O Óxido Nítrico Inibe a Apoptose Dependente do Receptor de Transferrina Induzida Por Peróxido de Hidrogênio nas Células Endoteliais: Papel da Via Ubiquitina-Proteossomo

Srigiridhar Kotamraju,* Yoshiko Tampo,* Agnes Keszler,* Christopher R. Chitambar,† Joy Joseph,* Arthur L. Haas,‡ and B. Kalyanaraman

RESUMO

Nós investigamos aqui o mecanismo de cito-proteção do óxido nítrico (NO) nas células endoteliais da aorta bovina tratadas com H2O2 (peróxido de hidrogênio). NONOatos foram usados como doadores de NO que liberaram o NO lentamente em uma taxa bem definida nos ambientes extracelular e intracelular. A fluorescência de diclorofluoresceína intracelular mediada por H2O2 e a apoptose foram aumentadas pela captura de ferro mediada pelo receptor de transferrina (TfR). A NO inibiu a captura de ferro mediada pelo TfR, a fluorescência da diclorofluoresceína e a apoptose nas células tratadas com H2O2. A NO aumentou a atividade proteossômica e a degradação de TfR nitrados por via da ubiquitinação. O metil éster Nω-nitro-L-arginina, um inibidor não específico da biossíntese endógena de NO, diminuiu a atividade típica de tripsina da unidade 26S do proteossomo. O NO, pela ativação da proteólise, alivia a captura de ferro dependente de TfR, a oxidação da diclorohidrofluoresceína e a apoptose das células endoteliais de aorta bovina tratadas com H2O2. A relevância da nitração biológica na sinalização redox é discutida. [Redox é a contração oxidação-redução.Sinônimo: oxidorredução. Stedman]
[Obs.: A maioria dos NONOatos são estáveis em solução alcalina em torno de pH 8.0 (exemplo 10 mM de NaOH) e podem ser estocados a menos 20oC dessa forma por curto prazo. Para gerar NO a partir de NONOatos, o pH é rebaixado de acordo. Tipicamente, uma diluição da reserva da solução de NONOatos é feita em um tampão de fosfato (pH 7.4) e incubada na temperatura ambiente pelo tempo desejado para permitir ao NO acumular-se na solução. http://en.wikipedia.org/wiki/NONOate]

TEXTO

Embora numerosos estudos tenham focalizado na interação celular entre o óxido nítrico (NO) e no ânion de superóxido (O2-), sabe-se relativamente pouco sobre os efeitos celulares induzidos pelo NO e o H2O2. Esses efeitos celulares incluem a homeostase do ferro, estresse oxidativo, nitrativo e nitrosativo (nitroso é um composto nitrogenado com menos um átomo de oxigênio do que os compostos nítricos e em que o nitrogênio está presente em sua forma trivalente. Stedman), proliferação celular e apoptose. O efeito citoprotetor do NO contra a toxidade celular mediada pelo H2O2 tem sido atribuído à quelação do ferro, reciclagem de radicais, e restauração da respiração mitocondrial. Recentemente nós relatamos que a apoptose endotelial induzida por H2O2 era mediada pela captura de ferro celular dependente do receptor de transferrina (TfR), pois o bloqueio da captura de ferro por um anticorpo anti-TfR (de classe IgA) aboliu completamente o estresse e a apoptose oxidativa induzida pelo H2O2. A liberação de NO por suas moléculas doadoras inibiu a apoptose induzida por hidroperóxido nas células endoteliais. Dessa forma, o efeito anti-apoptótico do NO pode estar relacionado à regulação da sinalização celular do ferro.As células endoteliais adquirem ferro através dos TfRs localizados na superfície celular. Células expostas ao hidroperóxidos (H2O2) aumentam a expressão de mRNA de TfR resultante da indução da proteína 1 regulatória do ferro (IRP-1), citosólica e com 98 quilo-dáltons. Sob essas condições, a síntese de ferritina, um proteína intracelular de estocagem do ferro, diminui. As sínteses de TfR e de ferritina são reguladas pelo ferro no nível da tradução do mRNA pela interação das IRPs citoplasmáticas com os seus respectivos mRNAs. Tióis nitrosos têm sido mostrados por ativarem as IRPs através da nitrosação de cisteínas presentes nas IRPs. O objetivo desse estudo foi investigar o efeito do NO na sinalização do ferro mediada pelo TfR e a apoptose nas células endoteliais expostas a H2O2.

Células revestidas com a acumulação de proteínas oxidizadas, nitradas e nitrosadas aumentaram a proteólise. A degradação proteolítica celular envolve a ubiquitinação pós-tradução de proteínas modificadas. Este estudo testou duas hipóteses: 1) o efeito cito-protetor do NO é devido à estimulação da via do proteossomo pela ubiquitina (Ub), e 2) o NO regula a sinalização do ferro induzida por oxidante, a homeostase intracelular do ferro e o estresse oxidativo através da ativação proteolítica aumentada. Os resultados mostram que o NO, tanto exógeno quanto endógeno, aumenta a atividade proteossômica nas células endoteliais, e os inibidores do proteossomo abolem a cito-proteção mediada pelo NO.

RESULTADOS

Efeito do NO na Oxidação Intracelular de DCFH (2’,7’-diclorodihidrofluoresceína) Induzida por H2O2 e Apoptose.

As células BAECs (células endoteliais da aorta bovina) foram tratadas com H2O2 (1μM/min) geradas de glucose/GO (glucose oxidase). Antes da adição do DCFH-DA (2’,7’-diclorodihidrofluoresceína diacetato), as células foram lavadas livres de glucose/GO. A oxidação intracelular da prova ativa carboxi-DCFH para diclorofluoresceína (DCF), um agente fluorescente, produto da oxidação de dois elétrons, foi medida. A intensidade da fluorescência de DCF estava perto de 1000 vezes maior nas células endoteliais da aorta bovina do que no controle após um trataento com glucose/GO por quatro horas. A fluorescência da DCf intracelular induzida pelo H2O2 quase totalmente abolida pela DETA/NO (NONOato dietilenetriamina) que lentamente liberou NO (7,2 nM/min). As BAECs tratadas com H2O2 e DETA/NO foram extensivamente lavadas antes da adição da DCFH-DA. A figura 1C mostra que o tratamento com DETA/NO inibe a liberação do citocromo c da mitocôndria para dentro do citosol nas BAECs tratadas com glucose/glocose oxidase por oito horas. Após o tratamento das BAECs com H2O2 por oito horas, a atividade proteolítica da caspase 3 aumentou perto de cinco vezes em comparação com o controle. A DETA/NO diminui grandiosamente a ativação da caspase 3 de células tratadas com H2O2 , o que está consistente com a interpretação de que a liberação do citocromo c no citosol é um pré-requisito para a ativação da caspase 3. A apoptose foi adicionalmente confirmada pelo uso da técnica de etiquetamento do final dUTP (desóxi uridina trifosfato?) mediado pela desoxinucleotidiltransferase terminal (TUNEL). Os resultados mostraram que a incubação com DETA/NO (50 a 100 µM) diminuiu substancialmente a fração das BAECs positivas do TUNEL após o tratamento com glucose/glucose oxidase por oito horas.

A adição de DETA/NO (dietilenotriamina/NONOato) não afetou o H2O2 liberado pela glucose/glucose oxidade. Evidência adicional para o efeito inibidor do NO em danos oxidativos dependentes de H2O2 foi obtida pelo uso de doador de NO intracelular. Porque o NO extracelular é predominantemente oxidizado a NO2-/NO3-, concentrações relativamente mais altas (50 a 100 μM) de DETA/NO foram requeridas. Em contraste, o pró doador de NO específico de célula permeável a esterase AcOM-PYRRO/NO libera NO intracelularmente. [Obs.: esterase é um termo genérico para enzima. Stedman.] Assim, baixas concentrações (1 µM) de AcOM-PYRRO/NO inibiram o estresse oxidative induzido pelo H2O2. Esses resultados mostram que o NO mitiga (alivia) a formação de oxidantes intracelulares dependentes de H2O2 e a apoptose nas células endoteliais.


Efeito do NO em Alterações Induzidas por H2O2 em GSH (glutationa), Aconitase e Atividades de IRP-1

[OBS.: Aconitase citoplasmática – omim 100880 – 9p22-p13 – A ACO1, ou IRP1 (Proteína 1 Regulatória de Ferro), é uma proteína bifuncional com funções mutuamente exclusivas enquanto uma proteína de ligação a elemento responsivo a ferro (IRE) envolvida no controle do metabolismo do ferro ou como a isoforma citoplasmática da aconitase. As aconitases são proteínas e ferro e enxofre que requerem o conjunto de 4Fe-4S (quatro ferros e quatro enxofres) para sua atividade enzimática, no qual elas catalisam a conversão de citrato a isocitrato.
A aconitase-1 funciona como uma proteína de ligação a IRE (IREBP). Os IREs são sequências regulatórias da tradução na extremidade 5 da UTR (região não traduzida) do mRNA da ferritina (veja omim 143790) e na extremidade 3 da UTR do mRNA do receptor de transferrina (omim 190010). A IREBP citoplasmática interage com os IREs desses mRNAs. O estatus do ferro na célula determina a habilidade da IREBP em ligar-se a um IRE através da redução-oxidação reversível dos grupos sulfidril que são críticos para a alta afinidade da interação proteína-RNA. Assim, a IREBP atua num papel central na homeostase celular do ferro regulando a tradução do mRNA de ferritina e a estabilidade do mRNA de TFRC.

Obs.: Aconitase miticondrial (omim 100850 - 22q11.21-q13.31 – Mirel e outros (1998) clonaram e caracterizaram a essencial enzima metabólica dependente de ferro ACO2. Eles mostraram que o mRNA da ACO2 tem 2,7 quilobases de comprimento e é expressado ubiquamente. Eles detectaram múltiplas isoformas da proteína ACO2.
Em ensaios da proteína purificada da mitocôndria no coração bovino, Bota e Davies (2002) encontraram que a protease Lon seletivamente reconhecia e degradava a forma hidrofóbica oxidada da aconitase após modificações oxidativas moderadas. A oxidação severa resultava em uma agregação da aconitase, tornando-a um substrato pobre para a Lon {LON omim 605490 - 12p13.2 – Nos eucariotos, a proteólise dependente de ATP é concluída através da conjugação à ubiquitina (omim 191339) e pela protease 26S (veja PSMD5; omim 604452). As proteases Lon e Clp mediam a proteólise dependente de ATP nos procariotos e parecem quase distintas da protease 26S. Organelas eucariotas, entretanto, podem ter sistemas proteolíticos independentes.}.
Bulteau e outros (2004) descobriram que a atividade de aconitase pode passar por modulação dependente de citrato em resposta a pró-oxidantes. A Frataxina (omim 606829 – 9q13 – a frataxina é uma chaperone mitocondrial de ferro codificada no núcleo celular envolvida na biogênese de enxofre e ferro e na biossíntese de heme. Alguns estudos também sugeriram que a Frataxina funciona como uma molécula de estoque de ferro, um anti-oxidante e um supressor de tumor.) interagiu com aconitase de modo dependente de citrato e converteu a enzima inativa [3Fe-4S]1+ para a forma ativa da proteína [4Fe-4S]2+. Bulteau e outros (2004) concluíram que a frataxina é uma proteína chaperone de ferro que protege o conjunto aconitase [4Fe-4S]2+ da desagregação e promove a reativação da enzima.]Porque o NO inibiu fortemente o estresse oxidante induzido por H2O2, nós avaliamos o papel do NO nos níveis intracelulares de GSH e atividade total da aconitase. [Obs.: GSH é glutationa – um tripeptídeo da glicina, da Lcisteína e do L-glutamato com o L-glutamato que possui uma ligação isopeptídica com o radical amino da L-cisteína; é o tiol não-protéico mais prevalente. O dissulfeto de glutationa consiste em duas glutationas ligadas por uma ponte disulfeto. A deficiência de glutationa pode causar hemólise com estresse oxidativo. Também é utilizada no curso do metabolismo intermediário como uma doadora de grupamentos tiol (SH). A glutationa oxidada age nas células como um receptor de hidrogênio; é reduzida pela glutationa redutase; é o dissulfeto de glutationa e o termo dissulfeto já inclui sulfonas e sulfóxidos que já são oxidados. A glutationa peroxidase é uma enzima que catalisa a reação de duas glutationas com peróxido de hidrogênio (H2O2 ) formando dissulfeto de glutationa e duas moléculas de água; uma enzima fundamental na detoxificação do peróxido de hidrogênio.Stedman] As BAECs foram tratadas com glucose/glucose oxidase por quatro horas com e sem DETA/NO (dietilenotriamiamina/NONOato). A figura 2 A mostra que os níveis de GSH foram diminuídos em mais de 50% após as quatro horas de tratamento com H2O2. Entretanto, a adição de DETA/NO (50 e 100 μM) aumentou os níveis de GSH de 2,3 nmol/mg de proteína para 4 e 5 nmol/mg de proteína em células tratadas com H2O2. A DETA/NO sozinha não afeta os níveis de GSH significativamente. A atividade de aconitase foi medida no citosol e na mitocôndria das células BAECs tratadas com glucose/glucose oxidase na presença e na ausência de DETA/NO. O NO inibiu marcadamente a inativação, induzida por H2O2 , da atividade da aconitase mitocondrial mas não da atividade da aconitase citosólica

Resultados prévios indicam que a oxidação das DCFH (diclorodihidrofluoresceínas) dependente de H2O2 é devida a um aumento dos níveis de expressão dos TfR e da captura de ferro dependente dos TfR. A figura 2D mostra que a expressão dos TfR aumenta significativamente nas BAECs tratadas com glucose/glucose oxidase, enquanto na presença de DETA/NO (NONOato dietilenotriamina), a expressão dos TfRs é inibida. Sendo a síntese de TfR regulada pela ligação da IRP (Proteína Regulatória do Ferro) ao IRE (Elemento Responsivo à Ferro) e a atividade da IRP-1 estimulada pelo H2O2, nós avaliamos os efeitos da DETA/NO (dietilenotriamina/NONOato) na atividade da IRP-1 nas células BAEC tratadas com glucose/glucose oxidase. Para determinar se o aumento na atividade da IRP-1 com tratamento com H2O2 e DETA/NO era devido a um aumento na IRP-1 total, os lisados foram tratados com 1% de 2-mercaptoetanol [mercapto é um prefixo que indica a presença de um grupamento tiol (SH). Stedman] , o qual ativa a IRP-1 em sua forma de ligação a RNA com alta afinidade. Sob essas condições, as principais diferenças na ligação da IRP-1 ao IRE não foram observadas entre os controles e outros grupos de tratamento. A falta de inibição do NO sobre a ligação IRP-1/IRE nas células tratadas com H2O2 confunde, porque o NO diminuiu marcadamente a expressão do TfR nas células BAECs tratadas com H2O2. Uma explicação aceitável é que a diminuição na expressão do TfR (nas células) em DETA/NO- H2O2 é devida ao aumento da degradação dos TfR pelo sistema do proteossomo. Por isso, as células foram pré-incubadas com Lac, um inibidor de protease específico do proteossomo que modifica covalentemente duas sub-unidades beta do proteossomo. Na presença de Lac, a expressão do TfR nas células tratadas com H2O2 e DETA/NO aumentou. O aumento na expressão do TfR pelo inibidor de protease, Lac, sugere que o TfR provavelmente sofre degradação proteolítica na presença de NO e de H2O2. Esses resultados sugerem que o NO possivelmente modula a sinalização do ferro mediada por H2O2 e o estresse oxidativo pela estimulação da atividade do proteossomo.


O Efeito dos Inibidores de Proteossomo no Decréscimo do Estresse Oxidativo Celular Mediado pelo NO.

A próxima etapa foi identificar se os inibidores de proteossomo poderiam aumentar a captura de ferro e a oxidação de DCFH (diclorodihidrofluoresceína) nas células tratadas com H2O2. As células endoteliais foram pré-tratadas com vários inibidores de proteossomo (10 µM de Lac, 10 μM de MG-132, e 2 µM de epoxomicina). Os inibidores de proteossomo sozinhos, nas concentrações usadas não induzem nenhum estresse oxidativo ou apoptose nas BAECs. A oxidação da diclorohidrofluoresceína aumentou nas células pré-tratadas com inibidores de proteossomo por duas horas e expostas à glucose/glucose oxidase e DETA/NO. Entretanto, a fluorescência da diclorofluoresceína foi eliminada completamente nas células tratadas com o anticorpo anti-TfR (de classe IgA) que se liga especificamente ao domínio extracelular do TfR e inibe a endocitose do receptor.

Para provar o envolvimento do ferro, a captura do ferro etiquetado (55Fe) na presença da Lac foi medida. A captura do 55Fe foi perto de 2,3 vezes maior nas células tratadas com H2O2 do que nas células de controle. Não havia aumento na captura do 55Fe com DETA/NO. Esse achado é consistente com o decréscimo nos níveis de TfR observado nas células endoteliais da aorta bovina (BAECs) tratadas com H2O2 do que nas células de controle. O tratamento com Lac contrabalançou o efeito da DETA/NO, como evidenciado pelo aumento na captura de 55Fe nas células tratadas com Lac. A inibição do proteossomo com Lac também reverteu o efeito anti-apoptótico do NO. A figura 3C mostra que a Lac causou um aumento na atividade da caspase 3 nas células tratadas com H2O2 e com NO. Esses resultados sugerem que o efeito cito-protetor e anti-oxidativo da DETA/NO provavelmente é devido à estimulação do proteossomo.

Então nós presumimos que o NO protege contra o estresse oxidativo nas células tratadas com H2O2 através da ativação da proteólise intra-celular, a acumulação celular de proteína oxidada poderia ser inibida. Os níveis de proteínas com carbonila [grupamento CO das cetonas, aldeídos e ácidos orgânicos. Stedman] eram significamente maiores nas células tratadas com glucose/glucose oxidase do que nas células não tratadas. Entretanto, os níveis de proteínas carbonila eram diminuídos drasticamente na presença de DETA/NO. Na presença de Lac, as proteínas carbonilas foram aumentadas. Coletivamente, esses resultados indicam um papel anti-oxidante descaracterizado previamente para o NO como um estimulador da função do proteossomo.


Recentemente, um aumento na nitração das proteínas foi detectado em presença de NO, H2O2 e Ferro. O decréscimo nos níveis de TfR casou com o aumento da atividade do proteossomo nas células tratadas com DETA/NO e H2O2 e nos prontificou a examinar se o TfR é modificado pela nitração. A nitração do TfR foi avaliada por imunoprecipitação do TfR e pela prova deste com um anti-corpo monoclonal anti-nitro-tirosina. A nitração do TfR aumentou nas BAECs tratadas com H2O2 e Deta/NO por quarto horas. Os níveis de TfR nitrados, entretanto, decresceram durante um tempo prolongado de incubação (mais de seis horas). Isso provavelmente é devido à estimulação da atividade do proteossomo pelo NO.


Efeito do NO nas Atividades das Sub-Unidades 20S e 26S do Proteossomo: Degradação de TfR Nitrado por Ubiquitinação.

A degradação de proteínas, modificadas por oxidação ou nitradas, pelo proteossomo poderia ocorrer por um mecanismo dependente de ubiquitina ou independente. Por isso as atividades de peptidase das sub-unidades 26S e 20S do proteossomo em células tratadas com DETA/NO somente e na presença de H2O2 foram medidas. O tratamento das BAECs por seis horas com glucose/ glucose oxidase anulou quase totalmente ambas as atividades típicas de quimiotripsina e de tripsina da sub-unidade 26S do proteossomo. A DETA/NO sozinha aumentou significativamente a atividade típica de quimiotripsina nas células. As atividades da enzima permaneceram elevadas nas células durante o tratamento combinado de H2O2 e DETA/NO, sugerindo que o NO aumenta as atividades proteolíticas nas células endoteliais tratadas com H2O2. As atividades das sub-unidades 26S e 20S do proteossomo foram medidas na presença ou ausência da Lac e MG-132. Ambas a Lac e a MG-132 inibiram as atividades do proteossomo estimuladas pelo NO. Esses resultados indicam que o NO ativa a atividade do proteossomo nas células endoteliais tratadas com H2O2.

A ubiquitinação total das proteínas celulares e sua degradação na presença do H2O2 e da DETA/NO foi então investigada. As BAECs foram tratadas com glucose/glucose oxidase e sem DETA/NO por seis horas. A figura 4D mostra que o tratamento com glucose/glucose oxidase não altera as proteínas ubiquinadas em comparação com as células de controle, sugerindo que a ubiquitinação por si só não é afetada pelo H2O2 quando as células são tratadas por seis horas sob essas condições experimentais. A ubiquitinação das proteínas estava drasticamente mais baixa nas células tratadas com glucose/glucose oxidase e DETA/NO, o que é consistente com um aumento na atividade da sub-unidade 26S do proteossomo, levando a uma taxa aumentada da degradação de proteínas ubiquinadas.

Depois nós investigamos se a degradação do TfR depende da ubiquitinação dessa proteína. As células foram tratadas com glucose/glucose oxidase por seis horas e sem DETA/NO, e os extratos de células foram imunoprecipitados com um anticorpo monoclonal anti-TfR, dissipadas em um SDS/5% PAGE, e provadas com um anticorpo policlonal anti-ubiquitina. A Figura 4F mostra que o TfR submete-se à degradação dependente de ubiquitina, e que o TfR ubiquitinado (Ub-TfR) aumenta em células tratadas com H2O2 e diminui em células tratadas com H2O2 e DETA/NO. Isso está em consistência com as atividades aumentadas do proteossomo na presença de H2O2 e DETA/NO. Finalmente, nós investigamos os efeitos da Nω-nitro-L-arginina metil Ester (L-NAME) e sua análoga estrutural inativa (Nω-nitro-D-arginina metil Ester) na atividade da sub-unidade 26S do proteossomo. A L-NAME, um inibidor não específico da atividade da NO sintase (NOS), diminuiu a atividade típica de tripsina de modo dependente da dose. Isso sugere que o NO endógeno gerado pela NOS endotelial é essencial para a manutenção da atividade inerente ao proteossomo.

DISCUSSÃO

Esse estudo encontrou que o NO liberado lentamente por doadores de NO inibe a sinalização do ferro mediada pelo recpetor de transferrina (TfR), a oxidação intracelular da dioclorodihidrofluoresceína, e a apoptose nas células endoteliais tratadas com H2O2. O NO aumentou a nitração do TfR e a atividade proteossômica. A inibição da NO sintase diminuiu a atividade do proteossomo. Nós sugerimos que, pela estimulação da proteólise, o NO inibe a captura do ferro mediada pelo TfR, o estresse oxidativo, e a sinalização apoptótica em células endoteliais tratadas com H2O2.


O Envolvimento do TfR na Sinalização do Ferro Induzida por Peróxido de Hidrogênio, Estresse Oxidativo e Apoptose.

Relatos indicam que o dano celular causado por espécies de oxigênio reativo e nitrogênio é criticamente controlado pela homeostase intracelular do ferro. A exposição dos fibroblastos murinos ao H2O2 aumenta a expressão do mRNA de TfR e a fluorescência da diclorofluoresceína, implicando num elo em potencial entre o estresse oxidativo e a captura de ferro mediada pelo TfR. Recentemente nós mostramos que a adição exógena de um bolo [uma quantidade única, relativamente grande, de uma substância, geralmente aquela destinada a uso terapêutico, como uma dose maciça de um medicamento injetado por via intravenosa. Stedman] ou de H2O2 gerado continuamente para as células endoteliais causa uma oxidação aumentada da diclorodihidrofluoresceína a diclorofluoresceína que é regulada pela captura do ferro da transferrina mediada pelo TfR. O bloqueio da captura do ferro pelo anticorpo anti-TfR (de classe IgA) que se liga especificamente ao domínio extracelular do TfR abple a fluorescência da diclorofluoresceína induzida pelo H2O2. Esse achado intrigante sugere que a oxidação intracelular da diclorodihidrofluoresceína é catalisada por ambos o H2O2 e o ferro transportado pelo TfR. Aqui nós mostramos que o NO gerado pela DETA/NO regula para menos a expressão do TfR em células tratadas com H2O2 e inibe a captura de ferro mediada pelo TfR. Consequentemente, a oxidação da diclorodihidrofluoresceína intracelular diminui. Em células tratadas com Lac, os níveis de TfR fora regulados para mais, o que levou a uma aumentada captura de ferro e oxidação da diclorodihidrofluoresceína.

Nossos resultados demonstram que a ativação da caspase induzida pelo H2O2 é acompanhada por um aumento na captura de ferro mediada pelo TfR. A liberação do NO a partir da DETA/NO inibe a apoptose induzida pelo H2O2 e a captura de ferro mediada pelo TfR. Assim, o TfR atua como um efetivo “portão de entrada” e modulador da apopose endotelial induzida pelo H2O2. O NO alivia o estresse oxidativo induzido pelo H2O2 e a apoptose endotelial pela inibição da sinalização do ferro.


Degradação das Proteínas pelo Efeito do NO Modulador da Rota da Ubiquitina-Proteossomo.

A via da Ubiquitina-Proteossomo atua num papel principal na quebra das proteínas modificadas oxidativamente que por outro lado romperiam a função normal da célula. A proteína mirada para degradação é fixada covalentemente a várias moléculas de ubiquitina, uma proteína de 76 aminoácidos. A nitração mira tipicamente as proteínas modificadas para ubiquitinação e rápida degradação pelas sub-unidades 26S dos proteossomos. A proteína ubiquinada é subsequentemente escoltada à sub-unidade 26S do proteossomo onde se submete à degradação por meio de uma via envolvendo uma série de enzimas chamadas E1, E2 e E3. O cerne proteolítico do complexo 26S, a sub-unidade 20S do proteossomo, contém múltiplas atividades de peptidase incluindo a atividade de tipo quimiotripsina (uma endopeptidade de serina que hidrolisa as ligações peptídicas presentes no grupo carboxila de aminoácidos hidrofóbicos como a fenilalanina). A atividade de tipo quimiotripsina foi considerada crucial para a remoção de proteínas nitradas no plasma. As proteínas nitradas (ex. gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foram mostradas enquanto indutoras da via ubiquitina-proteossomo.


Os doadores de NO induziram a nitração de proteínas por meio de um mecanismo envolvendo ferro ativo em redox e H2O2. Similarmente, a proteína TfR foi nitrada na presença de ferro, H2O2 e NO. O TfR nitrado foi subsequentemente mirado para a degradação proteossômica. Trabalhos prévios mostraram que a atividade de enzimas conjugando-se a ubiquitina (E1 e E2) é reversivelmente inibida durante o estresse oxidativo, Os dados presentes mostram que ambos os sistemas 20S e 26S do proteossomo são inativados pela glucose/glucose oxidase, a qual efetivamente comprometeu a remoção de proteínas oxidizadas. Como um resultado, as proteínas com carbonilas eram em maior número nas células tratadas com H2O2. Entretanto, as proteínas com carbonilas estavam consideravelmente diminuídas na presença de DETA/NO. Embora uma reportagem recente sugira que a conjugação à ubiquitina não seja requerida para a degradação de proteínas oxidizadas pelo proteossomo, os dados aqui indicam que ambos as sub-unidades 20S e 26S dos proteossomos estão envolvidas na degradação de proteínas nitradas e oxidadas, pois ambas as atividades 20S e 26S do proteossomo fora reguladas para menos com o H2O2 e reguladas para mais no tratamento com H2O2 e DETA/NO.


Nitração de Proteínas Receptoras e Sinalização Redox.

A nitração de proteínas com radical tirosil (A tirosina (Tyr) é, sem dúvida, o sítio de formação de radicais livres nas proteínas mais frequentemente mencionado. Alguns radicais tirosil estão associados com atividade enzimática. Em: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=MImg&_imagekey=B9...8f0b435&ie=/sdarticle.pdf - 584 KB) tem sido relatadas modificando a função do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) causando alterações na sinalização celular. A nitração de sub-unidades do receptor de NMDA induzida por hipóxia aumentou o influxo de Ca2+ no cérebro de leitão recém nascido. A sintase de óxido nítrico neuronal que é co-localizada com os receptores de NMDA é ativada pelo influxo de Ca2+, levando ao aumento da produção de NO. A inibição da sintase de óxido nítrico impede ambas a nitração do receptor de NMDA e o influxo de Ca2+ mediado pelo receptor. Por isso a nitração é um mecanismo viável pelo qual o receptor sensível a redox pode adquirir um ganho ou perda de função. Nesse estudo nós postulamos que a nitração do TfR pode alterar a captura de ferro dependente de TfR. A estrutura cristalina do domínio externo homodimérico do TfR tem um domínio helicoidal (resíduos 607 a 760) que se liga à transferrina. Existem seis tirosinas (resíduos 611, 614, 628, 643, 683 e 689) no domínio de ligação à transferrina. A nitração das tirosinas presentes no domínio helicoidal provavelmente inibirá a ligação da transferrina devido ao bloqueio estérico [bloqueio da reação porque os sítios ativos não conseguem aproximação suficiente devido] e mudanças conformacionais. Essa proposta experimental explica como a nitração do TfR pode inibir a captura do ferro induzida pelo H2O2.

Conclusão

Esse estudo descreveu o papel do NO, gerado lentamente em taxas definidas a partir de NONOatos, na sinalização do ferro induzida por oxidante. Os NONOatos inibem a oxidação da diclorodihidrofluoresceína, a sinalização do ferro no TfR, e a apoptose de células endoteliais sob estresse oxidativo. Admitidamente, a resposta aos doadores de NO nas células é variada e frequentemente paradoxal. Duas fontes diferentes de doadores de NO elicitam efeitos opostos na mesma função celular. Se o NO aumenta ou suprime a atividade do proteossomo parece depender do status proliferativo de uma célula. A sinalização mediada pelo NO e a ativação dos proteossomo pode atuar num papel regulatório crítico na apoptose e sobrevivência da célula pela modulação da sinalização do ferro dependente de TfR nas células endoteliais submetidas à modificação oxidativa e nitrativa. A maioria das patologias vasculares (diabetes, hiperglicemia e aterosclerose) são caracterizadas por um decréscimo na produção endotelial de NO. Sob essas condições, os radicais de oxigênio e a degradação da proteína estão usualmente aumentados. Assim, o papel do NO (isto é, mantendo a função do proteossomo) é altamente significativa numa perspectiva patofisiológica.

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC196859/?tool=pubmed