A Captura do Antígeno às Células Dendríticas com Nanopartículas de Poli ácido glutâmico Induz a Imunidade Humoral e Celular Específicas ao Antígeno.

Tomofumi Uto, Xin Wang, Katsuaki Sato , Misako Haraguchi , Takami Akagi , Mitsuru Akashi and Masanori Baba

RESUMO

As nanopartículas são consideradas ferramentas eficientes para induzir respostas imunes potentes por um carregador de antígeno. Nesse estudo, nós examinamos o efeito de nanopartículas (NPs) poli- ácido glutâmico gama (ƴ-PGA) biodegradáveis na indução de respostas imunes nos camundongos. As NPs foram eficientemente tomadas pelas células dendríticas (DCs) e subsequentemente localizadas nos compartimentos lisossomais. As NPs -PGA induziram fortemente a produção de citocinas, a sobre-regulação de moléculas co-estimulatórias, e o aumento da capacidade estimulatória das células T nas DCs. Essas mudanças de maturação das DCs envolveram a via de sinalização de NF-KB mediada por MyD88. In vivo, as NPs -PGA foram internalizadas preferencialmente pelas APCs (DCs e macrófagos) e induziram a produção de IL12p40 e IL-6. A imunização dos camundongos com NPs carregando OVA induziu a atividade da CTL (linfócito T citotóxico) específica para o antígeno e a produção de interferon gama específica ao antígeno nos esplenócitos (células do baço) bem como a produção potente de anticorpos IgG1 e IgG2a específicas para o antígeno no soro. Além disso, a imunização com NPs carregando um peptídeo epítopo para célula T CD8+ de Listeria monocytogenes protegeu significativamente da morte os camundongos infectados. Esses resultados sugerem que as NPs -PGA carregando antígenos são capazes de induzir fortes respostas imunes celular e humoral e deverão ser potencialmente úteis como adjuvantes vacinais efetivos para a terapia de doenças infecciosas.

INTRODUÇÃO

A geração de respostas imunes robustas e específicas contra doenças infecciosas é um objetivo primário da vacinação. Novas vacinas candidatas em desenvolvimento são capazes de induzir tanto as respostas imunes celular quanto humoral. No momento, as vacinas contra patógenos intracelulares tais como HIV de tipo I e malária são requeridas para induzirem fortes respostas imunes celulares, enquanto as vacinas que miram em micro-organismos extracelulares têm que induzir respostas imunes humorais.

Há quase setenta anos atrás, Freund e seus colegas desenvolveram o adjuvante altamente potente CFA, que é uma emulsão de água e óleo mineral contendo a micobactéria morta. A despeito da potente atividade, a CFA também induz reações locais severas e assim não pode ser usada em humanos. Por esse motivo, parece obrigatório desenvolver adjuvantes vacinais menos tóxicos e mais efetivos. Compostos baseados em alumínio tais como fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio são seguros e usados correntemente como os adjuvantes predominantes em humanos. Esses compostos são capazes de induzir respostas de Th2, mas eles têm pouca capacidade de estimular as respostas imunes de Th1.

As células dendríticas (DCs), as APCs mais potentes, são definidas por sua morfologia dendrítica e de fenótipo único. As DCs consistem de sub-conjuntos heterogêneos com as linhagens mielóides ou linfóides bem como de diferentes níveis de maturação nos tecidos linfóide e periférico. As DCs imaturas (iDCs) sentem a presença de patógenos invasores por via de vários receptores de reconhecimento de padrão e processam os patógenos intracelulares nos tecidos inflamatórios. As iDCs desenvolvem-se em DCs maduras (mDCs) com a sobre-regulação do MHC e de moléculas co-estimulatórias nos micro-ambientes inflamatórios. Subsequentemente, as mDCs migram aos tecidos linfóides secundários onde elas apresentam os antígenos processados às células T novas (não estimuladas por antígeno até então) para gerar efetivamente células T efetoras. Por esse motivo o alvejamento dos antígenos para as DCs é considerado uma promissora estratégia para a indução potente e eficiente das respostas imunes protetoras específicas para antígenos.

As nanopartículas (NPs) são consideradas eficientes portadoras de antígenos e são amplamente investigadas por seu potencial biológico. Nós relatamos previamente que NPs de poliestireno [o estireno pode polimerizar-se com a presença do grupo vinil, formando o poliestireno, que é uma cadeia aromática de monômeros de estireno; o poliestireno é um plástico sólido em temperatura ambiente e existe na forma biodegradável e não biodegradável. A composição química do poliestireno é uma longa cadeia de hidrocarboneto (só carbono e hidrogênio) com todos os outros carbonos conectados a um grupo fenil (o nome dado ao círculo aromático do benzeno quando ligado ao complexo de carbono substituinte). A fórmula química do poliestireno é (C8H8)n. A oxidação completa do poliestireno produz somente dióxido de carbono e vapor de água.http://en.wikipedia.org/wiki/Polystyrene] imobilizadas com ConA puderam capturar eficientemente partículas do HIV-1 e antígenos de gp120. A imunização com HIV-1 inativado capturado por NPs induziu anticorpos IgA específicos para o HIV-1 no trato genital de camundongos. Além disso, a imunização intra-nasal dos camundongos com HIV símio capturado pó NPs pôde induzir respostas imunes na mucosa em macacos, e os macacos imunizados com os NPs de HIVsímio exibiram proteção parcial contra o desafio vaginal e sistêmico do vírus.
Entretanto, devido ao poliestireno não ser biodegradável, ele não pode ser aplicável à situação clínica como uma substância vacinal por motivo de segurança. Para melhorar a formação da vacina baseada em NP, nós geramos bem suscedidamente NPs degradáveis usando poli-ácido glutâmico gama (ƴ-PGA). O ƴ-PGA é um exopolímero capsular produzido por certas linhagens bacterianas. As NPs de ƴ-PGA são degradadas pela gama glutamil transpeptidase, a qual é amplamente distribuída em todo o corpo. Em adição, várias moléculas como proteínas e peptídeos podem ser imobilizados na superfície e/ou dentro das partículas. Neste estudo, nós examinamos o efeito das NPs de ƴ-PGA nas funções da DC e a eficácia das NPs de ƴ-PGA carregando antígenos para a produção de respostas imunes específicas ao antígeno.

RESULTADOS

Captura das NPs de ƴ-PGA pelas APCs in vitro.

Quando as células do baço, macrófagos do peritôneo, e DCs derivadas da medula óssea foram incubados com FITC-NPS e examinadas por sua captura de NP por citometria de fluxo, as DCs foram encontradas tomando os FICT-NP mais eficientemente do que as células B e macrófagos. Para determinar a localização intracelular das NPs de ƴ-PGA, as DCs foram incubadas com FITC-NPs e depois etiquetadas com um anticorpo monoclonal (mAb) anti-CD11c conjugado com PE. Os sinais verdes dentro da membrana celular mostraram claramente a captura das NPs pelas DCs. Quando a dependência da dose e do tempo da captura de NP pelas DCs foi examinada, a quantidade das NPs intracelulares foi aumentada com o aumento do tempos de concentrações e incubação das NPs, indicando que a captura foi dependente de ambos a dose e o tempo. Entretanto, um aumento suplementar no tempo de incubação por mais de 24 horas não aumenta significativamente a quantidade de NPs intracelulares. Para determinar, além disso. A localização das NPs nas DCs, os lisossomos foram tingidos com corante específico para lisossomo. As NPs internalizadas foram detectadas principalmente junto aos lisossomos das DCs, indicando que as NPs internalizadas licalizaram-se preferencialmente nos compartimentos lisossomais. Além disso, está claro que a forma de OVA (ovalbumina; um peptídeo inibidor de protease, uma serpina) associada a NP (FITC-OVA-NPs) pôde ser tomada muito mais eficientemente pelas DCs do que a forma de OVA sem NP (FITC-OVA). As NPs ƴ-PGA não afetaram a viabilidade das DCs após 48 horas de co-cultivo a concentrações superiores a 300 µg/ml.

Maturação e Ativação das DCs por NPs ƴ-PGA

Para examinar o efeito das NPs ƴ-PGA na maturação da DC, as iDCs (dendríticas imaturas) foram cultivadas na presença de várias concentrações de NPs ƴ-PGA. Quando a produção de citocina foi examinada, as iDCs não produziam níveis detectáveis de IL-12p40 e de TNF-α (fator de necrose tumoral alfa). Em contraste, ambas as citocinas eram abundantemente produzidas a partir de mDCs (dendríticas maduras) e DCs tratadas com NP de maneira dependente da dose e do tempo. A maturação das iDCs é acompanhada pela aumentada expressão de marcadores de superfície, incluindo moléculas co-estimulatórias e complexos MHC. O tratamento das iDCs com NPs de ƴ-PGA resultou em um marcado aumento na expressão de CD40 em suas superfícies de maneira dependente da dose. As expressões da CD86 [omim 601020 – A indução de uma resposta imune requer que as células T recebam dois conjuntos de sinais das células apresentadoras de antígeno. O primeiro sinal é etregue através do complexo receptor de célula T, enquanto o segundo é proporcionado pelos antígenos de ativação da célula B B7-1, ou CD80 (omim 112203), e B7-2, ou CD86 (ligante de CD28), pela interação com moléculas na superfície da célula T, CD28 (omim 186760) e CTLA4 (omim 123890)], do MHC de classe I, e do MHC de classe II também foram sobre-reguladas nas DCs expostas a NP, em comparação as iDCs. Como as mDCs, as DCs tratadas com NP mostraram forte capacidade de estimular células T alogênicas de maneira dependente da dose.

As NPs de ƴ-PGA Induzem a Ativação de NF-KB por Via do Caminho Dependente de MyD88

[Obs.: MyD88 – omim 602170 – O marcador de diferenciação mielóide (MyD) MyD88 foi caracterizado primeiramente durante um estudo das respostas genéticas iniciais das células mielóides murinas à vários estímulos de difereciação e inibitórios de crescimento (Lord e outros, 1990). Os genes de resposta primária na diferenciação mielóde são ativados nas células mieloleucêmicas M1 em resposta à interleucina 6 (IL-6; omim 147620), as quais induzem ambos o embargo e diferenciação terminal.]

Para iluminar a rota de sinalização subjacente à maturação das DC induzida por NP de ƴ-PGA, nós examinamos o efeito de vários inibidores na produção de TNF-α induzido por NP de ƴ-PGA. O tratamento com o inibidor de MAPK p38 [MAPK é proteína cinase ativada por mitógeno] SC68376 suprimiu ambas as produções de TNF-α induzidas por LPS e NP, enquanto o inibidor de JNK SP600125 falhou. Embora o peptídeo inibidor de ERK [ERK é cinase de tirosina relacionada a ELK, e ELK é um receptor de cinase de tirosina expressado no neurônio relacionado a EPH; EPH também é um ligante de receptor de cinase de tirosina] não tenha inibido a produção de TNF-α induzida por NP, ele suprimiu a produção de TNF-α induzida por LPS. Em contraste um inibidor de MyD88, mas não um peptídeo de controle, reduziu significativamente a produção de TNF-α em ambas as DCs tratadas com NP e com LPS. Nós também examinamos a translocação nuclear da subunidade p65 da NF-KB [Fator Nuclear kapa B – omim 164011 – O NFKB tem sido detectado em numerosos tipos de células que expressam citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, moléculas de adesão celular, e algumas proteínas de fase aguda em estados de saúde e vários estados de enfermidade. O NFKB é ativado por uma ampla variedade de estímulos tais como citocinas, radicais oxidantes livres, partículas inaladas, irradiação ultravioleta, e produtos bacterianos ou virais. A ativação inapropriada do NF-kappa-B tem sido ligada a eventos inflamatórios associados com artrite auto-imune, asma, choque séptic, fibrose pulmonar, glomerulonefrite, aterosclerose e AIDS. Em contraste, a inibição completa e persistente do NF-kappa-B tem sido ligada à apoptose, desenvolvimento inapropriado das células imunes, e atraso do crescimento celular.] por microscopia confocal de varredura a laser. A sub-unidade p65 foi alocada no citoplasma de células não tratadas, onde a translocação da sub-unidade p65 para dentro do núcleo foi detectada em ambas as DCs tratadas com NP e com LPS. Além disso, o tratamento com o partenólide [é um anti-inflamatório, uma droga usada na leucemia mielóide pois mata as células que dão origem às células leucêmicas por indução de apoptose] inibidor de NF-KB mostrou uma supressão mais profunda na produção de TNF-α nas DCs tratadas com NP do que nas DCs tratadas com LPS.

Captura de NPs de y-PGA pelas APCs in vivo.

Para examinar a captura das NPs de ƴ-PGA in vivo, células do baço foram coletadas de camundongos quatro horas após a administração de FITC-NPs in vivo. As células positivas para FTIC foram detectáveis em células B, DCs e macrófagos, mas não nas células T. O número de células FTIC positivas foi o mais alto nas DCs em comparação com os outros tipos celulares. As DCs linfóides CD8a+ atuam num papel importante na inciação da resposta imune baseada na célula Th1 bem como na apresentação cruzada de antígenos processados às células T CD8+, levando à geração de CTLs (linfócitos T citotóxicos) específicos para o antígeno. Para determinar se as NPs-FTIC são apanhadas pelas DCs CD8a+, as células do baço foram manchadas com anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD11c e anti-CD8 e examinadas em suas populações positivas em FTIC. Aproximadamente um terço (34,3%) das células positivas em FITC eram DCs CD11c+, e 3,21% das células positivas em FITC (9,4% das DCs CD11c+) também eram CD8a+. Quando as expressões de CD40, CD80 e de CD86 foram examinadas para as DCs do baço obtidas de camundongos tratados com NP, a expressão aumentada dessas moléculas foi identificada mais claramente em 40 horas após o tratamento do camundongo com NP. Entretanto, tal aumento não foi observado em camundongos tratados com PBS. Os níveis de IL-12p40 e IL-6 no soro foram considerados significativamente mais altos nos camundongos tratados com NP do que em camundongos tratados com PBS [omim 109610 – Benzodiazepinas são drogas psicoativas com propriedades sedativas, ansiolítico e anti-convulsivas. Elas exercem essas ações através de receptores localizados no sistema nervoso central; entretanto, algumas benzodiazepinas também interagem com diferentes tipos de receptores presentes principalmente no compartimento mitocondrial nos tecidos periféricos. O papel fisiológico desses receptores de tipo periférico não está claro. Riond e outros (1991) descobriram que o receptor periférico é muito similar no rato, no ramster chinês e no ser humano. Um clone continha a representação da lente total do mRNA do sítio de ligação periférico humano (PBS). A sequência de aminoácidos do PBS de benzodiazepina deduzida do clone de DNA tinha 79% de identidade com a PBS do rato.]

NPs de ƴ-PGA carregando Ovalbumina Induzem Respostas Imunes Específicas para o Antígeno.

A eficácia das NPs de ƴ-PGA em capturar o antígeno na indução das respostas imunes celular e humoral específicas para antígenos foi examinada usando-se a ovalbumina como um modelo de antígeno. Como mostrado na figura 5A, uma resposta de CTL específica ao antígeno não foi observada nas células do baço obtidas de camundongos imunizados com controle (PBS) e OVA(ovalbumina). Em contraste, as células do baço obtidas de camundongos imunizados com NPs-OVA mostraram uma resposta mais potente de CTL específica ao antígeno do que a obtida de camundongos imunizados com OVA mais CFA. Em adição, o número de células produzindo interferón gama específicas ao antígeno foi significativamente mais alto no grupo NP-OVA do que no grupo OVA. Quando um peptídeo de controle restrito de Kb foi usado para estimulação, tal indução das células produzindo interferón gama não foi identificada. Além disso, um nível similar de respostas imunes celulares foi observado em camundongos imunizados com doses reduzidas de NPs-OVA. Quando respostas de anticorpos específicas ao antígeno foram examinadas e comparadas entre os grupos após a imunização, ambos os camundongos imunizados com NP-OVA e OVA mais CFA mostraram níveis mais altos de anticorpos IgG, IgG1, e IgG2a totais específicos para OVA do que os camundongos imunizados só com OVA.

Proteção dos Camundongos à infecção com L.monocytogenes

O desafio com uma dose letal de bactéria viva é um teste rigoroso para a eficácia da vacinação. A infecção de L.monicytogenes nos camundongos parece ser um modelo representativo para a avaliação da proteção mediada por células T CD8+ contra patógenos intracelulares. Quatorze dias após a imunização final os camundongos foram infectados com uma dose letal de L.monocytogenes viável e monitorados diariamente em sua sobrevivência. Aproximadamente 80% dos camundongos imunizados com NPs imobilizando LLO tinham sobrevivido por dia após 11 dias de infecção. Em contraste, a maioria dos camundongos de controle e aqueles imunizados somente com o peptídeo LLO sucumbiram à infecção. Pouca ou nenhuma proteção foi observada para os camundongos imunizados com NPs encapsulando LLO. Esses resultados indicam qua a imunização com NPs imobiliando LLO foi eficiente na proteção dos camundongos contra a infecção com L. monocytogenes.

DISCUSSÃO

Vários experimentos foram feitos para identificar estratégias que induzem atividades imunoestimulatórias potentes. Entretanto, a maioria dos adjuvantes experimentais não podem ser usados para humanos devido a seus efeitos colaterais. No presente, somente o sal de alumínio foi aprovado para uso clínico, ainda que com fraca atividade. Nós criamos recentemente os NPs ƴ-PGA biodegradáveis que tem atividades imunomodelatórias potentes bem com excelente capacidade de carregar vários peptídeos e proteínas.

Nesse estudo, nós mostramos que os NPs de ƴ-PGA foram tomados pelas DCs mais eficientemente do que por outras APCs, tais como macrófagos e células B, e localizados nos lisossomos. Embora o mecanismo da captura das NP reste por ser elucidado, os inibidores de fagocitose mostraram modesta (~30%) de inibição na captura pelas DCs. Foi demonstrado que peptídeos exógenos podem ser adquiridos por apresentação cruzada às células T através do MHC de classe I no compartimento entolisossomal das DCs. As análises das propriedades funcionais das DCs revelaram que os NPs ƴ-PGA são capazes de induzir fortemente a ativação das DCs. A ativação das DCs através das rotas de sinalização da CD40 e da IL-12p40 foram necessárias para a ligação entre as imunidades inata e adaptativa, incluindo as respostas das células T CD4+ e T CD8+ às DCs. De fato, as DCs tratadas com NP puderam induzir a produção de citocinas inflamatórias inatas IL-12p40 e TNF-α bem como a expressão da CD40 e a forte estimulação das células T alogênicas. Esses resultados sugerem que as NPs de ƴ-PGA são capazes de induzir ambas as imunidades adaptativa e inata através da ativação da DC.

As análises da rota de sinalização nas DCs tratadas com NP indicaram o envolvimento da ativação do NG-KB mediada por MyD88 e da p38MAPK. Resultados similares também foram obtidos com DCs tratadas com LPS (lipopolissacarídeo). Entretanto, o inibidor de ERK pôde suprimir a produção do TNF-α em DCs tratadas com LPS, mas não em DCs tratadas com NP. Além disso, o inibidor partenólito do NF-KB foi encontrado suprimindo mais efetivamente a produção do TNF-α nas DCs tratadas com NP do que nas DCs tratadas com LPS. Assim, parece que a rota de sinalização envolvida na estimulação pela NP sobrepõe mas não é idêntica à rota envolvida na estimulação com LPS. Provavelmente, um menor número de moléculas de transdução de sinal pode participar na ativação do NF-KB induzida por NP do que na ativação do NF-KB induzido por LPS. Também de boa nota que a y-PGA não particulada não tem atividade suficiente para induzir a maturação da DC, indicando que a forma da ƴ-PGA em nanopartículas é requerida para interagir com uma certa molécula necessária à ativação da DC. Estudos adicionais estão progredindo para determinar se as NPs de ƴ-PGA interagem com os TLRs (receptores de células T).

Porque as NPs de ƴ-PGA provaram ser tomadas predominantemente para dentro das DCs do baço e puderam sobre-regular a expressão de moléculas co-estimulatórias in vivo, as NPs de ƴ-PGA parecem ser um candidato promissor para adjuvante vacinal. A captura dos antígenos pelas DCs resulta em sua migração subseqüente aos linfonodos, aumento da produção de citocinas, e expressão aumentada das moléclulas co-estimulatórias e do MHC seguindo-se pela apresentação dos antígenos às células T. Nos camundongos as DCs são divididas em três sub-classes, CD11c+CD8a+CD4–, CD11c+CD8a–CD4–, and CD11c+CD8a–CD4+. As DCs CD8a+ têm-se mostrado atuar num papel importante no primeiro cruzamento com as células T CD8+. De fato, as NPs de ƴ-PGA foram encontradas tomadas pelas células DC CD8+, as quais pode ativar as células T diretamente in vivo.

As NPs de ovalbumina induziram fortemente as células produtoras de IFN gama específicas para OVA, a atividade de CTL e a produção de anticorpos. Esses resultados sugerem que as potentes respostas imunes celular e humoral podem ser geradas por NPs de ƴ-PGA carregando não somente OVA mas também outros peptídeos ou proteínas. De fato, as NPs de ƴ-PGA carregando antígenos do HIV-1 foram encontradas induzindo forte imunidade celular e humoral específicas ao antígeno em camundongos (X. Wang, T. Uto, T. Akagi, M. Akashi, e M. Baba). Outra observação impressionante é que as NPs imobilizando LLO puderam proteger os camundongos imunizados da infecção letal com L.monocytogenes. Tomados juntos, as NPs de ƴ-PGA têm grande potencial não somente como carregadores vacinais eficientes mas também como adjuvantes efetivos in vivo.

Em conclusão, o presente estudo mostra claramente a efetividade das NPs de ƴ-PGA como um sistema de entrega de antígeno e um adjuvante para as DCs in vitro e in vivo. Estudos suplementares, incluindo a otimização das NPs de ƴ-PGA e imunização com NPs carregando antígenos em outras espécies animais estão progredindo para o desenvolvimento clínico dessa nova vacina candidata.

FONTE: http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/178/5/2979