OMIM 309060 LYSOSOME-ASSOCIATED MEMBRANE PROTEIN 2; LAMP2
Alternative titles; symbols
LYSOSOME-ASSOCIATED MEMBRANE PROTEIN B; LAMPBLYSOSOMAL MEMBRANE GLYCOPROTEIN, 110-KD; LGP110
Gene map locus Xq24
TEXT
DESCRIPTION
The lysosomal membrane plays a vital role in the function of lysosomes by sequestering numerous acid hydrolases that are responsible for the degradation of foreign materials and for specialized autolytic functions. LAMP1 (153330) and LAMP2 are glycoproteins that constitute a significant fraction of the total lysosomal membrane glycoproteins. Both consist of polypeptides of about 40 kD, with 16 to 20 N-linked saccharides attached to the core polypeptides (Fukuda et al., 1988).
A membrane lisossomal desempenha um papel vital na função dos lisossomos seqüestrando numersas hidrolases ácidas (enzimas que clivam substratos com a adição de H2O no ponto de clivagem; por ex. esterases, fosfatases, nucleases, peptidases. Dic Stedman) que são responsáveis pela degradação de materiais externos e pelas funções autolíticas (autólise é a digestão enzimática de células mortas ou degeneradas por enzimas presentes dentro delas mesmas; ou destruição de células em conseqüência de uma lisina formada nessas células ou em outras de um mesmo organismo. Dic. Stedman. É o mesmo que apoptose da célula?) especializadas. LAMP1 e LAMP2 são glicoproteínas que constituem uma significativa fração do total de glicoproteínas da membrana lisossomal. Ambas consistem de polipeptídeos de aproximadamente 40 kD, com 16 a 20 nucleotídeos de sacarídeos unidos ao cerne dos polipeptídeos.
CLONING
Fukuda et al. (1988) isolated human cDNAs encoding LAMP1 and LAMP2.
Fukuda et al. isolaram clones de DNAs humanos codificadores de LAMP1 e LAMP2.
Using mouse Lgp110 to screen a human liver cDNA library, Konecki et al. (1994) cloned LAMP2. Sequencing analysis indicated that there are 4 polyadenylation signals in the 3-prime UTR, with the second being the most frequently used. The deduced 410-amino acid protein contains a leader sequence; a luminal domain consisting of 2 homologous domains with 4 identically spaced cysteines linked by 2 disulfide bonds; a 20-amino acid transmembrane region; and a short cytoplasmic tail containing the lysosomal membrane targeting signal. The protein is heavily N-glycosylated.
Usando a glicoproteína L( L pode ser abreviatura de leucina) 110 do camundongo para rastrear uma biblioteca de clones de DNA do fígado humano, Konechi e outros (1994) clonaram LAMP2. Análises seqüenciais indicaram que haviam quatro (4) sinais de poliadenilação no UTR 3- prime (unidade de repetição terminal na extremidade 3), com a segunda sendo mais freqüentemente usada. A proteína deduzida em 410 aminoácidos contém uma seqüência líder; um domínio luminal (relativo à luz/cavidade de um vaso ou estrutura tubular; será uma estrutura em gancho?) consistindo em dois domínios homólogos com quatro cisteínas identicamente espaçadas ligadas por duas pontes dissulfídicas; uma região transmembrânica de 20 aminoácidos; e uma pequena aba citoplasmática contendo o sinal para reconhecimento pela membrana do lisossomo. A proteína é pesadamente nucleotideo-glicosilada. (Obs.: Os nucleotídeos são base, açúcar e fosfato, neste caso deve ser licose ao invés de ribose)
By screening human liver and pheochromocytoma cDNA libraries, Konecki et al. (1995) identified a LAMP2 variant, which they called LAMP2B, that results from alternative splicing of exon 9. They designated the variant reported by Konecki et al. (1994) as LAMP2A. The deduced LAMP2B protein contains 410 amino acids, like the LAMP2A protein, but its C-terminal sequence differs in the last 11 amino acids of the luminal domain, the transmembrane domain, and the cytoplasmic tail. LAMP2B retains the lysosomal targeting signal, gly-tyr-x-x, and has the same number of potential glycosylation sites as LAMB2A. The LAMP2B variant has 3 polyadenylation signals in the 3-prime UTR. Using a common 5-prime LAMP2 sequence as probe for Northern blot analysis, Konecki et al. (1995) identified 6 major LAMP2 transcripts in liver and 4 major transcripts in pheochromocytoma mRNA. By Northern blot analysis using LAMP2B-specific probes, they detected highest expression of LAMP2B in skeletal muscle, with very low expression in liver. LAMP2B was also expressed in fibroblasts and fetal liver. Northern blot analysis using LAMP2A-specific probes detected highest LAMP2A expression in placenta, lung, and liver, with much lower expression in skeletal muscle. Immunoelectron microscopy localized LAMP2 primarily on the luminal side of endocytic organelles. No labeling of the plasma membrane was observed.
Pela verificação de bibliotecas de clone de DNA de fígado humano e feocromocitoma (cromafinoma funcional, geralmente benigno, derivado de células do tecido medular supra-renal e caracterizado pela secreção de catecolaminas, resultando em hipertensão arterial, que pode ser paroxística {estado de uma doença em que os sintomas se manifestam com maior intensidade} e associada a episódios de palpitação, cefaléia, náuseas, dispnéia {dificuldade de respiração}, ansiedade, palidez e sudorese profusa. O feocromocitoma freqüentemente é hereditário, não apenas em facomas como a doença de Hippel-Lindau, neurofibromatose e neoplasia endócrina familiar, mas como também um defeito isolado [OMIM 171300] como um traço autossômico dominante. Dic.Stedman), Konecki e outros (1995) identificaram uma variante de LAMP2, que eles denominaram LAMP2B, que resulta de um splicing alternativo do éxon 9. Eles designaram a variante identificada por Konecki e outros (1994) como LAMP2A. A deduzida proteína LAMP2B contém 410 aminoácidos, igualmente à proteína LAMP2A, mas a seqüência C-terminal (carboxila) difere nos últimos onze (11) aminoácidos do domínio luminal, o domínio transmembrânico, e na alça citoplasmática. LAMP2B retém o sinal de reconhecimento do lisossomo, gly-tyr-x-x, e possui o mesmo número de sítios com potencial de glicosilação [obs.: formação de ligações com grupamentos glicosila, como ocorre entre a D-glicose e a cadeia da hemoglobina para formar a fração hemoglobina AIC, cujo nível aumenta de acordo com a concentração de D-glicose sangüínea aumentada no diabetes melito não controlado ou mal controlado. Dic.Stedman] de LAMB2A. A variante LAMP2B tem três sinais de poliadenlação no 3-prime UTR. Usando uma seqüência comum do 5-prime (ponta 5) do LAMP2 como uma prova para análises em Northern blot (que analisa RNA), Konecki e outros (1995) identificaram seis transcritos principais de LAMP2 no fígado e quatro no mRNA de feocromocitoma. Através das análises de Northern blot usando provas específicas de LAMP2B eles detectaram altíssima expressão de LAMP2B no músculo do esqueleto, com muito baixa expressão no fígado. LAMP2B foi também expressada em fibroblastos e no fígado fetal. Análises de Northern blot usando provas específicas de LAMP2A detectaram altíssima expressão de LAMP2A na placenta, pulmões e fígado, com muito baixa expressão no músculo do esqueleto. A microscopia imunoeletrônica localizou LAMP2 primeiramente no sítio luminal de organelas endocíticas (que fazem endocitose). Nenhuma característica de membrana plasmática foi observada.
GENE FUNCTION
LAMP2 is thought to protect the lysosomal membrane from proteolytic enzymes within lysosomes and to act as a receptor for proteins to be imported into lysosomes (Fukuda, 1994).
LAMP2 é pensada como uma proteção da membrana lisossomal a enzimas proteolíticas dentro dos lisossomos e por atuar como um receptor para proteínas a serem importadas para dentro dos lisossomos (Fukuda, 1994)
GENE STRUCTURE
Konecki et al. (1995) determined that the LAMP2 gene contains 9 coding exons, with 2 alternate last exons, 9a and 9b.
Konecki e outros (1995) determinaram que o gene de LAMP2 contem nove éxons codificadores, com dois éxons finais alternantes 9a e 9b.
MAPPING
By in situ hybridization, Mattei et al. (1990) mapped the LAMP2 gene to Xq24-q25. This was taken to support the view that LAMP1 and LAMP2 diverged relatively early in evolution and that they have distinct functions which emerged as soon as eukaryotic cells acquired lysosomes as subcellular compartments.
Por hibridização no sítio, Mattei e outros (1990) mapearam o gene LAMP2 no cromossomo Xq24-q25. Isso foi tomado como fundamento da visão de que LAMP1 e LAMP2 divergiram relativamente cedo na evolução e que elas tem funções distintas as quais emergiram tão logo as células eucarióticas adquiriram lisossomos como compartimentos subcelulares.

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OMIM 153330 LYSOSOME-ASSOCIATED MEMBRANE PROTEIN 1; LAMP1
Alternative titles; symbols
LYSOSOME-ASSOCIATED MEMBRANE PROTEIN A; LAMPALYSOSOMAL MEMBRANE GLYCOPROTEIN, 120-KD; LGP120
Gene map locus 13q34
TEXT
The 120-kD lysosomal membrane glycoprotein is an acidic, heavily glycosylated membrane protein enriched in the lysosomal membrane. By using an oligonucleotide probe corresponding to the amino terminus of rat lgp120, Howe et al. (1988) isolated and characterized cDNA clones containing the entire coding region. The deduced amino acid sequence demonstrated that the rat LGP120 contains a putative signal peptide, 18 sites for N-linked glycosylation, a single membrane-spanning segment, and a short (11 amino acid) cytosolic tail. LGP120 showed similarity to 2 other lysosomal membrane proteins and showed a high degree of conservation in domain organization and primary structure with the proteins in other species.
A glicoproteina de 120 kD da membrane lisossomal é uma ácida, pesada e glicosilada proteína de membrana enriquecida na membrana lisossomal. Usando como prova um oligonucleotídeo correspondente a dois terminais amina da glicoproteína l 120 do rato, Howe e outros (1988) isolaram e caracterizaram clones de clones de DNA contendo a região codificadora inteira. A seqüência de aminoácidos deduzida demonstrou que a glicoproteína 120 contem um peptídeo sinal putativo, dezoito sítios para glicolização em conexão ao terminal N, um segmento que atravessa a membrana, e uma pequena aba citosólica (que fica no citoplasma da célula) de onze aminoácidos. LGP 120 apresentou smilaridade com outras duas proteínas de membranas lisossomais e apresentou também um alto grau de conservação na organização do domínio e da estrutura primária em relação a esta proteína em outras espécies.
Viitala et al. (1988) reported the complete amino acid sequence for the human lysosome-associated membrane glycoprotein with M(r) about 120,000. The amino acid sequence, which was deduced from analysis of the cDNA, contains 385 amino acid residues. By means of in situ hybridization, Mattei et al. (1990) assigned the LAMP1 gene to 13q34. A related gene, which may be a pseudogene, mapped to 12p13.3. The hybridization of LAMP1 cDNA to 12p13.3 was observed even when probes representing different portions of the LAMP1 cDNA were used. Although LAMP1 contains a functional hinge region, it has a disulfide arrangement different from that observed in members of the immunoglobulin superfamily and thus may represent a new family of membrane glycoproteins.
Viitala e outros (1988) expuseram a seqüência completa de aminácidos da glicoproteína associada à membrana do lisossomo com M(r) aproximado de 120,000. A seqüência de aminoácidos, a qual foi deduzida de análises do cDNA, contem 385 resíduos de aminoácidos. Através da expressão da hibridização “in situ”, Mattei e outros (1990) assinalaram o gene de LAMP1 em 13q34 (no cromossomo 13, braço longo período 34). Um gene relacionado, o qual pode ser um pseudogene, foi mapeado em 12p13.3 (mesmo lócus do vWf) . A hibidização de LAMP1 cDNA no lócus 12p13.3 foi observado mesmo quando provas representando diferentes porções do cDNA ( de clone de DNA) de LAMP1 eram usados. Embora LAMP1 contenha uma região de articulação funcional, ela tem um arranjo dissulfídico diferente daquelas observadas em membros da superfamília das imunoglobulinas e assim podem representar uma nova família de glicoproteínas de membranas.

The amino acid sequence of LAMP1 is more homologous to corresponding molecules from other species than it is to LAMP2 (309060). Furthermore, LAMP1 and LAMP2 are immunologically distinguishable from each other. Thus it was proposed that LAMP1 and LAMP2 diverged relatively early in evolution but that LAMP1 (and possibly LAMP2) structures have been strongly conserved. Using Southern hybridization in hamster/human hybrid cell panels, Schleutker et al. (1991) confirmed the assignment of the LAMP1 gene to chromosome 13. Furthermore, Schleutker et al. (1991) demonstrated absence of genetic linkage of either LAMP1 or LAMP2 with Salla disease (604369), a condition in which defective function of a lysosomal membrane transporter protein is the probable cause of accumulation of sialic acid in lysosomes.
A seqüência de aminoácidos de LAMP1 é mais homóloga a moléculas correspondentes de outras espécies do que esta é para LAMP2. Além disso, LAMP1 e LAMP2 são imunologicamente distintas uma da outra. Assim foi proposto que LAMP1 e LAMP2 divergiram relativamente cedo na evolução mas as estruturas de LAMP1 (e possivelmente LAMP2) tem sido fortemente conservadas. Usando hibridização Southern (de DNA) num painel de células humanas e de hamster hibridizadas, Schleutker e outros (1991) confirmaram o assentamento do gene de LAMP1 no cromossomo 13. Além disso, Schleutker e outros (1991) demonstraram abstenção de ligação genética entre LAMP1 e LAMP2 com a disfunção Salla, uma condição em que a função defectiva da proteína de transporte da membrana lisossomal é a provável causa de acumulação do ácido siálico (da saliva) nos lisossomos.
Bermingham et al. (1996) demonstrated that the Lamp1 gene is located on mouse chromosome 8. They could find no evidence that it is the site of the mutation in mnd (motorneuron degeneration) mice.
Bermingham e outros (1996) demonstraram que o gene de LAMP1 é localizado no cromossomo 8 dos camundongos. Eles não encontraram evidências de que este é o sítio da mutação na mnd (degeneração neuromotora) dos camundongos.

Molecular Biology and Pathogenesis – Kuan-Teh Jeang
O RNA DE INTERFERENCIA E O HIV-1
Man Lung Yeung, Yamina Bennasser, Shu-Yun Le, and Kuan-Teh Jeang

Tradução: Isabela Matheus

1)Visão Geral do Capítulo


O RNA de interferência (RNAi) pode regular uma variedade de processos biológicos. Evidências recentes defendem a noção de que ambos miRNAs (micro RNA de interferência) celular e viral (vmiRNA) são aptos a modular a replicação viral. É também evidente que viroses como o HIV-1 envolveram métodos para controlar a atividade de RNA interferente das células. Neste capítulo, nós discutimos possíveis papéis desempenhados pelo RNAi no ciclo vital do HIV-1, e como o HIV-1 usa proteínas e elementos de RNA para regular o RNA de restrição Viral.

2) Introdução

RNAi, também chamado “silenciador pós-transcricional de genes” (PTGS) em plantas, foi primeiramente descrito como uma defesa imunogênica contra viroses alógenas, transgenes e transpossons (Voinnet, 2005). O RNAi emprega uma proteína ribonuclease (RNase) III conjugada (em complexo com) a um pequeno RNA guia para silencimento de sequências específicas de RNA marcados como alvos. Correntemente, dois tipos de pequenos RNAs (small interfering RNA – siRNA) e micro RNA (miRNA) têm sido identificados por participar como RNAi.
Observações:
1 – RNA = single RNA > RNA de fita simples;
dRNA = double RNA > RNA de fita dupla.


SiRNA (small RNA interference) e miRNA (microRNA interference) são primeiro processados, de RNA (RNA) precursores mais longos, em pequenos RNA de 18 a 25 nucleotídeos (nts) por proteínas RNase III chamadas Dicer e Drosha. Um siRNA precursor pode ser uma longa e linear (em estrutura primária) fita dupla de RNA (double stranded RNA: dsRNA) ou um grampo/gancho de RNA (estrutura não linear, que apresenta alças). Automaticamente, uma fita de um siRNA duplo é destinada a tornar-se um RNA guia que é canalilizado pelas proteínas de interação com a proteína Dicer (uma RNaseIII) que são as proteínas PACT e a proteína TRBP de ligação a TAR RNA (TAR é uma região gênica do HIV : trans-ativation responsive region. Esta região é composta de 59 nucleotídeos localizados imediatamente abaixo do início transcricional do HIV, próximo ao LTR [long terminal repeat] que, por sua vez, contém várias seqüências ativadoras da expressão gênica do HIV independentemente da ativação de TAR e tat. TRBP é TAR RNA binding protein, ou seja, proteína de ligação a TAR RNA cujo lócus gênico é 12p12.1-q13.1, ver no OMIM, no 605053) para dentro de um complexo de silenciamento de RNA induzido (RISC). {OBS.: No Livro Genética, um Enfoque Molecular, o autor T.A.Brown, explica que os pequenos RNAs-guia participam no processo de edição do mRNA. A edição do RNA consiste na inserção de novos nucleotídeos na seqüencia do RNA ou na deleção de seqüências já existentes. A edição do RNA por pequenos RNA-guias foi descoberta durante estudos dos genes mitocondriais do protozoário Trypanosoma brucei, e neste, os mRNAs não editados não transcrevem proteínas. Entretanto, o RNA editatado, ou não editado, transcrevem proteínas funcionais. Especificamente a apolipoproteína‑B humana existe nas células hepáticas e no intestino, mas as primeiras, que não são editadas trazem uma versão mais longa do códon original e tem uma função bioquímica diferente da segunda, que é mais curta por motivo da edição, neste caso promovida pela enzima citidina desaminase. Uma Citosina no mRNA é desaminada pela remoção do grupamento –NH2 ligado ao carbono 2. Dessa forma, a Citosina é transformada em Uracila, criando um códon finalizador UAA, onde havia CAA.} Correntemente, muitos componentes dos RISC permanecem descaracterizados; entretanto, é crível que os complexos RISC contêm minimamente uma guia de si RNA como uma fita singular unida à proteína Argonaoute 2 (Ago2 é a subunidade dois do fator de iniciação da tradução nos eucariotos, ver no OMIM, no 606229, lócus gênico 8q24). Foi visualizado que o guia de siRNA hibridiza a seqüência marcada (alvo) de mRNA baseado em perfeita seqüência de complementaridade. Utilizando tal hibridização, a seqüência guia do siRNA captura uma seqüência-alvo de mRNA e leva o mRNA para dentro da proximidade do domínio Piwi da proteína Ago2 para degradação.
Os MiRNAs constituem uma segunda via complementar na função do siRNAs (pequenos RNAs de interferência). Embora os miRNAs também silenciem a expressão dos genes, a gênese e ação dos miRNAs são diferentes das dos siRNAs. Os miRNA precursores (pri-miRNAs) são altamente estruturados em RNA de aproximadamente 70 nucleotídeos transcritos geralmente de regiões não codificadoras endógenas no interior dos genes transcritos em RNA pela polimerase II eucariótica (é a enzima que transcreve a maioria dos genes de pequeno RNA nuclear snRNA, além de genes de proteínas, T.A.Brown, Genética, um Enfoque Molecular, pg 47). Uma vez transcrito, um miRNA precursor (pri-miRNA) é rapidamente processado no núcleo da célula em uma estrutura imperfeita de fita-alça encurtadora (pri-miRNA) pelo microprocessor, um amplo complexo multicomponente que inclui uma proteína RNase III Drosha e a proteína de ligação a RNA DGCR8 (OMIM 609030, lócus gênico 22q11.2). Pré-miRNAs processados com o final 3’ protuberante/ saliente, são então exportados para o citoplasma pela Exportina 5. No citoplasma, após a remoção da região em alça do pré-miRNA pela Dicer, uma fita de seu resultado da dupla fita de miRNA é incorporada ao RISC.Diferindo do siRNA, o reconhecimento de sítios alvo pelo miRNA é tolerante ao pareamento imperfeito bases (A, C,G,U). Geralmente, um miRNA pode mirar um mRNA se a forma e o final apresentarem perfeita complementaridade no interior do intervalo dos nucleotídeos de 2 a 7 do final 5’ do miRNA guia (a seqüência-fonte) ainda que havendo imperfeita complementaridade em miRNA e mRNA noutro sítio. Contudo, o exato mecanismo do reconhecimento do mRNA pelo miRNA está sendo apenas definido. Em geral, admite-se que mRNAs capturados pelos miRNAs não são hidrolizados pela proteína Ago2; em vez disso são transportados por RISC para dentro do compartimento, inativo para transcrição, de um ribossomo livre, denominado Corpo de Processamento.

Molecular Biology and Pathogenesis – Kuan-Teh Jeang

Continuação do Capítulo:
O RNA DE INTERFERENCIA E O HIV-1
Man Lung Yeung, Yamina Bennasser, Shu-Yun Le, and Kuan-Teh Jeang

Tradução: Isabela Matheus


3 – siRNA como terapia anti-HIV

Um uso óbvio para o siRNA é o silenciamento da expressão do gene viral. De fato, siRNAs têm sido extensivamente testados por suas propriedades anti-HIV‑1. siRNAs têm sido designados para alvejarem ambas seqüências codificadoras e não-codificadoras do HIV-1 (nef, tat, gag, vif, env, rev e LTR). Essas abordagens têm apresentado curtos períodos de sucesso; entretanto, a alta taxa de mutagênese do HIV-1 e sua possível habilidade para codificar RNAi supressores (discutido adiante) desafia o sucesso durável dos siRNAs para um longo período de supressão da replicação viral. De fato, o HIV tem evolvido métodos de escapar à restrição do siRNA. A substituição de nucleotídeos e a deleção de seqüências virais, marcadas/ alvejadas por siRNAs, pelo HIV tem sido também descritas como meios para o vírus escapar ao siRNA mediador da inibição. Além disso, o HIV pode envolver mutações fora do sítio de reconhecimento do siRNA para criar uma estrutura secundária de RNA que escudeia o alvo de acesso do siRNA e do RISC.
A evasão mutacional do HIV pode aparentemente ser atenuada pelo uso simultâneo de múltiplos siRNAs, com sítios-alvo para diferentes regiões do genoma viral. O conceito por trás dessa estratégia é defendido em razão de que um vírus não pode alterar muitas seqüências simultaneamente e ainda preservar sua competência para replicação. O sucesso dessa estratégia é fundamentado por dados de que o uso de dois siRNAs, comparado a um siRNA singular, neutralizou significativamente o escape mutacional do HIV. Além do mais, em células em que há tradução estável para expressar quatro diferentes siRNAs alvejadores do HIV-1, nenhuma RNAi resistente do vírus foi detectada antes de 60 dias após a infecção viral. Avanços recentes na modelagem computacional proporcionam uma nova elucidação (um novo insigth) às predições quanto a como o HIV-1 deverá envolver‑se quando está alvejado pelo siRNA. Através da compreensão de curtos períodos da evolução do vírus, um deles pode potencialmente designar uma grande série dos siRNAs para antecipar as variantes de escape.
Outro meio para combater a infecção por HIV-1 é usar o siRNA para desmantelar proteínas celulares que são essenciais ao ciclo viral. Essa abordagem contorna a habilidade do vírus para transformar sua seqüência viral com o objetivo de evadir-se ao RNAi. Eficiente inibição à replicação viral através do alvejamento de proteínas celulares usado para diferentes estágios do ciclo do HIV-1 têm sido demonstrada. Entretanto, um termo extensor concernente permanece se é que existem genes celulares que possam ser verdadeiramente degradados em feição não tóxica para o funcionamento normal da célula.


4 - O HIV-1 REMODELA A EXPRESSÃO DO miRNA CELULAR NAS CÉLULAS INFECTADAS.

A atividade antiviral do miRNA celular contra uma infecção viral foi primeiro anunciada por Lacellier et al (2005). Esses autores demonstraram a habilidade do miR-32 na restrição da replicação do virus espumante tipo 1 (PFV-1) na saliva de primatas. O PFV-1 influencia a defesa dos miRNAs das células através da codificação de um RNA supressor, Tas, que inibe o processamento e maturação de miR-32. Similarmente, usando uma aproximação/ abordagem computacional, cinco miRNAs de células T humanas foram prognosticados por alvejar regiões altamente conservadas através de todo o invólucro do HIV-1. Se semelhante prognóstico está correto, então ele suporta a razão de que o HIV-1 poderia querer desenvolver meios para evitar a ação restritiva destes miRNA humanos. Na verdade, recentemente nós relatamos que o perfil do miRNA de células humanas é dramaticamente alterado após a expressão das proteínas do HIV-1 com a maior parte do miRNAs sendo reduzido em abundância. Nós atribuímos este fenômeno em parte à atenuação da atividade de Dicer devido à proteína Tat do HIV-1. Mais recentemente, o RNA de TAR do HIV-1 foi também apresentado como capaz de reprimir o processamento do miRNA pelo seqüestro das proteínas de ligação dsRNA (double sRNA) das células humanas, TRBP (proteína de ligação a TAR RNA), um co-fator chave da proteína (RNaseIII) Dicer. Por que a TAR é abundantemente expressada nas células infectadas pelo HIV-1 e por que este RNA tem grande afinidade de ligação com o TRBP, há a expectativa de que a habilidade da Dicer para processar miRNA precursores poderia ser reduzida na presença de TAR RNA. Portanto, como o PFV, o HIV-1, através da combinação de Tat e de TAR, pode aparentemente reduzir a expressão dos miRNAs humanos que poderiam, por outro lado, alvejar o vírus desfavoravelmente a este último.
Uma redução da expressão do miRNA pode também contribuir parcialmente em grande risco para pacientes desenvolverem neoplasia. O mais comum neoplasma associado ao HIV é o Sarcoma de Kaposi, que é causado pelo herpesvírus 8 (HHV-8, conhecido também como uma associação de KS ao herpesvírus, KSHV). Notavelmente, pacientes do HIV-1 imunonossuprimidos têm setenta vezes mais chances para o KS do que imunossupressões similares induzidas por outros fatores. Não está claro como o HIV-1 assessora o HHV-8 nessa moléstia. Contudo, por que as alterações no miRNA têm sido relacionadas a carcinogêneses, uma possível especulação, que não exclui outras possibilidades, poderia ser a de que a reduzida expressão de certos miRNAs nas células infectadas pelo HIV tornam os indivíduos infectados mais vulneráveis aos sarcomas induzidos de HHV-8. Mais dados estruturais são necessários antes de alguma compreensão sobre o papel potencial do HIV-1 e dos miRNAs nos cânceres como KS. Um entendimento que deve ser mantido em mente é que a contribuição do miRNA deverá ser vista no contexto total de uma adicional, talvez mais ampla, contribuição que chega do processo imunológico.

Molecular Biology and Pathogenesis – Kuan-Teh Jeang

Continuação do capítulo:
O RNA DE INTERFERENCIA E O HIV-1
Man Lung Yeung, Yamina Bennasser, Shu-Yun Le, and Kuan-Teh Jeang
Tradução: Isabela Matheus

V – O HIV-1 codifica miRNA?

Enquanto o genoma celular codifica miRNA, algumas viroses também carregam seus próprios vmiRNAs. Desse modo, evidências têm sido apresentadas como fundamento de que mais de oito vírus codificam seqüências de miRNA que podem ser processadas dentro de células na maturação do miRNAs. Embora a maioria das funções dos vmiRNAs permaneçam desconhecidas, as expressões de algumas vmiRNAs são consideradas importantes para o estabelecimento de infecções latentes e para permitir o escape de células infectadas à vigilância imunológica. Exemplos de auto-alvejamento de miRNA incluem o miRNA do HIV-1 codificado e o miRNA de EBV codificado, os quais silenciam a partícula nef (Obs.: Nef : Negative factor gene. Os genes nef codificam proteínas de 25kDa a 27kDa que são expressadas no citoplasma das células. Sua função é decrescer a expressão antigênica de CD4 na membrana celular.) e a DNA polimerase BALF5, respectivamente. O miRNA do SV40 codificado é também um inibidor da transcrição viral. SV40-mir-S1 é expressado mais tarde na infecção e aparece para suprimir o excesso da produção de antígenos T nas células infectadas pelo SV40. Dessa maneira, as células infectadas por SV40 são moderadas para serem menos suscetíveis à resposta dos linfócitos T citotóxicos (CTL) assim como menos potentes na estimulação da liberação de citocinas.
Além do próprio alvejamento, os vmiRNAs podem também alvejar mRNAs celulares. Nas células infectadas pelo vírus de herpes simples tipo 1 (HSV-1), o hsv‑mir-H1, um vmiRNA codificado pelo transcrito associado à latência do HSV-1 (LAT) suprime a transformação das proteínas do fator de crescimento de (TGF)-β1 {Obs.: TGF é uma citocina que é uma linfotoxina das células T que atua na morte das células por ataque de células TCD8+ citotóxicas. TGFB é um peptideo multifunctional que controla a proliferação, diferenciação e outras funções em muitos tipos de células. Lócus: 19q13.1} e da SMAD3 {Omim: SMAD3 lócus: 15q21-q22. Zawel et al. (1998) descoriram que as proteínas humanas SMAD3 e SMAD4s podiam reconhecer especificamente uma seqüência palindrômica de idênticos 8 pares de base (GTCTAGAC). Repetições em tandem (seguidas uma atrás da outra na mesma fita) desta palíndrome conferiram espantosa correspondência ao mínimo promotor de TGF-beta. Essa correspondência foi abolida pela pelo alvejamento deletério do gene cellular SMAD4. Esse resultado mostrou que as proteínas SMAD são envolvidas na resposta biológica do TGF-beta e seus ligantes. A SMAD3 é um mediador direto da ativação transcricional pelo receptor TGF-beta. Seus genes alvejados nas células epiteliais incluem os inibidores de quinases dependents de ciclina (CDK) que promovem uma resposta citostática.} e reduz a indução da apoptose pelo regulador TGF-B. Desse modo, os vmiRNAs podem ser usados por viroses para alterar o modelo de expressão gênica da célula hospedeira transformando o ambiente celular a favor da replicação viral.
Correntemente, a maioria dos vmiRNA são encontrados nos DNA virais. Nós desenvolvemos um algoritmo para predizer a ocorrência dos miRNA no interior de uma seqüência que mudou de sítio aleatoriamente (aleatoriamente é modo de dizer, na verdade, não se sabe a causa.) Baseados nesse algoritmo, nós observamos que três miRNAs podem estar presentes em estoque por 100kb com suposição SigZscr> 4.0 e p<0.00003 [ see Bennasser et al (2006 a) for detail]. Num momento neutro de evolução, nos parece que não deveríamos fazer diferença ou manter um preconceito quanto à habilidade do DNA viral e do RNA viral para codificar miRNAs. Os dados empíricos que descrevem principalmente os vmiRNAs são codificados por viroses de DNA , mais do que por viroses de RNA, o que sugere um curso de evolução não interrompido (i.e. os vmiRNAs são evolucionariamente favorecidos por viroses de DNA versus as viroses de RNA). Enquanto outras razões sejam aceitáveis, talvez uma razão para a escassez de vmiRNAs nas viroses de RNA seja que o genoma viral de RNA pode ser vulnerável à restrição pelos vmiRNAs. Dessa forma, uma pressão seletiva exercida no genoma viral do RNA por vmiRNAs codificados de si mesmo pode levar a uma seleção evolutiva contra a presença de vmiRNA nesses genomas. A pouca preservação de vmiRNA do HIV-1 codificados, como o miR-N367, sugere que certas seqüências de RNA (por razões desconhecidas) no interior do genoma do HIV são pobremente mutáveis apesar de apresentarem um miRNA de estrutura precursora. Alternativamente, uma explicação simples pode ser a de que o vírus de RNA codifica vmiRNA em pequena quantidade tornando-se de difícil detecção. Tempo e investigação são necessários para esclarecer este cenário.

O HIV-1 tem duas seqüências virais candidatas a mi/siRNA virais, sendo elas: miR-N367 e vsiRNA. O HIV-1 também incorpora dois RNAi supressores (Tat e TAR) sugerindo que esse vírus emprega um esquema complexo de regulação genética através do pequeno RNA (sRNA). Potencialmente, numa infecção latente do HIV-1, transcrições de si mesmo são alvejadas por vmiRNAs e pelos miRNAs celulares. Na transcrição produtiva do HIV-1, a proteína Tat e TAR RNA inibem o processamento de miRNA e a atenuação da seleção de vmiRNA e do miRNA celular de apoio contra o vírus. Essa interpretação do miRNA pode ser um dos fatores que governam a transição da forma latente para a forma lítica da infecção.



V – PERSPECTIVAS FUTURAS.


Achados recentes sugerem que RNAs virais não codificadores, outros além dos miRNAs, também funcionam para modular a replicação viral. Por exemplo, o herpes vírus (MDV) codifica uma pequena telomerase (Obs 8: Telomerase é uma enzima que funciona como transcriptase reversa. É produzida a partir dos genes do hospedeiro e existe em todos os cromossomos. Neste texto, os autores referem-se a uma telomerase viral. ) viral em RNA (VTR) que promove a transformação das células T pelo aumento da atividade do complexo da telomerase reversa Transcriptase (TERT). Separadamente, foi identificado numa fita minus de RNA HTLV-1 o fator básico do zíper de leucina nas células T humanas infectadas pelo vírus tipo 1 da leucemia (HTLV-1). Análises mutagênicas revelaram que uma porção de RNA do HBZ, não a capacidade de codificação de proteínas do HBZ, semelhante ao HTLV-1 induziu a transformação celular. De modo parecido, diferentes viroses podem desenvolver específicos pequenos RNAs de apoio a mecanismos para aumentar sua replicação. Outra descoberta recente da classe de pequeno ncRNA (clone nuclear de RNA?) que atua desempenhando a regulação do ciclo vital do vírus resta ser consignada. Também há outros pequenos ncRNAs codificados por viroses. Nós temos desenvolvido uma técnica que nos permite mapear todos os RNAs transcritos do genoma do HIV-1 com determinação de todos os cinco pares de bases. Nos meses vindouros, nós esperamos compreender se existe evidência de um pequeno RNA di vírus do HIV-1 adicional que ao tenha sido reconhecido.

Página 143, 143-v, do livro: “Textbook of Hemophilia”. Editado por Christine A.Lee, Erik E. Berntorp & W. Keith Hoots

Subtítulo do Capítulo 25 “Produtos usados para tratar a Hemofilia: derivados de plasma concentrados de fatores da coagulação.” Paul L. F. Giangrande
Tradução Isabela Matheus

Pureza do Produto

A pureza do produto não é confundida com concentrados eficazes ou seguros (contra patógenos). A pureza simplesmente se refere à porcentagem do ingrediente desejado (FVIII) em concentrados relacionados com outros ingredientes. Concentrados no mercado variam amplamente em sua pureza de aproximadamante 5.0 IU FVIII MG/proteína, em concentrados de pureza intermediária, para 2000 em caso de concentrados de alta pureza. Geralmente, produtos que são altamente puros tendem a ser associados com manufatura de pouco rendimento e por isso custam mais. Produtos altamente puros são mais prontamente solúveis, o que os torna mais convenientes para tratamento caseiro e também facilitam a administração em infusões contínuas se desejado no momento de uma cirurgia. A incidência de reações alérgicas também é menos provável com produtos altamente puros. Entretanto, não há evidência de que concentrados de alta pureza ofereçam uma alta margem de segurança com relação à transmissão de patógenos. Muitos estudos têm sugerido que o uso de concentrados altamente puros retardam o declínio na contagem de linfócitos CD4+ (ativos) em indivíduos soropositivos para o HIV, mas isso não tem sido um achado consistente. Todavia, não foi claramente demonstrado que alguma mudança resultante no linfócito CD$+ seja associada com uma progressão mais lenta da AIDS e algo como o efeito positivo de produtos altamente puros é insignificante quando comparado à reconstituição da imunidade associada à terapia de alta atividade (HAART). Uma vantagem do produto de concentrado menos puro de FVIII é que eles usualmente contém quantidades significativas do fator vonWillebrand (VWF) então eles podem ser úteis no tratamento dessa condição (de hemofilia). Exemplos de concentrados suscetíveis para o tratamento da disfunção relativa ao fator VWF incluem 8Y (BPL), Alphanate (Alpha), Fanhdi(Grifols), HemateP (Aventis Behing) e concentrado de VWF (LFB). Nenhuma marca de plasma derivado de alta concentração de FVIII ou recombinante contém VWF.
Embora pudesse ser imparcial dizer que o consenso geral corrente é de que a incidência do desenvolvimento de um inibidor seja muito similar entre pacientes tratados com produtos recombinantes e com derivados de plasma, há algumas evidências de que o uso de um concentrado contendo vWF resulte em baixa incidência de desenvolvimento de inibidores e melhor resposta em pacientes com inibidores resistentes à tolerância imune.
No caso dos concentrados de fator IX, concentrados altamente puros têm sido apresentados por induzir menos ativação da coagulação do que os concentrados de complexos de trombina. Este último poderá ser, não longe empregado na rotina da administração da hemofilia B em vista de casos relativos à trombose (incluindo tromboembolismo venoso, coagulação intravascular disseminada e enfarte do miocárdio) associados com seu uso.

SITE DO
OMIM

193400 VON WILLEBRAND DISEASE
Alternative titles; symbols
VWDVON WILLEBRAND FACTOR DEFICIENCYVON WILLEBRAND FACTOR, INCLUDED; VWF, INCLUDEDFACTOR VIII-VON WILLEBRAND FACTOR, INCLUDED; F8VWF, INCLUDED
Gene map locus 12p13.3
TEXT
Von Willebrand (1931) discovered a hemorrhagic condition in persons living on the Aland Islands in the Sea of Bothnia between Sweden and Finland and called it 'pseudohemophilia.' (See 300600 for another Aland Island disease.) The main difference from classic hemophilia was prolonged bleeding time. Major clinical problems were gastrointestinal, urinary, and uterine bleeding; hemarthroses were rare. The condition ameliorated with age. Later von Willebrand and Jurgens (1933), using the capillary thrombometer, suggested the designation 'constitutional thrombopathy.' Alexander and Goldstein (1953) discovered low antihemophilic globulin (AHG; factor VIII) in this disorder. Thereafter the condition became known as 'vascular hemophilia.' In the next 10 years, the main developments were the demonstrations that (1) the platelet is intrinsically normal but has reduced adhesiveness because of factor VIII deficiency, and (2) plasma from persons with classic hemophilia will correct both the vascular defect and the factor VIII deficiency.Von Willebrand (1931) descobriu uma condição hemorrágica em pessoas vivendo na Ilha Aland no Mar da Bósnia entre a Suécia e a Finlândia e chamou isto de pseudoemofilia. A diferença mais impotante da hemofilia clássica era o prolongado tempo de sangramento. Os grandes problemas clínicos eram gastrointestinais, urinários e sangramento uterino, hemartroses eram raras. A condição amenisava com a idade. Mais tarde Von Willebrand e Junens (1933), usando trombometria capilar (tubo), sugeriram a designação ‘trombopatia constituinte”. Alexander e Goldstein (1953) descobriram baixa globulina antiemofílica (AHG; fator VII) nesta desordem da hemostasia. Depois disso a condição passou a ser conhecida como “hemofilia vascular”. Nos dez anos que se seguiram, os mais importantes desenvolvimentos eram demonstrações de que as plaquetas são intrinsicamente normais mas tem reduzida aderência (as plaquetas ficam na superfície da membrana celular) por causa da deficiência do fator VIII, e o plasma para pessoas com hemofilia clássica corrigiria ambos o defeito vascular e a deficiência do fator VIII.

SITE DO OMIM

605053 TAR RNA-BINDING PROTEIN 2; TARBP2
Alternative titles; symbols
TRBP
Gene map locus 12p12.1-q13.1
TEXT
CLONING
HIV-1, the causative agent of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), contains an RNA genome that produces a chromosomally integrated DNA during the replicative cycle. The HIV Tat protein (see 601409), a transcription-activating protein that binds to the bulge region of a stable stem-bulge-loop structure, TAR RNA, activates the HIV-1 long terminal repeat (LTR). Tat activates the LTR less efficiently in rodent than in human cells, suggesting that cellular RNA-binding proteins are also involved in the regulation of HIV replication. By screening a HeLa cell cDNA library with a TAR RNA probe, Gatignol et al. (1991) purified a cDNA, TARBP2, encoding a 345-amino acid protein termed TRBP by the authors. Mutation analysis showed that the TARBP2 protein binds to the helix between the bulge and the loop of the TAR RNA. Functional analysis demonstrated that TARBP2 enhanced expression of the HIV-1 LTR 20- to 60-fold and that the transactivation required an intact TAR RNA structure.
O HIV1, o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), contém um genoma em RNA que produz um DNA integrado no cromossomo durante o ciclo replicativo. A proteína Tat do HIV, uma proteína de ativação da transcrição que se liga à região da saliência de uma estável estrutura em laço saliente de fita, TAR RNA, ativa o LTR (longo terminal de repetição) do HIV-1. Tat ativa o LTR com menos eficiência em roedores do que em células humanas, sugerindo que proteínas celulares de ligação a RNA também são envolvidas na regulação da replicação do HIV. Através do rastreamento de uma biblioteca de cDNA de células HeLa com uma prova de TAR RNA, Gatignol ET al. (1991) purificaram um cDNA (clone de DNA), TARBP2, codificando uma proteína de 345 aminoácidos chamada TARBP2 pelos autores. Análises mutacionais demonstraram que a proteína TARBP2 intensificou a expressão do LTR DO HIV-1 de 20 para 60 cópias e que a transativação requeria uma estrutura intacta da TAR RNA.
By sequence analysis, Kozak et al. (1995) determined that human and mouse TARBP2 genes are expressed as 1.6-kb transcripts. However, immunoblot analysis revealed that TARBP2 encodes 90- and 37-kD proteins in mouse cells, a 37-kD protein in hamster cells, and a 55-kD protein in monkey and human cells.
Através de analyses de seqüências, Kozak et al. (1995) determinaram que os genes da TARBP2 humano e do camundongo expressavam transcridos como 1.6 kbytes. Entratanto, análises de imunoblot (imunoensaio) revelaram que o gene de TARBP2 codifica proteínas de 90 e 37 quilodáltons nos camundongos, uma de 37-kD nas células do hamster, e uma proteína de 55-kD nas células dos macacos e humanas.
GENE FUNCTION
Chendrimada et al. (2005) demonstrated that TRBP, which contains 3 double-stranded RNA-binding domains, is an integral component of a Dicer (606241)-containing complex. Biochemical analysis of TRBP-containing complexes revealed the association of Dicer-TRBP with Argonaute-2 (AGO2; 606229), the catalytic engine of the RNA-induced silencing complex (RISC). The physical association of Dicer-TRBP and AGO2 was confirmed after the isolation of the ternary complex using Flag-tagged AGO2 cell lines. In vitro reconstitution assays demonstrated that TRBP is required for the recruitment of AGO2 to the small interfering RNA (siRNA) bound by Dicer. Knockdown of TRBP resulted in destabilization of Dicer and a consequent loss of miRNA biogenesis. Finally, depletion of the Dicer-TRBP complex via exogenously introduced siRNAs diminished RISC-mediated reporter gene silencing. Chendrimada et al. (2005) concluded that these results support a role of the Dicer-TRBP complex not only in miRNA processing but also as a platform for RISC assembly.
Chendrimada et al. (2005) demonstraram que TRBP, a qual contém três domínios de ligação a RNA de dupla fita, é um componente integral do complexo que contém a (RNaseIII) Dicer. Análises bioquímicas dos complexos que contém TRBP revelaram a associação do ligante Dicer-TRBP com a proteína Argonaute 2 (AGO2), o motor catalítico do complexo de RNA indutor de silenciamento (RISC). A associação física de Dicer-TRBP com AGO2 foi confirmada após o isolamento dos complexos ternários usando linhagens de células com AGO2 alvejadas por marcadores. Ensaios de reconstituição “in vitro” demonstraram que a TRBP é requerida para o recrutamento de AGO2 para o pequeno RNA de interferência (siRNA) ligado por Dicer. A desagregação do TRBP resultou na desestabilização de Dicer e uma coseqüente queda na bioênese de miRNA. Finalmente, a depleção do complexo Dicer-TRBP por meio de siRNAs exógenos introduzidos reduziu o silenciamento de genes mediado por RISC. Chendrimada er al. (2005) concluíram que esses resultados fudamentam um papel do complexo Dicer-TRBP não somente no procesamento de miRNA mas também como uma plataforma para reunião do complexo RISC.
MAPPING
By analysis of somatic cell hybrids, Kozak et al. (1995) mapped the TARBP2 gene to the centromeric region of chromosome 12 (12p12.1-q13.1). Using the same method, they mapped a human TARBP2 pseudogene (TARBP2P) to 8q22-qter and the mouse Tarbp2 gene to chromosome 15.
Por análises de células somáticas híbridas, Kozak et al. (1995) mapearam o gene de TARBP2 na região centromérica do cromossomo 12 (12p12.1-q13.1). Usando o mesmo étodo eles mapearam um pseudogene humano de TARBP2 (TARBP2P) no 8q22-qter e o gene Tarbp2 no camundongo no cromossomo 15.
SEE ALSO
Gatignol et al. (1996)
Sequential steps in Tat trans-activation of HIV-1 mediated through cellular DNA, RNA, and protein binding factors.Gatignol A, Duarte M, Daviet L, Chang YN, Jeang KT.Unité 332 INSERM, Institut Cochin de Génétique Moléculaire, Paris, France.The regulation of HIV expression is controlled by the activity of the Long Terminal Repeat (LTR). Trans-activation by the virally encoded Tat protein is one of the main mechanisms of LTR activation. Tat binds to its target, TAR RNA, and cellular proteins that bind the LTR, Tat, or TAR RNA are important components of the trans-activation process. We will review the factors that have been characterized for a possible involvement in this mechanism. Whereas LTR binding proteins consist of Sp1 and TBP, a large number of factors that bind TAR RNA have been isolated. We have previously cloned two of them by RNA probe recognition: TRBP and La. We have shown that the in vitro and in vivo binding of TRBP to TAR RNA correlates with a constant expression of the protein during HIV-1 infection. Several proteins that interact with Tat have mainly positive, but some negative, effects on trans-activation. Genetic studies have defined that human chromosome 12 encodes a protein that will allow trans-activation in rodent cells. The binding and the functional data about these proteins suggest sequential steps for the Tat trans-activation mechanism. Each of these intracellular molecular events could be the target for molecular intervention against the virus.
A regulação da expressão do HIV é controlada pela atividade do Longo Terminal de Repetição (LTR). A transativação pela proteína viral codificada Tat é um dos mais importantes mecanismos de ativação do LTR. Tat liga-se a seu alvo, TAR RNA, e as proteínas celulares que ligam LTR, Tat ou TAR RNA são importantes componentes do processo de transativação. Nós revisaremos os fatores que têm sido caracterizados por um possível envolvimento neste mecanismo. Enquanto proteínas de ligação ao LTR consisem de Sp1 e TBP, um largo número de fatores que ligam TAR RNA têm sido isolados. Nós temos dois deles previamente clonados através da prova RNA de reconhecimento: TRBP e La. Nós temos demonstrado que a ligação do TRBP ao TAR RNA “in vitro” e “in vivo” são correlatos a uma constante expressão de proteínas durante a infecção por HIV-1. Várias proteínas que interagem com Tat tem efeitos positivos na transativação, mas, algumas, negativo. Estudos genétcs tem definido que o cromossomo 12 humano codifica uma proteína que permitirá a transativação em células de roedores. A ligação e os dados funcionais sobre estas proteínas sugerem passos seqüenciais para o mecanismo de transativação de Tat. Algum desses eventos moleculares poderia ser objetivo de intervenção molecular contra o vírus.

Capítulo Iv do livro – HIV-1: MOLECULAR BIOLOGY AND PATHOGENESIS. VIRAL MECHANISMS, 2ND EDITION
Kuan-Teh JEANG
Ed. Advances in Pharmacology

A TRANSCRIÇÃO DO HIV: A PROTEÍNA Tat E A CROMATINA CELULAR
ANNE GATINOL

(Tradução: Isabela Matheus)

Visão Geral do Capítulo

O pró-vírus do vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1) é integrado para dentro da cromatina celular e é estruturado nos nucleossomos (OBS: nucleossomo é o conjunto do nucleotídeo junto à histona, a proteína que compõe a cromatina, um trilho de histonas se liga à fita de DNA e torna o cromossomo compacto). Os nucleossomos precisam estar desdobrados para permitir o início da transcrição. O remodelamento inicial do nucleossomo ocorre através de eventos celulares que ativam complexos de remodelação da cromatina (SEQÜÊNCIA DE HISTONAS QUE SE LIGAM À FITAS DE DNA E FORMAM AS DOBRAS, O COMPACTAMENTO DOS CROMOSSOMOS). O transativador do HIV-1, Tat, também recruta alguns destes fatores até o promotor (OBS.: sítio para o reconhecimento de inicialização da transcrição pelo primer, no caso do DNA não é mais o tRNA), incluindo SWI/SNF, a proteína de ligação p300/CREB (CBP), o fator associado ao p300/CBP (PCAF), e hGCN5. A Tat se liga ao fator positivo b de alongamento de transcrição (P-TEFb), composto de Cyclina T1 (CycT1) e da quinase 9 dependente de ciclina (CDK9), e o complexo se liga ao transativador de reação (TAR) RNA . A Tat recruta a proteína de ligação a TATA (TATA BOX É UM SÍTIO DE LIGAÇÃO DO PROMOTOR DE TRANSCRIÇÃO NOS EUCARIONTES, AS PLANTAS E NÓS INCLUÍDOS), o TBP, o TFIIB e o P-TEFb ao promotor para formar um complexo ativo de pré-iniciação (PIC) no qual a CDK9 hiperfosforila o domínio C-Terminal (OBS.:lado da proteína em que há uma carboxila e permite ligação de outro aminoácido, aqui abreviado em CTD) da RNA polimerase II (RNA PII). Este complexo PIC (complexo de pré-inicialização) é competente para disparar a partida e ativar a transcrição de alongamento. A CDK9 (é um domínio de P-TEFb) recrutada por Tat também fosforila o fator indutor de sensibilidade DRB e o fator de alongamento negativo (NELF), o qual converte de fator negativo para fator positivo no processo de alongamento. Esta atividade é preservada da iniciação da transcrição até o final do processo de alongamento.

II – INTRODUÇÃO

A produção do mRNA (RNAmensageiro) do HIV-1 a partir do pró-vírus integrado requer várias etapas que envolvem ambas as proteínas virais e celulares. A cromatina organizada em nucleossomos é transcripcionalmente inativa e requer eventos celulares para disparar o remodelamento da cromatina e o início da transcrição. Uma vez que algum mRNA do HIV-1 é produzido, ele passa por entrelaçamento/ recomposição (OBS.: splicing é o processo de remoção de íntrons do transcrito em RNA que vai maturar em mRNA. No livro “Genética um Enfoque Molecular”: A transcrição produz uma cópia fiel do filamento molde do gene. Isto significa que se o gene contiver íntrons, então o transcrito primário incluirá cópias deles. Entretanto, os íntrons precisam ser removidos, e as regiões de éxons do transcrito ligadas antes que ocorra a tradução. Este processo é chamado recomposição (splicing )... ...(a) os snRNA (small nuclear RNA) estão envolvidos na remoção de íntrons GT-AG. Sabemos há algum tempo que um tipo especial de molécula de RNA está envolvido na remoção de íntrons. Estas moléculas são chamadas de pequenos RNAs nucleares (snRNAs), que não devem ser confundidos com snoRNA e estão envolvidos no processamento de rRNA( snoRNA é smal nucleolar RNA, aquele que fica no nucléolo, a parte do núcleo celular onde são processados os rRNA, que por sua vez são os RNA que compõem os ribossomos). Após o processo de splicing, o vmRNA (RNA mensageiro viral) é exportado para o citoplasma onde é traduzido em Tat (transativador de transcrição), Rev e Nef. Estas duas proteínas Tat e voltam ao núcleo. Tat exerce suas propriedades de transativação usando os fatores de modelação da cromatina e mecanismos específicos que influenciam ambas as transcrições de iniciação e alongamento. Como conseqüência, o mecanismo global da transcrição e transativação por Tat ocorre in vivo pelas etapas seqüenciais de remodelamento da cromatina para o alongamento transcricional que requer o envolvimento de variados componentes celulares.
III- O LTR DO HIV-1 Integrado e a Cromatina Celular

A.O LTR(Long Terminal Repeat) DO HIV-1 integrado é organizado em Nucleossomos

Nucleossomos são compostos de um enrolamento de 146 pares de bases de DNA em volta de uma histona em octâmero (OBS.: um dímero multiplicado por 4?) que constitui o cerne do nucleossomo. A estrutura da cromatina pode ser alterada pelos complexos de modificação da cromatina que facilitam o desenrolamento dos nucleossomos e permitem a transcrição. Alguns complexos são dependentes de ATP e contém proteínas com o domínio da helicase ATPase , como as proteínas das famílias SWI/SNF e ISWI. Elas estão envolvidas no remodelamento do nucleossomo através da alteração da interação entre a histona e o DNA. Outros complexos, compostos de histona acetiltransferases (HATs) e histonas desacetilases (HDACs), modificam a estrutura do nucleossomo pela regulagem da acetilação da histona.
Após o HIV-1 integrar-se como DNA na cromatina celular, o pró-vírus torna-se organizado na forma de nucleossomo. A posição do nucleossomo no 5’LTR (ou do 5’LTR no nucleossomo?) tem sido intensivamente estudada e precisamente definida pela determinação dos sítios de hipersensitividade a nuclease. Nucleossomos são barreiras à transcrição, e o nucleossomo 1 (nuc 1) do HIV-1 (OBS.: o DNA do Hiv-1 fica enrolado em mais de uma histona) integrado previne a reunião do complexo de transcrição. O remodelamento do nucleossomo por complexos dependentes de ATP e complexos de acetilação da histona disparam a transcrição básica do promotor do HIV-1. Então o promotor é regulado por um largo número de ativadores de transcrição que têm acesso aos seus sítios de ligação ao DNA. A despeito da atividade desses fatores, a atividade transcricional básica do HIV é muito lenta e o transativador Tat é necessário para estimular a transcrição do genoma viral.

Continuação do capítulo "HIV, Tat e a Cromatina" de Anne Gatignol
(Tradulção de Isabela Matheus)

B.Complexos Celulares que modificam a Estrutura da Cromatina.

O papel dos complexos de modificação da cromatina é romper a estrutura nucleossômica (nucleossomo é o nucleotídeo ligado à histona) de modo que o DNA torna-se mais acessível para a interação com as proteínas. Esses complexos pertencem a dois grupos principais: os complexos de remodelamento dependentes de ATP que alteram a interação do DNA com a histona e as proteínas que regulam a acetilação da histona.
B.1.Complexos de Remodelação da Cromatina dependentes de ATP

Os complexos de remodelação da cromatina dependentes de ATP consistem de duas a doze subunidades e sua formação comum é aquela em que têm uma subunidade de ATPase (uma subunidade protéica capaz de interagir com ATP). Subfamílias são definidas de acordo com seqüências que não o domínio de ATPase. Nas células humanas, elas são compostas das famílias SWI/SNF, ISWI, e da família NURD. Os complexos SWI/SNF, originariamente encontrados nas leveduras, são representados por dois complexos em que a BRG1 e a hBRM são sub-unidades de ATPase. Ambas as proteínas são envolvidas no remodelamento da cromatina e na indução de genes do músculo. BRG1 também atua como um repressor tumoral. O complexo ISWI foi encontrado na Drosophila (mosca da banana), e o seu homólogo nos mamíferos é SNFL2 em que a SNF2h representa a sub-unidade de ATPase. Os complexos básicos de ISWI podem reunir nucleossomos e estão envolvidos na replicação da heterocromatina (não é transcrita em proteínas, só tem seqüências de repetição) e na repressão transcricional. O complexo NURD combina a atividade de uma ATPase e de HDAC e um membro, Mi-2, que é um autoantígeno específico de dermatomiosite (dermatomiosite é um distúrbio progressivo caracterizado por fraqueza muscular proximal simétrica, com níveis séricos elevados de enzimas musculares e erupção cutânea, típicamente um eritema vermelho-púrpura na face, e edema palpebral e dos tecidos periorbitais; o tecido muscular afetado mostra degeneração das fibras com reação inflamatória crônica; ocorre em crianças e adultos, e nestes últimos, pode estar associada a câncer visceral ou outros distúrbios do tecido conjuntivo. Dicionário Stedman). Os dois primeiros complexos também contribuem para alta organização da estrutura da cromatina.

B.2.HATs (acetiltransferase) e HDACs (desacetilase)

A acetilação da histona atua como um interruptor de ativação/repressão da transcrição através da regulação da acessibilidade do DNA para as proteínas regulatórias. HATs e HDACs catalizam a adição ou remoção de resíduos de acetil em lisinas alocadas no final N‑terminal (ponta da proteína que termina em amina) . Existem três grupos principais da família HATs: as sub-famílias do GNAT ( GCN5 relatado N-acetiltransferase), do p300/CBP, e do MYST . Nas células humanas, o GNAT inclui as proteínas hGCN5 e PCAF. Seus finais C-terminal (terminal carboxila) têm um domínio de bromo que reconhece resíduos de acetil-lisina. A hGCN5 acetila histonas do nucleossomo e é um adaptador transcricional. PACF interage com p300 e CBP e funciona como um coativador em vários processos como miogênese, mediador de ativação do receptor nuclear, e ativação de fatores de crescimento sinalizados. A p300 e CBP são altamente homólogas e são freqüentemente referidas como p300/CBP. Elas estimulam a transcrição de muitos genes pela interação com os fatores de transcrição. A perturbação da atividade de HAT (acetilação) de p300/CBP tem sido associada a muitos tipos de cânceres. A família MYST inclui muitos membros envolvidos no processo tal como a replicação do DNA, reparo de DNA e apoptose (suicídio da célula induzido por quinase). Sua desregulagem tem sido observada na leucemia e no sarcoma associado a hiperativação de histona. Essa família HAT também funciona como fator acetiltransferase (FATs) através da acetilação de lisinas de proteínas que não compõem as histonas, inclusive a proteína Tat transativadora do HIV-1. A acetilação da histona é reversível, e a remoção dos grupos acetil é concretizado pelas HDACs. HDACs são enzimas que catalizam a remoção de grupos acetil dos resíduos de lisina na histona e nas proteínas que não são histonas. Através dessa atividade, elas mediam a repressão transcricional e o silenciamento. A hiperativação da HDAC é ligada a gênese tumoral e ao desenvolvimento do câncer, e os inibidores de HDAC são agentes anticancerígenos em potencial.

C. O Complexos de Modelação da Cromatina e o LTR (long terminal repeat) do HIV-1

A interação do DNA do HIV-1 não está num sítio específico (OBS.: não para todas as variantes do HIV-1, ver adiante o item IV.A), e embora ele se integre preferencialmente em unidades com transcrição ativa, o meio ambiente do cromossomo influencia o nível de atividade de transcrição básica. Quando a transcrição está inativa, a transcrição básica do promotor do HIV-1 pode ser aumentada pela ativação de uma citocina ou de ésteres forbóis que remodelam nucleossomos. Especificamente, a ativação por acetato de forbol miristado (PMA) (OBS.: ácido mirístico é um ácido graxo saturado presente na forma de um acilglicerol no leite, em gorduras vegetais, no óleo de fígado de bacalhau e em ceras. Dic. Stedman) desestabiliza o nuc 1 (nucleossomo 1) do HIV-1. Na ativação do PMA, o fator de transcrição ATF3 liga-se ao sítio de ligação de AP1 no nucleossomo de fronteira e então recruta SWI/SNF. O seguinte tratamento com acetato de forbol tetradecanoil (OBS.: 12-0-Tetradecanoyl phorbol 13 – acetate = TPA; ou, 13-acetato de 12-0-tetradecanoilforbol é um éster duplo de forbol encontrado no óleo de cróton (um arbusto ornamental ; dic. Aurélio) ; é um co-carcinógeno ou promotor de tumor. Dic. Stedman) , aumentou a acetilação da histona e o recrutamento de PCAF, CBP e de hGCN5 e induziu uma alta acessibilidade do DNA no nuc 0 (nucleossomo zero), nuc 1 e nuc 2. Portanto, os complexos de remodelamento da cromatina atuam como um primeiro estágio no pró-vírus integrado para desestabilizar a estrutura do nucleossomo e permitir a transcrição basal. Depois de ser produzido uma quantidade inicial em RNA, a TAt é sintetizada e recrutará mais fatores de remodelamento da cromatina.

Continuação do capítulo "HIV, Tat e Cromatina" de Anne Gatignol
(Tradução de Isabela Matheus)

D. Tat e os Complexos de modelação da Cromatina dependentes de ATP

Dados recentes mostraram que Tat também interage com os complexos de remodelação da cromatina dependentes de ATP. Tat imunoprecipita (OBS.: imunoprecipitação é o fenômeno de agregação de antígenos sensibilizados após a adição de anticorpo específico (precipitina) ao antígeno em solução. Dic.Stedman) com BRM e BRG-1, partes da ATPase do complexo SWI/SNF, e com a INI-1 e β-actina do cerne deste componente. A Tat recruta esses fatores para o LTR do HIV-1 como é demonstrado por imunoprecipitação da cromatina (ChIP – obs.: esta abreviatura será usada novamente no texto) que abrange o nuc 1 da seqüência de DNA. Este dado sugere que a Tat transporta o complexo SWI/SNF para o nucleossomo para logo aumentar suas propriedades transativadoras. A transativação por meio de Tat é reduzida pelo decréscimo de BRM, BRG-1, ou da expressão de INI-1 e aumentada pela expressão em excesso de BRM ou INI-1. A atividade desses três fatores é semelhante em diferentes etapas, visto que BRM interage somente com Tat não acetilada. A INI-1 ativou o LTR EM CINERGIA COM Tat e p300, mas não com a mutação Tat K50, 51R. Os três fatores contribuem para o recrutamento do complexo SWI-SNF para o promotor do HIV, para desestabilização do nuc-1, e para o crescimento da transcrição do HIV-1.

E.Tat e HAT

TIP60 foi originalmente isolada como uma proteína de interação de Tat que estimula a expressão do LTR do HIV-1. Foi demonstrado mais tarde que ela acetila histonas específicas, pertence à sub-família MYST da família HAT, e atua como uma enzima multifuncional. Tat modifica a atividade de TIP60 em MnSOD e media sua ubiquitinação (obs.: ubiquitina é uma proteína pequena de 76 resíduos de aminoacil encontrada em todas as células dos organismos superiores e cuja estrutura sofreu modificação mínima na história evolutiva; é envolvida em , pelo menos, dois processos: modificação da histona e decomposição de proteínas intracelulares. Dic.Stedman) e degradação indicando que a proteína viral interfere com os processos celulares, mas Tip60 não modificou a transativação de Tat. O fator TBP associado (TAFs) TAFII250 é também uma HAT e liga-se à Tat. Essa associação media a repressão por Tat de alguns promotores incluído do complexo MHC de classe I (OBS.: “Os peptídeos gerados em vesículas ácidas ligam-se às moléculas classe II do MHC recentemente sintetizadas, enquanto os peptídeos gerados no citoplasma ligam-se às moléculas classe I do MHC recentemente sintetizadas. “ trecho do capítulo 8 do livro Imunologia, de Eli Benjamini, Richard Coico e Geofrey Sunshine, quarta edição.) Outras HATs ligam-se à Tat, mediam sua acetilação, e aumentam sua atividade transativadora no LTR do HIV-1. São elas : p300/CBP, PCAF e hGCN5.



IV- A Proteína Tat do HIV-1 e suas Modificações

A.A Proteína Tat.

O transativador do HIV-1 Tat é uma proteína de 14kDa codificada por dois éxons. O éxon 1 codifica do 1o ao 72o aminoácido e o éxon 2 codifica do 73o aminoácido ao 86o ou do 73o ao 101o, dependendo das fitas do vírus. A Tat pode ser dividida em cinco domínios:
- domínio 1 (aa 1-20) é localizado no terminal N; mutações nesta região não modificam a transativação em larga extensão;
- domínio 2 : tem sete cisteínas altamente conservadas, o que é importante para a função de Tat;
- domínio 3 (aa 40-48) ou cerne, é essencial para a transativação; nesta região, uma única mutação no K41 aboliu a atividade de Tat (obs.: aa é aminoácido);
- domínio 4 (aa 49-72) contém uma distensão rica em arginina, a qual media a ligação comRNA e a localização nuclear.

Os três primeiros domínios (aa 1-48) representam o domínio de ativação de Tat que funciona como um transativador quando ligado à região IV ou o domínio de ligação RNA/DNA heterólogos. Tat 66 (com 66 aminoácidos) é o suficente para a total transativação. O domínio V, codificado pelo segundo éxon, contribui para a infectividade viral e para outras funções de Tat. Em contraste a outros transativadores conhecidos, Tat atua através de um alvo de RNA chamado TAR localizado na região R do LTR. Para esta função, Tat recruta uma quinase celular que fosforila o CTD (domínio C-Terminal) de RNAPII, o qual dispara a partida da polimerase, a remoção do promotor e o alongamento eficiente. Na transativação do promotor do HIV-1 mediada por Tat, o recrutamento de proteínas celulares e a modificação pós-tradução de Tat por várias enzimas são cruciais para sua função.

B.Proteínas de ligação a Tat

Muitas proteínas de ligação a Tat têm sido isoladas e caracterizadas por seus papéis na transativação mediada por Tat. A interação entre Tat e o TBP, TFIIB, TFIIH, Sp1 e TAF55 sugere um direto envolvimento de TAt nos estágios iniciais da transativação durante a formação do PIC.
O fator melhor caracterizado que liga Tat é o P-TEFb que foi primeiro caracterizado como quinase associada a Tat. P-TEFb é um complexo composto de uma ciclina T e da CDK9. A Tat interage muito fortemente com CycT1 (ciclina T1) mas não com a CDK9. Em contraste, CycT1 interage com ambas Tat e CDK9 para formar o complexo ativo Tat-CycT1-CDK9.
Na ausência de Tat, P-TEFb existe na célula como um grande complexo inativo composto das proteínas 7SK snRNA e MAQ1/HEXIMI. Quando recrutado para o promotor, P‑TEFb fosforila as serinas da RNAPII CTD, a sub-unidade SPT5 da proteína DSIF, e a sub-unidade RD da proteína NELF resultando numa hiperfosforilação da RNAPII CTD por toda parte da transcrição em anlongamento.

C. Modificação de Tat
1. Acetilação de Tat

A ligação de Tat ao RNA de TAR e sua liberação são regulados pela acetilação por HATs. PCAF acetila Tat no K28 (lisina 28), mas esta acetilação libera PCAF de Tat. P300/CBP e hGCN5 acetilam Tat em K50 (lisina 50) e K51. Adicionalmente, o domínio bromo de PCAF liga-se especificamente à Ac50Tat e requer Y47 (tirosina 47) e R53 (arginina 53) em Tat. Ac28Tat tem uma afinidade aumentada por CycT1-CDK9, o qual estimula a ligação do complexo Tat-P-TEFb ao RNA de TAR. Em contraste, Ac50Tat ou o complexo Ac50Tat-CycT1 apresenta uma afinidade diminuída em relação a TAR sugerindo uma liberação do complexo Tat-P-TEFb de TAR.
Tat pode ser também desacetilada pela atividade de HDAC Sirtuin 1 (pesquisar no OMIM). A evidência de que a acetilação de TAt é importante para a transativação chegou do tratamento com inibidores de desacetilação que cinergisam com a função de TAt e as mutações tanto em K28 e K50 que reduzem a transativação de Tat e a replicação do HIV.

2.Fosforilação de Tat

A Tat do HIV-2, mas não a do HIV-1, é fosforilada pela CDK9 que vem a ser autofosforilada sobre o ponto de ligação com Tat. A fosforilação da CDK9 intensifica a lligação de Tat-CycT-CDK9 ao Rna de TAR. Em contraste, um estudo mostra que CDK2 associada com Ciclina E fosforila Tat. Embora a locação precisa do sítio de fosforilação não esteja determinada, ela requer os aminoácidos de 15 a 24 e de 36 a 49 (obs.:de Tat). Um decréscimo na expressão de CDK2 diminui a transcrição do HIV-1 e a produção do vírus. A Tat liga-se a proteína quinase R induzida de interferon (PKR) e inibe sua função como um substrato de competição (OBS.: competição pelo sítio de ligação). Em compensação, a Tat é fosforilada em S62 (serina 62), T 64 (Treonina 64) e S68 (serina 68) pela PKR (proteína quinase R). As mutações nestes sítios reduzem a capacidade de ligação entre Tat e TAR e a transativação do LTR do HIV‑1. Análises mutacionais e expressão decrescida de quinases sugerem uma importância funcional da fosforilação de Tat.

3. Metilação de Tat

A metilação por arginina pela proteína arginina metil metiltransferase (PRMTs) regula varias rotas incllusive de expressão de genes. A PRMT6 interage com e metila a Tat do HIV-1. Essa metilação ocorre na região entre os aminoácidos 49 e 63, a qual contém seis argininas. A expressão excessiva da proteína PRMT6 decresce o nível de LTR do HIV-1 transativada por mediação de Tat, visto que a expressão reduzida da enzima (PRMT6) incentiva a produção viral, sugerindo que a metilação de Tat inibe sua atividade.

4. Ubiqüinização de Tat

Uma proteína ubiquitina ligase, a proto-onco-proteína Hdm2, liga-se à Tat e media sua ubiquitinação nos aminoácidos Lys 71. Entretanto, essa modificação não torna Tat um alvo do proteossomo (ubiquitina) para degradação, mas antes estimula a transativação mediada por Tat.
As diferentes modificações descritas anteriormente, todas têm uma importância funcional na função de Tat para diferentes extensões. Por que a Tat truncada para 66 aminoácidos) mantém toda sua atividade de transativação, modificações no C-Terminal e similares afetam a transativação marginalmente ou indiretamente, mas influenciam primariamente outras funções de Tat. Adiantados estudos sobre estas modificações nas várias funções de Tat ajudarão a elucidar seus papéis específicos, mas alguns tem sido desde já implicados precisamente nas etapas de transativação mediadas por Tat “in vivo”.

Continuação do capítulo "HIV, Tat and Chtomatin" de Anne Gatinol
(Tradução de Isabela Matheus)


V- Transativação Mediada por Tat

Um modelo dinâmico in vivo para a transativação mediada por Tat tem que incluir dados da repressão transcricional do LTR do HIV-1 cromatinizado desde o início ao final do alongamento transcricional e o papel de Tat em cada etapa.
A.A produção inicial do mRNa de HIV-1

Após sua entrada na célula, o HIV-1 em RNA é reversamente transcrito para a forma de DNA que se move para o núcleo via complexo de pré-integração e torna-se integrado na cromatina celular. O LTR do HIV-1 integrado é transcripcionalmente inativo devido a formação de nucleossomos como demonstrado na proximidade do promotor. Nucleossomo desdobrado é um pré-requisito para qualquer iniciação transcricional e esse mecanismo é realizado pelos complexos de remodelação da cromatina que modificam as interações entre a histona e o DNA. Esses complexos são tanto ativados por citocinas, por quimiocinas, por vários eventos celulares, ou podem ser recrutados pela proteína Tat após sua produção. Se este primeiro estágio foi alcançado por Tat, Tat teria que ser incorporada para dentro das partículas virais, liberada no citoplasma, e redirecionada para o núcleo para exercer sua atividade. Contudo, a proteína Tat não tem sido observada no vírion nem no complexo de pré-integração, e nós não temos evidêcias de sua atividade durante os primeiros estágios de replicação do HIV. Dados recentes que detectaram um peptídeo Tat dentro do vírion do HIV-1 podem mudar esta visão, mas há estudos na expectativa de quantificar e analisar a relevância funcional desse achado. Portanto, é mais aceitável que a formação inicial de uma abertura na cromatina na região do LTR do HIV-1 seja mediada por eventos intracelulares ou extracelulares tais como ativação de citocinas ou rotas de sinal de tradução que ativarão os complexos de remodelação dos nucleossomos para reduzir a interação entre a histona e o DNA e ativar a transcrição Esses eventos dispararão a iniciação transcricional e a formação de alguns mRNAs que iniciam com TAR RNA. Algumas proteínas de Tat poderão então ser produzidas e serão transportadas para o núcleo. Este exercerá sua função no complexo de modificação da cromatina e suas propriedades de transativação no núcleo.

B. A Atividade de Tat nos complexos de Modificação da Cromatina

Os estágios seguintes na atividade de Tat são exercidos tanto pelas novas Tat sintetizadas ou por Tat secretadas que tenham entrado numa nova célula. Tat não modificada liga-se ao BRM, a subunidade de ATPase do complexo SWI-SNF, e o complexo contribui para o remodelamento do nuc 1 e ativação do promotor. A acetilação de Tat no aminoácido K50 (Lisina 50) previne a ligação Tat-BRM sugerindo uma atividae antes da associação entre Tat e p300/CBP e hGCN%. Não é sabido se esse recrutamento ocorre independentemente de TAR ou quando Tat é ligada à TAR ou a CycT1. Considerando que o nuc 1 abrange a seqüência de DNA codifocadora de TAR, se o DNA for completamente estruturado em nucleossomos, nenhuma TAR estará presente, mas se uma pequena parte da cromatina não é compactada, alguma ligação de TAR-Tat ajuda a levar o complexo aos arredores do nuc1 (nucleossomo 1). O remodelamento do nuc 1 (nucleossomo 1) favorece a acessibilidade ao DNA por complexos de transcrição.





C. A Formação do complexo RNA de TAR-Tat-CycT1-CDK9

A ligação de Tat ao TAR (RNA) e sua liberação é altamente regulada por modifcações de Tat e sua afinidade com CycT1-CDK. A recém formada Tat liga-se à PCAF, o que produz Ac28Tat que tem afinidade aumentada para CycT1 já ligada à CDK9. Tat pode cooptar P-TEFb de seu depósito inativo no 7SK snRNA-MAQ1/HEXIMI1 ou ligar-se a formas livres de P-TEFb presentes no citoplasma. Tat ligada a SWI-SNF pode também ligar P-TEFb para transportar o complexo protéico de modelação para a proximidade do nucleossomo 1. PCAF tem uma diminuída afinidade para Ac28Tat, a qual induzirá à dissociação do complexo. O complexo Ac28Tat-CycT1-CDK9 tem uma crescente afinidade com TAR e liga-se à pequena qualidade de nascente TAR RNA presente na célula. Devido a sua afinidade com Tat, p300/CBP e hGCN5 são recrutados neste sítio e acetilam Tat no K50 (nucleotídeo Lisina 50) e K51. Por que Ac50Tat tem diminuída afinidade por TAR, o p300/CBP-Ac50Tat-P-TEFb é liberado de TAR e transferido para o próximo PIC (complexo de pré-inicialização) no promotor. É possível que esta dissociação de TAR também favoreça uma transferência de Tat-SWI/SNF para o nuc1 (nucleossomo 1) para abrir a cromatina. Alguns modelos, principalmente baseados em estudos “in vivo”, favorecem a transferência do complexo Tat-CycT1-CDK9 de TAT para o complexo de alongamento intervalado após TAR, mas dados recentes da análise dos fatores recrutados por Tat no promotor podem ser explicados pela transferência do complexo Tat-CycT1-CDK9 de TAR para o PIC (complexo de pré-inicialização) transcricional.

D. A Atividade de Tat no PIC

O papel de TAt no PIC tem sido deduzido de estudos iniciais e substanciado por estudos recentes de modelos “in vivo”. Os primeiros estudos demonstraram que a TAt liga-se ao TBP, TFIIB e TAF55, os quais são parte do PIC. Uma interação direta com TFIIH tem também sido descrita, mas não encontrada por outros. Ensaios quinéticos mostraram uma rápida ação de Tat antes de TAR ser produzida, e ensaios funcionais indicam que Sp1 e NF-kB intensifica a transativação.
Vários dados têm mostrado que a Tat e o complexo P-TEFb estão presentes em ambos PIC e complexo de transcrição de alongamento (TEC). Experimentos com ChIP (imunoprecipitação da cromatina) têm mostrado que Ac50Tat ou Ac50/51Tat, mas não a Tat não-acetilada, está associada ao promotor do HIV‑1 “in vivo”, o qual está a favor de sua transferência de TAR para PIC após a acetilação por p300/CBP. Experimentos adicionais com ChIP demonstram que p300, CBP, NF-kBp65, e PCAF são recrutadas primitivamente do promotor do HIV-1 sobre a ativaão de Tat “in vivo”. Quando o recrutamento geral de fatores de transcrição para o promotor foi analisado por ChIP, o TBP e o TFIIB foram recrutados por TAt, mas não o TFIID como nenhuma TAF foi detectada no promotor CycT1 ou CDK9 mostram a mesma atividade indicando que ativadores que funcionam via P-TEFb promovem a reunião do complexo de transcrição com TBP e não com TFIID. Consistente com a ligação de Ac50Tat a sua subunidade BRG1 ou a subunidade INI, SWI/SNF também é recrutado por Tat para a região da cromatina que engloba o promotor e o nuc 1 (nucleossomo 1). Sobretudo, esses dados indicam que o complexo Tat-CycT1-CDK9 ligado a TAR recruta TBP e TFIIB para a reunião do complexo de pré‑inciação (PIC), assim como HATs e SWI/SNF para a dissociação do DNA com a histona. O remodelamento do nucleossomo permite a progressão de um competente alongamento pelo complexo de transcrição.

E. A Atividade de Tat no Complexo de Alongamento.

A atividade de Tat no complexo de alongamento foi clarificado durante os últimos anos e é mediado pela atividade de recrutamento do P-TEFb por Tat. Por que nenhuma evidência direta “in vivo” de um RNAPII (Polimerase II de RNA) atrasado na ausência de Tat tem sido observado em ensaio de imunoprecipitação (ChIP), é muito aceitável que a atividade de Tat na transcrição de alongamento seja uma conseqüência direta da formação de um PIC altamente competente pelo recrutamento de Tat-P-TEFb. O PIC recruta primeiro TFIIH, cuja quinase CDK7 fosforila o RNA-PIICTD em Ser 5 (serina 5). Esta etapa é independente de Tat e permitiu a síntese de aproximadamente 15 nucleotídeos pela polimerase. Uma atividade coordenada entre CDK7, lançada após o intervalo do décimo-quarto ao trigésimo-sexto nucleotídeos (14‑36 nts) e CDK9 provocada por Tat no PIC leva à hiper-fosforilação do CTD de RNAPII (Domínio C-Terminal da RNAPII assim como múltiplas fosforilações serão mantidas por toda extensão de todo o alongamento pela atividade de CDK9 no complexo Tat-P-TEFb.
O alongamento transcricional é inibido pela atividade de NELF e pela DSIF que reprime a fosforilação do C-Terminal de RNAPII. Em humanos, DSIF é composta de SPT e SPT5, enquanto NELF é um complexo contendo cinco (5) subunidades (NELF A para E: A, B, C, D e E) em que NELF-E é uma proteína de ligação a RNA. Esta inibição não afeta a RNAPII cujo CTP foi fosforilado por P-TEFb, indicando que a função primária da CDK9 no P-TEFb é para aliviar os efeitos de DESIF e NELF.
O recrutamento de P-TEF b por Tat no PIC promove a hiper-fosforilação do CTD da RNAPII pela CDK9, portanto evita que DSIF e NELF ajam contra uma transcrição de alongamento efetiva. SPT5 também funciona como regulador positivo da transcrição de alongamento no contexto da transativação mediada por Tat do HIV-1. SPT5 é fosforilada pela CDK9 durante o alongamento e este mecanismo transforma sua atividade negativa numa função positiva. SPT5 também é metilada por PRMT1 e PRMT5, mas esta modificação pode tanto estimular ou reprimir a expressão gênica do HV-1 pela troca da associação de SPT5 com a RNAPII.
A NELF reprime a transcrição por ligação ao complexo DSIF-RNAPII e ao RNA. A subunidade RD/NELF de NELF é também fosforilada por CDK9, a qual modifica suas propriedades de ligação ao RNA e evita sua atividade repressiva. Essas modificações em SPT5 e NELF pela CDK9 criam um “interruptor” de repressão e ativação transcricional, instensificando a atividade de CDK9 na fosforilação do CTD da RNAPII. Esta função é confirmada por estudos com pequenos RNAs de intererência (siRNAs) em contraste/oposição a CDK9 e SPT5, ao quais mostraram que estes são requeridos para a transativação de Tat e a replicação do HIV1. Estudos suplementares ajudarão a compreensão total de sua atividade temporal na regulação da transcrição de alongamento do HIV-1.

V. Conclusão

Os mecanismos moleculares que levam à atividade transcricional do HIV-1 integrado ao DNA têm sido elucidados em grande parte. Tat contribui para várias etapas do início do remodelamento da cromatina ao fim da transcrição de alongamento pelo recrutamento de um grande número de fatores celulares. Algumas discrepâncias ainda permanecem entre vários investigadores, que favorecem mais à inicialização transcricional ou ao alongamento dependendo dos ensaios experimentais, mas o modelo “in vivo” agora atingiu um consenso. Todos os estudos têm contribuído para a elucidação das diferentes etapas “in vivo” da transcrição e da transativação com recrutamento por Tat de fatores específicos em cada etapa. Estudos futuros continuarão a decifrar esse complexo de interações entre o vírus e seu hospedeiro.

Página do site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim

300346 HIV-1 TAT STIMULATORY FACTOR 1; HTATSF1
Alternative titles; symbols
TATSF1
TEXT
DESCRIPTION
Whereas most DNA sequence-specific transcription factors increase the rate of initiation and interact with enhancer or promoter DNA, human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) Tat predominantly stimulates elongation and interacts with the trans-acting responsive (TAR) RNA element. Tat is essential for HIV replication.
Enquanto a maioria dos fatores de transcrição de seqüências específicas de DNA expandem a taxa de iniciação e interagem com intensificação ou promotor de DNA, a Tat do vírus 1 da imunodeficiência humana (HIV-1) predominantemente estimula o alongamento e interage com a trans-ativação do correspondente elemento TAR (RNA). A Tat é essencial para a replicação do HIV.
CLONING
By functional and biochemical purification of a Tat stimulatory factor, followed by microsequence analysis and screening of a monocyte cDNA library, Zhou and Sharp (1996) isolated a cDNA encoding HTATSF1. Sequence analysis predicted that the HTATSF1 protein has 754 amino acids. The N-terminal half of HTATSF1 contains 2 RNA-recognition motifs homologous to those in Ewing sarcoma protein (EWS; 133450) and FUS/TLS (137070), while the C-terminal half is rich in acidic amino acids, particularly glutamate and aspartate, and has several potential serine phosphorylation sites. Northern blot analysis revealed expression of a 3.0-kb HTATSF1 transcript in several cell lines. Immunoblot analysis showed that HTATSF1 is expressed as a 140-kD phosphoprotein in numerous cell types, suggesting that HTATSF1 may mediate a broadly active cellular process in addition to its essential role in Tat activation. Binding analysis showed that HTATSF1 weakly associates with TAR RNA. The association with TAR RNA was substantially enhanced by the presence of Tat.
Através da purificação functional e bioquímica de um fator de estímulo de Tat, seguido de análises de microseqüências e teste de monócito de uma biblioteca de cDNA, Zhou e Sharp (196) isolaram um cDNA codificador de HTATSF1. A análise da seqüência prognosticou que a proteína HTATSF1 tem 754 aminoácidos. O N-Terminal até a metade de HTATSF1 contém dois motivos homólogos de reconhecimento de RNA para a proteína do sarcoma de Ewing e para FUS/TLS, enquanto a metade C-Terminal é rica em aminoácidos acídicos, particularmente o glutamato e o aspartato, e tem vários sítios de serinas com potencial para fosforilação. Análises do teste do borrão ao norte (transferência de “northern”, explicação no final do texto) revelaram a expressão de um transcrito de HTATSF1 de 3.0-kb (quilolobites) em várias linhagens de células. Análises de immunoblot (marcadores imunológicos, explicação no final do texto) mostraram que a HTATSF1 é expressada como uma fosfoproteína de 140 kD (quilodaltons) em numerosos tipos de células, sugerindo que HTATSF1 pode mediar um amplo processo de atividade celular em acréscimo a seu papel essencial na ativação de Tat. Análises de ligações demonstraram que HTATSF1 associa-se debilmente com TAR RNA. A associação com TAR RNA foi substancialmente intensificada pela presença de Tat.

MAPPING
The International Radiation Hybrid Mapping Consortium mapped the HTATSF1 gene to the X chromosome (stSG31436). Ver a localização ao final do texto.
GENE FUNCTION
Fong and Zhou (2001) demonstrated that splicing factors function directly to promote transcriptional elongation. The spliceosomal U small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) interact with human transcription elongation factor TAT-SF1 and strongly stimulate polymerase elongation when directed to an intron-free HIV-1 template. Fong and Zhou (2001) suggested that this effect is likely to be mediated through the binding of TAT-SF1 to elongation factor P-TEFb (603251, 602506). Inclusion of splicing signals in the nascent transcript further stimulates transcription, supporting the notion that the recruitment of U snRNPs near the elongating polymerase is important for transcription. Because the TAT-SF1--U snRNP complex also stimulates splicing in vitro, Fong and Zhou (2001) proposed that it may serve as a dual-function factor to couple transcription and splicing and to facilitate their reciprocal activation.
Fong e Zhou (2001) demonstraram que fatores de corte por splicing funcionam para promover o alongamento functional. Os spliceosomos (estruturas especializadas que participam na remoção de íntrons e reunião dos éxons remanescentes do mRNA; além da transcrição primária do mRNA, pelo menos quatro RNA nucleares pequenos (snRNA) e algumas proteínas estão envolvidos. Dic Stedman) U pequenas ribonucleopriteínas nucleares (snRNPs) interagem com o fator de transcrição de alongamento humano TAT-SF1 e estimulam fortemente o alongamento da polimerase quando dirigidos a um íntron livre para o padrão do HIV-1. Fong e Zhou (2001) sugeriram que este resultado é provável por ser mediado através da ligação de TAT-SF1 ao fator de alongamento P-TEFb. A inclusão de sinais de splicing no transcrito nascente estimulou ainda mais a transcrição, fundamentando a noção de que o recrutamento de U snRNPs para perto do alongamento da polimerase é importante para a transcrição. Por que o complexo TAT-SF1—UsnRNP também estimulam o splicing “in vitro”, Fong e Zhou (2001) propuseram que isto serva com um fator de dupla função para transcrição emparelhada e splicing e para facilitar sua ativação recíproca.
OBS.:
A técnica “Transferência de Northern” é, para as moléculas de RNA, a mesma técnica desenvolvida em 1975 por E.M.Southern, chamada “Transferência de Southern”, ou Southern-blot que é uma transferêcia de segmentos da dupla fita de DNA clivada no ambiente de um gel de agarose para uma membrana de náilon ou nitrocelulose (ou papel). Essa membrana contendo os segmentos será mergulhada no gel de agarose e os segmentos de DNA ligam-se a ela. A finalidade é inserir uma sonda (é uma seqüência complementar ao gene, produzida a partir de um clone do gene procurado, e que é previamente marcada por hibridização, ou seja, contém uma seqüência suplementar para que possa ser identificada por um anticorpo), permitindo seu mapeamento, ou localização no plasmídio ou no cromossomo. (Livro consultado “Clonagem Gênica e Análise de DNA, uma Introdução. Cap 10. Pg 206, T.A.Brown)
IMUNOBLOT : processo que permite a separação de antígenos por eletrosforese, que aderem às camadas de nitrocelulose, onde se ligam de modo inespecífico e, a seguir, são identificados por coloração com anticorpos apropriadamente marcados. (dic. Stedman)


UniSTS:10313 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/sts.cgi?uid=10313
RH48850
Homo sapiens chromosome X, locus HTATSF1
Macaca mulatta chromosome X, locus LOC693589
Pan troglodytes chromosome X, locus LOC465882
Found by e-PCR in sequences from Homo sapiens and Pan troglodytes.

Primer Information


Forward primer:
ACTCTTTTGTGGGGCCAAC
Reverse primer:
AGGCAATCCCGTAAGAGGAT
PCR product size:
155 (bp), Homo sapiens


Homo sapiens

Warning! This marker matched more than 2 locations on contig(s) by e-PCR.
Name:
RH48850
Also known as:
stSG31436

Cross References


Gene
GeneID:
27336

Symbol:
HTATSF1

Description:
HIV-1 Tat specific factor 1

Position:
Xq26.1-q27.2
UniGene
Hs.204475
HIV-1 Tat specific factor 1
RHdb
RH48850
Mapping Information


RH48850
Sequence Map:
Chr X
Map Viewer

Position:
135421031-135421185 (bp)

RH48850
Sequence Map:
Chr XCelera

Position:
135957006-135957160 (bp)

stSG31436
GM99-GB4 Map:
CrX

Position:
320.11 (cR3000)

Lod score:
1.59

Reference Interval:
DXS1047-DXS998 (150.3-183.8 cM)