Comparação entre a Patogenia das Viroses de Chikungunya Epidêmica e Enzoótica em um Modelo de Macaco Rhesus Prenhe. Ching-I Chen , David C. Clark , Patricia Pesavento , Nicholas W. Lerche , Paul A. Luciw , William K. Reisen ,* and Aaron C. Brault RESUMO Desde 2004, um genótipo do vírus Chikungunya (CHIKV) do Leste Africano vem emergindo, causando significativas epidemias de síndrome artrálgica. Além disso, esse vírus foi associado em um primeiro momento com transmissão neonatal e complicações neurológicas. No presente estudo, macacos Rhesus prenhes foram inoculados com uma linhagem enzoótica e epidêmica de CHIKV para comparar a pagogênese e o potencial de transmissão transplacentária. As viremias foram similares para ambas as linhagens e chegaram ao pico em dois a três dias após a inoculação (dpi). O RNA viral foi detectado em necropsia ao vigésimo primeiro dia pós inoculação (dpi) nos tecidos maternais linfoide, associado a articulações e da coluna vertebral. A ausência de RNA viral detectável e a falta de desenvolvimento de um centro germinativo nos fetos indicou que a transmissão transplacentária não ocorre. Anticorpos neutralizantes foram detectados em todas as fêmeas e fetuses. Nosso estudo estabelece um modelo de primata não-humano para avaliar vacinas e terapias antivirais e indica que os macacos Rhesus poderiam servir como um competente reservatório enzoótico. INTRODUÇÃO O Vírus de Chikungunya (Togaviridae, Alphavirus; CHIKV) é transmitido na natureza entre primatas humanos e não-humanos e mosquitos e causa tipicamente síndromes artritogênicas debilitantes que podem se arrastar por semanas ou meses. O CHIKV foi isolado primeiro do soro humano de um portador em Tanganyika (Tanzânia) em 1952 durante a epidemia de uma doença parecida com a dengue. Nos últimos 50 anos, o CHIKV vem expandindo seu perímetro geográfico para a África Oriental e Asia Central e Sudeste, onde vem sendo associado a uma crescente frequência e intensidade de surtos. A análise da seuquência do gene E1 do CHIKV isolado indicou a presença de três clados (ramos) de genótipos distintos incluindo o Asiático, do Oeste Africano e do Leste/Centro/Sul Africano (ECSA). No oeste africano, o CHIKV é transmitido principalmente entre os diversos tipos de mosquito Aedes spp e primatas não-humanos, mas ocasionalmente ele infecta outros animais silvestres e chega a causar pequenos surtos ocasionais em humanos. O surto recente entre 2004-2010 envolveu uma linhagem viral monofilética (frutos de um mesmo ancestral) que divergiu do clado ECSA. Essa nova linhagem do Oeste Africano foi observada primeiramente no Kenya e depois se dispersou para um número de ilhas do Oceano Índico, para o Subcontinente Indiano e para o Sudeste Asiático. O surgimento dessa linhagem desencadeou epidemias significativas, mais notavelmente na Índia, onde mais de dois milhões de casos em humanos foi notificado. O vírus também estabeleceu focos autóctones de surto na Itália, o primeiro caso registrado do CHIKV em atividade na Europa. Além da magnitude da epidemia, manifestações neurológicas até então não declaradas em adultos e na encefalopatia fetal vêm sendo relatadas. A infecção por CHIKV do sistema nervoso central foi descrita primeiramente nos anos 60. Entretanto, novas síndromes neurológicas, tais como tonturas, meningoencefalopatia, mielite, e coroidite, foram registradas somente durante os surtos mais recentes. Além das manifestações neurológicas, as primeiras observações de transmissão neonatal pré-parto foram associadas com essa nova linhagem de CHIKV, entretanto, isso permanece a ser determinado se essas novas síndromes da doença observada durante os surtos de 2004-2010 refletem uma mudança no tropismo tecidual ou um aumento da patogenia, ou se elas são simplesmente indicativas da magnitude dos surtos recentes e do aperfeiçoamento da descrição dos casos. Adicionalmente, a associação da doença do CHIKV em neonatos com mães infectadas durante a gestação é amplamente epidemiológica, sem um estudo controlado de casos e sem analise do potencial de passamento viral transplacentário sob condições experimentais. Embora modelos de camundongos CHIKV exibissem muitos dos sintomas da doença observados durante a infecção em humanos, os sistemas reprodutivo, neurológico e imune de primatas não humanos são mais similares aos humanos do que os sistemas dos camundongos. Por este motivo, macacos prenhes podem servir como um modelo ideal para superar a limitação de modelos de roedores. No presente estudo, uma linhagem epidêmica do Leste Africano isolada de um viajante originário da Índia em 2006 e uma linhagem enzoótica isolada no Oeste Africano foram selecionadas para inoculação. Macacos Rhesus no terceiro mês de gestação foram infectados subcutaneamente com uma dose biológica relevante de ambas as linhagens de CHIKV epidêmica e enzoótica para reproduzir a transmissão natural do vírus pela picada do mosquito. Os macacos foram presos por 21 dias pós-inoculação (dpi) para permitir um tempo adequado de observação da apresentação da doença, da cinética da viremia, do tropismo tecidual, e das respostas imunes em ambos mãe e feto. As condições fetais foram monitoradas durante toda a infecção, e a transmissão transplacentária foi avaliada no vigésimo primeiro dia examinando-se se o RNA viral estava presente no tecido placentário e nos tecidos fetais bem como pela avaliação de desenvolvimento de folículos nos linfonodos fetais. O resultado da infecção viral e respostas dos hospedeiros foram examinados para determinar diferenças patofisiológicas entre as linhagens epidemiológica e enzoótica de CHIKV. Além da comparação da patogenicidade da recentemente emersa linhagem ECSA do CHIKV de um isolado com histórico enzoótico e da avaliação do potencial de o macaco Rhesus servir como um hospedeiro de amplificação do vírus na Ásia, este estudo serve para desenvolver um modelo animal da doença CHIKV para analisar as aplicações de vacinas engenhadas e antivirais em mulheres grávidas. MATERIAIS E MÉTODOS Animais. Seis macacos Rhesus (Macaca mulatta)fêmeas prenhes, fecundadas em colônia, abrigadas nas instalações para animais no Centro Nacional de Pesquisa de Primatas na Califórnia, com idade entre sete e quinze anos e com tempo de gestação entre 121 e 132 dias ( a gestação dura cerca de 146 a 180 dias), foram usadas para inoculação de CHIKV. Os animais foram abrigados e mantidos de acordo com o regulamento e indicações estabelecidos em conjunto pela Universidade da Califórnia, Davis, Instituto de Atendimento e Comitê de Uso Animal (IACUC) sob um protocolo aprovado pelo IACUC. Todos os animais foram testados para infecção viral antes da inoculação. Todos os macacos eram negativos para o vírus da leucemia linfotrópica de células T do tipo 1 (STLV-1), retrovírus símio (SRV) e retrovírus símio (SIV). Dois animais do grupo eram positivos para o vírus da espuma símio (spumavírus), Citomegalovírus (CMV), e Herpes B (HVB); um animal do grupo era positivo apenas para SFV e CMV. Todos os animais foram sangrados dois dias antes da inoculação para confirmar a ausência de anticorpos neutralizantes para CHIKV. Linhagens celulares e viroses. Células de rins de macaco verde africano (Vero), de rins de bebê ramster (BHK-21), e de Aedes albopictus (C6/36) foram cultivadas em meio Eagle’s (Eagle’s Minimun Essential Medium) modificado de Dulbecco (DMEM) (Vero e C6/36) e em Meio Mínimo Essencial (MEM) (BHK-21) suplementadas com 5% de soro bovino fetal (FBS) e antibióticos, e então foram incubadas em um ambiente humidificado com 5% CO2 a 37oC e 28oC, respectivamente. As macacas Rhesus foram inoculadas com uma linhagem do CHIKV do Oeste Africano (37997) isoladas de um grupo de mosquitos durante a transmissão enzoótica no Senegal em1983 (obtidos da Divisão de Doenças Infeciosas Nascidas de Vetores, Centros para Controle de Doenças e Prevenção de coleção de referência) e uma linhagem de CHIKV humano (DHS-4236) isolado pelo Departamento de Saúde Pública da Califórnia de um viajante infectado na Índia durante a epidemia de 2006. A linhagem do CHIKV epidêmica foi originalmente isolada em queratinócitos de coelho (RK), passada uma vez em BHK-21, e passada uma vez em células Vero antes da experimentação. A linhagem de CHIKV enzoótica foi isolada em células de mosquitos (Aedes pseudoscutellaris; AP) passada uma vez em células Vero, e passadas uma vez em células BHK-21. Ambas as reservas de vírus foram preparadas pela inoculação de células C6/36 em infecção em multiplicidade (MOI) de 0,1 e foram colhidas em dois dias. Grupos de três macacas cada foram inoculados subcutâneamente no alto do braço superior com inóculo de µL (mililitro) compreendendo 1,000-10,000 unidades de formação de placa (PFU) de ambas as linhagens epidêmica do Leste Africano e enzoótica do Oeste Africano Os animais foram colocados em jejum por 3 a 4 horas antes da sedação com cetamina (5 a 20 mg/kg de peso) por injeção intramuscular para inoculação viral, exame fisiológico, e coleta de sangue. Sinais clínicos e viabilidade fetal. As macacas foram monitoradas diariamente para sinais clínicos da doença de CHIKV, incluindo febre, dores e evidenciada redução na mobilidade, inchaço nas juntas, sangramento no nariz e gengivas, erupção/vermelhidão na pele, linfadenopatia periférica. Esses exames incluíram monitoramento do peso corporal, temperatura retal, e medida da circunferência e temperatura local das articulações (pulsos e tornozelos). A circunferência das juntas foi avaliada diariamente através dos pulsos e tornozelos. Para ganhar consistência, os locais de dada medida foram marcados com tinta indelével. As temperaturas locais das juntas foram detectadas usando-se um Modelo de Sensor Remoto DermaTemp DT-1001RS (Exergen, Watertown, MA). Um Detector de Ultrassom Doppler Flow (Parks Medical Electronics, Inc., Aloha, OR) foi usado para monitorar o batimento cardíaco fetal como medida de viabilidade fetal. Coleta de tecidos e processamento. Amostras de sangue periférico foram coletadas dois dias antes da inoculação viral e uma dia antes do 21 dpi por punção venal. Amostras do sangue foram recolhidas em tubos com etilenediaminetetraacetic acid (EDTA) e heparina e centrifugados a 1,000 X g por 10 minutos para isolar o plasma e coágulos. O plasma foi para o frigorífico a -80oC até o ensaio para título viral (quantificado por ensaio de placa de células Vero), RNA viral, níveis de anticorpos anti-CHIKV, química plasmática e perfil de citocinas. Amostras do sangue total foram reservadas com tubos revestidos com EDTA para contagem de células do sangue. As mães e os fetos foram eutanasiados no 21 dpi com anestesia de cetamina seguida de uma overdose de barbiturato intravenosa usando-se pentobarbital de sódio a 60 mg/kg. Os tecidos maternos e fetais foram coletados e ensaiados para determinar a carga viral e extensão da histopatologia, incluindo sangue, tecidos conectivos/epífise/sinovial, músculo-esquelético e associado às articulações, cérebro, espinha dorsal, coração, pulmões, rins, baço, pâncreas, medula óssea, articulações e linfonodos (auxiliares e inguinais). Em adição, as glândulas mamárias, tecido placentário, e pele e linfonodos braquiais (axilas) dos braços próximo e distante do sítio de inoculação foram recolhidos das fêmeas. Os tecidos materno e fetal foram mantidos em tampão com formalina a 10% para histopatologia, foram guardados em paraformaldeído a 4% para microscopia eletrônica, e foram congelados em partículas em nitrogênio líquido para detecção de RNA viral e isolamento da infecção viral. Histopatologia. Os tecidos maternal e fetal foram fixados em tampão de formalina neutral a 10%. Os tecidos selecionados das fêmeas e seus fetos foram reservados, inclusive a pele dos braços (do lado da inoculação e do braço oposto), juntas, músculo esquelético associado à junta e espinha dorsal, coração, pulmões, rins, baço, pâncreas, tecido mamário, vagina, linfonodos braquiais (das axilas) junto ao ponto de inoculação e do braço oposto, linfonodos auxiliares e inguinais e placenta. Esses tecidos foram rotineiramente processados e embebidos em parafina, seccionados a 7 µm, e arrumados em lâminas de vidro carregadas positivamente (Superfrost Plus; Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa). Os tecidos seccionados foram tingidos com hamatoxilina e eosina (HE). Microscopia Eletrônica. Para transmissão da microscopia eletrônica ..... Opinião da Tradutora UM ARSENAL DE EQUIPAMENTOS NA MÃO DE UM BANDO DE INCOMPETENTES. Se procuram resposta para uma doença que dura meses, como acham que vão encontrá-la em 21 dias? Macaco eutanasiado não serve de prova.