteína Tat não tem sido observada no vírion nem no complexo de pré-integração, e nós não temos evidêcias de sua atividade durante os primeiros estágios de replicação do HIV. Dados recentes que detectaram um peptídeo Tat dentro do vírion do HIV-1 podem mudar esta visão, mas há estudos na expectativa de quantificar e analisar a relevância funcional desse achado. Portanto, é mais aceitável que a formação inicial de uma abertura na cromatina na região do LTR do HIV-1 seja mediada por eventos intracelulares ou extracelulares tais como ativação de citocinas ou rotas de sinal de tradução que ativarão os complexos de remodelação dos nucleossomos para reduzir a interação entre a histona e o DNA e ativar a transcrição Esses eventos dispararão a iniciação transcricional e a formação de alguns mRNAs que iniciam com TAR RNA. Algumas proteínas de Tat poderão então ser produzidas e serão transportadas para o núcleo. Este exercerá sua função no complexo de modificação da cromatina e suas propriedades de transativação no núcleo.

B. A Atividade de Tat nos complexos de Modificação da Cromatina

Os estágios seguintes na atividade de Tat são exercidos tanto pelas novas Tat sintetizadas ou por Tat secretadas que tenham entrado numa nova célula. Tat não modificada liga-se ao BRM, a subunidade de ATPase do complexo SWI-SNF, e o complexo contribui para o remodelamento do nuc 1 e ativação do promotor. A acetilação de Tat no aminoácido K50 (Lisina 50) previne a ligação Tat-BRM sugerindo uma atividae antes da associação entre Tat e p300/CBP e hGCN%. Não é sabido se esse recrutamento ocorre independentemente de TAR ou quando Tat é ligada à TAR ou a CycT1. Considerando que o nuc 1 abrange a seqüência de DNA codifocadora de TAR, se o DNA for completamente estruturado em nucleossomos, nenhuma TAR estará presente, mas se uma pequena parte da cromatina não é compactada, alguma ligação de TAR-Tat ajuda a levar o complexo aos arredores do nuc1 (nucleossomo 1). O remodelamento do nuc 1 (nucleossomo 1) favorece a acessibilidade ao DNA por complexos de transcrição.





C. A Formação do complexo RNA de TAR-Tat-CycT1-CDK9

A ligação de Tat ao TAR (RNA) e sua liberação é altamente regulada por modifcações de Tat e sua afinidade com CycT1-CDK. A recém formada Tat liga-se à PCAF, o que produz Ac28Tat que tem afinidade aumentada para CycT1 já ligada à CDK9. Tat pode cooptar P-TEFb de seu depósito inativo no 7SK snRNA-MAQ1/HEXIMI1 ou ligar-se a formas livres de P-TEFb presentes no citoplasma. Tat ligada a SWI-SNF pode também ligar P-TEFb para transportar o complexo protéico de modelação para a proximidade do nucleossomo 1. PCAF tem uma diminuída afinidade para Ac28Tat, a qual induzirá à dissociação do complexo. O complexo Ac28Tat-CycT1-CDK9 tem uma crescente afinidade com TAR e liga-se à pequena qualidade de nascente TAR RNA presente na célula. Devido a sua afinidade com Tat, p300/CBP e hGCN5 são recrutados neste sítio e acetilam Tat no K50 (nucleotídeo Lisina 50) e K51. Por que Ac50Tat tem diminuída afinidade por TAR, o p300/CBP-Ac50Tat-P-TEFb é liberado de TAR e transferido para o próximo PIC (complexo de pré-inicialização) no promotor. É possível que esta dissociação de TAR também favoreça uma transferência de Tat-SWI/SNF para o nuc1 (nucleossomo 1) para abrir a cromatina. Alguns modelos, principalmente baseados em estudos “in vivo”, favorecem a transferência do complexo Tat-CycT1-CDK9 de TAT para o complexo de alongamento intervalado após TAR, mas dados recentes da análise dos fatores recrutados por Tat no promotor podem ser explicados pela transferência do complexo Tat-CycT1-CDK9 de TAR para o PIC (complexo de pré-inicialização) transcricional.

D. A Atividade de Tat no PIC

O papel de TAt no PIC tem sido deduzido de estudos iniciais e substanciado por estudos recentes de modelos “in vivo”. Os primeiros estudos demonstraram que a TAt liga-se ao TBP, TFIIB e TAF55, os quais são parte do PIC. Uma interação direta com TFIIH tem também sido descrita, mas não encontrada por outros. Ensaios quinéticos mostraram uma rápida ação de Tat antes de TAR ser produzida, e ensaios funcionais indicam que Sp1 e NF-kB intensifica a transativação.
Vários dados têm mostrado que a Tat e o complexo P-TEFb estão presentes em ambos PIC e complexo de transcrição de alongamento (TEC). Experimentos com ChIP (imunoprecipitação da cromatina) têm mostrado que Ac50Tat ou Ac50/51Tat, mas não a Tat não-acetilada, está associada ao promotor do HIV‑1 “in vivo”, o qual está a favor de sua transferência de TAR para PIC após a acetilação por p300/CBP. Experimentos adicionais com ChIP demonstram que p300, CBP, NF-kBp65, e PCAF são recrutadas primitivamente do promotor do HIV-1 sobre a ativaão de Tat “in vivo”. Quando o recrutamento geral de fatores de transcrição para o promotor foi analisado por ChIP, o TBP e o TFIIB foram recrutados por TAt, mas não o TFIID como nenhuma TAF foi detectada no promotor CycT1 ou CDK9 mostram a mesma atividade indicando que ativadores que funcionam via P-TEFb promovem a reunião do complexo de transcrição com TBP e não com TFIID. Consistente com a ligação de Ac50Tat a sua subunidade BRG1 ou a subunidade INI, SWI/SNF também é recrutado por Tat para a região da cromatina que engloba o promotor e o nuc 1 (nucleossomo 1). Sobretudo, esses dados indicam que o complexo Tat-CycT1-CDK9 ligado a TAR recruta TBP e TFIIB para a reunião do complexo de pré‑inciação (PIC), assim como HATs e SWI/SNF para a dissociação do DNA com a histona. O remodelamento do nucleossomo permite a progressão de um competente alongamento pelo complexo de transcrição.

E. A Atividade de Tat no Complexo de Alongamento.

A atividade de Tat no complexo de alongamento foi clarificado durante os últimos anos e é mediado pela atividade de recrutamento do P-TEFb por Tat. Por que nenhuma evidência direta “in vivo” de um RNAPII (Polimerase II de RNA) atrasado na ausência de Tat tem sido observado em ensaio de imunoprecipitação (ChIP), é muito aceitável que a atividade de Tat na transcrição de alongamento seja uma conseqüência direta da formação de um PIC altamente competente pelo recrutamento de Tat-P-TEFb. O PIC recruta primeiro TFIIH, cuja quinase CDK7 fosforila o RNA-PIICTD em Ser 5 (serina 5). Esta etapa é independente de Tat e permitiu a síntese de aproximadamente 15 nucleotídeos pela polimerase. Uma atividade coordenada entre CDK7, lançada após o intervalo do décimo-quarto ao trigésimo-sexto nucleotídeos (14‑36 nts) e CDK9 provocada por Tat no PIC leva à hiper-fosforilação do CTD de RNAPII (Domínio C-Terminal da RNAPII assim como múltiplas fosforilações serão mantidas por toda extensão de todo o alongamento pela atividade de CDK9 no complexo Tat-P-TEFb.
O alongamento transcricional é inibido pela atividade de NELF e pela DSIF que reprime a fosforilação do C-Terminal de RNAPII. Em humanos, DSIF é composta de SPT e SPT5, enquanto NELF é um complexo contendo cinco (5) subunidades (NELF A para E: A, B, C, D e E) em que NELF-E é uma proteína de ligação a RNA. Esta inibição não afeta a RNAPII cujo CTP foi fosforilado por P-TEFb, indicando que a função primária da CDK9 no P-TEFb é para aliviar os efeitos de DESIF e NELF.
O recrutamento de P-TEF b por Tat no PIC promove a hiper-fosforilação do CTD da RNAPII pela CDK9, portanto evita que DSIF e NELF ajam contra uma transcrição de alongamento efetiva. SPT5 também funciona como regulador positivo da transcrição de alongamento no contexto da transativação mediada por Tat do HIV-1. SPT5 é fosforilada pela CDK9 durante o alongamento e este mecanismo transforma sua atividade negativa numa função positiva. SPT5 também é metilada por PRMT1 e PRMT5, mas esta modificação pode tanto estimular ou reprimir a expressão gênica do HV-1 pela troca da associação de SPT5 com a RNAPII.
A NELF reprime a transcrição por ligação ao complexo DSIF-RNAPII e ao RNA. A subunidade RD/NELF de NELF é também fosforilada por CDK9, a qual modifica suas propriedades de ligação ao RNA e evita sua atividade repressiva. Essas modificações em SPT5 e NELF pela CDK9 criam um “interruptor” de repressão e ativação transcricional, instensificando a atividade de CDK9 na fosforilação do CTD da RNAPII. Esta função é confirmada por estudos com pequenos RNAs de intererência (siRNAs) em contraste/oposição a CDK9 e SPT5, ao quais mostraram que estes são requeridos para a transativação de Tat e a replicação do HIV1. Estudos suplementares ajudarão a compreensão total de sua atividade temporal na regulação da transcrição de alongamento do HIV-1.

V. Conclusão

Os mecanismos moleculares que levam à atividade transcricional do HIV-1 integrado ao DNA têm sido elucidados em grande parte. Tat contribui para várias etapas do início do remodelamento da cromatina ao fim da transcrição de alongamento pelo recrutamento de um grande número de fatores celulares. Algumas discrepâncias ainda permanecem entre vários investigadores, que favorecem mais à inicialização transcricional ou ao alongamento dependendo dos ensaios experimentais, mas o modelo “in vivo” agora atingiu um consenso. Todos os estudos têm contribuído para a elucidação das diferentes etapas “in vivo” da transcrição e da transativação com recrutamento por Tat de fatores específicos em cada etapa. Estudos futuros continuarão a decifrar esse complexo de interações entre o vírus e seu hospedeiro.