Heparina Aumenta a Acessibilidade pela Ligação aos Resíduos Básicos Sensíveis à Tripsina nas Histonas.

B Villeponteau

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1131979/?tool=pubmed

RESUMO

Evidência recente indica que a acessibilidade da cromatina aos fatores de transcrição é de significância regulatória. Sabe-se que o poli-ânion heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à DNAase I e estimula a síntese de RNA e DNA. No presente estudo, a estrutura da cromatina e sua modificação por poli-ânions foram examinados pelo uso da tripsina e nuclease de micrococccus como provas. Ambos a heparina e o poli-ácido glutâmico foram encontrados como equivalentes à tripsina na digestão de histonas em sua habilidade de aumentar a acessibilidade de nucleases à cromatina. Entretanto, nenhum aumento da acessibilidade de nucleases foi observado quando a cromatina digerida por tripsina foi tratada suplementarmente com heparina, indicando que os poli-ânions e a tripsina não são aditivos em seus efeitos na acessibilidade à cromatina. Além disso, análises de gradiente de sacarose demonstraram que a heparina liga-se disciplinadamente a nucleossomos intactos, mas não a nucleossomos digeridos pela tripsina. Esses dados sugerem que os poli-ânions interagem predominantemente com resíduos de lisina e arginina sensíveis à tripsina na histona 1 e nos segmentos com teminais amina do cerne das histonas. A possível relevância desses resultados para a estrutura da cromatina das regiões ativamente transcritas é discutida.

INTRODUÇÃO

Para caber dentro do núcleo, DNA eucariótico é condensado pelas histonas, as quais compactam o DNA em nucleossomos e os 30 nanômetros da fibra de cromatina. Estudos prévios mostraram que a estrutura da cromatina ao redor de genes ativos está perturbada onde a cromatina ativamente transcrita é digerida preferencialmente por DNAase I ou nuclease de micrococcus (M Nase), sugerindo que o empacotamento da cromatina precisa ser alterado de acordo para que ocorra a transcrição. Sustentando essa noção, dados recentes indicam fortemente que o DNA empacotado dentro da cromatina frequentemente não está acessível aos fatores de transcrição e que as histonas podem impedir ambas a iniciação da polimerase e seu alongamento. Assim, uma questão básica não respondida é como a cromatina é modificada de modo que a transcrição ocorra.

Os poliânions ácidos heparina e poli-ácido glutâmico foram relatados enquanto alteradores da cromatina por termo-desnaturação e estimuladores da sensibilidade à DNAase I, transcrição e replicação do DNA ‘in vitro’. Essas mudanças no molde da cromatina não foram acompanhadas pelas maiores rupturas na estrutura da cromatina. No presente estudo eu tentei elucidar o mecanismo específico pelo qual esses poli-ânions atuam focalizando o papel dos domínios da histona sensitivos à tripsina.

Para examinar mudanças na estrutura da cromatina ou tratamento com heparina, a MNase foi usada como prova para acessibilidade da nuclease, enquanto a tripsina foi usada para determinar os domínios da histona sensitivos à tripsina. A MNase foi escolhida com uma prova da estrutura da cromatina pois um característico limite de 50% de digestão na solubilização do DNA é atingido em digestão prolongada do núcleo ou da cromatina. Essa digestão limitada reflete aparentemente a natureza das interações histona-DNA dentro do nucleossomo. Se a cromatina é digerida primeiro com tripsina para remover preferencialmente a histona H1 e os caules terminais em N das histonas H2A, H3B, H3 e H4, existe um aumento significativo na suscetibilidade ao ataque da MNase. Como meus experimentos iniciais indicaram que o tratamento da cromatina com poli-ânion leva a um aumento similar na suscetibilidade à digestão por MNase, eu comparei diretamente os efeitos dos tratamentos da cromatina com poli-ânions com os efeitos da digestão por tripsina. Os dados indicam que os poli-ânions interagem preferencialmente com regiões da histona sensitivas à tripsina, sugerindo que a estimulação da síntese de RNA e DNA endógenos induzida por poli-ânions é melhor explicada pelo mascaramento eletrostático dos resíduos de lisina e arginina sensitivos à tripsina nas histonas.

RESULTADOS

A Cromatina Tratada com Poli-ânions ou Tripsina Tem Limites de Assimilação Quase Idênticos aos de MNase.

Em torno de metade do DNA dentro da cromatina é normalmente resistente ao ataque da MNase ( Clack & Felsenfeld, 1974). A figura I mostra que o tratamento da cromatina com o poli-ânion heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à MNase. Para determinar a dose da resposta para esse efeito dos poli-ânions na cromatina, várias concentrações de heparina, ou poli-ácido glutâmico foram adicionadas a uma quantidade fixada da cromatina seguida pela digestão com MNase (5μg/ml). A suscetibilidade máxima da cromatina à MNase foi alcançada a uma razão de 0,2 para 0,4 entre o poliânion e o DNA. Acima dessa razão o poli-ácido glutâmico tem pouco efeito a mais, enquanto a heparina exibe uma forte inibição da nuclease (veja a seguir). A adição de uma proteína neutra como a BSA não tem efeito na acessibilidade da cromatina ao ataque da nuclease (resultados não mostrados).

A digestão da cromatina com tripsina gera os bem caracterizados fragmentos restritos da histona P1-P5, os quais contém os domínios terminais em C (carboxila) globulares do cerne das histonas (veja Bohm & Crane-Robinson, 1984; Weintraub & van Lente, 1974; e a figura 2a). A cromatina digerida pela tripsina tem uma suscetibilidade aumentada da cromatina ao ataque da MNase. A Figura 2 mostra que a disponibilidade aumentada da cromatina digerida pela tripsina ao ataque da nuclease paraleliza estritamente aquele encontrado para a cromatina tratada com poli-ânion. Além disso, a distribuição do tamanho dos fragmentos restritos em limites resistentes à MNase de cromatina tratada com heparina e digerida com tripsina também são similares, sustentando ainda mais a ligação entre a digestão pela tripsina e o tratamento com heparina.

Para verificar se a heparina ou o poli-ácido glutâmico tem um efeito direto na atividade de MNase, o DNA nú do timo de vitelo foi digerido com MNase (5 µg/ml) na presença de várias concentrações de poli-ânion. A Figura 2(b) mostra que a heparina inibe a atividade de MNase, enquanto o poli-ácido glutâmico não teve nenhum efeito. O mesmo resultado foi obtido quando a taxa de digestão do DNA nú pela MNase foi monitorada por hipercromicidade [aumento da absorção de luz. Stedman] usando-se um gravador de espectrômetro (resultados não mostrados). Assim, a explicação mais aceitável para a curva bifásica da heparina na figura 2(b) é que a heparina em baixas concentrações liga-se às histonas e aumenta a disponibilidade do DNA para a digestão, mas em altas concentrações o excesso de heparina livre a torna disponível para a inibição direta da MNase. Esses dados sugerem que a heparina e o poli-ácido glutâmico atuam similarmente na alteração da estrutura da cromatina.

A Extração das Histonas da Cromatina Induzida por Poli-ânions não é a Causa Primária do Aumento da Suscetibilidade à MNase.

Para determinar a extensão em que os poliânions extraem as histonas da cromatina, a cromatina de timo de vitelo foi incubada com várias concentrações de heparina ou poli-ácido glutâmico e então depositada na ultra-cientrífuga. Análises das histonas nos depósitos e nas frações sobrenadantes foram concluídas usando-se PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida). A figura 3 mostra que há alguma extração de H2A (histona 2 A) e de H2B sob concentrações moderadas de heparina. Varreduras densiométricas desses geles indicam que houve menos de 15% de perda de H2A e H2B sob o nível 0,3 de heparina. Além disso, ainda em altas concentrações, o poli-ácido glutâmico remove quantidades negligenciáveis de cerne de histona da cromatina do timo de vitelo, embora a H1 seja removida nas mais altas concentrações testadas.

Comparando os dados de digestão pela MNase na cromatina tratada com heparina na figura 2 com a extração de histona induzida por heparina mostrada na figura 3, é aparente que a suscetibilidade próxima ao máximo para a digestão pela MNase seja alcançada no valor da razão de heparina/DNA de 0,2 sob o qual se leva à substancial extração de H2A e H2B. Para o poli-ácido glutâmico, dificilmente qualquer dos cernes de histona parece ser extraído em razões de poli-ácido glutâmico/DNA acima daquelas que deram vez à máxima suscetibilidade da cromatina à digestão por MNase. Assim, a suscetibilidade aumentada para o ataque da MNase à cromatina tratada com poliânion não parece correlacionar-se com a extração da histona.

Os Efeitos da Tripsina e da Heparina Não São Aditivos.

A similaridade dos limites da digestão por MNase com a digestão por tripsina ou tratamento com heparina sugere que a heparina interage com as mesmas regiões das histonas que a tripsina o faz, na cromatina. Para comparar diretamente a cromatina tratada com tripsina e com heparina , a cromatina digerida com tripsina foi tratada adicionalmente com heparina antes da digestão pela MNase. A Tabela 1 demonstra que a sujeição da cromatina a digestão por tripsina e a tratamento com heparina têm o mesmo efeito na acessibilidade da cromatina à MNase como ocorre com o tratamento com tripsina ou heparina isoladamente. Essa completa falta de aditividade entre a tripsina e a heparina sustenta a noção de que a heparina interage com os mesmos domínios de histona que a tripsina, denominados H1 e caule terminal em N do cerne das histonas.

Análises dos Nucleossomos Tratados com Heparina no Gradiente de Sacarose.

Porque a heparina aumenta a acessibilidade da cromatina à MNase e à DNAse I, a heparina deve funcionar pelo relaxamento da ligação de histona e desdobramento parcial do nucleossomo. Para examinar ainda mais essas possibilidades, monômenos de nuclossomo livres de de histona H1 lavados de sais foram tratados com várias concentrações de heparina contendo rastreadores tritiados [que contém átomos de trítio, o hidrogênio 3.Stedman] e foram centrifugados através de um gradiente de sacarose de 5 a 25% -(w/v). A figura 4 demonstra que os nucleossomos tratados com heparina sedimentam-se mais lentamente e geram um pico mais nítido do que os nucleossomos não tratados. A heparina tritiada é encontrada nos nucleossomos sedimentando-se lentamente, marcando a heparina ligada aos nucleossomos. Além disso, a heparina tritiada que se liga aos nucleossomos parece sofrer pouca ou nenhuma troca com a heparina livre, já que os padrões de sedimentação da heparina tritiada e dos nucleossomos não são mudados quando a heparina não etiquetada está presente em todo o gradiente de sacarose. Algumas etiquetas, parte das quais pode representar a heparina tritiada degradada, permanecem no topo do gradiente junto com quantidades menores de histonas H2A e H2B livres, enquanto nenhuma histona ou heparina é encontrada no fundo do tubo.

Para verificar que o efeito da heparina no aumento da disponibilidade do DNA nucleossômico ao ataque da MNase é fartamente independente da habilidade de extração das histonas H2A e H2B, os nucleossomos tratados com heparina do segundo gradiente mostrados na figura 4 foram caracterizados segundo seus conteúdos de histona e acessibilidade à digestão por MNase do pico das frações da região do monossomo . A figura 5 e varreduras densiométricas demonstram que esses nucleossomos sedimentados contém quantidades normais de quatro histonas do cerne, ligam-se a heparina, e exibem máxima suscetibilidade à digestão por MNase. Tomados juntos, esses dados indicam que a heparina liga-se fortemente aos nucleossomos e os desdobra parcialmente.

A Heparina não se Liga aos Nucleossomos Digeridos pela Tripsina.

A Tabela 1 mostra que a heparina não tem efeitos na acessibilidade da MNase à cromatina digerida quando a cromatina é digerida por tripsina, indicando que a heparina se liga aos domínios das histonas sensíveis à tripsina. Para testar a ligação da heparina em regiões do cerne de histonas sensíveis à tripsina definitivamente, nucleossomos digeridos por tripsina foram tratados com heparina tritiada e então centrifugados em um gradiente de 5 a 25% de sacarose como anteriormente. A figura 6 demonstra claramente que a heparina não se liga a nucleossomos digeridos pela tripsina. Análises PAGE do pico das frações no gradiente revelaram o padrão típico de digestão limitada pela tripsina das histonas. Esses resultados indicam fortemente que a heparina se liga às regiões das histonas sensíveis a tripsina no cerne do nucleossomo.

DISCUSSÃO

A Heparina Desdobra a Cromatina e Aumenta a Acessibilidade à Cromatina.

As figuras 1 e 2 demonstram que, quando a cromatina é tratada com poliânions heparina ou poli-ácido glutâmico, o DNA contido dentro da cromatina torna-se marcadamente mais acessível à digestão por MNase. O limite de digestão por MNase é conhecido por depender das interações da histona com DNA, tanto que a heparina provavelmente rompe as ligações do DNA com a histona. Embora a heparina e o poli-ácido glutâmico hajam de extrair certas espécies de histona da cromatina em concentrações suficientemente altas, a acessibilidade máxima da cromatina à MNase é observada em baixas concentrações de poli-ânions, onde pouca histona é removida pela heparina e nenhuma por poli-ácido glutâmico. Assim as características alteradas da digestão por MNase da cromatina tratada tratada com poli-ânions não é devida à extensiva extração de histona, mas sim a uma perturbação nas interações das ligações da histona com o DNA de nucleossomos por outro lado intactos.

Em adição à aumentada sensibilidade à MNase, o tratamento dos nucleossomos com a heparina leva à sedimentação mais lenta nos gradientes de sacarose, sugerindo que os nucleossomos são desdobrados pela heparina. Esse resultado é consistente com os relatos de que a cromatina tratada com heparina teve a sensibilidade aumentada para DNAase I, estabilidade térmica diminuída, e um espectro c.d. mais parecido com o do DNA livre. Tomados juntos, esses dados indicam que a heparina aumenta a transcrição e a replicação pelo desdobramento da cromatina e aumento da acessibilidade à cromatina.

A Heparina Interage com a Histona H1 Sensível à Tripsina e com os Caules Terminais em Amina dos Cernes das Histonas.

A digestão da cromatina ou nucleossomos pela tripsina gera um padrão similar de fragmentos de digestão, P1-P5, os quais consistem principalmente de domínios terminais em carboxila globulares dos cernes das histonas H2A, H2B, H3, e H4. No núcleo, o cerne globular central da H1 também está protegido da tripsina. Na cromatina, acredita-se que a histona H1 e os caules terminais em amina básicos de 20 a 30 resíduos são preferencialmente degradados, devido a sua acessibilidade à tripsina mais do que à especificidade da enzima, já que a digestão da cromatina pela quimio-tripsina fornece o mesmo padrão de limite de digestão. Além disso, os caules altamente básicos no terminal amina da histona H1 removidos pela tripsina têm sido identificados carecendo de acetilação da estrutura secundária da histona e são conhecidos como sítios de acetilação e fosforilação de histona ‘in vivo’. Em contraste, os domínios globulares dos terminais carboxila dos cernes de histonas falham em ligarem-se a anticorpos anti-histona (Goldblatt & Bustin, 1975) e são responsáveis pelas interações entre as histonas no cerne do octâmero de histona [obs.: octâmero de histona se compõe de [(H3-H4)2(H2A-H2B)2], sendo (H3-H4)2 um tetrâmero e H2A-H2B um dímero PMID: 19914933].

Várias linhas de evidência indicam que a heparina interage principalmente com os domínios da histona sensíveis a tripsina. Primeiro, a cromatina tratada com tripsina foi descrita aumentado a sensitividade a DNAase I, reduzindo a estabilidade térmica e como um transformadorador do espectro c.d. rumo ao DNA livre que relembra estritamente mudanças similares encontradas na cromatina tratada com heparina. Em segundo lugar, a cromatina tratada com heparina ou com tripsina tem níveis equivalentes de sensibilidade a MNase. Em terceiro, após a cromatina ser digerida com tripsina, a adição de poli-ânions não tem efeito adicional na acessibilidade do DNA cromossômico à MNase. Finalmente, os nucleossomos digeridos pela tripsina não se ligam mais a heparina. Tomados juntos com esses dados mostrando que os caules do terminal em amina e da H1 do cerne das histonas são preferencialmente acessíveis às acetilases, fosfatases, anticorpos anti-histonas e proteinases, os resultados descritos aqui proporcionam evidência convincente de que a heparina interage preferencialmente com a H1 e com os caules do terminal N do cerne das histonas. Dados os padrões de ligação da heparina às histonas, a heparina pode ser postulada por aumentar a acessibilidade da cromatina por mascarar as cargas eletrostáticas dos resíduos de lisina e arginina na histona H1 e os caules terminais em amina do cerne das histonas.

Já que a histona H1 é a principal histona envolvida na ordem superior de dobramento da cromatina, as interações da heparina com a H1 poderiam contribuir para todos os efeitos da heparina sobre a acessibilidade da nuclease na cromatina. Entretanto, os dados na figura 5 argúem contra a possibilidade de que os efeitos da heparina na cromatina dependam somente das interações com a H1. Enquanto a sensibilidade dos nucleossomos à MNase é marcadamente aumentada pela remoção da H1, nucleossomos livres de H1 tornam-se ainda mais acessíveis à digestão pela MNase após o tratamento com heparina. Esses resultados sugerem fortemente que os aumentos na acessibilidade à cromatina induzidos por heparina envolvem interações dos poli-ânions com ambos a H1 e o cerne das histonas.

O Desdobramento Induzido pela Heparina Proporciona um Modelo para as Alterações na Estrutura da Cromatina Requerida para a Transcrição?

Genes ativos são preferencialmente acessíveis à DNAase I, DNAase II e MNase. A sensibilidade preferencial de genes ativos à DNAase I é reduzida pela digestão pela tripsina, tanto que os domínios de histona disponíveis à tripsina e aos poli-ânions são aceitáveis por atuarem num papel proeminente na cromatina ativa. As proteínas do grupo de alta mobilidade, as quais tem um grande conteúdo de resíduos de aminoácidos ácidos em um domínio, representam uma classe de não-histonas ocorrendo naturalmente que podem funcionar de um modo imitado pela heparina ou poli-ácido glutâmico. As proteínas do grupo de alta mobilidade têm sido localizadas em regiões ativamente transcritas e têm sido relatadas por promoverem a sensibilidade à DNAase I.

Experimentos genéticos recentes têm demonstrado que o cerne de histonas ou a região terminal em amina da histona H4 pode reprimir a iniciação da transcrição de vários genes. Por outro lado, muitos fatores de transcrição podem contrariar a repressão mediada pela histona. Os domínios de ativação de muitos fatores de transcrição contém resíduos ácidos que podem formar uma hélice alfa anfipática [qualidade de uma molécula que tem características opostas, por exemplo: propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas. Stedman. A ceruloplasmina pode ser oxidativa e redutora.] com resíduos negativamente carregados enfileirados ao longo de uma superfície. Enquanto os fatores de transcrição são considerados por ligarem-se uns aos outros, a ativação ácida dos domínios também pode contrariar a repressão mediada pelas histonas pela ligação aos resíduos de arginina e lisina sensíveis à tripsina na H1 e nos caules terminais em amina do cerne de histonas com postulado pela heparina no presente papel.

Fonte: FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1131979/?tool=pubmed