*129010 EARLY GROWTH RESPONSE 2; EGR2
Alternative titles; symbols
KROX20
Lócus gênico mapeado 10q21.1-q22.1

TEXTO

CLONAGEM

Usando hibridização de baixa rigidez com uma prova de cDNA de EGR1(omim 128990), Joseph e outros (1988) identificaram um cDNA humano distinto, designado EGR2 (para gene de resposta de crescimento primária 2), o qual está regulado com a EGR1 por mitógenos de fibroblastos e linfócitos; entretanto, vários estímulos que induzem o mRNA de EGR1 nas células de feocromocitoma [cromafinoma funcional, geralmente benigno, derivado de células do tecido medular supra-renal e caracterizado pela secreção de catecolaminas (catecolaminas são compostos derivados do aminoácido tirosina. As catecolaminas são solúveis em água, e 50% circulam no sangue ligadas a proteínas plasmáticas. As catecolaminas mais abundantes são a adrenalina, noradrenalina e dopamina. Como hormônios, são libertadas pela glândula supra-renal em situações de stress psicológico ou hipoglicemia. Wikipédia), resultando em hipertensão arterial. Stedman] do rato não induzem o mRNA de EGR2. A sequência de cDNA prediz uma proteína de 406 aminoácidos, incluindo três dedos de zinco seguidos da classe cis(2)-his(2). As sequências de aminoácidos deduzidas da ER2 humana e da Egr1 do camundongo são 92% idênticas na região dos dedos de zinco, mas não apresentam similaridade em nenhum outro ponto.

ESTRUTURA DO GENE

Chavrier e outros (1989) mostraram que no camundongo, o splicing alternativo da maior parte do íntron da extremidade 5 do gene Krox20 enseja a codificação de mRNAs de supostas proteínas de dedos de zinco com diferentes terminais na ponta de amina. O primeiro éxon contém um elemento sequencial com forte similaridade com o elemento de resposta ao proto-oncogene FOS no soro (SRE). Esse elemento (do éxon) pode substituir funcionalmente o SRE de FOS, e ele se liga à mesma proteína nuclear. Ele é provavelmente responsável pela indução do Krox20 por soro, possivelmente em combinação com o SER mais fraco localizado na região flanqueadora do início em 5 do gene. O gene FOS, Krox20, e um número de genes de respostas iniciais de imediato do soro parecem ser co-regulados.

MAPEAMENTO

Por uma combinação de análises de Southern de DNA de células somáticas híbridas de camudongo e humanas e por hibridização em sítio, Joseph e outros (1988) maperaram o gene EGR2 em 10q21-q22. Wu e outros (1988) demonstraram um polimorfismo de HindIII (deve ser um polimorfismo na sequência de reconhecimento pela enzima de restrição HindIII do gene) do EGR2; usando esse polimorfismo, eles confirmaram a localização da EGR2 no 10q. Chavrier e outros (1989) mapearam o gene do camundongo (ao qual eles se referiram com Krox20) na banda B5 do cromossomo 10 e o gene homólogo humano no cromossomo 10q21.1-q22.1, ambos por hibridização em sítio.

FUNÇÃO DO GENE

Usando procedimento de expressão de micro-seriação (microarray), Nagarajan e outros (2001) identificaram 98 genes conhecidos que foram induzidos pela Egr2 em células de Schwann. Os supostos genes alvejados pela Egr2 incluíram proteínas e enzimas da mielina [material lipoproteináceo, composto de membranas alternadas regulares de lamelas lipídicas (colesterol, fosfolipídeos, esfingolipídeos, fosfatidatos) e proteína, da bainha de mielina. Stedman] requeridas para a síntese de lipídeos normais da mielina. Usando RT-PCR para monitorar a expressão do gene nas células de Schwann, Nagarajan e outros (2001) confirmaram que a Egr2 é suficiente para indução de genes alvo incluindo MPZ (159440), PMP22 (601097), MBP (Proteína Básica da Mielina 159430 [Os transcritos relacionados a MBP estão presentes não só no sistema nervoso, mas também na medula óssea e no sistema nervoso. Esses mRNAs são transcritos da região de três éxons, localizados a montante dos éxons clássicos do MBP, e pertencem ao longo gene MBP também chamados ‘Golli-MBP’. O mais abundante desses mRNAs, chamados MBP hemopoiéticos (HMBP), abrange a sequência codificada pela região do iniciador zero-positivo do éxon 1 e parte do íntron 1 do gene MBP clássico. Marty e outros (2002) demonstraram que as proteínas HMBP estão presentes em mais de 95% das células do timo, as quais expressam os transcritos correspondentes, como fazem as células T maduras dos linfonodos e do baço. Os mRNAs e proteínas de HMBP também são manifestados na maioria dos linfócitos B do baço e nas linhagens de células B. Em adição às células linfóides, as proteínas HMBP estão em todos os tipos de linhagens de células mielóides, i.e., macrófagos, células dendríticas, e granulócitos, bem como megacariócitos e eritoblastos. As proteínas HMBP também estão presentes em células CD34(+) da medula óssea. Além disso, em culturas altamente proliferativas, essas células CD34(+) expressam RNAs e proteínas de HMBP. Assim, os produtos do ene MBP estão presentes em ambos o sistema nervoso e em todo o sistema hemopoiético. ]), MAG (159460), CX32 (304040), e periaxina (605725). Usando domínios mutantes de ligação a DNA da EGR2, Nagarajan e outros (2001) demonstraram uma inibição dominante negativa da indução de genes essenciais da mielina mediada pela Egr2 de tipo selvagem. Nagarajan e outros (2001) observaram que a introdução pós-natal da Egr2 dentro de células de Schwann deficientes em Egr2 é suficiente para a indução de genes críticos para a mielinação. Eles hipotetizaram que a função normal das células de Schwan em pacientes com neuropatias periféricas herdadas atribuídas a mutações na EGR2 deveriam ser restauradas pela reintrodução da EGR2.

Matsushima-Nishiu e outros (2001) analisaram os perfis de expressão de células de câncer após a introdução do PTEN (omim 601728) exógeno, um supressor de tumor, e descobriram que a EGR2 foi transcricionalmente transativada. Unoki e Nakamura (2001) mostraram que em ensaios de formação de colônias, a EGR2 foi capaz de suprimir significativamente o crescimento de células de câncer. Oligonucleotídeos anti-senso para EGR2 inibiram efetivamente a sua expressão, e o crescimento celular foi acelerado. Unoki e Nakamura (2001) sugeriram que a EGR2 pode mediar o efeito supressor de crescimento da PTEN.

Usando micro-seriação (microarray), RT-PCR e análises de computador, Safford e outros (2005) descobriram que a Egr2 e a Egr3 (602419) estavam associadas com a indução de anergia em células T do camundongo, como medido pela inibição da produção de Il2 (147680). A Sobre-expressão da Egr2 ou da Egr3 inibiu a produção de Il2 equivalentemente. Embora os camundongos Egr2 -/- tivessem morrido perinatalmente (ao nascer), os camundongos Egr3 -/- eram resistentes à tolerância imunológica induzida por peptídeo. Safford e outros (2005) concluíram que a EGR2 e a EGR3 estão envolvidas na promoção de um programa genético regulatório negativo induzido do receptor de célula T.

Kao e outros (2009) descobriram que camundongos carecendo de calcineurina B1 (CNB1;601302) na crista neural tinham defeitos na diferenciação da célula de Schwann [células de origem ectodérmica, da crista neural, que compõem um envoltório contínuo ao redor de cada fibra nervosa de nervos periféricos; essas células são comparáveis às células da oligodendróglia do cérebro e da medula espinhal; como essas últimas, podem formar expansões membranosas que se enrolam em torno dos axônios e, assim, formar a bainha de mielina do axônio. Stedman] e na mielinação. A adição de neuregulina (NRG1;142445) às precursoras das células de Schwann iniciaram um aumento no íon de cálcio citoplasmático, o qual ativa a calcineurina e os fatores de transcrição subseqüentes Bfatc3 (602698) e Nfatc4 (602699). A purificação dos complexos protéicos Nfat mostraram que a Sox10 (602229) é uma parceira nuclear da Nfat e sinergisa com a Nfatc4 para ativar a Krox20, a qual regula genes necessários à mielinação. Kao e outros (2009) concluíram que a calcineurina e a NFAT são essenciais para a sinalização da neuregulina [Omim 603818 – As neuregulinas são uma família de fatores de crescimento e diferenciação que estão relacionados ao fator de crescimento da epiderme (EGF;131530). Os receptores para as neuregulinas são da família ERBB dos receptores transmembrana de cinase de tirosina, os quais incluem receptor de EGF (EFR;131550), ERBB2 (164870), ERBB3 (190151) e ERBB4 (600543). Através da interação com os receptores RBB, as neuregulinas induzem o crescimento e diferenciação de células epiteliais, neuronais, gliais e outras (Burden e Yarden, 1997). Em particular, as vias de sinalização dos ERBB pela neuregulina atuam em papéis cruciais na proliferação e diferenciação das células de Schwann, das células formadoras da mielina dentro do sistema nervoso periférico. Yamada e outros (2000) clonaram o cDNA de NRG2, ao qual eles chamaram de NTAK, de uma linha célula de neuroblastoma humano, usando um clone de DNA de NTAK como prova. Por PCR de RT, eles identificaram um total de sete isoformas possíveis no cDNA humano e do rato formado por splicing alternativo de sequências similares ao fator de crescimento epitelial e sequências hidrofóbicas. Eles acharam um transcrito de 7 quilobases expressado nas células de neuroblastoma. Ring e outros (1999) clonaram o gene NRG2 e determinaram que ele contém 12 éxons. Yamada e outros (2000) descobriram que os 12 éxons do NRG2 expandem-se por mais de 55 quilobases. Na região promotora, eles identificaram os sítios de ligação a fatores de transcrição TFIII (600860), SP1 (189906), AP2 (107580) e YY1 (600013) bem como sequências box de GC como uma alternativa ao TATA box.] e da ErbB (veja 131550 - [Carlin e outros (1982) mostraram que ambas as proteínas EGFR de 145 e de 165 quilo-dáltons de células A431 ligaram-se a EGF radio-etiquetados, e ambos foram fosforilados na estimulação por EGF. Haley e outros (1987) mostraram que a atividade do promotor de EGFR foi modulada pela proteína E1A do adenovírus. A estimulação com forbol-éster ou soro fetal de veado aumentou os níveis de mRNA de EGFR. Yang e outros (1996) demonstraram que o tratamento com genisteteína (uma isoflavona), um inibidor da atividade de cinase de tirosina, inibiu a fosforilação da tirosina induzida pelo EGF e a deradação do EFR em células HepG2, sugerindo aos autores que a atividade de cinase de tirosina é requerida para tanto a internalização quanto para a degradação dos complexos EGF-AGFR. ]), para a diversificação da crista neural e diferenciação das células de Schwann.

Swanberg e outros (2009) mostraram por análise de imunoprecipitação da cromatina que a EGR2 ligou-se ao promotor da MECP2 (300005) e que a MeCP2 ligou-se à região que salienta o íntron 1 da EGR2. A redução nos níveis de EGR2 e de MeCP2 em células de neuroblastoma humano cultivadas por RNA de interferência reduziu reciprocamente a expressão de ambos o EGR2 e MECP2 e seus produtos protéicos. Amostras do córtex de camundongo deficente em Mecp2 mostraram EGR2 significativamente reduzido por imunofluorescência quantitativa. Além disso, a MeCP2 e a EGR2 mostraram níveis aumentados coordenadamente durante o desenvolvimento pós-natal de ambos córtex de camundongo e humano. Em contraste com controles iguais em idade, as amostras pós-mortem de córtex portadores de síndrome de Rett (Omim 312750) e de autismo apresentaram significativa redução em EGR2. Swanberg e outros (2009) propuseram um papel da desregulação de uma atividade dependente da via ER2-MeCP2 na síndrome de Rett e no autismo.

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=129010

Complexos Imunes do Fator VIII Circulantes em Pacientes com Hemofilia A Adquirida de Tipo 2 e a Proteção à Proteólise Mediada pela Proteína C Ativada

Keiji Nogami, Midori Shima, John C. Giddings, Kazuya Hosokawa, Masanori Nagata, Seiki Kamisue, Hiroshi Suzuki, Masaru Shibata, Evgueni L. Saenko, Ichiro Tanaka, and Akira Yoshioka


RESUMO

Anticorpos inibidores do Fator VIII (FVIII) são classificados em dois grupos de acordo com o padrão cinético da inativação do FVIII. Os anticorpos de tipo 2 são observados mais costumeiramente em pacientes com hemofilia A adquirida e não inibem completamente a atividade do FVIII; na maioria dos casos, níveis substanciais de FVIII circulante são detectados. Três anticorpos de tipo 2 de pacientes que tinham níveis normais do antígeno FVIII a despeito de baixos níveis de atividade do FVIII foram estudados. Os anticorpos reagiram exclusivamente com a cadeia leve do FVIII mas não com o domínio C2, e seus epítopos foram por isso atribuídos a regiões dos domínios A3-C1. As cadeias pesada e leve do FVIII foram detectadas em imuno-complexos derivados do plasma extraídos por uso da sefarose deproteína G. Ensaios de ligação direta usando a proteína C ativada anidro (retirada de água) (anidro-APC), um derivativo cataliticamente inativo da proteína C ativada (APC) no qual o sítio ativo de serina é convertido em dehidrolanina, foi usado para examinar a relação entre os complexos imunes e a proteína C ativada. O FVIII intacto, as cadeias leves de 80 quilo-dáltons e de 72 quilo-dáltons do FVIII intacto ligaram-se de maneira dependente da dose à anidro-APC, com valores Kd de 580, 540 e 310 nM, respectivamente, enquanto nenhuma ligação apreciável foi detectada para a cadeia pesada. Os três auto-anticorpos bloquearam a ligação do FVIII com a anidro-APC em aproximadamente 80% e consequentemente inibiram a inativação proteolítica do FVIII induzida pela APC. Esses anticorpos também se ligaram aos peptídeos sintéticos, de HIS 2009 a Val2018, os quais contém o sítio de ligação da APC. O achado sugere que a ligação dos auto-anticorpos de tipo 2, reconhecendo os resíduos de His2009 a Val 2018, protegem o FVIII da proteólise mediada pela APC e devem contribuir para a presença de imuno-complexos do FVIII na circulação.

INTRODUÇÃO

Os inibidores do Fator VIII (FVIII) desenvolvem-se como alo-anticorpos em pacientes com hemofilia A que receberam múltiplas transfusões ou como auto-anticorpos em indivíduos normais hemostaticamente, particularmente pessoas mais velhas, pacientes com doenças auto-imunes, mulheres grávidas, e mulheres no período pós-parto. O surgimento dos auto-anticorpos causa uma redução na atividade do FVIII (FVIII;C) e usualmente resulta em uma tendência ao sangramento severo conhecido como hemofilia A adquirida.

O FVIII é uma glicoproteína co-fator que acelera o complexo tenase (fator IX em complexo com Fator VIII, na via intrínseca) da coagulação sanguínea. O FVIII maduro é sintetizado como uma única cadeia polipeptídica consistindo de 2332 resíduos de aminoácidos, e consiste de três domínios arranjados na seguinte ordem: A1-A2-B-A3-C1-C2. Como resultado do processamento proteolítico, o FVIII circula como uma heterodímero ligado por cátion divalente formado por uma cadeia pesada (HCh) composta dos domínios A1-A2 e B e de uma cadeia leve (LCh) composta pelos domínios A3,C1 e C2. O FVIII é transformado em sua forma ativa, um heterodímero A1/A2/A3/C1/C2, pela proteólise limitada na Arg372, Arg740 e Arg 1689 pela trombina e pelo fator Xa. A clivagem proteolítica adicional da Arg336 pela proteína C ativada (APC) inativa o FVIII. O sítio de ligação para APC foi encontrado dentro dos resíduos His2009 a Val 2018 na cadeia leve. No plasma, o FVIII é ligado não covalentemente ao Fator von Willebrand (vWF), e a formação desse complexo protege o FVIII da inativação pela APC.

Epítopos comuns de auto-anticorpos, bem como alo-anticorpos hemofílicos, têm sido encontrados tanto nos domínios A2 e C2 quanto em ambos. A maioria dos auto-anticorpos, entretanto, parece ser direcionada contra um único domínio mais do que aos dois, com os anticorpos contra o domínio C2 sendo mais comuns do que anticorpos anti-A2. Em contraste, a maioria dos alo-anticorpos hemofílicos parece reconhecer os dois domínios. Os anticorpos mais inibidores com epítopo em C2 inibem a ligação do FVIII a ambos o vWF e aos fosfolipídeos (PL). Entretanto, um novo epítopo dominante nos domínios A3-C1 tem sido indentificado, a alguns anticorpos que reconhecem este epítopo também impedem a associação entre o FVIII e o Fator IXa (FIXa).

Anticorpos inibidores são classificados em dois tipos com base do padrão de inativação do FVIII. Os inibidores de tipo 1 inibem a FVIII:C (atividade de FVIII) completamente, seguindo a segunda ordem cinética, enquanto os inibidores de tipo 2 seguem uma cinética mais complexa e não inibem a FVIII:C completamente. Os alo-anticorpos hemofílicos são caracteristicamente inibidores de tipo 1, enquanto os auto-anticorpos tendem a ser inibidores de tipo 2. Esses diferentes padrões de inativação do FVIII sugerem que inibidores podem reagir com diferentes determinantes antigênicos. Entretanto a razão para a inibição parcial do FVIII pelos anticorpos de tipo 2 permanece obscura, e a possível importância de imuno-complexos em circulação nessas instâncias não foi completamente explorada.

Nesse estudo, nós identificamos imuno-complexos no plasma de 3 pacientes com hemophilia A adquirida. Nós descobrimos que a ligação dos auto-anticorpos protegeu o FVIII da proteólise mediada pela APC e deve ter contribuído para a presença de imuno-complexos circulantes.

RESULTADOS

NÍVEIS DE FVIII E CARACTERIZAÇÃO DE AUTO-ANTICORPOS ANTI-FVIII EM PACIENTES COM HEMOFILIA A ADQUIRIDA.

Os níveis de FVIII e as características básicas do teste de auto-anticorpos estão mostrados na Tabela 1. O tratamento da amostra do plasma de cada paciente com acidificação e ácido n-caprílico resultou na remoção do FVIII da IgG e nenhum FVIII:Ag (antígeno) ou FVIII:C (atividade de FVIII) foram detectados na fração de auto-anticorpo IgG sobrenadante. Por isso, o FVIII não foi detectado na fração da IgG purificada após a cromatografia com a Sefarose de proteína A (a sefarose é o gel e a proteína A fica ligada nele; o anticorpo se liga na proteína A e, dessa forma, é imobilizado para capturar a proteína alvo do teste). Os níveis de FVIII:Ag no plasma dos pacientes estavam dentro da amplitude normal e eram desproporcionalmente mais altos do que os níveis de FVIII:C na presença de anti-FVIII:C. Similarmente os níveis desproporcionais de FVIII:Ag foram observados em misturas de FVIII normal purificado e auto-anticorpos IgG incubados ‘in vitro’ por duas horas a 37oC. Todos os auto-anticorpos foram classificados como inibidores de tipo 2. Em todos os casos a subclasse de anti-corpos IgG ficou restrita a IgG4. Para localizar a reatividade dos anticorpos ao epítopo, inicialmente nós desempenhamos o ensaio de neutralização e ensaios de inibição competitiva usando fragmentos do FVIII. Em todos os casos, a anti-FVIII:C foi neutralizada completamente (>95%) pelos fragmentos de 80 quilodáltons ou de 72 quilodáltons da cadeia leve. A atividade inibidora não foi neutralizada (<5%), entretanto, pela cadeia pesada, domínio A2 ou domínio C2 da cadeia leve. O ensaio de ligação competitiva rendeu resultados similares (Tabela 1). Como os efeitos inibitórios dos fragmentos de 80 quilo-dáltons e de 72 quilo-dáltons da cadeia leve (livres da região ácida) eram similares, nós concluímos que os epítopos dos três anticorpos podem estar no domínio A3-C1 mas não associados à região ácida.

EFEITOS DOS AUTO-ANTICORPOS NO FVIII E NO FIXa OU ASSOCIAÇÃO A PL (Fosfolipídeo)

Estudos prévios mostraram que os anticorpos mais inibidores com epítopos em A3-C1 inibem a ligação do FVIII ao FIXa. Para isso nós avaliamos a capacidade inibidora dos auto-anticorpos estudados na interação do FVIII com o FIXa usando um ELISA específico. Os fragmentos F(ab’)2 [Fab é a porção do anticorpo que se liga ao antígeno] nos três auto-anticorpos inibiram a ligação do FIXa à cadeia leve do FVIII em 92%, 93% e 95% respectivamente. Os valores para essas concentrações que inibem 50% (IC50) foram 0,47, 0,85, e 0,62 μM, respectivamente. A região de ligação do FIXa à cadeia leve foi previamente identificada nos resíduos de lisina 1804 a valina 1819 no domínio A3. Para determinar se os epítopos dos anticorpos estudados contém uma região crítica de ligação a FIXa no domínio A3, nós examinamos a ligação direta a um peptídeo sintético correspondendo ao fragmento da lisina1804 à valina 1819. Padrões de ligação dependente da dose foram observados para os três anticorpos (Figura 1B). O anticorpo de tipo 1, o qual não inibe a ligação do FVIII ao FIXa, não se liga ao peptídeo. A especificidade da ligação foi confirmada pela demonstração de que a ligação foi completamente bloqueada pela pré-incubação com quantidade excessiva de peptídeo solúvel. Em adição, uma versão aleatória do peptídeo lisina 1804 a valina 1819 (VKWFYTKTENPKVFNK) não se ligou a nenhum dos anticorpos.

Nós também testamos os efeitos do peptídeo em ligações do auto-anticorpo à cadeia leve em ensaios competitivos e mostramos que a ligação foi inibida em 73%, 68% e 61% respectivamente, com os três auto-anticorpos. Esses resultados indicam que os auto-anticorpos estudados reconhecem a região correspondente aos resíduos de lisina 1804 a valina 1810 do domínio A3 ou sua região próxima e que eles bloqueiam a interação entre o FVIII e o FIXa. Em contraste, os anticorpos não inibem apreciavelmente a ligação do FVIII a PS ( proteína S) (<5%). O domínio C2 está envolvido na ligação do FVIII à PS, e nossos resultados estão consistentes com a ausência de um inibidor anti-C2.

Associação entre o FVIII e o vWF

Para investigar a associação do FVIII ao vWF no plasma, nós medimos o FVIII:Ag e o vWF:Ag em frações, após a filtração em Sefarose CL-4B. No plasma normal, o pico de eluição (separação por lavagem) de ambos o FVIII e vWF apareceu em volume não nulo. Em contraste, em cada amostra do plasma dos pacientes, a eluição do FVIII foi demorada e o FVIII:Ag não foi detectado em nenhuma das primeiras frações contendo vWF. Esses resultados indicam que o FVIII estava dissociado do vWF no plasma dos pacientes. A figura 2A mostra um padrão representativo da filtração em gel de um experimento usando-se plasma do paciente 2.

A inibição da associação do FVIII com o vWF também foi observada em um ELISA usando F(ab’)2 [Fab é a fração do anticorpo que se liga ao antígeno] de auto-anticorpos junto com o FVIII normal e o vWF. Em todos os casos as preparações de F(ab’)2 inibiram a ligação do FVII ao vWF em mais de 90% (Fig 2B). Como o sítio de ligação do vWF está no domínio C2, nós examinamos o efeito inibidor dos F(ab’)2 destituídos de imunidade após cromatografia de colunas de C2 para excluir completamente a presença de reatividade anti-C2 nos auto-anticorpos estudados. Em todos os casos, os F(ab’) destituídos de imunidade bloquearam a ligação do FVIII normal com o vWF por mais de 50% e de maneira dependente da dose. A Figura 2B mostra um padrão inibidor representativo de um experimento usando-se anticorpo do paciente 2.

Detecção Direta dos Complexos de Anticorpos do FVIII no Plasma

Os imuno-complexos circulantes foram resgatados do plasma por uso da Sefarose de proteína G e identificados com imuno-pigmentação usando-se anticorpo monoclonal anti-A3 NMC-VIII/10 e anticorpo monoclonal anti-A2 JR8 para detectar o FVIII ligado. Nenhuma banda de FVIII foi detectada no plasma de controle de anticorpo tipo 1. Em contraste, nas três amostras de plasma dos pacientes com hemofilia A adquirida, bandas da cadeia leve de 80 quilodáltons foram detectadas usando-se anticorpo monoclonal NMC-VIII/10 (Fig.3A). Essas bandas desapareceram após o tratamento do plasma com trombina, refletindo a conhecida reatividade do NMC-VIII/10 à cadeia leve. Similarmente, as bandas da cadeia pesada alternado de 90 para 210 quilo-dáltons foram detectadas com o anticorpo monoclonal JR8 e, em todos os casos, essas bandas foram abolidas e convertidas em bandas de 44 quilo-dáltons após o tratamento do plasma com trombina (Figura 3B).

Efeitos Inibitórios dos Auto-Anticorpos na Clivagem Proteolítica do FVIII na Arginina 336 pela APC

Como se sabe que o FVIII livre é rapidamente degradado pela APC, nós focalizamos a ação da APC como um mecanismo potencial para a persistência de imuno-complexos nos três pacientes. Para estimar os efeitos quantitativos dos auto-anticorpos na clivagem proteolítica do FVIII pela APC, nós desenvolvemos um ELISA para medir a inativação do FVIII pela APC independentemente de PL (fosfolipídeos). Neste ensaio o anticorpo monoclonal C5, o qual reconhece a região ácida do domínio A1 (epítopo nos resíduos de 351 a 365), foi usado para detecção. Este anticorpo monoclonal perde sua reatividade após a clivagem do FVIII pela APC na Arg336 no domínio A1, e então uma redução na ligação ao C5 reflete a proteólise do FVIII dependente de APC. Na presença do teste de F(ab’)2 do auto-anticorpo, a reatividade do C5 nas três amostras foi reduzida a 38%, 30% e 35%, respectivamente, por 90 minutos após a adição da APC. Em contraste, a reatividade com o anticorpo monoclonal permaneceu mais alta do que 95% na presença dos F(ab’)2 de IgG normais ou anticorpos de tipo 1 de controle. Além disso, ensaios de atividade do FVIII mostraram que o FVIII foi inativado pela APC, com cursos de tempo similares àqueles observados nos ensaios de clivagem do FVIII pela APC.

Ligação Direta do FVIII à anidro-APC imobilizada (anidro significa sem água)

Como os três tipos de auto-anticorpos de tipo 2 impediram a inativação proteolítica do FVIII induzida pela APC, nós consideramos que eles interferem diretamente com a interação entre o FVIII e a APC. Para confirmar esta idéia, nós examinamos inicialmente a ligação direta em um ELISA por uso de uma APC com sítio ativo modificado (anidro-APC), a qual carece de atividade pró-coagulante. A ligação do FVIII foi detectada pelo uso do anticorpo monoclonal NMC-VIII/5 ou JR8, os quais não afetam a reatividade da APC. O FVIII intacto ligou-se de modo dependente da dose à anidro-APC imobilizada e permaneceu detectável por ELISA por ao menos 12 horas. Os fragmentos de 80 quilodáltons e de 72 quilodáltons da cadeia leve também se ligaram à anidro-APC de modo dependente da dose. O valor de afinidade (Kd) para o FVIII intacto foi de 580 nM ; os valores para a cadeia leve de 80 quilo-dáltons e da cadeia leve de 72 quilo-dáltons foram de 540 nM e 310 nM respectivamente. O fragmento da cadeia pesado não se ligou apreciadamente à anidro-APC.

Para avaliar a especificidade de ligação, a anidro-APC solúvel foi pré-incubada com fragmentos de FVIII em fase fluida antes do ELISA. A ligação de todos os fragmentos de FVIII à anidro-APC imobilizada foi inibida mais de 95% por anidro-APC solúvel (1μM), dessa forma confirmando a especificidade do ensaio de ligação direta. Além disso, a ligação direta do FVIII à anidro-APC foi confirmada em um ensaio competitivo usando I-FVIII pré-incubado com fragmentos de FVIII. Os fragmentos de cadeia leve de 80 e 72 quilo-dáltons inibiram a ligação do I-FVIII à anidro-APC em 80 e 90%. Em contraste, a cadeia pesada e o domínio C2 mostraram pouca ou nenhuma inibição, ainda que numa concentração de 1μM.

Efeitos Inibitórios dos Auto-anticorpos na Ligação do FVIII à anidro-APC.

As preparações F(ab’) dos três auto-anticorpos de tipo 2 inibiram a ligação do FVIII com a anidro-APC em 82%, 79% e 77%, respectivamente. Os valores de IC50 foram 0,20, 0,31 e 0,40 μM, respectivamente. Em contraste, os F(ab’) de auto-anticorpos de tipo 1 de controle não inibiram a ligação do FVIII com a anidro-APC. Além disso, todos os auto-anticorpos inibiram a ligação da cadeia leve de 80 quilo-dáltons ou de 72 quilodáltons à anidro-APC de 70 a 90%. Em adição, o preparado de F(ab’) imuno-depletado por uso de colunas de afinidade a C2 inibiram a ligação em extensão similar. Esses resultados sugerem que a inibição da ligação do FVIII à anidro-APC pelos anticorpos estudados levou à restrita inativação proteolítica do FVIII induzida pela APC.

Ligação de Auto-anticorpos a um Peptídeo Sintético Composto dos Resíduos de His2009 a Val 2018.

O sítio de ligação para a APC está nos resíduos de His2009 a Val2018 na cadeia leve. Para confirmar que os auto-anticorpos estudados reconheceram essa região crítica de ligação à APC, nós examinamos a ligação direta a um peptídeo sintético composto desses aminoácidos. Padrões de ligação dependentes da dose foram observados para todos os três anticorpos. Em contraste, o auto-anticorpo de tipo 1, o qual não afeta a interação do FVIII com a APC, não se liga ao peptídeo. Além disso, a versão ampla (aleatória) do peptídeo His2009-Val2018 (VIFLTSMGAH) não se liga a nenhum dos auto-anticorpos. A especificidade para uma ligação direta foi confirmada pela demonstração da inibição completa após a pré-incubação com quantidades excessivas de peptídeo solúvel.

Nós também examinamos o efeito inibidor do peptídeo na ligação do auto-anticorpo à cadeia leve com 80 quilodáltos. O peptídeo inibiu a ligação de todas as preparações de F(ab’)2 de tipo 2 à cadeia leve de 80 quilo-dáltons de modo dependente da dose similar, em 67%,58% e 66%, respectivamente, para os três auto-anticorpos. O peptídeo aleatório (VIFLTSMGAH) não inibiu nenhuma dessas reações de ligação. Como descrito acima, o peptídeo Lis1804-Val2018, correspondente à região de ligação ao fator IXa, inibiu a ligação do anticorpo à cadeia leve. Nós também testamos os efeitos inibidores de misturas de ambos os peptídeos (Lis1804-Val1819 e His2009-Val2018) na ligação do anticorpo à cadeia leve. A inibição foi aumentada para 87%, 80% e 79%, respectivamente, consistente com a presença de ao menos duas populações de anticorpos com epítopos incluindo os resíduos de 2009 a 2018 e de 1084 a 1819.

DISCUSSÃO

Nós encontramos níveis normais de FVIII:Ag circulantes nos três pacientes com hemofilia A adquirida, a despeito da presença dos inibidores e dos níveis muito baixos de FVIII:C. A presença de FVIII:Ag nesses pacientes pareceu se similar àquela observada nos pacientes de hemofilia A positivos para material de reação cruzada (CRM+). Na hemofilia A CRM+, o FVIII funcionante é pensado por estar em diminuição como resultado de mutações pontuais em resíduos cruciais na molécula do FVIII associadas com sua atividade de co-fator, tais como sítios de clivagem pela trombina. Tais mutações não causam usualmente sérias alterações na conformação, entretanto, e a ligação do FVIII:Ag circulante ao vWF está protegida da degradação proteolítica. Pareceu possível que o FVIII endógeno nos pacientes que nós estudamos também tivesse escapado da degradação pela ligação dos anticorpos. Uma remoção mais rápida da circulação pela formação de imuno-complexos poderia ser esperada, entretnato, e as razões para a persistência desses FVIII:A nesses pacientes com hemofilia A CRM+ adquirida incitavam investigações suplementares.

Os anticorpos que nós estudamos mostraram complexos padrões cinéticos de inativação típicos de inibidores de tipo 2 do FVIII. Nós usamos anticorpos anti domínio C2 para medir o FVIII:Ag, e os níveis normais de FVIII:Ag no plasma que nós encontramos sugeriram que os epítopos dos anticorpos eram aceitavelmente diferentes daqueles dos inibidores mais comuns do FVIII. Esses resultados estavam de acordo com a sugestão de Gawryl e Hoyer, que propuseram que diferenças entre os epítopos nos anticorpos de tipo 1 e de tipo 2 poderiam explicar a diferente inativação cinética. Em geral aceita-se que ambos os auto-anticorpos para o FVIII e os alo-anticorpos para o FVIII reconhecem principalmente sequências no domínio C2, e embora todos os auto-anticorpos que nós estudamos reconhecerem exclusivamente a cadeia leve do FVIII, eles não reagem com o domínio C2 no ensaio de neutralização ou nos ensaios de ligação competitiva. Os inibidores do FVIII com epítopos em C2 são conhecidos por inibir a ligação à fosfolipídeo, mas eles não inibem a ligação a FIXa, achados que são consistentes com a falta de reação com o domínio C2.

Nós também preparamos anticorpos altamente específicos por meio da depleção imune nas colunas de afinidade a C2 para excluir a contribuição dos anticorpos anti-C2 completamente. Os resultados obtidos com os anticorpos imuno-depletados foram similares àqueles com anticorpos não depletados. Além disso, nós encontramos que os anticorpos interagiram com dois peptídeos sintéticos, de lis1804 a Val 1819 e de His2009 a Val2018, na ligação direta e experimentos de competição. Ao todo, esses resultados proporcionam evidência persuasiva de que os anticorpos estudados tinham epítopos no domínio A3-C1. O grande efeito inibidor da mistura dos dois peptídeos sintéticos comparada com o efeito de cada um deles sozinho está em consistência com a presença de duas populações diferentes de anticorpos reconhecedores de epítopos de Lis1804 a Val1819 e de His2009 a Val2018. Também é possível que uma população de anticorpos clonalmente relacionada mire em ambos os peptídeos, já que os efeitos inibidores das misturas não foram completos e os dois segmentos da cadeia leve estão em proximidade no arranjo tri-dimensional da cadeia leve.

Os níveis normais de FVIII:Ag encontrados nas amostras de plasma de todos os três pacientes com inibidores de tipo 2 sugeriu a possibilidade de que o FVIII estivesse circulando em imuno-complexo com os anticorpos. Além disso, quando os F(ab’)2 dos anticorpos foram adicionados ao FVIII ‘in vitro’, padrões similares de FVIII:Ag residual foram observados, sugerindo fortemente que os padrões CRM+ foram causados pela ligação do anticorpo e sustentando o conceito de que o FVIII existia nos complexos imunes. O FVIII não foi detectado nas frações IgG preparadas por precipitação com ácido n-caprílico seguida de cromatografia com Sefarose de proteína A. Parece possível que o tratamento com o ácido caprílico, com redução do pH a 4,0, dissociou o FVIII:Ag dos imuno-complexos. Alternativamente, esse procedimento deve ter influenciado mudanças na conformação que alteraram a reatividade antigênica da proteína FVIII irreversivelmente. Em contraste, a presença de complexos imunes contendo FVIII:Ag foi confirmada por experimentos de imuno-pigmentação usando-se extratos do plasma com gotas de Sefarose de proteína G. Ambas as cadeias leve e pesada do FVIII foram detectadas nas três amostras de plasma, indicando que o FVIII intacto e heterodimérico circulava como os imuno-complexos. Além disso, a expectativa é de que os imuno-complexos sejam removidos rapidamente da circulação pelo sistema reticulo-endotelial, e nossos resultados sugerem que o FVIII esteja protegido desse mecanismo de remoção.

No plasma normal, o FVIII está protegido e estabilizado pelo vWF. Por isso nós consideramos inicialmente que o FVIII e o vWF devam ser mais fortemente associados pela formação de imuno-complexos. É pertinente à essa idéia que Saenko e outros relataram que o anticorpo monoclonal anti-FVIII com epítopo compreendendo os resíduos de 2248 a 2285 do domínio C2 um alo-anticorpo inibidor do C2 impediram a dissociação entre o FVIII e o vWF. Os efeitos opostos observados nos três auto-anticorpos que nós estudamos, os quais inibiram a ligação do FVIII ao vWF, foram quase inesperados. Ambas as regiões ácidas no terminal amina do domínio A3 e do domínio C2 foram propostas como regiões de ligação para o vWF, embora os sítios precisos não tenham sido identificados. O efeito inibidor dos anticorpos na ligação do FVIII ao vWF observado neste estudo foi cinsistente com os padrões do plasma de filtração em gel, os quais revelaram a existência de FVIII independente de vWF. Em adição, os efeitos anti-FVIII:C dos auto-anticorpos foram neutralizados completamente pela cadeia leve com 72 quilo-dáltons mas não pelo domínio C2. Os resultados que nós obtivemos não revelam a presença de anticorpos contra os sítios de ligação a vWF nos terminais em amina dos domínios A3 e C2. Além disso, os efeitos inibidores na ligação do FVIII ao vWF permanecem nas frações F(ab’)2 após a depleção imune nas colunas de afinidade a C2. Jacquemin e outros relataram que anticorpos anti-C1 inibiram a ligação do FVIII ao vWF, indicando um possível papel das sequências A3 e C1 na associação entre FVIII e vWF, embora o bloqueio estérico não possa ser excluído.

O sítio de ligação para a APC foi localizado previamente no domínio A3-C1 da cadeia leve do FVIII, e um peptídeo sintético (His2009-Val2018) no domínio A3 foi mostrado por inibir a inativação do FVIII pela APC. Embora os sítios de ligação precisos e os mecanismos de ligação não tenham sido fartamente definidos, a região A3 do peptídeo parece ser provavelmente envolvida direta ou indiretamente na ligação da APC. Uma relação íntima entre a ligação da APC e do vWF é sugerida pelo achado de que o vWF protege o FVII da inativação proteolítica pela APC, e o FVIII, o qual esteve dissociado do vWF em nossos casos, poderia ser esperado por ter sido rapidamente degradado pela APC. Os níveis normais de FVIII:Ag encontrados indicam dessa forma que os anticorpos podem substituir o efeito protetor do vWF efetivamente. Consequentemente, nós tentamos determinar se a formação dos imuno-complexos restringiu a proteólise do FVIII induzida pela APC.

Nós encontramos que, de fato, os três auto-anticorpos diminuíram a inativação proteolítica do FVIII induzida pela APC. A inibição da inativação foi parcial, entretanto, e a repressão de outros processos proteolíticos não pôde ser descontada. No momento, o FIXa Pé conhecido por inativar o FVIII pela clivagem na Arg336 e todos os três auto-anticorpos estudados inibiram a ligação do FIXa ao FVIII. É possível que a inibição da ligação do FVIII ao FIXa tenha contribuído para os mecanismos protetores observados. Tem sido relatado que a remoção do FVIII da circulação envolve proteínas relacionadas com receptores de lipoproteína de baixa densidade (LRP) nas células. Embora as regiões de ligação para LRP tenham sido encontradas em ambos os domínios A2 e C2, nós ao pudemos descartar completamente a possibilidade de que os auto-anticorpos que nós estudamos também protejam o FVIII circulante dos pacientes do sistema de captura mediado por célula pelo bloqueio de uma região ainda desconhecida no domínio A3-C1 para LRP que participe na interação com o LRP. Todavia, nosso estudo demonstrou claramente que os auto-anticorpos de tipo 2 bloquearam a ligação do FVIII com a anidro-APC e ligaram-se a um peptídio sintético (His2009-Val2018) contendo o sítio de ligação a APC. Os achados sugerem que a inibição da clivagem proteolítica pela APC contribui ao menos em parte para a persistência do FVIII:Ag na circulação.

Nosso estudo demonstrou diretamente pela primeira vez a presença de imuno-complexos ao FVIII circulante em pacientes com hemofilia A adquirida. Os auto-anticorpos manifestaram feições fenotípicas características de inibidores de tipo 2, embora os epítopos parecessem localizados nos domínios A3-C1 do FVIII; um achado incomum. Nós também encontramos que a proteção do FVIII à proteólise mediada pela APC pelos auto-anticorpos de tipo 2 ligados ao FVIII deve contribuir para a presença desses imuno-complexos. Sendo a hemofilia adquirida vista como uma doença auto-imune causada por reações simples de antígeno-anticorpo, a demonstração de imuno-complexos circulantes nessas circunstâncias proporciona luz adicional aos aspectos patofisiológicos das desordens auto-imunes.

http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/content/full/97/3/669

Terapia Adotiva Com Células T Regulatórias Primárias Redirecionadas Resulta Em Supressão Antígeno-específica da Artrite

Wright, G. P. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106, 19078–19083 (2009)

O efeito supressivo as células T regulatórias (Tregs) no sistema imune tem feito dessas células candidatas para o tratamento da auto-imunidade. Wright e outros usaram a terapia genética para converter a expressão de um receptor específico de ovalbumina (OVA) na célula T e o gene forhead box P3 (FOXP3) pelas células T CD4+, as quais produziram células Tregs específicas para OVA. Os autores usaram um modelo de artrite induzido por antígeno no qual a OVA foi injetada com o antígeno indutor de artrite mBSA (albumina do soro bovino metilada). As células TReg engenheiradas convertidas adotivamente diminuíram o inchaço quando a OVA estava presente, mas não quando os camundongos foram desafiados somente com o mBSA, sugerindo que embora a OVA não seja um auto-antígeno iniciador da artrite, sua presença foi suficiente para induzir a supressão da artrite pela célula Treg. Os autores sugeriram que as células Treg engenheiradas poderiam ser efetivas no tratamento da auto-imunidade quando os auto-antígenos iniciais são desconhecidos.

HIV
O ESPERMATOZÓIDE CAPTURA O HIV-1 ATRAVÉS DO HAPARAN SULFATO (HSPG) E TRANSMITE O VÍRUS PARA AS CÉLULAS DENDRÍTICAS EFICIENTEMENTE

Ceballos, A. et al. J. Exp. Med. 26 Oct 2009 (doi:10.1084/jem.20091579)

Existem três possíveis fontes de transmissão do HIV-1 através do sêmem: vírions lives, leucócitos infectados e vírus associado a espermatozóide. Até o momento, a transmissão do HIV-1 pelo espermatozóide tem sido olhada com desatenção, mas esse estudo mostra que os espermatozóides são ativos carreadores do HIV-1 e podem transmitir o vírus às células imunes. O espermatozóide captura as partículas de HIV-1 em sua superfície celular através da ligação ao sulfato de heparan (HSPG) e podem transmitir o vírus às células dendríticas (DCs) por seu contato célula-célula ‘in vitro’, levando à maturação da DC. Os autores sugerem que o espermatozóide poderia ter acesso às DCs ‘in vivo’ a partir de micro-abrasões na superfície da mucosa induzidas durante o inter-curso ou poderiam interagir com as protrusões da DC, as quais se apertam entre as células epiteliais no lúmen da mucosa.

Fonte: http://www.nature.com/nri/journal/v9/n12/pdf/nri2683.pdf
nature reviews Immunology volume 9 december 2009

LECTINA LIGANTE DE MANOSE PODE FACILITAR A REMOÇÃO DE IMUNO-COMPLEXOS CIRCULANTES – IMPLICAÇÕES DE UM ESTUDO COM INDIVÍDUOS DEFICIENTES EM C2.

RESUMO

A deficiência de ambos a lectina ligante de manose (MBL) e componentes C4 e C2 do complemento tem sido associada com o risco aumentado para o lúpus eritematoso sistêmico (SLE). A MBL pode ativar o sistema do complemento tanto através do C4 e do C2 ou diretamente através do C3. Acredita-se que imuno-complexos circulantes (CICs) atuem num papel patogênico no SLE e a MBL tem-se mostrado ligar a certas formas de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG e IgA. Assim, a MBL deve promover a remoção dos CIC. De acordo a avaliar isto, seis indivíduos com a via clássica não funcional, devido a uma rara deficiência de C2 homozigota, foram escolhidos, já que a via clássica é conhecida por ter um papel fundamental na remoção de CIC. Quatros dos seis indivíduos deficientes em C2 tinham SLE, dois deles também tinham deficiência em MBL. Os níveis de MBL no soro e os genótipos foram comparados com os níveis de CICs no soro, como calculado por seu conteúdo de cadeias kappa, lambda, IgM, IgA, IgG e opsonização por C3. Os indivíduos deficientes em C2 tinham níveis de CICs mais altos no soro do que 16 controles saudáveis (P<0,0001). Além disso, uma associação inversa foi observada entre os níveis de MBL e de CIC nos indivíduos deficientes em C2, os quais eram os mais fortes para IgM-CICs (r=0,84, P= 0,037). Além disso, a opsonização dos CICs por C3 correlacionou-se positivamente com os níveis de MBL nos indivíduos deficientes em C2 (r=0,89; P=0,017). Em conclusão, indivíduos com deficiência em C2 tinham níveis aumentados de CICs e a MBL pode facilitar sua remoção. A remoção deficiente de CIC deve explicar parcialmente o risco aumentado para o SLE associado à pouca MBL.

INTRODUÇÃO

A ativação do complemento é uma faca de dois gumes no lúpus eritematoso sistêmico (SLE). Enquanto a ativação do complemento localizada nos tecidos pode ser nociva, o sistema do complemento tem um papel importante na contínua remoção não inflamatória de complexos imunes circulantes (CICs). Isso foi demonstrado em um paciente de SLE deficiente em C2, que por muitos anos mostrou uma melhora clínica consistente e queda nos níveis de CIC após infusões regulares de plasma fresco congelado para re-substituir o C2. Entretanto, a remoção dos CICs mediada pelo complemento ‘in vivo’ tem sido analisada até agora somente no contexto da via clássica, sem tomar em conta a possibilidade de que a via da lectina da ativação do complemento também pode estar envolvida. Pouco se sabe sobre o significado da via da lectina quando outros componentes do sistema complemento estão diminuídos. Ambos o C1q da via clássica e a lectina ligante de manose (MBL) da via da lectina podem ativar o sistema do complemento através de C4 e de C2, porém têm sido mostrado recentemente que a MBL pode também ativar o C3 diretamente. A MBL ativa a via da lectia após a ligação à resíduos de carboidrato na superfície em vários micro-organismos e de componentes próprios desgastados, incluindo fragmentos apoptóticos. A MBL também se há relatada por ligar IgG agactosiladas e complexos de IgG de pacientes com artrite reumatóide (AR) e, além disso, ligar IgAs polimerizadas. Recentemente, a MBL foi mostrada por ligar-se a 20% das glicoformas de IgM. Assim, a MBL deve ter um papel na remoção de CIC. Dependendo da definição, de 10 a 30% dos caucasianos têm deficiência em MBL, que é similar à proporção de indivíduos deficientes em C2 que sofrem de SLE. Nós relatamos recentemente uma associação entre a MBL baixa e o SLE em casos de SLE familiar múltiplo, e a MBL baixa junto com deficiência parcial de C4 pode ter um efeito aditivo no risco para SLE. Notavelmente, o paciente de SLE deficiente em C2 mencionado acima também tem níveis indetectáveis de MBL. Nós fizemos hipótese de que se a MBL está baixa, os CICs podem acumular-se em níveis limitantes que disparam ou aumentam os sintomas do SLE e irrompem. Isso pode sem particularmente importante em indivíduos que também tem uma deficiência de C2 e/ou de C4. Como a via clássica é conhecida por tem um papel fundamental na remoção do CIC, indivíduos com uma via clássica não funcional devido à deficiência de C2 foram escolhidos para avaliar se a MBL também deva ter um papel na remoção de CIC.

RESULTADOS

De acordo a validar o sistema Proceptor TM ELISA, os CICs foram medidos em amostras seriais de soro durante uma infusão de plasma fresco congelado em um paciente com deficiência em ambos C2 e MBL, assim os recosntituindo. Como visto na figura 1, os níveis de CIC no soro neste paciente foram baixadas após as infusões de modo muito similar, como tinha sido reladado previamente após a infusão de plasma fresco congelado no mesmo paciente usando-se outros métodos de detecção de CIC mais ineficientes. Esses sistemas de ensaio, referidos como ensaios de consumo de complemento e ensaio de ligação de imuno-complexos de células vermelhas, foram descritos previamente. Os níveis de CIC nos sujeitos deficientes em C2, e também no paciente após a infusão do plasma medido pelo novo sistema ProceptorTM, foram comparados com os níveis de CIC medidos por estes métodos e mostraram uma correlação muito boa. Os níveis de cadeias kappa e lambda foram considerados por refletirem os níveis totais de CIC. Baseados nesses achados, nós decidimos usar este ensaio simples para a mensuração dos CICs neste estudo.

Os níveis de CICs, como julgados por seus conteúdos de cadeias kappa e lambda e pelos três principais isotipos de imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) em seis indivíduos com uma deficência completa de C2, foram comparados aos seus controles saudáveis. Os pacientes deficientes em C2 tinham níveis mais altos de CICs do que os controles, como julgado tanto pela quantidade de cadeias leves kappa e lambda (P=0,0001 e P<0,0001, respectivamente, Fig 2a,b), quanto por seus conteúdos de IgM, IgG e IgA (P=0,032, P=0,010 e P=0,0065, respectivamente, Fig2c-e). Notavelmente, os dois indivíduos deficientes em C2 que tinham níveis mais altos de CIC de IgG tinham amos SLE. Além disso, dois dos seis indivíduos deficientes em C2 não tinham histórico de infecções recorrentes e eles tinham os níveis mais baixos de CIC de IgM.

Dois dos indivíduos deficientes em C2 também tinham níveis imensos de MBL. Um era o paciente que vinha recebendo infusões de plasma por muitos anos (Fig 1), e ela é homozigota para o alelo da MBL variante estrutural C. O outro paciente era heterozigoto para o alelo da MBL variante estrutural D. Nenhum os dois indivíduos deficientes em C2 que só tiveram infecções tinham baixos níveis de MBL e eles eram ambos homozigotos para os alelos da MBL com estrutura de tipo selvagem. Como a remoção dos CICs da circulação pela via clássica do complemento é largamente bloqueada em indivíduos com deficiência em C2, foi de interesse estudar a associação entre os níveis de MBL e de CICs no contexto da deficiência em C2. Uma associação inversa foi observada entre os níveis de MBL e de CICs (Fig. 3), como detectado por seus conteúdos de cadeias lambda (r=-0,80, P-0,05) e kappa (r=-0,74, P=-0,09). Isso também se aplicou ao conteúdo de IgM do CICs (r=-0,84, P=0,037) e uma tendência similar foi vista para o isotipo IgA (r=-0,72, P=0,1) mas não para IgG (r=-0,32, P=0,5).

A deposição do componente C3 do complemento(C3d) indica uma ativação em curso do complemento. Justificando a noção de que a MBL ajuda a remoção dos CICs, a quantidade relativa de C3 depositado para CICs correlacionou-se com absoluta rigidez com os níveis de MBL nos indivíduos deficientes em C2 (r=0,89, P=0,017 e r= 0,83, P=0,037; Fig.4). Entretanto, a MBL não pôde ser detectada nos CICs capturados pelas placas do Proceptor.

DISCUSSÃO

Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo analisando a MBL em relação aos níveis de CIC, endereçando a questão sobre a possibilidade de a MBL poder, como a via clássica do complemento, ter um papel na remoção de imuno-complexos. Indivíduos com via clássica do complemento não funcional devido à deficiência do complemento foram escolhidos para avaliar o papel da MBL individualmente. Não surpreendentemente, os indivíduos deficientes em C2 tinham níveis de CICs marcadamente mais altos do que os controles saudáveis, iluminando o papel da via clássica do complemento na remoção dos CICs. Entretanto uma associação inversa foi observada entre os níveis de MBL e de CIC no soro deficiente em C2, e isso ficou particularmente evidente para a CICs com alto conteúdo de IgM. Além disso, nós observamos uma associação inversa entre a quantidade relativa de C3 nos níveis de CICs e de MBL em indivíduos com deficiência de C2. Esso está de acordo com o achado recente de que a MBL pode suplantar o C2 pela ativação direta do C3. Tomados juntos, esses achados indicam que a MBL pode ter um papel na remoção dos CICs ao menos em indivíduos deficientes em C2. Isso está de acordo com estudos recentes, onde a MBL foi mostrada por ligar-se a certos isotipos de imunoglobulina ‘in vitro’. Nosso estudo é a primeira tentativa de avaliar o efeito potencial de tais ligações da MBL nos níveis gerais de CICs ‘in vivo’. Entretanto, nós não fomos capazes de detectar a MBL ligada aos CICs nas placas de ProceptorTM. Isso deve ser devido ao obstáculo estérico (estrutural) ou que a ligação da MBL aos CICs foi abaixo do limite de detecção pelo método que nós usamos. Além disso, pode ser imaginado que os CICs com conteúdo relativamente alto de MBL são preferencialmente removidos da circulação. Nós estamos estudando correntemente se a MBL pode ligar-se aos CICs ‘in vitro’ sob condições que imitam o cenário do microambiente o mais próximo possível.

O simples ensaio de detecção de CIC usado correlacionou-se bem com os ensaios mais complexos que foram usados para mensuração dos níveis de CIC. Também distinguiu-se bem entre os pacientes e controles e tem uma utilidade potencial para aplicação de rotina. Assim, alterações nos níveis de CIC no soro durante a infusão de plasma a pacientes deficientes em C2 com SLE medidas com o novo ensaio foram muito similares àquelas medidas anteriormente com ensaios mais complexos. Uma deficiência homozigota de C2 é rara, e esse estudo é baseado em todos os seis indivíduos em Iceland conhecidos por ter deficiência em C2. Entretanto, os resultados são significativos a despeito do pequeno tamanho desse precioso grupo de estudo, e os mesmos mecanismos são passíveis de aplicação também a indivíduos sem deficiência em C2. Concluiu-se que a MBL pode promover a remoção dos CICs in vivo, provavelmente pela via da ativação direta do C3. Baixos níveis de MBL ou genótipos associados foram associados com o risco de SLE em ambos os estudos de família com múltiplos casos e nas meta-análises recentes, e isso deve ser devido parcialmente ao defeito na remoção de CIC. Um teste clínico de fase I de infusão de MBL em voluntários saudáveis está sendo conduzido agora para ambas a MBL purificada e recombinante sem efeitos adversos. Resta por ser elucidado se as infusões de MBL podem ter um papel terapêutico em pacientes com doenças mediadas por imuno-complexos como o SLE.

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1868874/?tool=pubmed

Uma Bio-Armadilha de Metal Pesado para Remediar o Desperdício de Água Usando Poli-Ácido Glutâmico.


O poli-ácido glutâmico gama (gama-PA) obtido do Bacillus Licheniformis ATCC 9945 foi avaliado como um material potencialmente bio-sorvente para uso na remoção de metais pesados de uma solução aquosa. O cobre (Cu(2+)) foi escolhido como modelo de metal pesado usado nesses estudos uma vez que sendo extensivamente usado em eletrochapeamento (cobertura de objetos com metal) e outras indústrias, tem sido modelo para muitos outros estudos similares, e pode ser facilmente ensaiado através de muitos métodos convencionais. O CU(2+)-PGA-gama foi determinado como biopolímero ligando-se a parâmetros sob variadas condições de pH, temperatura, força iônica, e na presença de outros íons de metal, usando-se um aparato de diálise (uma forma de filtração para separar substâncias cristalóides de colóides, ou moléculas menores e maiores em uma solução por interposição de uma membrana semi-permeável. Stedman) especialmente desenhado. A aplicação do modelo isotérmico de adsorção (ligação de moléculas a uma substância) de Langmuir mostrou que o PGA-gama tinha uma capacidade de cobre aproximada de 77,9 mg/g e uma constante de ligação de 32 mg/L (0,5 mM) em pH 4.0 e 25 graus C. A adsorção de Cu(2+)-PGA-gama foi relativamente independente da temperatura entre 7 e 40 graus C, enquanto um aumento na força iônica levou a um decréscimo na ligação de íons de metal. O Cd(2+) e o Zn(2+) competem com o Cu(2+) pelos sítios de ligação no biopolímero de PGA-gama. A captura do metal pelo PGA-gama foi testado adicionalmente usando-se um aparato de filtração de fluxo tangencial num modelo de desfiltração no qual o metal foi continuamente processado através de uma solução diluída de PGA-gama sem permitir o estabelecimento do equilíbrio. A solução de polímero circulante foi capaz de complexar o metal bem como impedir com sucesso a passagem de íons de cobre não ligados presentes na solução através da membrana. Usando 500 mL de uma solução com 0,2% de PGA-gama, mais de 97% da solução de 50 mg/L de sultato de cobre processada numa taxa de fluxo de 115mL/min foi retida pelo polímero. Para uma solução de 10 mg/L de Cu(2+) como sulfato de cobre, as concentrações de Cu(2+) no filtrado nunca se elevaram além de 0,6 mg/L quando processavam 2,5 litros de sulfato de cobre diluído.

PMID: 16599572

A Captura do Antígeno às Células Dendríticas com Nanopartículas de Poli ácido glutâmico Induz a Imunidade Humoral e Celular Específicas ao Antígeno.

Tomofumi Uto, Xin Wang, Katsuaki Sato , Misako Haraguchi , Takami Akagi , Mitsuru Akashi and Masanori Baba

RESUMO

As nanopartículas são consideradas ferramentas eficientes para induzir respostas imunes potentes por um carregador de antígeno. Nesse estudo, nós examinamos o efeito de nanopartículas (NPs) poli- ácido glutâmico gama (ƴ-PGA) biodegradáveis na indução de respostas imunes nos camundongos. As NPs foram eficientemente tomadas pelas células dendríticas (DCs) e subsequentemente localizadas nos compartimentos lisossomais. As NPs -PGA induziram fortemente a produção de citocinas, a sobre-regulação de moléculas co-estimulatórias, e o aumento da capacidade estimulatória das células T nas DCs. Essas mudanças de maturação das DCs envolveram a via de sinalização de NF-KB mediada por MyD88. In vivo, as NPs -PGA foram internalizadas preferencialmente pelas APCs (DCs e macrófagos) e induziram a produção de IL12p40 e IL-6. A imunização dos camundongos com NPs carregando OVA induziu a atividade da CTL (linfócito T citotóxico) específica para o antígeno e a produção de interferon gama específica ao antígeno nos esplenócitos (células do baço) bem como a produção potente de anticorpos IgG1 e IgG2a específicas para o antígeno no soro. Além disso, a imunização com NPs carregando um peptídeo epítopo para célula T CD8+ de Listeria monocytogenes protegeu significativamente da morte os camundongos infectados. Esses resultados sugerem que as NPs -PGA carregando antígenos são capazes de induzir fortes respostas imunes celular e humoral e deverão ser potencialmente úteis como adjuvantes vacinais efetivos para a terapia de doenças infecciosas.

INTRODUÇÃO

A geração de respostas imunes robustas e específicas contra doenças infecciosas é um objetivo primário da vacinação. Novas vacinas candidatas em desenvolvimento são capazes de induzir tanto as respostas imunes celular quanto humoral. No momento, as vacinas contra patógenos intracelulares tais como HIV de tipo I e malária são requeridas para induzirem fortes respostas imunes celulares, enquanto as vacinas que miram em micro-organismos extracelulares têm que induzir respostas imunes humorais.

Há quase setenta anos atrás, Freund e seus colegas desenvolveram o adjuvante altamente potente CFA, que é uma emulsão de água e óleo mineral contendo a micobactéria morta. A despeito da potente atividade, a CFA também induz reações locais severas e assim não pode ser usada em humanos. Por esse motivo, parece obrigatório desenvolver adjuvantes vacinais menos tóxicos e mais efetivos. Compostos baseados em alumínio tais como fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio são seguros e usados correntemente como os adjuvantes predominantes em humanos. Esses compostos são capazes de induzir respostas de Th2, mas eles têm pouca capacidade de estimular as respostas imunes de Th1.

As células dendríticas (DCs), as APCs mais potentes, são definidas por sua morfologia dendrítica e de fenótipo único. As DCs consistem de sub-conjuntos heterogêneos com as linhagens mielóides ou linfóides bem como de diferentes níveis de maturação nos tecidos linfóide e periférico. As DCs imaturas (iDCs) sentem a presença de patógenos invasores por via de vários receptores de reconhecimento de padrão e processam os patógenos intracelulares nos tecidos inflamatórios. As iDCs desenvolvem-se em DCs maduras (mDCs) com a sobre-regulação do MHC e de moléculas co-estimulatórias nos micro-ambientes inflamatórios. Subsequentemente, as mDCs migram aos tecidos linfóides secundários onde elas apresentam os antígenos processados às células T novas (não estimuladas por antígeno até então) para gerar efetivamente células T efetoras. Por esse motivo o alvejamento dos antígenos para as DCs é considerado uma promissora estratégia para a indução potente e eficiente das respostas imunes protetoras específicas para antígenos.

As nanopartículas (NPs) são consideradas eficientes portadoras de antígenos e são amplamente investigadas por seu potencial biológico. Nós relatamos previamente que NPs de poliestireno [o estireno pode polimerizar-se com a presença do grupo vinil, formando o poliestireno, que é uma cadeia aromática de monômeros de estireno; o poliestireno é um plástico sólido em temperatura ambiente e existe na forma biodegradável e não biodegradável. A composição química do poliestireno é uma longa cadeia de hidrocarboneto (só carbono e hidrogênio) com todos os outros carbonos conectados a um grupo fenil (o nome dado ao círculo aromático do benzeno quando ligado ao complexo de carbono substituinte). A fórmula química do poliestireno é (C8H8)n. A oxidação completa do poliestireno produz somente dióxido de carbono e vapor de água.http://en.wikipedia.org/wiki/Polystyrene] imobilizadas com ConA puderam capturar eficientemente partículas do HIV-1 e antígenos de gp120. A imunização com HIV-1 inativado capturado por NPs induziu anticorpos IgA específicos para o HIV-1 no trato genital de camundongos. Além disso, a imunização intra-nasal dos camundongos com HIV símio capturado pó NPs pôde induzir respostas imunes na mucosa em macacos, e os macacos imunizados com os NPs de HIVsímio exibiram proteção parcial contra o desafio vaginal e sistêmico do vírus.
Entretanto, devido ao poliestireno não ser biodegradável, ele não pode ser aplicável à situação clínica como uma substância vacinal por motivo de segurança. Para melhorar a formação da vacina baseada em NP, nós geramos bem suscedidamente NPs degradáveis usando poli-ácido glutâmico gama (ƴ-PGA). O ƴ-PGA é um exopolímero capsular produzido por certas linhagens bacterianas. As NPs de ƴ-PGA são degradadas pela gama glutamil transpeptidase, a qual é amplamente distribuída em todo o corpo. Em adição, várias moléculas como proteínas e peptídeos podem ser imobilizados na superfície e/ou dentro das partículas. Neste estudo, nós examinamos o efeito das NPs de ƴ-PGA nas funções da DC e a eficácia das NPs de ƴ-PGA carregando antígenos para a produção de respostas imunes específicas ao antígeno.

RESULTADOS

Captura das NPs de ƴ-PGA pelas APCs in vitro.

Quando as células do baço, macrófagos do peritôneo, e DCs derivadas da medula óssea foram incubados com FITC-NPS e examinadas por sua captura de NP por citometria de fluxo, as DCs foram encontradas tomando os FICT-NP mais eficientemente do que as células B e macrófagos. Para determinar a localização intracelular das NPs de ƴ-PGA, as DCs foram incubadas com FITC-NPs e depois etiquetadas com um anticorpo monoclonal (mAb) anti-CD11c conjugado com PE. Os sinais verdes dentro da membrana celular mostraram claramente a captura das NPs pelas DCs. Quando a dependência da dose e do tempo da captura de NP pelas DCs foi examinada, a quantidade das NPs intracelulares foi aumentada com o aumento do tempos de concentrações e incubação das NPs, indicando que a captura foi dependente de ambos a dose e o tempo. Entretanto, um aumento suplementar no tempo de incubação por mais de 24 horas não aumenta significativamente a quantidade de NPs intracelulares. Para determinar, além disso. A localização das NPs nas DCs, os lisossomos foram tingidos com corante específico para lisossomo. As NPs internalizadas foram detectadas principalmente junto aos lisossomos das DCs, indicando que as NPs internalizadas licalizaram-se preferencialmente nos compartimentos lisossomais. Além disso, está claro que a forma de OVA (ovalbumina; um peptídeo inibidor de protease, uma serpina) associada a NP (FITC-OVA-NPs) pôde ser tomada muito mais eficientemente pelas DCs do que a forma de OVA sem NP (FITC-OVA). As NPs ƴ-PGA não afetaram a viabilidade das DCs após 48 horas de co-cultivo a concentrações superiores a 300 µg/ml.

Maturação e Ativação das DCs por NPs ƴ-PGA

Para examinar o efeito das NPs ƴ-PGA na maturação da DC, as iDCs (dendríticas imaturas) foram cultivadas na presença de várias concentrações de NPs ƴ-PGA. Quando a produção de citocina foi examinada, as iDCs não produziam níveis detectáveis de IL-12p40 e de TNF-α (fator de necrose tumoral alfa). Em contraste, ambas as citocinas eram abundantemente produzidas a partir de mDCs (dendríticas maduras) e DCs tratadas com NP de maneira dependente da dose e do tempo. A maturação das iDCs é acompanhada pela aumentada expressão de marcadores de superfície, incluindo moléculas co-estimulatórias e complexos MHC. O tratamento das iDCs com NPs de ƴ-PGA resultou em um marcado aumento na expressão de CD40 em suas superfícies de maneira dependente da dose. As expressões da CD86 [omim 601020 – A indução de uma resposta imune requer que as células T recebam dois conjuntos de sinais das células apresentadoras de antígeno. O primeiro sinal é etregue através do complexo receptor de célula T, enquanto o segundo é proporcionado pelos antígenos de ativação da célula B B7-1, ou CD80 (omim 112203), e B7-2, ou CD86 (ligante de CD28), pela interação com moléculas na superfície da célula T, CD28 (omim 186760) e CTLA4 (omim 123890)], do MHC de classe I, e do MHC de classe II também foram sobre-reguladas nas DCs expostas a NP, em comparação as iDCs. Como as mDCs, as DCs tratadas com NP mostraram forte capacidade de estimular células T alogênicas de maneira dependente da dose.

As NPs de ƴ-PGA Induzem a Ativação de NF-KB por Via do Caminho Dependente de MyD88

[Obs.: MyD88 – omim 602170 – O marcador de diferenciação mielóide (MyD) MyD88 foi caracterizado primeiramente durante um estudo das respostas genéticas iniciais das células mielóides murinas à vários estímulos de difereciação e inibitórios de crescimento (Lord e outros, 1990). Os genes de resposta primária na diferenciação mielóde são ativados nas células mieloleucêmicas M1 em resposta à interleucina 6 (IL-6; omim 147620), as quais induzem ambos o embargo e diferenciação terminal.]

Para iluminar a rota de sinalização subjacente à maturação das DC induzida por NP de ƴ-PGA, nós examinamos o efeito de vários inibidores na produção de TNF-α induzido por NP de ƴ-PGA. O tratamento com o inibidor de MAPK p38 [MAPK é proteína cinase ativada por mitógeno] SC68376 suprimiu ambas as produções de TNF-α induzidas por LPS e NP, enquanto o inibidor de JNK SP600125 falhou. Embora o peptídeo inibidor de ERK [ERK é cinase de tirosina relacionada a ELK, e ELK é um receptor de cinase de tirosina expressado no neurônio relacionado a EPH; EPH também é um ligante de receptor de cinase de tirosina] não tenha inibido a produção de TNF-α induzida por NP, ele suprimiu a produção de TNF-α induzida por LPS. Em contraste um inibidor de MyD88, mas não um peptídeo de controle, reduziu significativamente a produção de TNF-α em ambas as DCs tratadas com NP e com LPS. Nós também examinamos a translocação nuclear da subunidade p65 da NF-KB [Fator Nuclear kapa B – omim 164011 – O NFKB tem sido detectado em numerosos tipos de células que expressam citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, moléculas de adesão celular, e algumas proteínas de fase aguda em estados de saúde e vários estados de enfermidade. O NFKB é ativado por uma ampla variedade de estímulos tais como citocinas, radicais oxidantes livres, partículas inaladas, irradiação ultravioleta, e produtos bacterianos ou virais. A ativação inapropriada do NF-kappa-B tem sido ligada a eventos inflamatórios associados com artrite auto-imune, asma, choque séptic, fibrose pulmonar, glomerulonefrite, aterosclerose e AIDS. Em contraste, a inibição completa e persistente do NF-kappa-B tem sido ligada à apoptose, desenvolvimento inapropriado das células imunes, e atraso do crescimento celular.] por microscopia confocal de varredura a laser. A sub-unidade p65 foi alocada no citoplasma de células não tratadas, onde a translocação da sub-unidade p65 para dentro do núcleo foi detectada em ambas as DCs tratadas com NP e com LPS. Além disso, o tratamento com o partenólide [é um anti-inflamatório, uma droga usada na leucemia mielóide pois mata as células que dão origem às células leucêmicas por indução de apoptose] inibidor de NF-KB mostrou uma supressão mais profunda na produção de TNF-α nas DCs tratadas com NP do que nas DCs tratadas com LPS.

Captura de NPs de y-PGA pelas APCs in vivo.

Para examinar a captura das NPs de ƴ-PGA in vivo, células do baço foram coletadas de camundongos quatro horas após a administração de FITC-NPs in vivo. As células positivas para FTIC foram detectáveis em células B, DCs e macrófagos, mas não nas células T. O número de células FTIC positivas foi o mais alto nas DCs em comparação com os outros tipos celulares. As DCs linfóides CD8a+ atuam num papel importante na inciação da resposta imune baseada na célula Th1 bem como na apresentação cruzada de antígenos processados às células T CD8+, levando à geração de CTLs (linfócitos T citotóxicos) específicos para o antígeno. Para determinar se as NPs-FTIC são apanhadas pelas DCs CD8a+, as células do baço foram manchadas com anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD11c e anti-CD8 e examinadas em suas populações positivas em FTIC. Aproximadamente um terço (34,3%) das células positivas em FITC eram DCs CD11c+, e 3,21% das células positivas em FITC (9,4% das DCs CD11c+) também eram CD8a+. Quando as expressões de CD40, CD80 e de CD86 foram examinadas para as DCs do baço obtidas de camundongos tratados com NP, a expressão aumentada dessas moléculas foi identificada mais claramente em 40 horas após o tratamento do camundongo com NP. Entretanto, tal aumento não foi observado em camundongos tratados com PBS. Os níveis de IL-12p40 e IL-6 no soro foram considerados significativamente mais altos nos camundongos tratados com NP do que em camundongos tratados com PBS [omim 109610 – Benzodiazepinas são drogas psicoativas com propriedades sedativas, ansiolítico e anti-convulsivas. Elas exercem essas ações através de receptores localizados no sistema nervoso central; entretanto, algumas benzodiazepinas também interagem com diferentes tipos de receptores presentes principalmente no compartimento mitocondrial nos tecidos periféricos. O papel fisiológico desses receptores de tipo periférico não está claro. Riond e outros (1991) descobriram que o receptor periférico é muito similar no rato, no ramster chinês e no ser humano. Um clone continha a representação da lente total do mRNA do sítio de ligação periférico humano (PBS). A sequência de aminoácidos do PBS de benzodiazepina deduzida do clone de DNA tinha 79% de identidade com a PBS do rato.]

NPs de ƴ-PGA carregando Ovalbumina Induzem Respostas Imunes Específicas para o Antígeno.

A eficácia das NPs de ƴ-PGA em capturar o antígeno na indução das respostas imunes celular e humoral específicas para antígenos foi examinada usando-se a ovalbumina como um modelo de antígeno. Como mostrado na figura 5A, uma resposta de CTL específica ao antígeno não foi observada nas células do baço obtidas de camundongos imunizados com controle (PBS) e OVA(ovalbumina). Em contraste, as células do baço obtidas de camundongos imunizados com NPs-OVA mostraram uma resposta mais potente de CTL específica ao antígeno do que a obtida de camundongos imunizados com OVA mais CFA. Em adição, o número de células produzindo interferón gama específicas ao antígeno foi significativamente mais alto no grupo NP-OVA do que no grupo OVA. Quando um peptídeo de controle restrito de Kb foi usado para estimulação, tal indução das células produzindo interferón gama não foi identificada. Além disso, um nível similar de respostas imunes celulares foi observado em camundongos imunizados com doses reduzidas de NPs-OVA. Quando respostas de anticorpos específicas ao antígeno foram examinadas e comparadas entre os grupos após a imunização, ambos os camundongos imunizados com NP-OVA e OVA mais CFA mostraram níveis mais altos de anticorpos IgG, IgG1, e IgG2a totais específicos para OVA do que os camundongos imunizados só com OVA.

Proteção dos Camundongos à infecção com L.monocytogenes

O desafio com uma dose letal de bactéria viva é um teste rigoroso para a eficácia da vacinação. A infecção de L.monicytogenes nos camundongos parece ser um modelo representativo para a avaliação da proteção mediada por células T CD8+ contra patógenos intracelulares. Quatorze dias após a imunização final os camundongos foram infectados com uma dose letal de L.monocytogenes viável e monitorados diariamente em sua sobrevivência. Aproximadamente 80% dos camundongos imunizados com NPs imobilizando LLO tinham sobrevivido por dia após 11 dias de infecção. Em contraste, a maioria dos camundongos de controle e aqueles imunizados somente com o peptídeo LLO sucumbiram à infecção. Pouca ou nenhuma proteção foi observada para os camundongos imunizados com NPs encapsulando LLO. Esses resultados indicam qua a imunização com NPs imobiliando LLO foi eficiente na proteção dos camundongos contra a infecção com L. monocytogenes.

DISCUSSÃO

Vários experimentos foram feitos para identificar estratégias que induzem atividades imunoestimulatórias potentes. Entretanto, a maioria dos adjuvantes experimentais não podem ser usados para humanos devido a seus efeitos colaterais. No presente, somente o sal de alumínio foi aprovado para uso clínico, ainda que com fraca atividade. Nós criamos recentemente os NPs ƴ-PGA biodegradáveis que tem atividades imunomodelatórias potentes bem com excelente capacidade de carregar vários peptídeos e proteínas.

Nesse estudo, nós mostramos que os NPs de ƴ-PGA foram tomados pelas DCs mais eficientemente do que por outras APCs, tais como macrófagos e células B, e localizados nos lisossomos. Embora o mecanismo da captura das NP reste por ser elucidado, os inibidores de fagocitose mostraram modesta (~30%) de inibição na captura pelas DCs. Foi demonstrado que peptídeos exógenos podem ser adquiridos por apresentação cruzada às células T através do MHC de classe I no compartimento entolisossomal das DCs. As análises das propriedades funcionais das DCs revelaram que os NPs ƴ-PGA são capazes de induzir fortemente a ativação das DCs. A ativação das DCs através das rotas de sinalização da CD40 e da IL-12p40 foram necessárias para a ligação entre as imunidades inata e adaptativa, incluindo as respostas das células T CD4+ e T CD8+ às DCs. De fato, as DCs tratadas com NP puderam induzir a produção de citocinas inflamatórias inatas IL-12p40 e TNF-α bem como a expressão da CD40 e a forte estimulação das células T alogênicas. Esses resultados sugerem que as NPs de ƴ-PGA são capazes de induzir ambas as imunidades adaptativa e inata através da ativação da DC.

As análises da rota de sinalização nas DCs tratadas com NP indicaram o envolvimento da ativação do NG-KB mediada por MyD88 e da p38MAPK. Resultados similares também foram obtidos com DCs tratadas com LPS (lipopolissacarídeo). Entretanto, o inibidor de ERK pôde suprimir a produção do TNF-α em DCs tratadas com LPS, mas não em DCs tratadas com NP. Além disso, o inibidor partenólito do NF-KB foi encontrado suprimindo mais efetivamente a produção do TNF-α nas DCs tratadas com NP do que nas DCs tratadas com LPS. Assim, parece que a rota de sinalização envolvida na estimulação pela NP sobrepõe mas não é idêntica à rota envolvida na estimulação com LPS. Provavelmente, um menor número de moléculas de transdução de sinal pode participar na ativação do NF-KB induzida por NP do que na ativação do NF-KB induzido por LPS. Também de boa nota que a y-PGA não particulada não tem atividade suficiente para induzir a maturação da DC, indicando que a forma da ƴ-PGA em nanopartículas é requerida para interagir com uma certa molécula necessária à ativação da DC. Estudos adicionais estão progredindo para determinar se as NPs de ƴ-PGA interagem com os TLRs (receptores de células T).

Porque as NPs de ƴ-PGA provaram ser tomadas predominantemente para dentro das DCs do baço e puderam sobre-regular a expressão de moléculas co-estimulatórias in vivo, as NPs de ƴ-PGA parecem ser um candidato promissor para adjuvante vacinal. A captura dos antígenos pelas DCs resulta em sua migração subseqüente aos linfonodos, aumento da produção de citocinas, e expressão aumentada das moléclulas co-estimulatórias e do MHC seguindo-se pela apresentação dos antígenos às células T. Nos camundongos as DCs são divididas em três sub-classes, CD11c+CD8a+CD4–, CD11c+CD8a–CD4–, and CD11c+CD8a–CD4+. As DCs CD8a+ têm-se mostrado atuar num papel importante no primeiro cruzamento com as células T CD8+. De fato, as NPs de ƴ-PGA foram encontradas tomadas pelas células DC CD8+, as quais pode ativar as células T diretamente in vivo.

As NPs de ovalbumina induziram fortemente as células produtoras de IFN gama específicas para OVA, a atividade de CTL e a produção de anticorpos. Esses resultados sugerem que as potentes respostas imunes celular e humoral podem ser geradas por NPs de ƴ-PGA carregando não somente OVA mas também outros peptídeos ou proteínas. De fato, as NPs de ƴ-PGA carregando antígenos do HIV-1 foram encontradas induzindo forte imunidade celular e humoral específicas ao antígeno em camundongos (X. Wang, T. Uto, T. Akagi, M. Akashi, e M. Baba). Outra observação impressionante é que as NPs imobilizando LLO puderam proteger os camundongos imunizados da infecção letal com L.monocytogenes. Tomados juntos, as NPs de ƴ-PGA têm grande potencial não somente como carregadores vacinais eficientes mas também como adjuvantes efetivos in vivo.

Em conclusão, o presente estudo mostra claramente a efetividade das NPs de ƴ-PGA como um sistema de entrega de antígeno e um adjuvante para as DCs in vitro e in vivo. Estudos suplementares, incluindo a otimização das NPs de ƴ-PGA e imunização com NPs carregando antígenos em outras espécies animais estão progredindo para o desenvolvimento clínico dessa nova vacina candidata.

FONTE: http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/178/5/2979

A Resposta Inflamatória Aguda Não Afeta as Concentrações de Cobre, Zinco e Selênio no Eritrócito.

Oakes EJ, Lyon TD, Duncan A, Gray A, Talwar D, O'Reilly DS.

Fonte de Conhecimentos e Objetivos:

A mensuração do estado nutricional de elementos vestigiais no plasma é invalidada na presença de uma resposta inflamatória sistêmica. Nós examinamos o potencial dos eritrócitos para acessar as condições de cobre, zinco e selênio nessas situações.

Métodos:

Amostras de sangue venoso foram retiradas, pré-operatoriamente e em 12, 24,48,72 e168 horas pós-operatoriamente , de onze pacientes (seis homens e cinco mulheres) adimitidos para atroplastia (criação de uma articulação artificial para corrigir artrite degenerativa avançada) eletiva do joelho. A proteína C reativa, albumina, cobre zinco, selênio e ferro foram medidos no plasma e nos eritrócitos.

Resultados:

As concentrações de zinco e selênio no plasma caíram significativamente: 95% de intervalos de confiança (termo usado em Estatística) (CI)= de -32% para -44% e de -22% para -36%, respectivamente. As concentrações de cobre caíram transitoriamente e depois aumentaram significativamente: CI = 12-43%. Nenhuma mudança significativa foi vista nas concentrações dos elementos vestigiais nos eritrócitos que expressavam tanto como uma razão de hemoglobina ou de concentração de ferro. Os níveis de ferro nos eritrócitos correlacionaram-se significativamente com a hemoglobina (r=0,93).

Conclusões:

As concentrações de cobre, zinco e selênio no plasma são marcadores não confiáveis do estado em pacientes com uma resposta inflamatória aguda. As concentrações desses elementos vestigiais nos eritrócitos podem proporcionar uma medida mais confiável em estudos de longo prazo em pacientes com resposta inflamatória sistêmica crônica. O ferro pode ser usado no lugar da hemoglobina como denominador enquanto expressão das concentrações dos elementos vestigiais nos eritrócitos.

PMID: 18037540