O HIV-1 Liga-se Preferencialmente a Receptores Coligados Temporariamente com a Elastase na Superfície Celular.



RESUMO

A elastase do leucócito humano (HLE) interage com a glicoproteína (gp) 41 do HIV-1, sugerindo uma função receptora não enzimática para a HLE no contexto do HI-1. A HLE é encontrada localizada na superfície celular, mas não nos grânulos (partícula semelhante a um grão; exemplos: a) os grânulos alfa, semelhantes a bastões ou filamentosos são encontrados em vários tipos de células, principalmente nas plaquetas onde contêm proteínas secretoras como o fibrinogênio, a fibronectina, a trombospondina e o vWF; b) grânulos específicos dos leucócitos, basófilos, eosinófilos e neutrófilos em oposição aos grânulos azurófilos não específicos; c) grânulo de zimogênio encontrado nas células acinares do pâncreas. Stedman) em clones permissivos ao HIV-1, e nos grânulos, mas não na superfície celular em clones não permissivos ao HIV-1. A ligação do HIV-1 e a infectividade apresenta dependência à dose do ligante natural da HLA, o inibidor de proteinase alfa1, ( 1antitripsina, 1PI). As quimiocinas impedem, enquanto a 1PI promove, a coligação da HLE com os receptores canônicos do HIV. A recente demonstração de que a diminuição do RNA viral está significativamente correlacionado com a diminuição da 1PI em indivíduos soropositivos está consistente com um modelo no qual a HLE e a 1PI podem servir como um co-receptor para o HIV e co-fator, respectivamente, e participar potencialmente na patofisiologia da progressão da doença do HIV.

INTRODUÇÃO

Entende-se que a entrada e a fusão do HIV-1 envolvem uma interação inicial entre a glicoproteína do envelope, gp120, e a CD4 na superfície celular. Essa interação expõe um sítio dentro da gp120 que então interage com um co-receptor (isto é, CCR5 ou CXCR4), induzindo uma mudança na conformação dentro da porção gp41 do envelope viral; este conjunto de eventos resulta na inserção do domínio de fusão da gp41 para dentro da membrana celular. A expressão dos receptores de quimiocina específicos na superfície celular e a CD4 são necessários, mas não suficientes, para conferir a permissividade ao HIV-1. A resistência celular à infectividade ao HIV pode ser devida à falência na fusão e entrada, sugerindo que essa restrição associada à diferenciação seja devida a um fator positivo ou negativo.

A comparação entre os sub-clones não permissivos ao HIV e sub-clones U937 permissivos ao HIV revelou uma relativa equivalência entre a CD4 e a CXCR4 na superfície celular e uma falta de CCR5. Uma diferença notável foi que os sub-clones não permissivos, mas não os permissivos, expressaram detectáveis proteinases associadas à grânulos, a catepsina G (CatG) e a elastase do leucócito humano (HLE). Essas mesmas proteinases são conhecidas por estarem associadas à superfície celular em certas situações e por ligarem proteínas do envelope do HIV-1, mas em associação com a dupla camada lipídica, a atividade enzimática e a detecção de antígenos estão ausentes ou comprometidas. Isso sugere que as proteinases associadas à membrana podem exibir funções de receptor não enzimáticas e que a localização, mais do que a expressão do gene, deverá ter impacto na permissividade ao HIV-1.

Tradicionalmente, a atividade de proteinase da HLE tem sido caracterizada nos ambientes aquosos, e os lipídeos da superfície celular são conhecidos por influenciar negativamente sua atividade catalítica além de respaldar uma função não enzimática para a HLE da membrana plasmática. De fato, as ações primárias da HLE na superfície celular e da catepsina G envolvem a adesão, quimiotaxia, e mobilização de células-tronco. As HLE associadas aos grânulos translocam-se rapidamente para a superfície celular em resposta a muitos agonistas (aqueles que se ligam a receptores) incluindo o lipopolissacarídeo (LPS) endotoxina da bactéria, sugerindo que esses sinais de ativação rapidamente mobilizam a HLE para a superfície celular na ausência de síntese celular. Os domínios precisos na HLE que permitem sua associação com a membrana plasmática não são completamente conhecidos, entretanto, o domínio da alfa-1-antitripsina ( 1PI) que inicia a quimiotaxia foi identificado como penta-peptídeo escondido dentro de sua região terminal C. Os pentapeptídeos hidrofóbicos correspondentes encontrados em vários outros inibidores de protease de serina contêm um par de resíduos fenilalanina que compartilham o motivo FXFXX ou FXXFX, onde X representa os aminoácidos hidrofóbicos V,L,I ou M. A identificação de um pentapeptídeo tendo um motivo similar dentro do domínio de fusão da gp41 do HIV-1 (FLGFL) e outras viroses humanas levou à descoberta de uma interação ligante-receptor entre a gp41 e o HLE receptor de 1PI.

Nos pacientes HIV-1 soropositivos, a carga viral está correlacionada com os níveis circulantes de 1PI. Neste estudo, 100% dos pacientes na categoria assintomática da doença manifestaram níveis deficientes de 1PI. Além disso, a infectividade in vitro foi mostrada como altamente correlacionada com a HLE de superfície celular (y2 = 0,81, P= 0,01). Indivíduos com a forma herdada de deficiência em 1PI, especialmente do sexo masculino, são notavelmente suscetíveis à infecções respiratórias. Assim, a deficiência em 1PI adquirida durante a infecção pode ser um mecanismo responsável em parte pela presença da enfisema, patologia pulmonar, e estabelecimento de infecções oportunistas conforme a progressão da doença do HIV-1. A descoberta de que a expressão anormal da quimiocina correspondia à resistênica ao HIV-1 precipitou a identificação dos receptores da quimiocina durante a entrada do HIV-1. A relação entre a 1PI e a doença do HIV-1 sugeriu a participação potencial de um co-receptor adicional cognato para a 1PI. A relação física entre proteinases, inibidores de proteinases e receptores de quimiocina não foram examinados previamente.

RESULTADOS

Diferentes compartimentos sub-celulares ocupados pela HLE em sub-clones permissivos ao HIV-1 e sub-clones U937 não permissivos.

O exame TEM imunohistoquímico de sub-clones U937 revelou a HLE associada com a membrana plasmática nos clones 10 permissivos ao HIV-1. A HLE associada à membrana plasmática nunca foi vista em clones17 não permissivos ao HIV-1 não estimulados (dados não mostrados). Ao invés disso, a HLE foi encontrada em conjuntos no clone 17 associada com corpos de formas irregulares lembrando grânulos. intracitoplasmáticos e densos em elétrons. A localização da HLE em um compartimento interno no clone 17 foi confirmada por CLSM (dados não mostrados). Conjuntos de HLE intracitoplasmáticos nunca foram vistos no clone 10 permissivo. A proteína catepsina G de controle positivo foi encontrada no local das mesmas estruturas que a HLE nos clones 10 e 17, enquanto a NFKB foi encontrada na localidade do citoplasma e da mitocôndria em ambos os clones equivalentemente (dados não mostrados). A descoberta da HLE residindo em estruturas de tipo grânulos em células não permissivas e na superfície celular em células permissivas sugeriu que esses clones tinham sido detidos em diferentes estágios de diferenciação.

A endotoxina LPS, um glicolipídeo encontrado em bactérias Gram-negativas, produz múltiplos efeitos nas células incluindo a liberação da HLE associada ao grânulo, o qual torna-se ligado à membrana plasmática. A liberação do grânulo é mediada pela interação da LPS com dois diferentes receptores de sinalização incluindo a CD14 e as integrinas beta-2 CD11a/CD18, CD11b/CD18, e CD11c/CD18. No plasma, a LBP (proteína ligante de lipopolissacarídeo) facilita a ligação do receptor aos monômeros do LPS por sua ação como proteína de transferência e lipídeo. Quando o clone 17 não permissivo foi estimulado com a presença de LPS e LBP, a HLE foi visualizada por TEM em transporte dos grânulos para a superfície celular, o citoplasma e o espaço extracitoplasmático. Esses resultados sugerem que em resposta ao LPS, a liberação dos grânulos permita a associação da HLE à membrana plasmática na ausência da síntese da proteína.

A análise dos co-receptores do HIV-1 por citometria de fluxo na presença ou ausência da estimulação por LPS foi comparada usando-se três cores de fluorescência. Como esperava-se que a densidade da HLE fosse baixa ou não detectável, o clone 10 permissivo ao HIV-1 foi examinado com ou sem anti-CD4 como um controle de pigmentação. Surpreendentemente, a HLE foi grandemente aumentada quando o clone 10 interagiu primeiro com anticorpos específicos para CD4 e específicos para HLE em seguida; a HLE não foi detectada quando a ordem foi invertida. A explicação para as diferenças na detecção da HLE na superfície de células soltas na presença ou ausência de anti-CD4 não é conhecida, mas evidências sugerem um papel potencial do remodelamento da membrana ou auto-degradação. Em contraste, a ordem de ligação do co-receptor teve influência insignificante na intensidade da fluorescência da CD4 ou da CXCR4. A estimulação do clone 17 não permissivo com a LPS teve pouca ou nenhuma influência na densidade da CD4 ou da CXCR4; entretanto, a expressão da HLE aumentou. Além disso, como com o clone 10, a ordem de ligação ao receptor influenciou a detecção da HLE, mas não da CD4 ou da CXCR4. A expressão relativamente idêntica da HLE induzida por LPS com ou sem LBP é interpretada como resultado dos fatores no soro contido no tecido do meio de cultura meio de cultura do.

A Ligação da HLE com o Domínio de Fusão do HIV-1.

As associações constantes de proteínas solúveis são convencionalmente medidas em 0,15 M de NaCl, pH7,2, para acomodar comparações entre proteínas competindo pelo mesmo ligante solúvel e produzir valores na escala de 106M-1. Para otimizar a ligação de proteínas não solúveis, as associações constantes podem ser determinadas por modificação do sal, pH ou temperatura. Embora uma constante determinada em 0,5 M de NaCl a 0oC não seja diretamente comparável a uma constante determinada em 0,15 M de NaCl a 25oC, cada constante é válida e definitiva para as condições sob as quais a afinidade está mensurada. Nós achamos previamente que a solução salina hipertônica (0,5 M NaCl) pode ser usada para limitar interações iônicas não específicas entre receptores de superfície celular e o pentapeptídeo hidrofóbico FLGFL, representativo do domínio de fusão do HIV-1. Usando essas condições para análises de Scatchard, nós demonstramos a existência de um único receptor (Kassoc = 1x103 M-1) nas células T linfoblastóides CEM para o FLGFL. Por inibição competitiva, o receptor foi identificado como a HLE (HLE IC100 = 8.0 mM, 1PI IC100 = 8.1 mM com uma razão de HLE/ 1PI = 0.99 a IC100).

Esses resultados podem ser interpretados para dizer que a HLE e a 1PI inibem competitivamente a mesma interação molecular que envolve o FLGFL, mas por diferentes mecanismos. O FLGFL foi mostrado além disso por ligar-se à HLE purificada, sustentando suplementarmente a identidade do receptor do FLGFL com a HLE. Para comparar se a HLE associada à membrana deverá atuar também como um receptor para o domínio de fusão nas células U937, membranas plasmáticas do clone 10 foram isoladas, solubilizadas e iodinizadas (124I-U937) como descrito previamente. A ligação saturável das 125I-U937 com o FLGFL imobilizado foi detectada e as análises de Scatchard sobre a saturação revelaram linearidade. Como nós achamos no uso das células CEM, esses dados sugerem a existência de um único receptor proteináceo (semelhante a uma proteína). A inibição competitiva usando HLE (IC100=77mM) e 1PI (IC100=91mM) sob essas condições revelaram afinidades virtualmente idênticas (Kassoc= 1x103 M-1) e razões de ligação competitiva (HLW/ 1PI=0,85) como determinado por uso das CEM, e isso sugere fortemente que no decurso do estado desdobrado do envelope do HIV-1 e a exposição de um domínio de fusão hidrofóbico, o domínio de fusão do HIV-1 e a HLE participam em uma interação molecular singular.

Respaldando essa hipótese, a HLE visualizada por CLSM usando-se um anticorpo monoclonal foi encontrada à bordo da superfície celular em resposta ao FLGFL solúvel ou a α1PI, mas não em resposta a SDF-1 α ou veículo. Esses resultados sustentam a especificidade da ligação do peptídeo de fusão à HLE e sustentam um papel para a HLE durante a ligação do HIV-1 às células de ambas as linhagens monocíticas e linfocíticas. Sabe-se que a polarização do receptor é induzida por ligação cruzada. Já que a ligação cruzada do receptor pelo pentapeptídeo de fusão do HIV-1 parece não ter ocorrido, a polarização induzida por anti-HLE foi examinada por CLSM para comparação. A HLE foi encontrada em co-polarização com a CXCR4 nas pernas traseiras (deve ser as cadeias de trás) em resposta à ligação cruzada por anti-HLE. A Nistatina é um antibiótico de ligação a colesterol que rompe seletivamente os receptores do HIV-1 residentes em plataformas contendo colesterol e tem sido demonstrada por interferir com a infectividade do HIV-1 in vitro (IC50=4μ M) em células H9, HUT-78 e U937, mas tem pouco efeito ‘in vivo’ exceto contra a candidíase. A co-polarização da HLE e da CXCR4 estimulada pela α1PI foi encontrada em completa anulação por pré-tratamento com 50 µM de Nistatina durante 60 minutos.

A imunolocalização dos receptores nas células sequencialmente incubadas com α1PI e SDF-1α também foi examinada por CLSM. Quando o clone 10 foi estimulado primeiro com α1PI e depois com SDF-1α, a α1PI e a SDF-1α foram encontradas co-polarizadas na superfície celular. A co-polarização pareceu não lembrar o capeamento clássico induzido por ligação cruzada, mas parecia com protrusões da membrana plasmática. Quando o clone 10 foi estimulado primeiro por SDF-1α e depois por α1PI, a α1PI não foi detectável, e a SDF-1α foi detectada em uma seção interna da célula mas não na superfície celular. Esses resultados sustentam a co-associação de receptores na superfície celular para com SDF-1α e α1PI nos clones permissivos ao HIV-1. Cada preparação de inibidor de proteinase é composto de uma única razão de proteína ativa e inativa. Para determinar se os receptores reconhecem formas ativas ou inativas de α1PI, duas preparações de sítio-ativo padronizado de α1PI foram comparadas as quais eram 32,7% e 8,3% ativas. Quando o clone 10 foi estimulado por essas duas preparações em concentrações equivalentes da proteína, uma concentração muito maior do preparado com 8,3% de atividade era requerido do que do preparado com 32,% de atividade, sugerindo que a fração ativa, e não a inativa, da α1PI era reconhecida pelo receptor. A ligação da HLE na superfície celular suficiente para induzir a co-localização da HLE com o CXCR4 sugere que a co-polarização do receptor pode ser essencial para a entrada do HIV-1.

A Infectividade do HIV-1 Aumentada na Presença da α1PI Exógena.

Foi mostrado previamente que a gp120 do HIV-1 induz a co-localização da CD4 e da CXCR4. A co-polarização da HLE e da CXCR4 induzida pela α1PI sugeriu que a α1PI também deve influenciar na infectividade. O clone 10 premissivo ao HIV-1 e o clone 17 não permissivo foram infectados com HIV-1NL4-3 usando-se MOI (momento de inércia?) variadas na ausência ou presença de várias concentrações fisiológicas de 1PI no meio livre do soro. Sabe-se que a α1PI é um quimioatraente que induz a aderência. Para examinar a influência da α1PI sem obliterar o resultado contra as células aderentes, as células foram infectadas e cultivadas nos mesmos reservatórios de uma placa de cultura de tecido de 96 reservatórios. Para comparação, as células foram infectadas em tubos microfuga (centrífuga de microtubo) e transferidas para reservatórios limpos de placa de cultura de tecido de 96 reservatórios, Quando as células foram infectadas, lavadas e livres de vírus, e cultivadas nos mesmos reservatórios de uma placa de cultura de tecido, encontrou-se o pico de atividade da transcriptase reversa aumentando em relação direta à concentração da α1PI. Quando as células foram infectadas em tubos microfuga, lavados livres de vírus e transferidos para reservatórios, existia uma pequena atividade da RT detectável após 12 dias de cultura no meio livre do soro contendo alguma concentração de α1PI. As células não permissivas ao HIV-1 permaneceram não permissivas em todas as condições testadas. A perda da infectividade do HIV-1 nas concentrações mais baixas da α1PI ainda na presença das mais altas MOI demonstra uma dependência da dose de α1PI e sugere que as células infectadas nas microplacas não foram prejudicadas pela inóculo residual. Além disso, qua a dependência da dose de α1PI é identicamente repetida em todas as três MOI e que o decréscimo da MOI produz o esperado decréscimo na infectividade sugere que a α1PI é necessária para a infectividade eficiente do HIV-1 no meio livre do soro e pode estimular a aderência e seleção de populações de células significativa e influenciar a detecção subseqüente da conseqüência da infectividade usando-se ensaios tradicionais de infectividade.. Além disso, os resultados sugerem a hipótese de que a α1PI deve influenciar na infectividade do HIV-1 por sua influência na co-localização do receptor.

Já que a HLE não é expressada constitutivamente na superfície celular do clone 17, considerou-se que a expressão da HLE na superfície celular induzida por LPS poderia conferir permissividade. O clone 17 foi cultivado no meio livre do soro e estimulado com LPS na presença ou ausência de LBP (proteína ligante de lipopolissacarídeo) antes da adição do HIV. As células foram subsequentemente infectadas na presença ou ausência de concentrações fisiológicas da α1PI no meio livre do soro. Na presença de LPS (lipopolissacarídeos) e de LBP, a cinética da aparência e sumiço da atividade da transcriptase reversa em células não permissivas foi similar à das células permissivas. O aspecto atrasado da atividade de RT quando as células foram estimuladas com LPS na ausência da LBP está consistente com a evidência prévia do nível diminuído da formação do monômero na LPS e reconhecimento do receptor do LPS na ausência da LBP. Esses resultados sugerem a expressão na membrana de um co-fator do HIV-1 adicional em resposta ao LPS. Na ausência da α1PI, a atividade detectável de RT não ocorreu nem nas células permissivas ou nas não permissivas sob nenhuma das condições examinadas. Esses resultados sugerem que a α1PI e um receptor de superfície celular são co-fatores do HIV-1 nessas células pró-monocíticas.

Para examinar a possibilidade de que a polarização possa ocorrer durante a entrada do HIV-1, o clone 10 foi incubado a 38oC com o HIV-1NL4-3 infeccioso, e as células foram fixadas e examinadas em vários pontos de tempo por CLSM para a co-localização do HIV-1 e dos co-receptores. O HIV-1 foi detectado usando-se um anticorpo monoclonal com especificidade para os epítopos próximos ao laço V3. Esse anticorpo foi mostrado recentemente por não reconhecer a α1PI em contraste com um anticorpo monoclonal diferente (1C1; Repligen, Cambridge, MA) com especificidade para epítopos próximos ao domínio de fusão do HIV-1. Após a incubação das células com o vírus por 15 minutos, o HIV-1 foi detectado em vários ligações transitórias na superfície da célula co-localizado com CD4, CXCR4 e HLE. O HIV-1 pareceu imiscuir e coalescer (rejuntar) com esses receptores em extensões da membrana plasmática.

Requerimento para a HLE na Superfície Celular Durante a Infecção por HIV-1.

Os dados apresentado até agora sugerem a participação da HLE como um receptor durante a captura e infecção do HIV-1. A ligação da entrada do HIV-1 com a expressão original da CD4 e do clone de DNA do receptor de quimiocina nas células carecendo de sua expressão estabeleceu esse método como o padrão outro para a identificação de receptores do HIV-1. Por outro lado, o silenciamento da expressão do gene provou ser uma ferramenta igualmente poderosa para demonstrar a dependência da entrada do HIV-1 sobre a expressão da CD4. Já que a expressão original do clone de DNA da HLE não é tecnicamente possível até o momento, a importância da HLE durante a entrada do HIV-1 e a infectividade foi examinada pela inibição da expressão da HLE. Oligonucleotídeos anti-senso complementares ao mRNA e pré-mRNA da HLE foram introduzidos no clone 10 permissivo ao HIV1 e cultivados por 48 horas. Oligonucleotídeos anti-senso complementares à globina beta foram usados como controles negativos. As análises através de citometria de fluxo mostraram que células transfectadas com oligonucleotídeos anti-senso específicos para o códon de iniciação ou para o sítio de splicing na extremidade 3’ do éxon 4 da HLE diminuíram a expressão da HLE na superfície em aproximadamente 30% relativamente ao oligonucleotídos de controle da globina beta. Nenhum o oligonucleotídeo anti-senso influenciou a expressão da CXCR4 ou da CD4 na superfície celular.

Células tratadas com oligonucleotídeo foram incubadas com o HIV-1 NL4-3, lavadas livres de vírus, e cultivadas por 48 horas. A presença da fita mínus (Obs.: A fita mínus de decalque de DNA junta a Unidade 3 com a unidade R e a unidade 5 para gerar de novo o Longo Terminal de Repetição durante a síntese em DNA. Embora seja uma etapa fundamental na transcrição reversa o exato mecanismo da transferência do DNA permanece obscuro. A hipótese corrente é que a síntese da fita minus de DNA copia a unidade 5 e R para formar o DNA de forte parada de fita mínus e que a função de RNase H da transcriptase reversa degrada o molde de RNA em híbrido DNA-RNA. O DNA de parada forte da fita minus de fita única contém a região R que é complementar à região R no RNA viral. Usando a complementaridade, o DNA nascente pode hibridizar o RNA viral e o complexo da transcrição reversa pode continuar copiando as sequências nas unidades 3 - http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/hujv75_809.pdf - 2 MB), do DNA de forte parada, o produto inicial da transcriptase reversa seguinte à entrada do HIV-1 foram determinados por amplificação com PCR de células lisadas usando-se pares de iniciadores R/U5 (R é sequência de repetição e U5 é a unidade da ponta 5 porque a replicação ocorre na direção de 5’ para 3’). Como encontrado em havendo expressão da HLE, a fita mínus, o DNA de forte parada estavam diminuídos nas células transfectadas com oligonucleotídeos anti-senso complementares ao códon iniciador da HLE ou ao sítio de splicing na extremidade 3’ do éxon 4. Em contraste, esse DNA foi facilmente detectado nas células transfectadas com os oligonucleotídeos anti-senso complementares à globina beta. Nós concluímos que em adição à CD4 e à CXCR4, a HLE na superfície celular é necessária para a ligação e infecção pelo HIV-1.

DISCUSSÃO

A ligação da HLE da superfície celular pela α1PI, anti-HLE, e peptídeo de fusão do HIV-1 foi mostrada aqui enquanto indutora da co-polarização da HLE, CD4 e receptores de quimiocina. Um modelo está proposto no qual a ligação da HLE induz a conjunção dos receptores do HIV-1, e que esse denso foco de receptores aumenta as probabilidades do denso foco das proteínas do envelope do HIV-1 interagirem com os receptores livres remanescentes. Assim, receptores ocupados por ligantes produzem um aumento tangível nos receptores próximos mais do que produzem interferência estérica (relativa à estrutura da molécula) e diminuída acessibilidade dos receptores do HIV-1. Consistente com esse modelo, a SDF-1 alfa foi encontrada por impedir a conjugação do receptor, e isso sugere que as quimiocinas podem suprimir a infectividade do HIV-1 pela redução dos conjuntos receptores do HIV-1 mais do que pelo bloqueio direto dos receptores como previamente se acreditava. O aumento da α1PI circulante esta correlacionado com o aumento da carga viral na população do HIV-1, sugerindo a hipótese de que a α1PI deve facilitar a ligação e infectividade do HIV-1. Aqui nós mostramos que a atividade da transcriptase reversa produzida pela infectividade do HIV-1 é dependente da α1PI de modo dependente da dose, que a α1PI facilita a co-polarização da HLE com os receptores canônicos do HIV-1, que o HIV-1 vivo liga-se preferencialmente a receptores co-polarizados, e que a ligação do vírus a receptores co-polarizados não ocorre na ausência da α1PI. Nós mostramos adicionalmente que a translocação da HLE dos grânulos para a superfície celular transfere a permissividade ao HIV-1 para células não permissivas e que a inibição do mRNA da HLE diminui proporcionalmente a detecção dos primeiros produtos da transcriptase reversa, a fita mínus, o DNA de forte parada.


Os parâmetros críticos determinantes da cinética da infectividade do HIV-1 foram definidos como concentração viral, número de vírions produzidos por uma célula, e o tempo para o ciclo completo da infecção. Em uma população de células homogêneas, o tempo de pico da atividade de transcriptase reversa produzido pelo clone 10 foi diminuído em dois dias para cada logaritmo de diluição do HIV-1NL4-3, e esses resultados estão consistentes com estudos prévios de cinética. Entretanto, o clone 10 produziu uma atividade de transcriptase reversa insignificante quando as células foram infectadas em meio livre do soro carecendo de α1PI, e a atividade de transcriptase reversa aumentou de modo dependente da dose no aumento da α1PI sugerindo que a α1PI é necessária para a infectividade. A atividade de pico da transcriptase reversa não aumentada pela α1PI sugere que a influência da α1PI no pico dos níveis da transcriptase reversa não está relacionada com o inóculo viral ou tempo de infecção. Ao contrário, esses resultados sugerem que o pico aumentado nos níveis da transcriptase reversa resultou tanto do número aumentado de vírions produzidos por cada célula quanto do número aumentado de células infectadas.

O modo dependente da dose no qual a α1PI influenciou a infectividade do HIV-1 sugeriu um mecanismo dependente do receptor. Os clones U937 permissivos e não permissivos ao HIV-1 diferem com respeito à localização da HLE na superfície celular. Nós achamos que a infectividade do HIV-1 foi permitida quando a HLE liberada dos grânulos foi ligada à superfície celular de clones 17 não permissivos ao HIV-1. Significativamente, a infectividade do HIV-1 no clone 17 também requereu a participação da α1PI, e isso respalda a identidade da HLE como componente liberado dos grânulos correspondentes. Durante a fase aguda da inflamação coincidente com a liberação da HLE estimulada por LPS, a concentração da α1PI aumenta mais de quatro vezes. Neste cenário, a fase aguda de infecções oportunistas poderia produzir o fenômeno da co-polarização do receptor do HIV e dessa forma facilitar o aumento da carga viral.

A evidência de que a gp120 do HIV-1 liga-se à CD4 inclui a demonstração de que a ligação é reversível e saturável, que a introdução da expressão do cDNA da CD4 nas células nulas em CD4 resulta no aumento correspondente na infectividade ao HIV-1, e que o silenciamento da expressão do mRNA da CD4 bloqueia a infectividade pelo HIV-1. Já que a HLE pode residir tanto na superfície celular quanto nos grânulos, e desde que a localização da HLE não seja dependente nem do DNA, nem do mRNA e nem da estrutura da proteína, mas da produção de grânulos pela célula, um processo ainda indefinido, a intrdução do mRNA da HLE em células HLE negativas não é um bom teste para sua função de receptor. O verdadeiro teste é identificar células carentes de HLE na superfície; testar se essas células não são suscetíveis à entrada do HIV-1 na presença da CD4, CCR5, e CXCR4; e determinar se a co-expressão específica da HLE na superfície celular agora recupera a entrada do HIV-1 para dentro dessas células. A ligação reversível e saturável do domínio de fusão do HIV-1 à HLE foi mostrada aqui e algures. Nós demonstramos aqui que a inibição da expressão do mRNA da HLE bloqueia a infectividade do HIV-1 e que o favorecimento da associação da HLE com a membrana plasmática favorece a infectividade do HIV-1. O modelo de Clark da ocupação do receptor estabelece que em adição à reversibilidade, a ligação saturável do ligante ao receptor, a ligação deve produzir uma resposta biologia proporcional ao número de receptores ligados. As evidências apresentadas sugerem que a supressão da expressão da HLE suprime proporcionalmente os produtos primários da transcriptase reversa do HIV-1, e isso sustenta a necessidade da HLE durante da ligação do HIV-1 e as primeiras etapas da infecção consistente com um modelo de entrada do HIV-1 que requer a HLE como um receptor de fusão. Nós achamos previamente que a conseqüência da infectividade viral “in vitro” está correlacioanada com a HLE, mas não com CD4, CXCR4, ou CCR5, e isso sugere que a HLE é potencialmente um receptor de limitação de taxa para a entrada do HIV-1 por um mecanismo envolvendo o fenômeno da co-polarização do receptor.

http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/content/full/102/13/4479

Síntese e Localização de Proteínas do Plasma no Cérebro Humano em Desenvolvimento. Integridade da Barreira Cerebral do Sangue Fetal às Proteínas Endógenas de Origem Hepática.

Institute of Medical Anatomy A, University of Copenhagen, Denmark.


A distribuição e possíveis origens das proteínas do plasma no cérebro embrionário e fetal em diferentes estágios do desenvolvimento têm sido investigadas por uma combinação de isolamento e tradução de mRNAs e imunocitoquímica usando anti-soro específico. Vinte e três proteínas de tipo plasmático foram identificadas usando-se métodos imunocitoquímico ao nível da luz microscópica. A presença de mRNAs para treze das proteínas imunocitoquímicamente positivas no plasma foi demonstrada por tradução “in vivo” e no ovo por imunoeletroforese cruzada e auto-radiografia; isso indica a síntese “in sito” dessas proteínas (ou seja, alfa-fetoproteína, alfa 1-antitripsina, GC-globulina, alfa 2-macroglobulina, pseudocolinesterase e transferrina) em algumas regiões do cérebro.A distribuição regional de algumas proteínas e a ausência de alguns mRNAs sugere que a presença de algumas proteínas do plasma no cérebro em desenvolvimento podem ser contadas por captura de csf ou via processo de extensão do nervo para além da barreira do sangue cerebral. Em vários casos, proteínas específicas parecem estar associadas com tipos celulares definidos, por exemplo: alfa-fetproteína, GC-globulina, e ceruloplasmina com os neurônios, alfa 2-macroglobulina com células endoteliais, e ferritina com células gliais. Algumas proteínas estavam associadas com dois ou três tipos de células, por exemplo: alfa 1-antitripsina com neurônios e células gliais, e transferrina e 2HS-glicoproteína com neurônios, células da glia e endoteliais. A comparação da expressão dos mRNAs da barreira fetal e do fígado injetados nos oócitos do Xenopus (peixe de laboratório) mostrou que poucas proteínas (transferrina e ceruloplasmina) eram secretadas quando o mRNA do fígado era injetado, mas não quando o mRNA do cérebro era injetado. Isso sugere que pode existir uma diferença importante na estrutura e/ou processamento dessas proteínas no cérebro que pode refletir uma função diferente daquela associada com as mesmas proteínas quando têm origem no fígado. A pigmentação foi, de modo geral, mais intracelular do que extracelular; as proteínas do plasma não estavam associadas com as áreas imediatas em torno dos vasos sanguíneos embora existisse uma forte imunoprecipitação para cada proteína dentro do lúmen dos vasos sanguíneos cerebrais. Esses achados imunocitoquímicos juntos com a identificação dos mRNAs para um grande número de proteínas do plasma no cérebro imaturo são discutidas em relação a um trabalho experimental em animal que sugere que a barreira do sangue cerebral à proteína está presente ainda nos mais precoces estágios do desenvolvimento do cérebro.


PMID: 3289986

A Indução da Ceruloplasmina nos Pulmões do Rato Durante a Hiperóxia

Fleming RE; Whitman IP; Gitlin JD Mallinckrodt Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri 63110

Nós examinamos os efeitos da hiperoxia na expressão do gene da ceruloplasmina. A exposição de ratos adultos a 95% de O2 resultou em uma indução do mRNA da ceruloplasmina de cinco a seis vezes maior no tecido pulmonar em 46 horas, e essa resposta foi dependente do tempo, alcançando os valores máximos em 86 horas. A indução do mRNA da ceruloplasmina por hiperoxia foi específico para os pulmões e não o resultado de inflamação sistêmica pois o conteúdo de mRNA da ceruloplasmina hepática permaneceu constante. Esses dados indicam que os pulmões são um sítio proeminente de expressão do gene da ceruloplasmina durante a inflamação e a hiperoxia e sugerem que esta proteína pode atuar num papel não verificado previamente na injúria ou reparo pulmonar.

http://mad-cow.org/~tom/ceruloplasmin.html#Copper

EXPLORANDO A MITOCÔNDRIA


Uma mitochondria contêm membranas externa e interna compostas de duas camadas de fosfolipídeos e proteínas. As duas membranas, entretanto, têm propriedades diferentes. Devido à sua organização em dupla membrana, existem cinco compartimentos distintos dentro da mitocôndria. Existe a membrana mitocondrial externa, o espaço intermembrana (espaço entre as membranas externa e interna), a membrana mitocondrial interna, o espaço em forma de crista (formado por dobramentos internos da membrana interna).

MEMBRANA EXTERNA

A membrane mitochondria externa, a qual circunda a organela inteira, tem uma razão de proteína para fosfolipídio similar à da membrana plasmática eucariótica (aproximadamente 1:1 por peso). Ela contém grandes números de proteínas integrais chamadas porinas. Essas porinas formam canais que permitem a difusão de moléculas de até 5000 dáltons de peso molecular de um lado para outro da membrana. Grandes proteínas podem entrar na mitocôndria se uma sequência sinalizadora no terminal amino ligar-se à uma proteína de grandes sub-unidades chamada translocase da membrana externa, a qual então as move ativamente através da membrana. A ruptura da membrana externa permite proteínas no espaço intermembrana escaparem para o citosol, levando certas células à morte. A membrana mitocondrial externa pode associar-se com a membrana do Reticulo Endoplasmático, numa estrutura chamada MAM (membrana do RE associada à mitcôndria). Isso é importante na sinalização de cálcio entre o Reticulo Endoplasmático e a mitocôndria e está envolvido na transferência de lipídios entre o RE e a mitocôndria.

Espaço Intermembrana

O espaço intermembrana é basicamente o espaço entre a membrane externa e a membrane interna. Porque a membrane externa é livremente permeável à pequenas moléculas, as concentrações de pequenas moléculas tais como íons e açúcares no espaço intermembrana é o mesmo do citosol. Entretanto, como as proteínas grandes devem ter uma sequência de sinalização específica para serem transportadas através da membrana externa, a composição da proteína desse espaço é diferente da composição das proteínas no citosol. Uma proteína que esteja localizada no espaço intermembrana nessa via é o citocromo c.

Membrana Interna

A membrana mitochondrial interna contém proteínas com cinco tipos de funções:
1- Aquelas que desempenham reações redutoras de fosforilação oxidativa;
2- ATP sintase, que gera ATP na matriz;
3- Proteínas de transporte específico que regulam a passagem de metabólitos para dentro e para fora da matriz;
4- Maquinaria de importação de proteína;
5- Proteína de fusão e fissão da mitocôndria.

Ela contém mais de 100 polipepídeos diferentes, e tem uma razão de proteína para fosfolipídeo (mais do que 3:1 por peso, o que é aproximadamente 1 proteína para 15 fosfolipídeos). A membrana interna é o alojamento para aproximadamente 1/5 da proteína total em uma mitocôndria. Em adição, a membrana interna é rica em um fosfolipídeo incomum, a cardiolipina. Esse fosfolipídeo foi descoberto originalmente em corações de vaca em 1942, e é usualmente característico da mitocôndria e das membranas plasmáticas bacterianas.


A cardiolipina contém quarto ácidos graxos além de dois e pode ajudar a tornar a membrana interna impermeável. Ao contrário da membrana externa, a membrana interna não contém porinas e é altamente impermeável à todas as moléculas. Quase todos os íons e moléculas requerem transportadores de membrana especiais para entrar ou sair da matriz. Proteínas são levadas para dentro da matriz por via do complexo da translocase da membrana interna (TIM) ou por via de Oxa1. Em adição, existe um potencial de membrana no outro lado da membrana interna formado pela ação de enzimas de cadeia de transporte de elétrons.


A CRISTA

A membrana mitochondrial interna é compartimentalizada em numerosas cristas, as quais expandem a área da superfície da membrana mitocondrial interna, aumentando sua capacidade de produzir ATP. Essas não são simples dobras ao acaso mas invaginações além da membrana interna, as quais podem afetar a função quimiosmótica geral. Em mitocôndria típica do fígado, por exemplo, a área da superfície, incluinda a crista, é de aproximadamente cinco vezes a da membrana externa. A mitocôndria das células que têm grande demanda de ATP, tais como as células do músculo, contém mais cristas do que as mitocôndrias típicas do fígado. Essas dobras tachadas com pequenos corpos redondos conhecidos como partículas F1 ou oxissomos.


MATRIZ

A matriz é o espaço fechado pela membrana interna. Ela contém aproximadamente 2/3 da proteína total da mitocôndria. A matriz é importante na produção de ATP com o auxílio da ATP sintase contida na membrana interna. A matriz contém uma mistura concentrada de centenas de enzimas, ribossomos especiais da mitocôndria, tRNA, e várias cópias do DNA genômico da mitocôndria. Das enzimas, a principal função inclui a oxidação do piruvato (sal ou éster do ácido pirúvico) e ácidos graxos, e o ciclo do ácido cítrico.

A mitocôndria tem seu próprio material genético, e a maquinaria para manufaturar seus próprios RNAs e proteínas. Uma sequência mitocondrial humana publicada revelou 16.569 pares de bases codificando 37 genes no total: 22 para tRNA, 2 para rRNA (ribossômico), e 13 genes de peptídeos. As 13 peptídeos mitocondriais nos humanos são integrados dentro da membrana mitocondrial interna, junto com proteínas codificadas por genes que residem no núcleo da célula hospedeira.

http://www.biosolutions.info/2009/10/exploring-mitochondria.html

Estrutura das Proteínas de Cobre

Adman ET Department of Biological Structure, University of Washington, Seattle 98115. Adv Protein Chem 42: 145-97 (1991)

A comparação estrutural das proteínas que contêm cobre tem proporcionado uma nova dimensão para os relacionamentos sugeridos por similaridade seqüencial. Ryden (1988) sumarizou o suposto relacionamento, sugerindo que um domínio de cupredoxina singular primordial evoluiu em oxidases de cobre de múltiplos domínios. As estruturas têm revelado o fato de que as diferenças residem primariamente em inserções e deleções nas junções entre elementos de estrutura secundária. O mecanismo da evolução (ou seja, a integração de novas sequências dentro de regiões não essenciais para a dobra em Chave grega) permanece desconhecida.

Quais das propriedades de um dobramento de cupredoxina são necessárias para a função é o objeto de estudos de mutagênese direcionada de sítio. Podem dois dos ligantes ser intercambiados (ou seja, a histidina a montante) e parcialmente respondidos pela estrutura de múltiplos domínios da oxidase de cobre? A sequência Tyr,Cys-Thr na plastocianina (na qual a treonina é um membro do par ligante a hidrogênio) é homóloga à sequência His-Cys-His na ascorbato oxidase. Nessa última, a transfência de elétrons acredita-se fluir do cobre de tipo I (ligado pela cisteína) para o conjunto trinuclear, provavelmente por via dos resíduos de histidina. Portanto, deve-se inferir que a tirosina e a treonina têm algum papel na transferência de elétrons.

[Obs.: Oxidação: é a perda de elétron;-Redução: é o ganho de elétron;-Agente oxidante: é a espécie química que provoca a oxidação(sofre redução);-Agente redutor: é a espécie química que provoca a redução(sofre oxidação).]

A tirosina 83 foi previamente implicada em estudos NMR como um sítio primário de transferência de elétron. As estruturas das proteínas de múltiplo cobre revelaram interessantes características novas. Os cobres extra são ligados na interface dos domínios, e podem ser metais singulares ou novos conjuntos tri-nucleares, dependendo da disponibilidade das histidinas ligantes. Um modelo estrutural da ceruloplasmina sugere que ela terá ao menos dois sítios de tipo I e, possivelmente, um terceiro sítio de tipo I como a stellacianina (não ligante a metionina), bem como um sítio de ligação para o conjunto trinuclear.

A similaridade das sequências de N2O redutase (óxido nítrico redutase) e de um domínio de citocromo oxidade para com as sequência de proteínas com estruturas conhecidas sugere que essas também terão domínios de Chave grega. A Galactose oxidade e a hemocianina não têm dobramentos de chave grega em seus domínios funcionais, embora cada um tenha um domínio de Chave Grega. A necessidade do dobramento em Chave grega permanece obscuro. As apoproteínas são claramente estáveis sem metais; existem exemplos outros, além das imunoglobulinas, do dobramento em Chave Grega. Até agora, o cobre parece ser encontrado em um subconjunto muito limitado de estruturas; o zinco e o ferro têm uma variedade muito mais ampla de ambientes na proteína. Pode ser que proteínas contendo Chave- Grega em cobre representem um nicho evolutivo muito pequeno.

O Papel da Micróglia e da Proteína Príon do Hospedeiro na Neurotoxidade de Um Fragmento da Proteína Prion

Brown DR; Schmidt B; Kretzschmar HA Institut fur Neuropathologie, Universitat Gottingen, Germany. Nature 380: 345-7 (1996)

[Obs.: Micróglia são pequenas células da neuroglia que podem tornar-se fagocíticas em áreas de lesão ou inflamação neural. Stedman.]

A proteína príon PrPc é uma glicoproteína de função desconhecida normalmente encontrada nos neurônios e na glia. [Obs.: células não neuronais, com funções metabólicas, interpostas entre os neurônios e os vasos sanguíneos que suprem sistema nervoso. No SNC, as células da oligodendróglia são os astrócitos, células ependimárias e as células da micróglia. As células satélites dos gânglios ao redor das fibras nervosas periféricas podem ser interpretadas como células da oligodendróglia do sistema nervoso periférico. Stedman.] Ela está envolvida em doenças como a encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca), scrapie (encefalopatia esponiforme do SNC transmissível de caprinos caracterizada por um período de incubação muito longo. Stedman) e doença de Creutzfeldt-Jakob.

[Omim 123400: A doença de Gerstmann-Strussler (GSD; 137440) e a insônia familial fatal (FFI; 600072) são duas outras doenças alélicas de príon herdadas causadas por mutação no gene PRNP.

Rosenthal e outros (1976) relatou uma família na qual 16 membros tinham doenças neurológicas oscilando de demência sub-crônica e aguda para várias anormalidades do sistema motor sem demência. A herança era autossômica dominante. Embora o probando tivesse típica doença de Creutzfeldt-Jakob com demonstração neuropatológica de encefalopatia espongiforme, uma primeira prima tinha demência crônica sem mudanças espongiformes. Ambos os pacientes tinham PAS positivo, placas de eosinófilos através do cérebro. Os autores sugeriram que a suscetibilidade para a doença neurológica nessa família foi herdada como um traço autossômico dominante.]

O PrPSc, uma isoforma alterada do PrPC que está associada com a doença, apresenta grande resistência a protease e é parte do agente infeccioso, o príon. As doenças derivadas de Príon são caracterizadas por degeneração neuronal, gliose e acumulação de PrPSc. Camundongos desprovidos de PrPC são resistentes à scrapie. Um framento da PrP humana consistindo dos aminoácidos de 106 a 126 que formam fibrilas ‘in vitro’ é tóxico para neurônios em cultura. Aqui nós mostramos que esse efeito tóxico requer a presença da microglia que responde ao PrP106-126 por aumento da sua produção de radical de oxigênio. Os efeitos combinados do PrP106-126 direto e mediados pela micróglia são tóxicos para neurônios normais mas são insuficientes para destruir neurônios de camundongos que não expressam PrPC.

A sequência do príon bovino, mostrando a repetição octapeptídica da área de ligação de cobre e o fragmento tóxico:

MVKSHIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYP

Dissulfetos e Cisteínas no FVIII Humano

McMullen BA; Fujikawa K; Davie EW; Hedner U; Ezban M Department of Biochemistry, University of Washington, Seattle 98195, USA. Protein Sci 4: 740-6 (1995)

As localizações das ligações dissulfeto e das cisteínas livres nas cadeias pesada e leve do Fator VIII recombinante humano foram determinadas por análises seqüenciais de fragmentos produzidos por digestões químicas e enzimáticas. Os domínios A1 e A2 da cadeia pesada e o domínio A3 da cadeia leve contêm uma cisteína livre e duas ligações dissulfeto, enquanto os domínios C1 e C2 da cadeia leve têm somente uma ligação dissulfeto e nenhuma cisteína livre. As posições dessas ligações dissulfeto são conservadas no fator V e na ceruloplasmina exceto que a segunda ligação dissulfeto no domínio A3 está perdida em ambos o fator V e ceruloplasmina. As posições das três cisteínas livres no fator VIII são as mesmas de três das quatro cisteínas presentes na ceruloplasmina, entretanto, as posições das cisteínas livres no fator VIII e na ceruloplasmina não são conservadas no fator V.

Deficiência Hereditária da Ceruloplasmina com Hemossiderose [acúmulo de hemossiderina (proteína amarelo-ouro produzida pela digestão fagocítica da hematina {heme com ferro 3+} nos tecidos, particularmente no fígado e no baço]

Okamoto N; Wada S; Oga T; Kawabata Y; Baba Y; Habu D; Takeda Z; Wada Y Osaka Medical Center and Research Institute for Maternal and Child Health, Japan. Hum Genet 97: 755-8 (1996)

A deficiência hereditária da ceruloplasmina com hemossiderose (aceruloplasminemia) é uma nova doença caracterizada pela hemossiderose sistêmica, diabetes mellitus, anomalias neurológicas e degeneração do pigmento da retina. A perda da atividade de ferroxidase da ceruloplasmina resulta em deposição sistêmica de ferro e dano no tecido. Estudos de neuro-imagem revelam a deposição de ferro nos gânglios basais e em núcleos vermelhos e dentados. A ataxia do cerebelo (ausência total de oxigênio), sinais extrapiramidais (o sistema motor extrapiramidal é uma rede de nervos no cérebro cuja disfunção denota em sinais motores e sentimentais) e demência desenvolvem-se após a meia-idade.Análises da sequência do cDNA da ceruloplasmina a partir desse paciente revelaram uma inserção de adenina no éxon 3; isso produziu um sinal finalizador prematuro.

Expressão Celular da Ceruloplasmina nos Pulmões: Papel Anti-Oxidante

Yang F; Friedrichs WE; deGraffenried L; Herbert DC; Weaker FJ; Bowman BH; Coalson JJ Department of Cellular and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio 78284, USA.

A ceruloplasmina (CP) é um importante anti-oxidante extracelular e reciclador de radical livre. Embora CP seja expressada principalmente no fígado, estudos recentes identificaram os pulmões como outro sítio principal da síntese da CP. Os sítios e tipos celulares que são responsáveis pela expressão da CP nos pulmões do babuíno e do camundongo estão descritos. O mRNA da CP é detectado no epitélio brônquico em fetos de babuínos em sessenta dias de gestação e nas células do duto das glândulas submucosas. Em camundongos em desenvolvimento e maduros, os dados sugerem que as células da via respiratória são a maior fonte de CP no fluido dos pulmões e sustenta o papel crítico da ceruloplasmina na defesa do hospedeiro contra o dano oxidativo e a infecção nos pulmões.

O Papel da Ceruloplasmina na Oxidação do LDL por Células Monocíticas

Ehrenwald E; Fox PL Department of Cell Biology, Cleveland Clinic Research Institute, Ohio 44195, USA. A oxidação de lipídeos e lipoproteínas por macrófagos é um evento importante durante a aterogênese. A ativação de célula monocíticas por zimosan (carboidrato obtido das paredes celulares de leveduras que interfere com o complemento. Stedman) e outros agonistas (concorrentes) resulta na liberação de múltiplas espécies oxidantes e conseqüente oxidação do LDL. Agora nos mostramos evidência de que a ceruloplasmina, um reagente de fase aguda contendo cobre, é secretada por células monocíticas U937 ativadas por zimosan. Em uma abordagem, a ceruloplasmina mostrou exibir atividade oxidante sob condições apropriadas. A adição exógena de ceruloplasmina purificada humana simula a oxidação do LDL pela célula U937 quase na mesma extensão que a ativação pelo zimosan. Em contraste com experimentos prévios sem células, nos quais a ceruloplasmina por si mesma (em solução salina misturada com fosfato) oxida o LDL, sob as condições desse experimento (em meio de cultura celular RPMI 1640) a ceruloplasmina só oxidou a LDL na presença das células; o mecanismo pelo qual as células superaram a inibição por componentes do meio não foi verificado. Em suma, esses resultados são consistentes com um mecanismo no qual a ceruloplasmina derivada da célula participa na oxidação da LDL. Os dados também mostram que fatores celulares em adição à ceruloplasmina, possivelmente espécies de oxigênio ativo e/ou lipo-oxigenases, são essenciais e atuam sinergisticamente com a ceruloplasmina para oxidar o LDL.

Fonte: http://mad-cow.org/~tom/ceruloplasmin.html#Copper

INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL DOS DOMÍNIOS A DO FATOR V DE COAGULAÇÃO SANGUÍEA POR MODELAMENTO MOLECULAR


B. O. Villoutreix and B. Dahlbäck

RESUMO

O Fator V (FV) é um grande (2.196) cofactor não enzimático na cascata da coagulação com uma organização de domínios (A1-A2-B-A3-C1-C2) similar à do Fator VIII (FVIII). O FV é ativado a fator Va (FVa) pela trombina, a qual cliva fora o domínio B levando a uma estrutura heterodimérica composta da cadeia pesada (A1-A2) e da cadeia leva (A3-C1-C2). A proteína C ativada (APC), junto com seu co-fator proteína S (PS), inibe a cascata da coagulação por via de limitada proteólise do FVa e FVIIIa (a APC cliva o FVa nos resíduos R306, R506 e R579). Os domínios A dos fatores Va e VIIIa compartilham importante identidade de sequência com a proteína ligante de cobre, ceruloplasmina (CP). A estrutura em raio X da CP e os modelos teóricos para o FVIII foram relatados recentemente. Essa informação nos permitiu construir um modelo teórico (de 994 resíduos) para os domínios A dos FV/FVa humanos (resíduos de 1 a 656 e de 1546 a 1883). Análises estruturais do modelo FV indicam que: a) os três domínios A são arranjados de modo triangular como no caso da CP e a organização desses domínios deve permanecer essencialmente a mesma antes e depois da ativação; b) o íon de cobre de tipo II está localizado na interface A1-A3; c) os resíduos R306 e R506 (sítios de clivagem pela APC; R é arginina) são ambos expostos a solvente; d) os resíduos 1667 a 1765 dentro do domínio A3, esperados por interagirem com a membrana, são essencialmente cobertos/escondidos; e) a APC não se liga aos resíduos de 1865 a 1874 do fator FVa. Várias outras feições do fator V/Va, como as mutações R506Q e A221V; fator Xa (FXa) e clivagem pela elastase do neutrófilo humano (HNE); proteína S, protrombina e ligação de FXa também são investigados.

TEXTO

A cascata da coagulação envolve a ativação enzimática seqüencial dos zimogênios de protease de serina, com os co-fatores não enzimáticos, FV e FVIII, como elementos críticos. A trombina cliva a fbrinogênio para gerar a fibrina, o produto final da cascata, o qual estabiliza o coágulo hemostático. O FVa, a forma ativada do FV, serve como um co-fator dentro do complexo da protrombinase (PT), uma maquinaria multi-molecular que aumenta significativamente a geração de trombina. O FV é homólogo ao FVIII e ambas as deficiências de FV e FVIII podem levar a desordens de sangramento severas. O FV circula no sangue como uma glicoproteína de única cadeia de peso molecular 333.000 com pouca ou nenhuma atividade pró-coagulante. A estrutura primária do FV humano foi relatada, e começando pelo terminal N (amina), o FV consiste nos domínios A1, A2, B, A3, C1, e C2. Os domínios A têm cada um aproximadamente 310 resíduos, o domínio B tem aproximadamente 840 resíduos e cada domínio C tem aproximadamente 150 resíduos. O FV é clivado pela trombina no domínio B nas posições R709, R1018 e R1545 para dar surgimento ao co-fator ativo (FVa), o qual é composto de uma cadeia pesada (domínios A1 e A2 e um pequeno segmento do domínio B) e uma cadeia leve (domínios A3-C1-C2). As cadeias pesada e leve são ligadas não covalentemente na presença de íons divalentes de metal.

O complexo PT (protrombinase) consiste da protease de serina FXa, do cofator Va não enzimático, íons de cálcio, e uma superfície apropriada de fosfolipídeos. O Fator Va, dentro do complexo PT serve como um receptor de membrana para o Fator Xa, como um efetor que aumenta a atividade catalítica do FXa para a conversão da protrombina em trombina e como promotor da interação entre a protrpmbina e o complexo protrombinase. O complexo protrombinase é aproximadamente de 300.000 a 1.000.000 de vezes mais eficiente na ativação da protrombina do que o Fator Xa sozinho. O FXa liga-se fracamente ao FV intacto mas parece interagir com relativamente alta afinidade com as cadeias pesada e leve do FVa enquanto a protrombina liga-se somente à cadeia pesada do FVa. Sabe-se que a clivagem da APC na R506 do FVa reduz a afinidade do FVa para FXa sugerindo que a área do R506 tem contato com o FXa. A remoção dos resíduos de 683 a 709 do FVa resulta em diminuída interação do FXa com o FVa e reduz grandiosamente a atividade de co-fator do FVa. Ambos FV e FVa ligam-se com alta afinidade de modo independente do cálcio à membranas que contêm fosfolipídeos negativamente carregados. Tem sido proposto que os domínios C2 e A3 do Fva interagem através de forças iônicas e hidrofóicas, respectivamente, com a superfície da membrana.

A inativação proteolítica do FVa pela APC é uma das reações chave na regulação da formação de trombina. A atividade catalítica da APC é estimulada por um co-fator não enzimático, a proteína S (PS), e fosfolipídeos carregados negativamente. A APC cliva o FVa dentro da cadeia pesada em R306, R506 e R679. Deficiências nas proteínas C e S têm sido associadas com risco aumentado de trombose. Recentemente, Dahlbäck e outros (1993) relataram um novo fator genético de risco para a trombose que envolve uma única mutação pontual no gene FV levando à substituição do resíduo R506 para Q (R é arginina e Q é glutamina). Essa anormalidade do FV (FV-R506Q) é referida como resistente a APC e tem sido caracterizada adicionalmente por vários grupos. A APC foi proposta por interagir com a cadeia leve do FVa com contribuição potencial dos resíduos de 1865 a 1874 enquanto dos resíduos de 493 a 506 do FVa poderiam estar envolvidos na ligação da PS e do FXa. A clivagem da APC na R506 é inibida seletivamente pela presença do FXa enquanto a PS é considerada por contra-atuar na capacidade do FXa de proteger o FVa da clivagem pela APC. A PS parece aumentar a clivagem do FVa na R506 pela APC. A PS também tem uma atividade independente da APC já que inibe diretamente a ativação da protrombina através das interações com FVa e Xa.

Recentemente, uma função anticoagulante da o FV foi relatada. O FV intacto tem sido proposto como um co-fator sinergístico para o sistema PS-APC na degradação do FVIIIa. Tem sido sugerido que uma região do domínio B poderia estimular o inativação do FVIIIa pela APC. Varandi e outros (1996) têm mostrado que o FV-R506Q tem reduzida atividade de co-fator na degradação do FVIIIa quando comparado ao FV de tipo selvagem.

Os três domínios A dos fatores V e VIII são homólogos aos três domínios A da ceruloplasmina, a principal proteína de transporte para o cobre no plasma. Interessantemente, o FV e o FVIII também se ligam a íons de cobre. A ceruloplasmina humana é uma glicoproteína de cadeia singular de 1.046 resíduos de aminoácidos. Ela pertence à uma família de oxidases de cobre azul, com sub-unidades estruturais baseadas no domínio cupredoxina (centros de cobre nas proteínas com diferentes classificações e cores). O dobramendo da cupredoxina é em oito faixas de chave grega beta em forma de barrica que foi observada primeiramente na plastocianina (proteína com função redox e de transferência de elétrons, de cor azul e que difere entre algas, bactérias e eucariotos) e na azurina.

[Figura da azurina retirada do texto reproduzido parcialmente na observação ao final desta seção: ]

A instabilidade do FV e glicosilação heterogênea tem até agora estorvado seu estudo estrutural por cristalografia de raio X. Avanços recentes em química computacional combinada com análises de dados experimentais e clínicos previamente relatados podem proporcionar pistas da função da estrutura. No momento, modelos teóricos para o fator VIII foram recentemente relatados usando o método de construção de modelo comparativo bem estabilizado (Greer, 1990). Na presente investigação, um modelo para os domínios A do FV foi desenvolvido usando-se a estrutura da ceruloplasmina como um molde. Esse modelo permitiu-nos propor mecanismos moleculares para o ponto do complexo FV/FVa de preferência para interações e inativação pela APC.



[Obs1.:

Os centros de cobre nas proteínas foram inicialmente classificados em três tipos. A classificação era baseada principalmente em seus formatos espectroscópicos, particularmente aqueles em absorção eletrônica e espetro de ressonância paramagnética de eletron. Desde a classificação inicial, dois novos centros de cobre, CuA 5,6 and Cuz,7 foram descobertos e caracterizados. Suas estruturas únicas não pertencem a nenhum dos três tipos de centros de cobre e agora aqueles centros formam suas próprias classes.


As proteínas de cobre de tipo 1 são a classe de proteínas que deram origem à denominação de cupredoxinas. As proteínas de cobre de tipo 1 incluem ambas as proteínas com função conhecida de transferir elétrons (plastocianina e rusticianina), e proteínas cujas funções biológicas foram determinadas conclusivamente (stelacianina e plantacianina). Embora essas proteínas com funções desconhecidas não possam ser chamadas cupredoxinas por definição funcional estrita, elas têm sido classificadas como cupredoxinas pois compartilham a mesma estrutura geral de dobramento e sítios de ligação a metal das cupredoxinas. Em adição, muitas proteínas de múltiplos domínios como lacase, ascorbato oxidase e ceruloplasmina contêm múltiplos centros de metal, um dos quais é o cobre de tipo 1. Esses centros de cupredoxina também estão incluídos aqui. Finalmente, ambos os centros CuA na citocromo c oxidase (CCO) e na óxido nitroso redutase (N2OR), e o centro de cobre vermelho na nitrocianin serão discutidos nesse capítulo porque seus centros de metal são estruturalmente relacionados com o centro de cobre de tipo 1 e o domínio de proteína que contém ambos os centros compartilham o mesmo motivo geral das cupredoxinas. O centro CuA também funciona como um agente de transferência de elétrons. Como as ferredoxinas, as quais contém ambos os centros ferro-enxofre dinucleares ou tetanucleares, as cupredoxinas podem incluir tanto centros de cobre mononucleares ou dinucleares e seus sítios de ligação a metal.



As cupredoxinas discutidas neste capítulo compartilham uma estrutura de dobramento geralmente similar, comumente chamada a dobra da cupredoxina. É isto apesar do fato de a homologia seqüencial entre as cupredoxinas variar grandemente, algumas delas são menos que 10% homólogas entre si. O dobramento da cupredoxina é um exemplo do motivo estrutural da proteína chamado chave-grega barrilhada, que é um dos motivos estruturais de proteínas mais comuns compartilhado pelas metaloproteínas (tais como a superóxido dismutase e a hemocianina) bem como pelas não-metaloproteínas (tais como imunoglobulinas e piruvirato cinase). Uma chave-grega barrilhada consiste de seis ou oito fitas antiparalelas com uma ou mais conexões que atravessam o topo ou o fundo do barril, mais frequentemente saltando duas faixas de permeio. A topologia relembra o padrão de uma chave-grega. Os laços conectando faixas diferentes variam em lente e identidade de sequência. Eles também podem ser substituídos por hélices. A dobradura da cupredoxina difere do motivo típico de chave-grega barrilhada em que este contém duas faixas paralelas, entre a sua primeira e terceira faixas e entre a oitava e metade da segunda faixa. A segunda faixa paralela pode formar-se porque, nas cupredoxinas, a segunda faixa está sempre quebrada em duas pequenas fitas separadas de modo que a primeira metade é antiparalela à primeira enquanto a segunda é paralela à oitava. Os centros de cupredoxina sempre residem numa bolsa entre três laços conectando as faixas, com dois desses três laços proporcionando ligantes ao centro de cobre. A despeito da sua proximidade com a superfície da proteína, o centro de cupredoxina é completamente protegido de solventes, uma feição estrutural que é importante para sua função de trasferidor de elétrons pois isso contribui para reduzir a reorganização de energia na transferência de elétron.


Uma característica interessante das cupredoxinas é que os membros dessa família apresentam uma variedade de cores intensas e belas, do azul (plastocianina e azurina), ao verde (plantacianina e algumas nitrito redutases), ao vermelho (nitrosocianina), ao amarelo (alguns modelos de proteínas e compostos com cupredoxina), e ao púrpura (o centro CuA da citocromo c oxidase e da óxido nitroso redutase). Esse arco-íris de cores torna as cupredoxinas agradáveis de se trabalhar e desafiadoras para estudo.


Centros de Cobre Azuis em Enzimas Multicobres e de Múltiplos Domínios

O centro de cobre azul as cupredoxinas também é encontrado em enzimas multicobre e de múltiplos domínios tais como ascorbato oxidase (AO), laccase (Lc), ceruloplasmina humana (Cp), e uma sub-família de nitrito redutase contendo cobre. A nitrito redutase (NiR) catalisa a redução do nitrito (NO2) para óxido nítrico (NO), uma etapa do ciclo de denitrificação biológico. Dois tipos distintos de NiR são conhecidos: o NiR multiheme e o NiR multicobre. O NiR multicobre pode ser classificado adicionalmente como NiRs contendo centro de cobre verde e NiRs contendo centro de cobre azul. As enzimas AO, Lc, e Cp são oxidases que catalisam a redução de quatro elétrons do dióxigênio para água in vitro. O papel funcional preciso de cada uma das proteínas não foi determinado conclusivamente.

A NiR multicobre é um homotrímero, no qual cada monômero contém dois domínios. Por outro lado, a AO e a Lc contêm três domínios enquanto a Cp humana contém seis domínios. Cada domínio dessas enzimas tem uma dobra típica de cupredoxina. O centro de cobre azul reside no primeiro domínio da NiR, o terceiro domínio da AO e da Lc, e o segundo, quarto e sexto domínios da Cp humana. O centro de cobre azul no domínio 1 da NiR, domínio 3 da AO e nos domínios quatro e seis da Cp humana são quase similares ao da plastocianina consistindo de CuII(NHis)2SCysSMet em geometria tetraédrica nivelada. Enquanto a distância do CuII–S_(Met) é menor para o centro de cobre na NiR do que na pastocianina, as distâncias na AO e na Cp são em geral mais longas.


Além disso, a metionina axial ligante no domínio três da Lc e no domínio 2 da Cp é substituída por uma leucina. Essa substituição da metionina com um resíduo de leucina mais hidrofóbico pode ser parcialmente responsável pelos altos potenciais de redução da Lc do polyporus versicolor (um fungo de casca de árvore) bem como o domínio dois de cobre azul da ceruloplasmina humana. O potencial de redução no domínio 2 da ceruloplasmina humana é tão alto que ela está sempre na forma reduzida sob condições fisiológicas e não se espera que atue num papel na função de enzima. Com exceção desse centro redox inativo, outros centros de cobre em oxidases multicobre funcionam por transferência de elétrons a partir de parceiros fisiológicos das oxidases para os centros de cobre trinucleares onde as reações de oxidases têm lugar.

“Electron Transfer: Cupredoxins “ Y. U http://montypython.scs.uiuc.edu/papers/08172_final.pdf - 861 KB,
Obs.: http://www.freepatentsonline.com/7511117.html ]

Fonte: Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2144041/?tool=pubmed

INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL DOS DOMÍNIOS A DO FATOR V DE COAGULAÇÃO SANGUÍEA POR MODELAMENTO MOLECULAR

(Continuação)

B. O. Villoutreix and B. Dahlbäck

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A estrutura da ceruloplasmina humana tem sido desvendada e foi encontrado que seus três domínios A estão arranjados de maneira triangular com cada domínio feito de duas dobras de tipo cupredoxina. Investigações em microscopia eletrônica (EM) têm sido descritas para FV/FVa e FV/FVa ligado a membrana mas uma estrutura em terceira dimensão com resolução atômica foi necessária para compreender mais além as funções de co-fator essenciais do FV/FVa e inativação.

VALIDAÇÃO DO MODELO

A estrutura geral do modelo do FV mostra as características básicas de dobras de tipo cupredoxina. Assim, cada domínio A é feito essencialmente de dois barrilhetes beta. O presente modelo (domínios A1, A2 e A3) pertence a um compartimento de 65 X 75 X 85 Å ( 1 Å = 0,1 nanômetros). Quando desprezado o eixo de três dobras, os três domínios A poderiam encaixar-se em um círculo com diâmetro de aproximadamente 80 a 90 Å. Os três módulos foram testados interativamente e suas estruturas em três dimensões bem como a distribuição dos resíduos hidrofóbicos, polares e carregados foram encontrados de acordo com o padrão do raio X e as características da estrutura da proteína foram conhecidas. No momento, os resíduos que se esperava como carregados em pH neutro são expostos a solvente, ou, se ocultados, envolvidos em interações iônicas e/ou ligação de hidrogênio. Nenhuma divergência estérica severa foi notada durante o processo de modelagem dos domínios A indviduais nem nas interfaces, endossando a qualidade da estrutura.

No modelo de FV todas as inserções/deleções em comparação com a ceruloplasmina são áreas expostas a solvente e estruturas em laço. Sabe-se bem que as estruturas em laço e as inserções são mais difíceis de prever. Longos laços também tendem à flexibilidade, e estruturas de alta resolução são raramente obtidas experimentalmente para essas regiões de uma proteína. Na presença do modelo FV, as áreas mais difíceis de modelar envolveram aproximadamente 40 resíduos fora dos 994 (dos domínios A em estudo) e compreende as regiões dos resíduos 302 a 317, 442 a 446, 1659 a 1673, e 1727 a 1736. A inserção 302 a 317 pode ser construída como um laço estendido ou poderia ter como apresentado aqui, vários resíduos em conformação helicoidal como previsto usando sistemas de rede de trabalho de Perfil de agente neural de Heidelberg. Este segmento contém oito resíduos positivamente carregados e um ácido glutâmico e deveria, assim, ser essencialmente exposto a solvente. Todos esses resíduos carregados nessa região estão expostos a solvente, sugerindo que a conformação selecionada é de razoável precisão. Tal estrutura em hélice poderia ser de fato de importância funcional. Com a conformação selecionada, as regiões dos resíduos de 442 a 446 e de 1658 a 1673 mostram contato favorável com partes remanescentes da proteína ou são expostas apropriadamente a solvente. Na CP, o segmento correspondente aos resíduos de 1727 a 1736 do FV foram perdidos da coluna coordenada mas foram relativamente fáceis de construir.

As pontes dissulfeto têm sido relatadas a respeito da cadeia pesada do FV bovino. Elas estão conservadas na estrutura da CP e correspondem àquelas propostas na figura 1 (C139-C165, C220-C301, C472-C498, C575-C656, C1697-C1723) como encontrado após as análises dos modelos. Tomadas juntos, as observações acima sugerem fortemente que o modelo do FV está correto.

SÍTIO DE LIGAÇÃO A COBRE

Os íons de metal das oxidases azuis (ex.: ceruloplasmina) são divididos em três tipos distinguíveis por espetroscopia, aos quais se refere como de Tipo I (cobre “azul”, com intensa absorção óptica por volta de 600nm), de Tipo II (sem absorção visível) e de Tipo III (absorção de 330 nm). Seis átomos de cobre foram identificados na estrutura cristalina da CP. Três íons de cobre ocupam centros mononucleares enquanto os três íons remanescentes formam um conjunto trinuclear. Na CP, existem três sítios de ligação a cobre de tipo I, dois de tipo III e uma de tipo II. Sabe-se que o FVIII contém um íon de cobre por molécula. Tagliavacca e outros (1997) descobriram depois de experimentos de mutagênese do sítio que o íon de cobre liga-se preferencialmente ao sítio de Tipo I (presente na CP) envolvendo no mínimo o C310 (cisteína 310) do FVIII (C319 na CP e S282 no FV (S é serina)) no domínio A1. Esses autores também mostraram que a ligação do cobre nesses sítios é importante para o dobramento do domínio, para a associação apropriada das subunidades e para a atividade do FVIII/FVIIIa. Baseados nesses dados, nós investigamos o modelo do FVIII e encontramos facilmente o sítio de ligação a cobre proposto experimentalmente. Isso sustenta a precisão da estrutura do FVIII e o fato da ceruloplasmina poder ser usada de modo exato como modelo dos domínios A do FVIII e do FV.

O FV e o FVa bovinos mostraram-se ligar a íons de cobre não tipo I e não tipo III por absorção atômica e espectroscopia de emissão. Além disso, tem –se sugerido que o íon de cobre no FVIII é ligante de diferentes resíduos mais do que o íon de cobre do FV. De fato, quando comparadas as sequências do modelo do FV humano e do FV bovino com a estrutura em raio X da ceruloplasmina, somente um sítio de ligação de cobre está conservado e corresponde ao cobre de tipo II da ceruloplasmina, o qual envolve a H101 (histidina) e H978, enquanto na ceruloplasmina a Y107 (tirosina) e S102 (serina), indiretamente envolvidas na ligação do cobre, são respectivamente a Y91 e a P86 (prolina) do FV. O suspeito sítio de ligação de cobre no modelo do FV é consistente com o estudo relatado por Mann e outros (1984). Um íon de cobre, em ambos o FV e FVIII, poderia contribuir para a estabilidade da estrutura do domínio e para a interface A1/A3.

SÍTIO DE LIGAÇÃO A CÁLCIO

Sabe-se que o cálcio liga-se ao FV bovino e humano e que nem a cadeia pesada, nem a leve sozinhas exibem afinidade significativa para com esse íon de metal. No modelo do FV, uma bolsa de ligação a cálcio pôde envolver todos ou alguns dos seguintes resíduos na interface A1-A3 (perto do sítio de ligação a cobre): E96 (ácido glutâmico), D102 (ácido aspártico), E108, D111, D112. Esses resíduos negativamente carregados são essencialmente conservados nas sequências do FV, da CP e do FVIII bovinas. Entretanto, outras regiões não podem ser elencadas com a informação disponível no presente.

PATOLOGIA BIOESTRUTURAL

A ocorrência da para-hemofilia (deficiência de FV) é pouca, em contraste com a hemofilia A (deficiência do FVIII). Duas mutações nos módulos A do FV foram relatadas até agora. Uma envolvia a substituição A221V no domínio A1 e a segunda , a substituição R506Q dentro do domínio A2.

O plasma de pacientes com a substituição A221V teve reduzidos níveis de antígeno FV e reduzida atividade. A alanina 221 está localizada em um laço e é exposta a solvente, assim, sua substituição por uma valina poderia ser tolerada. No alinhamento de múltiplas sequências apresentado por Pemberton e outros (1997), pode-se ver que essa alanina está conservada na ceruloplasmina e no FV mas é substituída por histidina no FVIII. O problema estrutural potencial devido à substituição de A por V poderia ser a perturbação da ponte de sal parcialmente encoberta entre K304 e E275 e/ou choques estéricos direcionados com E275 e/ou perda da ligação dissulfeto C220-C301. Entretanto, baseados nas análises estruturais do modelo, a ocorrência dessas mutações naturais podem não ser a razão para o fenótipo observado. Seria de interesse explorar suplementarmente o papel dessas mutações “in vitro”.

A arginina 506 está acessível ao solvente e localizada no topo (ponta) de um laço. Ela pode ter uma interação iônica com D504. A mutação R506Q pôde induzir algumas ligeiras mudanças conformacionais mas serão essencialmente desfavoráveis para a interação com a APC em D189 (limitante do número de quimio-tripsinogênio, veja Mather e outros, 1996), localizada na base de especificidade da bolsa. O FV intacto tem sido mostrado como um co-fator, junto com a OS, na inativação do FVIIIa pela APC, enquanto a proteína FV R506Q parece ser muito menos efetiva como um co-fator da APC durante este processo. Quatro hipóteses podem ser geradas aqui: 1) a área R506 liga-se à APC em uma região localizada fora do sítio ativo da enzima, 2) a clivagem da APC na R506 é necessária para a atividade anticoagulante do FV, 3) a área R506 interage com a proteína S, e 4) a área R506 interage com FVIIIa.

LIGAÇÃO A MEMBRANA

U FV recombinante sem o domíno C2 perdeu sua capacidade de ligação à membrana. O FVa também pôde interagir com a superfície fosfolípide por via do domínio A3. Os resíduos FVa bovinos de 1654 a 1752 (1667 a 1765 nos humanos), no domínio A3, poderia ser importante para a interação com fosfolipídeos neutros. Após as análises do modelo de FV, pode ser visto que a maioria desses resíduos do A3 estão escondidos do solvente e pertencem ao cerne hidrofóbico da proteína. Tal peptídeo hidrofóbico poderia interagir com os fosfolipídeos neutros mas por caminho não fisiológico. Os aminoácidos expostos a solvente no modelo de FV pertencentes ao segmento peptídico de 1667 a 1765 exigem aproximadamente K1667 (lisina) a Y1678 (tirosina), Q1724 (glutamina) a E740 (ácido glutâmico) e E1757 a R1765 (arginina). A região de 1724 a 1740 está perto de M1883 e possivelmente perto do domínio C2. Assim, se o domínio A3 do FV se liga à membrana, a região mais aceitável envolve apenas os resíduos de 1724 a 1740, enquanto a região em volta dos resíduos R1765 e T1767 (treonina) não deveriam estar envolvidos nesse processo já que esses resíduos são acessíveis ao FXa e à clivagem pela elastase do neutrófilo humana, respectivamente, na presença de fosfolipídeos. A região dos resíduos de 1667 a 1678 contêm principalmente aminoácidos carregados e não é consistente com o fato de as forças hidrofóbicas terem sido mostradas como essenciais para a interação peptídeo-membrana. Baseados nas análises estruturais do modelo do FV, nós sugerimos que somente o C2 (e possivelmente o domínio C1) interage com a membrana. Os dois domínios C serviriam, em parte, como espaçadores/separadores, posicionando os domínios A na distância apropriada do plano da membrana para a atividade funcional ótima. Tal hipótese é consistente com a representação esquemática da ligação do FVa à membrana, como mostrado pelo estudo de EM (microscopia eletrônica) (Stoylova e outros, 1994) ou investigação em EM de Lampe e outros (1984), que apontam que os componentes da cadeia leve (A3-C1-C2) do FVa ligados à superfície da membrana parecem estar em grande parte externamente aos fosfolipídeos.

Foi relatado que a cadeia pesada do FVa pode ter contato direto com fosfolipídeos neutros e que essa interação não é de natureza iônica. Após análises estruturais dos domínios A, nós sugerimos que a partida do domínio A3 de sua organização triangular dentro da estrutura A1-A2-A3 leva à exposição de cadeias laterais hidrofóbicas que são escondidas nas faces internas de A1-A3 e A2-A3. Após a inativação do FV/FVa pela APC, a interação dos domínios A com a membrana, entretanto, poderiam ser de importância fisiológica.

SÍTIO DE LIGAÇÃO DO FATOR Xa COM PROTEÍNA S

Foi relatado que a PS e o FXa poderiam interagir com os resíduos de 493 a 506 do FVa. Neste peptídeo , os resíduos K499, S500, D504, R505 e R506 estão expostos a solvente no modelo. Interessantemente, a remoção dos resíduos de 683 a 709 do FVa ou a clivagem em R506 pela APC resulta em diminuída interação entre FXa e FVa. Esses dados são consistentes pois a localização dessas duas regiões poderia estar relativamente próxima no espaço (possivelmente entre 10 e 20 Å). Os resíduos de 499 a 506 poderiam interagir com FXa, e esse resultado poderia explicar o efeito protetor do FXa observado na clivagem em R506 pela APC. Interessantemente, os resíduos de 558 a 565 e de 1811 a 1818 do FVIII foram propostos por interagirem com o fator IXa. Os segmentos equivalentes no FV envolvem os resíduos de 502 a 509 e de 1677 a 1682, respectivamente, e a maioria deles é exposta a solvente.

Também foi sugerido que os resíduos de 507 a 520 poderiam estar envolvidos na ligação do FXa. Os resíduos I508 (isoleucina), R510, A511, D513, I514 e E515 são expostos a solvente e poderiam assim ter contato com o FXa. O fato de que o FXa liga-se com dificuldade ao FV intacto e os dados acima sugerem que o domínio B poderia ter contato direto ou indireto com as regiões ao redor de R506.

Dois anticorpos monoclonais dirigidos tanto contra os domínios A1 ou A3 do F inibiram a interação FVa-FXa. Tendo sido proposto que a cadeia leve do FVa ligada à membrana não interage com o FXa, informações adicionais são necessárias de acordo a determinar se os anticorpos reconheceram o sítio de ligação do FXa na superfície do FVa ou se eles inibiram a interação FXa-FVa devido a estorvo estérico. Desde após a inativação do FVa pela APC, o domínio A2 dissocia-se, e, porque nesta situação o FV remanescente não se liga a FXa, é aceitável que áreas chave para contato entre o FVa e o FXa envolvem o domínio A2. Tal hipótese poderia ser investigada em futuro próximo desde que um modelo da estrutura do FXa tenha sido relatado.

Sabe-se que a PS estimula a clivagem do FVa em R306 pela APC e que a PS induz a realocação do sítio ativo da APC a 10 Å de proximidade da superfície da membrana. A distância entre a R306 e a R506 na estrutura modelo é de 35 Å. Entretanto, ainda é muito difícil a visualização do mecanismo exato de ação da PS a partir desses dados. Por outro lado, a PS poderia ligar-se aos resíduos de 499 a 506 e poderia assim contra-atuar o efeito protetor do FXa quanto à clivagem da APC na R506 e orientar a APC para a clivagem ótima na R306. Por outro lado, se a PS liga-se aos resíduos de 499 a 506 do FVa, isso poderia proteger ou afetar significativamente a clivagem na R506, ao mesmo tempo parece que a PS não atua num papel neste sito.

SÍTIOS DE LIGAÇÃO DA PROTROMBINA

A protrombina forma um complexo 1:1 com a cadeia pesada do FVa. Essa interação é de moderada afinidade e independente de cálcio na ausência da superfície de membrana. Entretanto o domínio Gla da protrombina atua num papel na interação protrombina FVa quando os fosfolipídios estão presentes. Após a inativação do FVa pela APC, o domínio A2 dissocia-se e a ligação à protrombina é perdida. Porque dentro do complexo protrombinase (FXa + FVa + fosfolipídeo) o FVa está parcialmente protegido da clivagem pela APC, porém para o sítio R306 e desde que o FXa proteja a clivagem da APC na R506, nós sugerimos que a protrombina tenha interação direta com o domínio A2 do FVa, em áreas margeando a R506 mas diferentes do sítio de ligação do FXa. Possivelmente, como no caso da ligação do FXa, os resíduos de 683 a 709 do FVa poderiam atuar num papel na interação com a protrombina.

O FATOR Xa E AS CLIVAGENS DA ELASTASE DO NEUTRÓFILO

A única clivagem do FXa que pôde ser investigada com o presente modelo de estrutura envolve o resíduo R1765 do FV humano. Esse resíduo é exposto a solvente e tendo sido os experimentos realizados na presença de fosfolipídeos, essa região poderia estar a 80Å da superfície da membrana. A elastase do neutrófilo humana cliva o FVa em A341, I508 e T1767. Esses três sítios de clivagem não são influenciados pela presença de fosfolipídeos, indicando que essas regiões estão localizadas fora da área de ligação a membrana. Esses três resíduos foram achados em laços expostos a solvente no modelo de FV. Esses dados também sustentam a acuidade do modelo da estrutura do FV.

OS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA C ATIVADA E A INATIVAÇÃO DO FV/FVa

A APC parece ligar-se à cadeia leve do FVa por via de um sítio que abrange os resíduos de 1865 a 1874 do FVa. Esses resíduos, entretanto, estão em sua maior parte escondidos dentro do cerne da proteína. Esse peptídeo, considerado inibidor da inativação do FVa pela APC, deveria assim atuar de modo não fisiológico.

O FVa é clivado pela APC nos resíduos R306, R506 e R679 (Kalafatis e outros, 1994b). Esses autores sugeriram que a clivagem pela APC do FVa ligado à membrana na R506 promove a clivagem na R306 e na R679, mas Nicolaes e outros (1995) mostraram que clivagem anterior na R506 não é requerida para a clivagem na R306 após estudos da proteína R506Q. O papel fisiológico da clivagem da APC no resíduo R679 não está bem definido por contraste com as clivagens nas R306 e R506. No momento, Egan e outros (1997) relataram que a clivagem da APC na R679 não contribui para a inativação do FVa. A taxa de clivagem da APC na R506 é aproximadamente 20 vezes mais alta do que na R306. Em adição, como descrito acima, o FXa parece proteger o FVa da clivagem na R506 enquanto a PS tem sido sugerida como intensificadora da clivagem da APC na R306. Também foi relatado que a clivagem do FVa pela APC leva à dissociação do domínio A2, o que então resulta no fator Va intermediário sem atividade. Essa última reação pareceria a dissociação espontânea do domínio A2 do FVIIIa que se segue à ativação pela trombina. [Obs.: Tanto a trombina quanto o fator Xa (FXa) ativam o FV. A ativação está associada à remoção do domínio B da parte remanescente do FV que constitui o FVa. O FVa é composto de uma cadeia pesada de 105 quilodáltons (A1-A2) e de uma cadeia leve de 71/74 quilodáltons (A3-C1-C2), sendo as duas cadeias presas por ligações não covalentes dependentes de cálcio. O FVa é um co-fator da protease de serina FXa, a qual, na presença de íons de cálcio e de uma superfície de membrana fosfolípide (PL) apropriada , intensifica a ativação da protrombina em trombina por várias ordens de magnitude. O complexo FXa-FVa-PL é chamado de complexo protrombinase. O FVIII ativado (FVIII) tem uma função homóloga à do FVa, servindo como um co-fator no complexo tenase (FVIII + FIX) para a enzima fator IXa (FIXa) na ativação do fator X (FX). PMID 12714495 – O FV e o FX ativam a trombina e o FVIII e o FXI ativam o FX.] Finalmente, o FV intacto ligado à membrana parece ser clivado lenta e sequencialmente pela APC nos resíduos R306, R506, R679 e K994. Tais informações sugeririam que ao menos a R506 e a R679 estão direta ou indiretamente protegidas pelo domínio B.

No presente modelo de estrutura, somente a R306 e a R506 do FV podem sem investigadas. A R306 é exposta a solvente e poderia estar localizada dentro de um segmento helicoidal distorcido entre os domínios A1 e A2 ou em uma estrutura em laço mais facilmente flexível. De fato, esse segmento pode submeter-se a mudanças em sua conformação e adotar ambas as conformações, como no caso do laço reativo de serpina. Em todas as situações, os rearranjos estruturais importantes seriam requeridos para a apropriada ancoragem na fenda do sítio ativo da APC. Como mencionado acima, a estrutura secundária prevista indicou que o segmento R306 poderia estar em conformação helicoidal. Tal estrutura de fita seria consistente com o fato de que, após a clivagem pela APC, o domínio A2 se dissocia. A clivagem do peptídio liado em R306 poderia assim liberar energia e promover a dissociação do domínio A2. Entretanto, o R306 deveria estar todo o tempo acessível à APC e a clivagem em R506 não necessária para ganho de acesso à ligação peptídica 306-307 enquanto, todavia, alguma mudança na conformação após a clivagem em R506 poderia facilitar a clivagem em R306. A arginina 306 tem em sua vizinhança direta vários resíduos positivamente carregados (FV resíduos K299, K303, K309, K310, R313) não diretamente contrabalançados por outros negativamente carregados que pudessem atuar num papel durante a clivagem e ligação da APC.

A R506 é exposta a solvente e pode encaixar-se facilmente para dentro da bolsa específica da APC mas alguns rearranjos de conformação no local seriam necessários, a partir de aproximadamente os resíduos P5-P3 e P2’-P5’ , de modo a igualar-se à estrutura canônica necessária para a ótima interação substrato da protease de serina/ inibidor. Os resíduos P2P1P1’ adotam realmente a conformação canônica no presente modelo, e assim, em contraste com o segmento R306, o peptídeo R506 dentro da estrutura nativa do FV/FVa parece mais apropriado para a interação com a fenda do sítio ativo da APC. Vários resíduos descompensadamente positivamente carregados são encontrados na vizinhança direta da R506. Esses envolvem a R316, R320, R400, R501, R505 e R510. O resíduo 506 está localizado entre duas barricas beta dentro do domínio A2, assim, após a clivagem na R506, as mudanças conformacionais são prováveis de ocorrer e poderiam explicar, em parte, a perda de ligação a FXa.

Interessantemente, o FVIIIa é clivado pela APC na R336 e na R562, e esses resíduos são homólogos aos R306 e R506 do FVa respectiamente. Trabalhos suplementares poderiam envolver a comparação dos modelos estruturais do FV e do FVIII junto com a ancoragem da estrutura APC em raio X em seus respectivos sítios de clivagem.

DO FATOR V AO FATOR Va

Investigações em microscopia eletrônica têm-se reportado ao FV, FVa e FVa ligado à membrana. O FVa foi visto como um composto de dois domínios, cada um tendo um diâmetro de aproximadamente 80 Å. O diâmetro geral do presente modelo do FV, quando despreza os pseudo eixos de três dobras, é de aproximadamente 80 a 90 Å. É possível que os três domínios A representem uma das duas esferas vistas no estudo de microscopia eletrônica. Os dois domínios C intoxicando os domínios A de aproximadamente 80 Å com respeito à superfície de membrana poderiam ser consistentes com o diagrama esquemático feito por Lampe e outros (1994). Isso também é possível de acordo com a distância esperada de 70 a 90 Å entre o plano da membrana e a fenda do sítio ativo de proteases como avaliado por transferência de energia fluorescente.
Mosesson e outros (1990) propuseram que o FV intacto tem uma forma retangular/alongada irregular de aproximadamente 100 a 200 Å que ostenta nenhum rearranjo estrutural principal após a liberação do domínio B. A ausência de rearranjo conformacional estaria consistente com o presente modelo de estrutura. Fowler e outros (1990) e Mosesson e outros (1990) sugeriram que as cadeias pesada e leve do FVa formam uma estrutura globular, enquanto o domínio B tem uma estrutura parecida com uma haste estendida projetando-se para fora da estrutura globular do FV intacto. Junto ao fato de que o domínio B tem vinte e cinco sítios em potencial para glicosilação em N e de que várias regiões são sensíveis à proteases, esses dados sugerem que esse domínio deveria tem contato extensivo com o solvente. Foi relatado após medição de transferência de energia de fluorescência para o FVIII intacto que a distância entre os resíduos C528 (domínio A2) e C1858 (domínio A3) está aproximada em 20 Å (de 25 a 30 Å no modelo da estrutura do FVIII). Essa informação também sugere que os domínios A estão em estreito contato antes da ativação.

Esses dados, juntos com o fato de que o FV e o FVa ligam íons de core igualmente bem, e o estudo do presente modelo, sugerem que, após a ativação pela trombina, o domínio B do FV é removido enquanto os três domínios A permanecem em estreito contato. Devido: ao FV intacto ter reduzida afinidade com o FXa, um sítio de ligação do FXa na superfície do FVa dever estar localizado próximo à R506, a APC catalisar o FV intacto bem lentamente, o FV e o FVa terem essencialmente a mesma afinidade para a superfície fosfolípide apropriada, o domínio C2 liga-se à membrana, ao menos a clivagem do FV intacto na R306 pela APC ser dependente de fosfolipídeo, a área da R1765 e da T1767 não estar em contato com o plano da membrana, os resíduos R306, R506 e R1765 terem que ter aproximadamente 80 Å de distância da membrana, e à possibilidade do domínio A3 inteiro não ter interação direta com os fosfolipídeos, nós sugerimos que somente o domínio C2 poderia interagir com a membrana enquanto o domínio B poderia cobrir parcialmente a região da R506 porém deixar a região da R306 mais exposta.

CONCLUSÕES

A qualidade do presente modelo estrutural do FV/FVa é fortemente sustentada já que o trabalho teórico é um grande acordo com os dados experimentais. Numerosas características estruturais e funcionais do FV/FVa foram analisadas e novos experimentos podem ser projetados com base nesse modelo estrutural.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2144041/?tool=pubmed

A ATIVAÇÃO DA HEMINA MELHORA A INFECÇÃO POR HIV-1 POR VIA DA INDUÇÃO DA HEME OXYGENASE

Krishnakumar Devadas and Subhash Dhawan

RESUMO

A Hemina [cloreto do heme em que o Fe2+ transformou-se em o Fe3+ , cloro-hemina. Stedman] , um componente critico da hemoglobina, é um ingrediente ativo de uma terapêutica biológica aprovada pela Administração de Alimentos e Medicamentos para o tratamento da porfíria [Obs.: A ferroquelatase, ou heme sintase (18q21.3), a enzima terminal da via da biosíntese do heme, catalisa a inserção do ferro na protoporfirina para formar o heme (omim 612386). A porfíria é um grupo de distúrbios envolvendo a biossíntese do heme, caracterizado pela excreção excessiva de porfirina ou seus precursores; a porfina é o núcleo básico não substituído das porfirinas]. Essa matéria descreve uma função biológica dessa molécula na indução da defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV-1 pela via da indução da heme oxigenase-1 (HO-1). O tratamento de monócitos com hemina inibiu substancialmente a replicação do HIV, como evidenciado pelo RNA viral quase indetectável e células livres da proteína p24 do HIV-1 de maneira dependente da dose. A exposição dessas células à hemina antes da infecção, no momento da infecção ou após a infecção causou uma redução de 90% no DNA do HIV com níveis significativamente baixos da p24 do HIV-1 e efeitos citopáticos associados ao HIV. Além disso, o tratamento com hemina suprimiu significativamente a infecção de monócitos e células T inoculadas com as linhagens com tropismo para R5, X4 e R5X4 (R5 deve ser CCR5 e X4 deve ser CXCR4), e de outros HIV isolados com transcriptase reversa resistente, resistência a azidothymidina (AZT), resistência a ddC/ddl, resistência a nivirapine, e outros. A administração intraperitoneal (peritôneo é uma membrana que recobre a parede abdominal e as vísceras) da hemina por quatro dias pós a infecção por HIV reduziu em seis vezes a carga viral no soro de camundongos SCID diabéticos não obesos reconstituído com células mononucleares do sangue periférico humanas. A supressão da replicação do HIV em células ativadas com hemina foi correlacionada com a indução da HO-1 e foi atenuada por tin protoporfirina (SnPP) IX, um inibidor da atividade da HO-1, sugerindo um papel central dessa enzima endógena na regulação da infecção pelo HIV. A indução da HO-1 induzida pela hemina nas células GHOST co-expressando CCR5, CXCR4 e CD4 foi consistente com a inibição da ativação do promotor do longo terminal de repetição (LTR) dependente de Tat levando à reduzida expressão de GFP. Esses achados sugerem um papel importante da atividade da HO-1 induzida pela hemina como um mecanismo de defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV-1.

INTRODUÇÃO

A hemina é a metade protética para um grande número do proteínas que atuam em papéis essenciais no transporte de oxigênio, função mitocondrial, e uma variedade de vias de transduções de sinais. Ela sobre-regula a heme oxigenase-1 (HO-1), uma enzima intracelular que catalisa a etapa inicial e de limitação da taxa da degradação oxidativa do heme, e gera biliverdina, ferro livre (Fe2+), e monóxido de carbono (CO). Ao longo das décadas passadas, investigações sobre o papel funcional da atividade da HO-1 aumentaram grandiosamente nossa compreensão sobre esta enzima como um mecanismo de defesa celular contra condições relacionadas ao estresse e outras condições patogênicas. Os efeitos benéficos da HO-1 também têm sido relatados em uma variedade de respostas imunes e na inflamação. Em desordens inflamatórias auto-imunes experimentais, tais como a encefalomielite e a colite, as funções protetoras da HO-1 têm-se mostrado associadas com a ativação do sistema imune.

Em adição às condições relacionadas com respostas imunes e inflamatórias, o ciclo de vida do HIV-1 está intimamente associado com a ativação do estado de suas células hospedeiras. A infecção pelo HIV-1 é dependente de uma variedade de fatores do hospedeiro para entrada, transcrição e expressão dos genes virais e é controlada por citocinas e pela maquinaria transcricional do hospedeiro. Embora numerosas reportagens publicadas prévia e recentemente tenham demonstrado múltiplas ações proeminentes da indução da HO-1 em vários processos inflamatórios, seu papel na regulação da infecção pelo HIV-1 não é conhecida. O presente estudo investigou o papel da HO-1 induzida pela hemina como um possível fator de proteção contra a infecção pelo HIV-1. Os achados deste estudo demonstram que o aumento da atividade da HO-1 mediado pela hemina suprime substancialmente a replicação do HIV tanto ‘in vitro’ quanto ‘in vivo’ com nenhum efeito tóxico aparente. Desde 1970, quando foi aprovada pela FDA, a hemina tem sido usada para tratar com sucesso uma variedade de desordens, tais como porfíria aguda, falência de transplante do fígado devida à recorrência de protoporfiria eritropoiética, e talassemia [qualquer tipo de distúrbio no metabolismo da hemoglobina caracterizado por comprometimento na síntese de uma ou mais das cadeias polipeptídicas da globina. Stedman] intermediária com mínimos efeitos colaterais. [Obs.: omim 141900 – Os locus alfa e beta determinam a estrutura de dois tipos de cadeias polipeptídicas na hemoglobina adulta, Hb A. A globina beta mutante que dobra como uma foice causa a anemia da célula em forma de foice (omim 603903). A ausência da cadeia beta causa a talassemia beta zero. Quantidades reduzidas de globina beta detectáveis causam a talassemia beta positiva. Por motivos clínicos, as talassemias beta são divididas em talassemia principal (dependente de transfusão), talassemia intermediária (de severidade intermediária) e talassemia menor (assintomática).]Nossos resultados, por isso, podem proporcionar novas estratégias no desenvolvimento de intervenções terapêuticas potencialmente seguras para o tratamento da infecção por HIV.

RESULTADOS

Químicamente conhecida como cloro-[7,12-diethenyl-3,8,13,17-tetramethyl-21H,23H-porfina-2,18-dipropanoato(2-)-N21,N22,N23,N24]ferro, a hemina representa um componente crítico da molécula de hemoglobina, cuja estrutura é mostrada na figura 1A. As vias de sinalização mediadas pela hemina envolvendo a ativação da HO-1 (heme oxigenase) têm sido implicadas numa variedade de desordens inflamatórias. Todavia, sua função na regulação da infecção por HIV permanece desconhecida. Para examinar o papel da ativação da HO-1 na infecção por HIV, monócitos foram expostos à hemina, infectados com HIV-1, e examinados para a replicação viral. Como mostrado na Figura 1B, o tratamento dos monócitos cultivados com hemina inibiram eficientemente a expressão do RNA viral de modo dependente da dose. Consequentemente, a replicação do HIV-1 foi completamente inibida numa concentração ótima de 100-µM(micro mol). A replicação do HIV-1 permaneceu suprimida ainda quando os monócitos foram infectados com alta MOI, como foi evidenciado pela indetectável produção de p24 do HIV livre na célula mensurada no sétimo dia após a infecção.

O tratamento dos monócitos com hemina 24 horas antes da infecção suprimiu significativamente a expressão do DNA viral (figura A). Os níveis do DNA do HIV em células tratadas com hemina no momento da infecção também estavam substancialmente mais baixos em comparação com controles não tratados. Para determinar a capacidade da hemina suprimir a replicação viral após a entrada, as células foram incubadas com hemina quatro horas após a exposição viral, e o DNA genômico foi analisado para a presença de sequências específicas de env por amplificação por PCR em 24 horas. Os resultados desses experimentos mostram que o tratamento com hemina quatro horas depois da inoculação do HIV, o que fornece tempo suficiente para a entrada viral, também reduziu significativamente a expressão do gene viral. O conjunto de iniciadores usados para a amplificação por PCR foi específico para sequências altamente conservadas do envelope do HIV-1. Os produtos do PCR a partir de DNA ou cDNA de células não infectadas usando-se os mesmos iniciadores foram negativas para bandas do HIV, sugerindo que os produtos amplificados por PCR de células não infectadas por HIV eram altamente específicos. O tratamento de monócitos com hemina 24 horas antes da infecção, no momento da infecção, ou ainda vinte e quatro horas após a infecção (+24h) suprimiu a replicação do HIV (Fig.2B). Esses resultados foram consistentes com uma marcada redução de efeitos citopáticos associados ao HIV em monócitos tratados com hemina 24 horas antes da infecção (-24h), no momento da infecção (0h), ou 24 horas após a infecção (+24h) como mostrado na Fig 2C.

Para determinar se a resposta celular induzida por hemina foi um mecanismo de defesa do organismo para refractariedade das células à infecção pelo HIV e, a partir disso, seria independente do tropismo viral, os monócitos tratados com hemina foram desafiados com viroses X4, R5 e de duplo tropismo R5X4 , e a cultura sobrenadante foi examinada para p24 no sétimo dia após a infecção. Como esperado, na ausência da hemina, os monócitos foram infectáveis com as linhagens virais R5 (92US714 HIV-1 com env do subtipo B, e 93IN101 HIV-1 com env do subtipo C) e R5X4 (92RW009 HIV-1 com env do subtipo A e 92HT596 HIV-1 com env do subtipo B). Entretanto, surpreendentemente, exceto para o HIV-1 92UG046 (HIV-1 env do subtipo D), todas as p24 do HIV estavam praticamente indetectáveis na cultura sobrenadante infectada com as outras duas linhagens virais com tropismo para X4 CMU02 (HIV-1 env de subtipo EA) e 98IN017 (HIV-1 env subtipo C). Todavia, a despeito do tropismo viral, o tratamento com hemina inibiu a infecção de monócitos com todos os HIV-1 isolados testados (Fig.3A). Similarmente, em adição aos vírus isolados adaptados em laboratório, o tratamento com hemina inibiu a replicação do HIV em PBL (deve se linha de células do sangue periférico) infectadas com um vírus resistente a azidothimidina (AZT) contendo uma mutação no aminoácido residual 215Y (tirosina) da transcriptase reversa (HIV-1RTMF/MT-2), uma mutação no aminoácido residual 74V (valina) da transcriptase reversa (HIV-174v/MT-2) gerando resistência ao 2’3’-dideoxi-iosina e ao 2’3’-dedeoci-citidina, um vírus resistente a nevirapuna (N119), bem com um vírus isolado de pacientes com tropismo para X4 92UG029 (HIV-1 env de subtipo A) e linhagens virais com tropismo R5X4 93BR (BRASIL)020 (HIV-1 envelope de subtipo F) (Fig.3B).

Para avaliar se a atividade anti-HIV induzida pela hemina é preservada “in vivo”, camundongos NOD-SCID implantados com células monocitóides de sangue periférico foram inoculados com o HIV-1 (105 TCID50/camundongo) e então, cinco dias depois, administrados com uma dose de 4mg/kg por dia. No sétimo dia, os camundongos foram re-injetados com 105 TCID50/camundongo HIV-1 para assegurar a infecção produtiva. Como mostrado na figura 4, os níveis de p24 do HIV-1 no soro dos camundongos infectados foi detectável no quarto dia, um dia antes da administração da hemina. Quatorze dias após a primeira inoculação o nível de p24 estava seis vezes mais baixo do que o dos controles não tratados (Fi.4). A supressão da replicação do HIV pelo tratamento dos camundongos com hemina foi consistente com a inibição “in vitro” da replicação do HV e a reduzida expressão do gene viral.

A hemina é conhecida por induzir a expressão da HO-1 em uma variedade de tipos celulares. O tratamento de monócitos com hemina induziu a expressão da HO-1 de maneira dependente da dose e do tempo (Fg5A). A indução máxima foi observada quando as células foram incubadas com 100 µM (micro mol) de hemina por 18 horas a 37oC. Esses dados foram consistentes com a supressão da replicação do HIV, como descrito acima. Nenhum efeito citotóxico foi observado nessas concentrações (dados não mostrados). Para determinar a especificidade da atividade da HO-1 induzida por hemina na mediação da atividade anti-HIV, monócitos foram incubados com várias concentrações de SnPP IX (protoporfirina IX), um inibidor da função da HO-1, uma hora antes do tratamento com hemina a 25 µM por uma hora, depois foram infectados com HIV-1, e então examinados enquanto células livres de p-24 do HIV-1 cinco dias após a infecção. Os resultados desse experimento mostrados na figura 5B demonstram que o tratamento com SnPP IX em ótima concentração de 6,25 µM atenuou a inibição da infecção por HIV induzida por hemina, sugerindo que a supressão da infecção do HIV mediada por hemina foi mediada pela indução da HO-1. Uma baixa concentração de hemina (25 µM) foi usada nesses experimentos devido aos efeitos citotóxicos do SnPP em altas concentrações. Em outro conjunto de experimentos, 12,5 µM de SnPP atenuou a supressão da replicação do HIV pela hemina a 50 µM (dados não mostrados). O SnPP é um inibidor competitivo para a atividade da enzima HO-1. Por isso, ele atenuou a atividade da enzima HO-1 sem afetar a expressão da proteína (HO-1) (dados não mostrados).

As células GHOST expressam CD4, R5 bem como co-receptores X4, e o cassette reporter de GFP dependente de Tat. Essas células, por isso, representam um sistema modelo ideal para visualizar a infecção com viroses usando um ou mais co-receptores. Similar aos monócitos, o tratamento das células GHOST com hemina induziu a expressão de HO-1 de modo dependente da dose. Essas células foram infectadas com a linhagem do HIV-1 com tropismo para R5X4 e examinadas por proteína verde fosforescente (GFP) por microscopia de fluorescência. Como mostrado na figura 6B, as células GHOST foram produtivamente infectadas como evidenciado pela expressão da GFP dirigida pelo longo terminal de repetição (LTR) do HIV e evidenciado por efeitos citopáticos associados. O tratamento com hemina suprimiu significativament a indução da expressão da GFP, indicando um baixo nível de replicação do HIV. Nenhuma expressão do GFP por observada nas células não infectadas. Consistentemente com essas observações, o tratamento com hemina reduziu substancialmente os efeitos citopáticos associados ao HIV, e como esperado, tais efeitos não foram observados em células não infectadas (Fig. 6B). A expressão da GFP em células GHOST depende da Tat produzida intracelularmente pela infecção produtiva do HIV.

Para confirmar que a indução da GFP em células infectadas produtivamente foi dirigida pela proteína Tat, células GHOST não infectadas foram pré-tratadas com hemina por 24 horas, eletroporadas com proteína Tat do HIV-1 exógena recombinante e depois examinadas para expressão de GFP. Como mostrado na Fig.6C, a expressão da GFP foi induzida pela proteína Tat ainda na ausência da infecção por HIV. Como observado com células infectadas por HIV, o tratamento com hemina inibiu significativamente a expressão da GFP em células eletroporadas com a proteína Tat exógena. A proteína Tat inativada por calor (delta Tat) ou somente com tampão (uma mistura para manter o pH) não causou a indução da GFP. A viabilidade da célula, determinada por teste de exclusão de azul de tripano [corante para células em cultura e tecidos], após a transfecção da Tat foi maior que 90%. A expressão da GFP foi observada em mais de 80% das células, sugerindo a eficiência da transfecção em mais de 80%. A experiência de fluorescência em células transfectadas tanto com Tat inativadas por calor ou somente por tampão foi substancialmente menor do que a das células transfectadas com a proteína de Tat ativa, proporcionando sustentação adicional para essas observações. Esses resultados proporcionam evidências para a inibição da ativação do promotor do LTR dependente de Tat, levando à redução da expressão da GFP e, dessa forma, replicação reduzida do HIV em células GHOST tratadas com hemina.

DISCUSSÃO

O presente estudo demonstra uma função da atividade da HO-1 como potente fator de defesa do hospedeiro para a infecção por HIV-1. Nossos estudos mostram claramente que a ativação da HO-1 por seu substrato hemina os protegeu contra a infecção por HIV com vários HIV isolados clínicos incluindo alguns dos que desenvolveram resistência às drogas anti-retrovirais convencionais. ‘In vivo’, a administração da hemina em camundongos humanizados NOD-SCID suprimiu substancialmente a replicação do HIV. Esses achados sugerem que o indutor de HO-1, a hemina, é um biológico endógeno potencialmente efetivo na indução da resposta de defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV. Um componenete crítico de uma variedade de proteínas, incluindo a hemoglobina, a hemina tem sido mostrada por exercer numerosas funções biológicas benéficas. Após ter sido aprovada pela FDA, várias formulações da hemina têm sido usadas desde 1970 para tratar a porfíria com sucesso, para controlar a falência do transplante de fígado devido à recorrência de protoporfiria eritopoiética [distúrbio benigno do metabolismo da porfirina causado por uma deficiência da ferroquelatase associada a aumento da excreção fecal de protoporfirina, urina vermelho-púrpura e aumento da protoporfirina IX nas hemácias, plasma e fezes; caracterizada por urticária solar aguda ou eczema solar mais crônico, desenvolve-se rapidamente quando há exposição à luz solar. Stedman.
Obs.: A protoporfirina de tipo III é a principal protoporfirina encontrada na natureza, caracterizada pela presença de quatro grupos metil, dois grupos vinil e duas cadeias laterais de ácido propiônico, um derivado da porfirina que, com o ferro, forma o heme da hemoglobina e os grupos prostéticos da mioglobina, catalase, citocromos, etc. Stedman.] e em pacientes com talassemia intermédia, com efeitos mínimos. Por isso, sujeita a estudos suplementares, a hemina poderia servir como um novo biológico terapêutico para o tratamento da infecção por HIV.

Embora houvesse infectividade do HIV substancialmente mais baixa relativa aos controles não tratados, o DNA do HIV detectável nas células infectadas pré-tratadas com hemina sugerem que e entrada viral foi substancialmente inibida, mas não completamente bloqueada. Similarmente, a exposição da hemina à células pré-inoculadas com HIV também suprimiu a replicação do vírus por mais de 90%. Por isso, a entrada viral reduzida nas células alvo pode não ser o único fator responsável pela supressão da infecção por HIV. Desde a entrada, há múltiplas etapas no ciclo de vida do HIV, tais como integração viral, transcrição reversa, ou supressão da ativação do LTR do HIV, onde a hemina intracelular ou a HO-1 induzida por hemina poderia interferir e retardar a replicação do vírus. A despeito da presença do DNA viral nas células infectadas, a incapacidade do HIV para replicar-se produtivamente sugere fortemente um suposto papel da hemina na inibição de eventos após a entrada. Nossos dados proporcionam uma correlação direta entre a indução da HO-1 e inibição da replicação do HIV em células ativadas com hemina. A atenuação da replicação do HIV suprimida por hemina através do SnPPIX, um inibidor da atividade da HO-1, sustenta mais ainda essa enzima endogenamente indutível como um importante fator na modulação da infecção por HIV.

A infecção com viroses de tropismo duplo, que usam tanto o co-receptor R5 quanto o X4 para entrada, também foram associadas com a depleção das células T e progressão para a AIDS. Nós temos mostrado que o tratamento com hemina inibiu a infecção das células não somente com vírus isolados em laboratório, mas também com vários isolados clínicos, usando múltiplos co-receptores para sua entrada nas células alvo. Em adição, as células tratadas com hemina foram refratárias à infecção com linhagens do HIV mutantes ou resistentes a AZT ou outras drogas. Esses resultados indicam que indiferente ao tropismo viral, as células ativadas com hemina permaneceram protegidas da infecção por todas as linhagens do HIV-1 testadas neste estudo. A maioria das drogas usadas correntemente para o tratamento da infecção por HIV são compostos sintéticos e elicitam efeitos colaterais altamente indesejáveis nos indivíduos infectados com HIV-1. A terapia anti-retroviral altamente ativada (HAART), embora benéfica em suprimir a viremia em indivíduos infectados, pode contribuir para mutantes às drogas após uso prolongado e induzir efeitos metabólicos adversos, tais como lipodistrofia, hipertensão, diabetis mellitus, osteopenia e hiperlipidemia. A síndrome lipodistrófica afeta mais de 60% dos pacientes infectads por HIV tratados com HAART e, por essa razão, está emergindo como uma séria preocupação médica. A indução da resistência do hospedeiro à infecção por HIV pela hemina, um fator endógeno do hospedeiro relatado no presente estudo, poderia proporcionar uma estratégia alternativa atrativa para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para o tratamento da infecção por HIV. Essa abordagem poderia ser potencialmente muito vantajosa, especialmente para o tratamento de infecções com múltiplos isolados do HIV, linhagens recombinantes, e linhagens do HIV resistentes a drogas. Esses achados significativos poderiam ser explorados suplementarmente em outras linhagens virais resistentes a drogas.

Camundongos Hu-NOD-SCID tem sido amplamente aceitos como um modelo válido para estudar a patogênese do HIV e testar drogas anti-retrovirais. Nossos dados demonstram que a administração da hemina suprimiu significativamente a infecção do HIV em camundongos hu-NOD-SCID sem mudanças de comportamento, perda de peso ou outra toxicidade aparente. Esses resultados foram consistentes com achados ‘in vitro’. A dose usada da hemina nesse estudo é tipicamente usada para tratar pacientes com uma variedade de sintomas clínicos. Por isso, o tratamento com hemina pode proporcionar uma terapêutica biológica potencialmente segura. Outros efeitos patogênicos causados pela infecção do HIV em camundongos hu-NOD-SCID e possível atenuação ou reconstituição do sistema imune pelo tratamento com hemina estão sendo explorados e serão objeto de futuros estudos.

Pacientes com AIDS costumam desenvolver vários anomalias hematológicas, tais como anemia, leucopenia, trombocitopenia e alterações na plasticidade das células tronco no microambiente da medula óssea. Essas condições clínicas sugerem que a infecção pelo HIV-1 pode afetar processos envolvidos nos primeiros estágios da hemopoiese ou diferenciação das células-tronco. O último pode ser resultante dos altos níveis de citocinas pró-inflamatórias circulantes nos indivíduos infectados com HIV-1. Recentemente, a indução da HO-1 tem sido mostrada por mediar a resposta anti-inflamatória ‘in vivo’. Assim, é aceitável que a indução da HO-1 pela hemina pode suprimir os efeitos deletérios das citocinas pró-inflamatórias na infecção por HIV.
Correntemente, a hemina é usada com sucesso para o tratamento de porfírias agudas. Por isso, objeto de futuros estudos, o uso limitado desse componente biológico poderia proporcionar potencialmente a conseqüência do benefício clínico com efeitos adversos controlados.

Em conclusão, os achados do presente estudo proporcionam forte evidência para a HO-1 como um novo componente biológico endógeno com atividade anti-HIV. A inibição ‘in vitro’ junto com a atividade supressora do HIV ‘in vivo’ garante que o substrato hemina indutor da HO-1 seja desenvolvido como um agente terapêutico potencial para o tratamento da infecção por HIV-1.

FONTE: http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/176/7/4252