ENTRADA DO VÍRUS HIV NA CÉLULA

FONTE:

http://bioisolutions.blogspot.com/2008/08/hiv-virus-cell-entry.html

HIV virus cell entry.

O HIV entra nos macrófagos e na células T CD4+ por adsorção de glicoproteínas de sua superfície por receptores na célula alvo seguida da fusão do envelope viral com a membrana e a liberação do capsídeo do HIV para dentro da célula.

A entrada na célula começa através da interação do complexo trimérico do envelope (ponta/ou espiga gp160) e ambos CD4 e receptor de citocina (geralmente tanto CCR5 ou CXCR4, mas outros são conhecidos por interagir) na superfície celular. A gp 120 liga-se à cadeia α4β7 da interina (integrina é uma glicoproteína com heterodímeros de sub-unidades de cadeia alfa e beta que atua como receptora de glicoprotéicos na superfície celular) ativando LFA-1 {um tipo de integrina que é o antígeno 1 associado a função linfocitária (LFA1), um dímero consistindo de antígeno a CD11 (ITGAL) e uma sub-unidade beta (ITGB2) [Omim: 153370]}, a integrina central envolvida no estabelecimento de sinapses virológicas, o que facilita a disseminação do HIV-1 de célula para célula. {Observar em OMIM: 600065: Osterman e outros (2002) demonstraram que sob ambas condições de fluxo estático e fisiológica, a JAM1, através de seu domínio 2 próximo à membrana, é um ligante da integrina LFA-1 que contribui para a migração trans-endotelial dependente da integrina LFA-1 de células T de memória CD45RO positivas expressando o receptor de citocina CXCR4 e de neutrófilos. Essas interações também facilitaram a captura de células T mediada por LFA-1. A ativação do endotélio com citocinas inflamatórias aumentou a transmigração de células T de memória. Osterman e outros (2002) sugeriram que um complexo de interação da ligação heterofílica de LFA-1 com JAM-1 e trans-interações homofílicas de JAM1 pode gerar um zíper molecular para a transmigração dos leucócitos.} A espiga de gp160 contém domínios de ligação para ambas CD4 e receptor de citocina. A primeira etapa na fusão envolve a alta afinidade de união dos domínios de ligação de CD4 de gp120 para CD4.

Uma vez que a gp120 esteja ligada à proteína CD4, o complexo do envelope submete-se a uma mudança estrutural, expondo os domínios de ligação de gp120 e permitindo a interação destes domínios com o receptor de quimiocina alvo. Isso permite uma fixação duplamente prolongada e mais estável, a qual permite a fusão do terminal N (amina) do peptídio gp41 penetrar a membrana celular. Seqüências repetidas na gp41, HR1 e HR2 {HR1 e HR2 são região homóloga 1 e 2, omim 610375} então interagem, causando o colapso da porção extracelular da gp41 para dentro de um grampo. {Hairpin: uma estrutura formada por um ácido polinucleico através do emparelhamento de bases entre seqüências unifilamentares de bases de RNA ou DNA complementares vizinhas; ou uma estrutura observada na prostaglandina em que dois segmentos dobram-se para trás um sobre o outro.} Esta estrutura em laço leva as membranas do vírus e da célula ao fechamento conjunto, permitindo a fusão das membranas e a subseqüente entrada do capsídio viral.


Uma vez que o HIV esteja ligado à célula alvo, o RNA do HIV e várias enzimas, incluindo a transcriptase reversa, a integrase, ribonuclease e protease, são injetadas dentro da célula. Durante o transporte para o núcleo baseado nos microtúbulos, o genoma viral de uma fita só é transcrito em DNA de fita dupla, o qual então é integrado no cromossomo hospedeiro.

O HIV pode infectar as células dendríticas (DCs) pela rota CD4-CCR5, mas outra rota usando receptores de lectina tipo C específicos para manose como sinal DC também podem ser usados. As DCs são umas das primeiras células encontradas pelo vírus durante a transmissão sexual. Elas são atualmente consideradas por atuar num papel importante na transmissão do HIV para as células T uma vez que o vírus tenha sido capturado na mucosa pelas células dendríticas.

Replicação e Transcrição

Uma vez que o capsídio viral entre na célula, uma enzima chamada transcriptase reversa libera a fita única de RNA (+) da fixação às proteínas virais e a copia num DNA complementar. Este processo da transcrição reversa é extremamente propenso a erros e é durante esta etapa que as mutações podem ocorrer. Tais mutações podem causar a resistência às drogas. Então, a transcriptase reversa compõe uma fita de DNA complementar para formar uma fita dupla de DNA intermediária (vDNA). Este vDNA é então transportado para dentro do núcleo celular. A integração do DNA viral para dentro do genoma da célula é concluído por outra enzima viral chamada integrase.

Esse DNA viral integrado pode então deixar-se dormente, no estágio latente da infecção por HIV. Para a produção ativa do vírus, certos fatores celulares de transcrição precisam estar presentes, o mais importante deles é o NF-kB (NF kappa B), o qual está regulado para mais quando as células T tornam-se ativadas. Isso significa que aquelas células mais suscetíveis a serem mortas pelo HIV são aquelas que estão combatendo a infecção no momento.

Neste processo de replicação, o pró-vírus integrado é copiado para mRNA o qual é então processado por “splicing” em pedaços menores. Esses pedaços pequenos produzem as proteínas regulatórias Tat (a qual intensifica a nova produção de vírus) e Rev. Como a Rev acumula-se, ela gradualmente começa a inibir o processo de “splicing” do mRNA. Neste estágio, as proteínas estruturais Gag e Env são produzidas a partir da lente completa de mRNA. A lente completa de RNA é neste momento o genoma viral (o vírus que vêm do genoma em RNA); ele liga-se à proteína Gag e é empacotado (reunido e envolvido) em novas partículas virais.

O HIV-1 e o HIV-2 parecem empacotar seu RNA diferentemente; o HIV-1 ligar-se-á a algum RNA apropriado enquanto o HIV-2 ligar-se-á preferencialmente ao mRNA que foi usado para criar a própria proteína Gag. Isso pode significar que o HIV-1 é mais capaz para mutação (a infecção por HIV-1 progride para a AIDS mais rápido do que a infecção por HIV-2 e é responsável pela maioria das infecções no mundo.


Reunião e liberação

A etapa final do ciclo viral, reunião de novos vírions de HIV-1, começa na membrana plasmática da célula hospedeira. A poli-proteína ENV (gp160) segue através do retículo endoplasmático e é transportada para o complexo de Golgi onde ela é clivada por protease e processada nas duas glicoproteínas do envelope do HIV, a gp41 e a gp120. Estas são transportadas para a membrana plasmática da célula hospedeira onde a gp41 ancora a gp120 na membrana nas células infectadas. As poli-proteínas Gag (p55) e Gag-Pol (gp160) também se associam com a face interna da membrana plasmática juntamente com o RNA genômico do HIV de modo que os vírions formados começam a brotar da célula hospedeira. Durante a maturação, proteases do HIV clivam as poli-proteínas em proteínas e enzimas funcionais individuais do HIV. Os vários componentes estruturais então se reúnem para produzir um vírion maduro do HIV. Esta etapa de clivagem pode ser inibida por inibidores de protease. O vírus maduro então está pronto para infectar outra célula.

INTERAÇÃO DA PROTEÍNA Tat DO HIV-1 COM HEPARINA – Modelo da estrutura, sulfatização e tamanho.

[do artigo:
Interaction of HIV-1 Tat Protein with Heparin
ROLE OF THE BACKBONE STRUCTURE, SULFATION, AND SIZE*
(Received for publication, November 14, 1996, and in revised form, January 16, 1997)
Marco Rusnati, Daniela Coltrini, Pasqua Oreste‡, Giorgio Zoppetti‡, Adriana Albini§,
Douglas Noonan§, Fabrizio d’Adda di Fagagna¶, Mauro Giacca¶, and Marco Prestai


THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, No. 17, Issue of April 25, pp. 11313–11320, 1997
© 1997 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.]


INTRODUÇÃO

A proteína Tat do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) é liberada das células infectadas. A Tat extra-celular entra na célula onde estimula a atividade transcricional do longo terminal de repetição do HIV (LTR) e de genes endógenos. A heparina modula a atividade angiogênica e transcricional da Tat extra-celular. Aqui nós demonstramos que a heparina liga-se especificamente à Tat recombinante do HIV-1 produzida como fusão da proteína glutationa S-transferase (GST) [glutationa é um tripeptídeo da glicina, da L-cisteína e do L-glutamato com o L-glutamato que possui uma ligação isopeptídica com o radical amino da L-cisteína; a glutationa tem numerosas funções na célula; é o tiol não-proteico mais prevalente... a deficiência de glutationa pode causar hemólise (liberação de hemoglobinas dos eritrócitos) com estresse oxidativo; no metabolismo intermediário, é doadora de grupamentos tiol (SH); glutationa S-transferase é uma classe de enzimas que catalisam a reação da glutationa com uma molécula aceptora (p.ex. um óxido de hidrocarboneto que contém pelo menos um anel aromático), para formar uma glutationa S-substituída; uma etapa fundamental na detoxificação de muitas substâncias; sin. ligandin] e imobilizada em gotas de agarose-glutationa. A heparina e o sulfato de heparan (HS), mas não o sulfato de dermatan , sulfatos de condroitina A e C [sulfato de condroitina é um(muco) polissacarídeo(proteoglicana) composto de resíduos alternados de ácidoβ-D-glucurônico e sulfato de N-acetil-galactosamina em ligações β(1-3) e β(1-4) alternadas; presente entre os constituintes da substância fundamental da matriz extracelular de tecido conjuntivo; o sulfato de condroitina A é uma condroitina com resíduos sulfúricos encontrada nos tecidos conjuntivos e a condroitina C também tem estes resíduos, mas em outra posição; a condroitina B é o sulfato de dermatan], ácido hialurônico [mucopolissacarídeo constituído por resíduos de ligação beta 1,4 alternados de ácido hialurônico, formando um material gelatinoso nos espaços teciduais e atuando como lubrificante e absorvente de choque geralmente por todo corpo; é hidrolisado à unidadededissacarídeos ou tetrassacarídeos pela hialuronidase] e o polissacarídeo K5 (queratina 5, lócus 12p13) competiram com heparina marcada com H (heparina marcada com substância facilmente detectável) pelas ligações a Tat-GST imobilizada e inibiram a transativação do LTR do HIV-1 induzida pela Tat-GST extracelular.


A dessulfatização seletiva em 2-O- e 6-O-, ou a dessulfatização total –O-, ou a dessulfatização em N/acetilação em N reduziram dramaticamente a capacidade da heparina ligar-se à Tat-GST. Heparinas totalmente dessulfatizadas –O- e dessulfatizadas 2-O- também apresentaram uma reduzida capacidade de inibir a atividade trans-ativadora de Tat. Heparinas de peso molecular muito baixo apresentaram um decréscimo significativo em sua capacidade de ligarem-se a Tat-GST e de inibirem sua atividade trans-ativadora do LTR quando comparadas com a heparina convencional de 13,6 quilo-dáltons. Entretanto, quando a heparina de 3,0 quilo-dáltons foi cromatografada [cromatografia é a separação de substâncias químicas e partículas por movimento diferencial através de um sistema de duas fases; a mistura de materiais a serem preparados é percolada através de uma coluna ou folha de algum absorvente adequadamente escolhido (p.ex. um material de intercâmbio iônico); as substâncias menos absorvidas emergem mais tarde.] em afinidade à Tat-GST imobilizada para isolar as sub-frações ligadas e não-ligadas, a fração ligada à Tat era 1000 vezes mais potente em inibir a atividade trans-ativadora de Tat-GST do que a fração não ligada.

Os resultados demonstram que Tat interage de maneira dependente do tamanho da Heparina/HS(heparan sulfato ou sulfato de heparan) e que a alta afinidade da interação Tat‑heparina requer ao menos as posições 2-O-, 6-O- e N para ser sulfatada. A atividade de ligação de Tat aos glicosaminoglicanos testados correlaciona-se com sua capacidade de afetar a atividade trans-ativadora da Tat extra-celular, indicando a possibilidade de desenharem-se estruturas específicas similares a heparina/HS com a atividade antagonista a Tat.

***********************************************************************************

Tat é um gene regulatório viral do vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1), o agente etiológico da AIDS. A Tat é essencial para a replicação viral pois seu produto protéico promove a transcrição do genoma viral por interação com o elemento responsável pela trans‑ativação, localizado na extremidade 5’ dos mRNAs virais. A proteína Tat do HIV-1 é um polipeptídeo de 86 a 102 aminoácidos, dependendo da fita viral (alterna de um vírus para o outro, porque o domínio B é muito variável), a qual é codificada por dois éxons e traduzida a partir de mRNAs multiplamente processados por splicing em faixas de duas (2) quilo-bases. A seqüência de aminoácidos 1-72 (do primeiro ao heptagésimo segundo) é codificada pelo primeiro éxon do gene Tat e é dotada de abundante atividade trans-ativadora, enquanto a região terminal em carboxila (COOH-), codificada pelo segundo éxon (do aminoácido 73 ao 86), não é requerida para a atividade trans-ativadora de Tat nem para a replicação do HIV-1.

A Tat é liberada de células infectadas por HIV-1. A Tat extracelular tem a habilidade de entrar na célula e no núcleo em forma ativa onde pode estimular a atividade transcricional do LTR do HIV. A Tat exógena absorvida por células não infectadas também pode trans-ativar genes endógenos, induzindo a produção de várias citocinas e seus receptores. Tem sido recentemente demonstrado que a trans-ativação do LTR e possivelmente a transcrição de genes celulares dependem da ativação de NF-kB (Fator Nuclear Kappa B; OMIM 164011) por Tat. A Tat exógena também é capaz de exercer atividade angiogênica “in vitro” e “in vivo” e estimular a proliferação celular, a quimio-invasão e ativação de células endoteliais cultivadas.

Os mecanismos de captura da Tat extra-celular, transporte intra-celular para o núcleo e atividade biológica exercida em células não infectadas ainda não estão claros. A Tat tem sido apresentada como ligante aos receptores de integrina, e aos receptores da quinase de tirosina (quinase que fosforila resíduos de tirosina) do fator de crescimento do endotélio vascular Flk‑1/KDR, de modo análogo ao fator de crescimento endotelial vascular por si mesmo Às células endoteliais. Também, a capacidade de Tat interagir com sulfato de heparina-heparan sulfato (HS) pode atuar num importante papel em sua interação com a superfície celular. A heparina inibe a captura da Tat extracelular e sua atividade trans-ativadora do LTR do HIV-1. A absorção de Tat é significativamente reduzida em células ovarianas mutantes de hamsters chineses defeituosas na síntese de glicosaminoglicanas (GAGs). Similar a vários fatores de crescimento angiogênicos ligantes a heparina, a atividade angiogênica exercida por Tat “in vivo” e sua atividade mitogênica e quimio-atrativa para células endoteliais cultivadas são moduladas por heparina. Finalmente, a proteína Tat recombinante do HIV-1 liga-se a suportes de Heparina-Sefarose (composto usado em testes do tipo blot. Obs.: a heparina é um anti-coagulante) e é purificada somente em altas concentrações de sal. Essas observações sugerem que os proteoglicanos HS (heparan sulfato proteoglicano)associados às células funcionam como co-receptores de superfície celular para a Tat exógena.

A heparina consiste largamente de unidades de dissacarídeo N-6-dissulfato D-glucosamina. Outros dissacarídeos contendo ácido L-iurônico ou D-glucurônico não sulfatados e N-sulfato ou N-acetilato de D-glucosamina também estão presentes enquanto componentes menores. Esta heterogeneidade é mais pronunciada em Heparan Sulfato, onde os dissacarídeos pouco sulfatados são mais abundantes. Observações recentes têm mostrado que a interação de heparina-HS com vários fatores de crescimento angiogênco, incluindo o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento de hepatócitos, e fator de crescimento endotelial vascular, depende do peso molecular da cadeia de polissacarídeos e do grau de distribuição dos grupos sulfato. Interessantemente, distintas seqüências de oligossacarídeos têm sido identificadas por reterem a capacidade de ligação do fator de crescimento de hepatócito ou do fator de crescimento básico do fibroblasto (bFGF). Em adição, estudos de ligação envolvendo heparinas ou preparados HS modificados têm mostrado que os grupos sulfato 2-O- e N- são importantes para a interação de bFGF, enquanto o fator de crescimento do hepatócito interage principalmente com grupos sulfato 6-O-. Tomados juntos, estes dados sugerem que requisitos distintos na estrutura são necessários para a interação de heparina/HS com diferentes fatores de crescimento.

Aqui, nós temos investigado as bases moleculares das interações de Tat com heparina. Diferentes glicosaminoglicanas, heparinas seletivamente dessulfatizadas, e heparinas com diferentes pesos moleculares foram avaliadas por sua capacidade de interagir com a proteína Tat em sistemas celulares livres. Esses compostos também foram avaliados por sua capacidade de modular a atividade trans-ativadora do LTR da Tat extracelular. Os resultados indicam que, entre os GAGs (glicosaminoglicanas) testados, somente a heparina e o HS interagem com Tat e inibem sua atividade trasn-ativadora. A interação requer ao menos alguns grupos de sulfato 2-O-, 6-O- e N- e é significativamente afetada pelo tamanho da cadeia do polissacarídeo.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

MATERIAL: HS de tipo 1 é de Opocrin (Corlo, Itália). O polissacarídeo K5 foi preparado como descrito. Os sulfatos de condroitina (polissacarídeo proteoglicano) A e C, dulfato dermatano, e ácido hialurônico foram uma doação do Dr. M. Del Rosso, da Universidade de Florença, Itália.

A heparina convencional (13,6 quilo-dáltons) foi obtida de um preparado convencional conjunto de heparina sódio (sal de heparina?) da mucosa da carne de vaca(1131/900 do Laboratório Derivati Organici S.p.A, Milão, Itália) a qual foi purificada de contaminantes de acordo com as metodologias descritas. A pureza foi superior a 95% como verificado por eletroforese em tampão acídico, determinação quantitativa de ácido urônico, e alta atuação em análises cromatográficas líquidas. .....( Esta parte não será traduzida por mim, por enquanto.)

RESULTADOS

A Tat recombinante do HIV-1 e a forma de Tat-1 com somente o primeiro éxon de TAt, a qual carece da seqüência de aminoácidos codificada pelo segundo éxon do gene de Tat, foram expressadas em E.coli como proteínas GST-Tat fundidas. Proteínas GST quiméricas foram então purificadas a partir de extratos celulares por cromatografia de afinidade de glutationa-agarose (glutationa é GSH, um tripeptídeo da glicina e ST é glutationa S-Transferase, uma enzima que catalisa a reação da glutationa com uma molécula aceptora.) As proteínas Tat foram clivadas da metade GST da quimera por digestão co trombina e comparadas com proteínas GST-Tat intactas para a capacidade de trans-ativar o LTR do HIV-1. As proteínas recomiantes foram adicionadas em meio de cultura de células HL3T1 que contém cópias integradas de pL3CAT naqual o gene bacterial CAT é orientado/dirigido pelo LTR do HIV-1. Após a incubação, o nível de trans-ativação do LTR do HIV-1 por Tat foi determinado pela medição da concentração de CAT por ELISA de extratos celulares. Como mostrado na figura 1B, as formas de um éxon e de dois éxons de Tat exercem a mesma atividade trans-ativadora ambos como proteínas fundidas GST-Tat e proteínas Tat clivadas por trombina. Esses dados indicam que a metade GST não interfere com a capacidade de Tat extracelular de ser submetida/capturada pelas células HL3T1 e de exercer sua atividade trans-ativadora após a internalização.Esses dados também confirmam achados prévios indicando que a seqüência de aminoácidos do segundo éxon de Tat é dispensável para a atividade trans-ativadora da proteína Tat.

A heparina tem sido previamente noticiada por inibir a atividade trans-ativadora de Tat extracelular. Para validar ainda mais o uso das proteínas fundidas GST-Tat para estudos de interações entre Tat e heparinas, nós testamos a capacidade da heparina convencional para inibir a atividade trans-ativadora de ambos os tipos selvagens de Tat e Tat-1e quando fundidas à metade GST. Como mostrado na figura 1C, a heparina inibe a atividade trans-ativadora do LTR do HIV-1 de ambas as proteínas de Tat fundidas a GST com potência similar (ID igual a 1-5 nm). Resultados similares foram obtidos quando a proteínas Tat foram avaliadas após a clivagem da metade GST pela trombina (dados não mostrados). De novo, os dados indicaram que a metade GST não interfere com as interações Tat-heparina e sugerem que a seqüência de aminoácidos codificada pelo segundo éxon de Tat não está envolvida com essa interação. Baseado nisto, uma proteína de fita total das proteínas GST e Tat fundidas, não clivadas, foi utilizada em experimentos subseqüentes.

A INTERAÇÃO DE DIFERENTES GLICOSAMINOGLICANOS COM A PROTEÍNA GST-Tat
(Obs.: ID deve ser a abreviação de ‘dose infectante’.)

A indicação de que a metade GST não afeta a capacidade de Tat interagir com a heparina nos prontificou a estabelecer um protocolo experimental no qual nós tivemos a vantagem da habilidade de GST de ligar-se a gotas de glutationa-agarose, permitindo a imobilização de GST-Tat numa matriz sólida. A capacidade da GST-Tat imobilizada de interagir com a heparina foi então investigada. A heparina convencional liga-se à coluna de GST‑Tat‑glutationa‑agarose e pode ser eluída (separada por lavagem) com lavado de 3,0M NaCl. A especificidade dessa interação foi demonstrada pela inabilidade da heparina interagir com colunas de glutationa-agarose nos quais nenhuma proteína ou alguma proteína GST recombinante desprovida da metade Tat estivesse ligada às gotas de resina. A determinação da quantidade máxima de heparina retida pela resina GST-Tat, avaliada por detecção de GAG no fluxo através das colunas de GST-Tat carregados com quantidade de heparina em aumento indicou que 1ml de gotas de GST‑Tat‑glutationa‑agarose, correspondendo a 400μg de proteínas Tat, ligou 650µg de heparina convencional.

Então nós examinamos a capacidade da heparina convencional não marcada de competir com heparina marcada com H (heparan?) na ligação a Tat imobilizada com GST. Uma série de colunas de 80μl de GST‑Tat‑glutationa‑agarose foi carregada com amostras de 300µl contendo 50μg de heparina marcada com H (20.cpm) e concentração de heparina não marcada em aumento. As colunas foram lavadas extensivamente e a radioatividade nos eluatos (solução que emerge de uma coluna ou papel cromatográfico) de 3,0M NaCl foi medida. Como mostrado na figura 2B, as heparinas não marcadas competem pela ligação com as heparinas marcadas com H de modo dependente da dose, com uma ID50 igual a 10µM. A especificidade da competição é demonstrada pela falta de competição por um glicosaminoglicano não sulfatizado, o polissacarídeo capsular K5 de E.coli.

A capacidade de diferentes glicosaminoglicanos de competir com heparina marcada com H pela ligação a GST-Tat imobilizada foi então avaliada no mesmo ensaio. Como demonstrado na figura 3A, somente as heparinas, e numa extensão menor o HS (heparan sulfato) foram hábeis em competir pela ligação a Tat, enquanto concentrações equimolares de sulfato de dermatan, sulfatos de condroitina A e C, ácido hialurônico e o polissacarídeo K5 foram ineficientes. De acordo, 0,5µg/ml de heparina ou heparan sulfato, mas não outros glicosaminoglicanos testados, foram capazes de inibir significativamente a atividade trans-ativadora do LTR exercida pela fusão das proteínas GST-Tat nas células HL3T1.

Esses dados sugerem que a capacidade de GAG (glicosaminoglicano) interagir com a proteína Tat está relacionada, ao menos em parte, a diferenças em suas estruturas e intensidade/graduação de sulfatização. De fato, a heparina, a qual apresenta o maior número de grupos sulfato por unidade de dissacarídeo (SO3-/COO- = 2,14) é mais efetiva do que o HS (sulfato de heparan), enquanto nenhuma interação significativa foi observada com os ácidos hialurônicos não sulfatizados e com o polissacarídeo K5. Por outro lado, o sulfato de heparan é muito mais efetivo do que o sulfato de dermatan e os sulfatos de condroitina, ainda que eles todos apresentam uma valor SO3-/COO- similar de aproximadamente 1,0. Nos sulfatos de heparan, os grupos sulfato estão arranjados em conjuntos em carga de alta intensidade intervalados com regiões de carga de baixa densidade. Assim, o conhecimento da estrutura dos polissacarídeos e/ou a distribuição dos grupos sulfato ao longo da cadeia podem atuar num papel na mediação de suas interações com a proteína Tat.

(continuação de "Interação da Proteína Tat do HIV-1 com Heparina")

PAPEL DA DESSULFATIZAÇÃO SELETIVA NA INTERAÇÃO COM Tat

(Obs.: ID deve ser abreviação de ‘dose infectante’.)

Para avaliar o papel dos grupos sulfato de heparina específicos na interação com Tat, heparinas não marcadas seletivamente dessulfatizadas foram avaliadas por sua capacidade de competir com as heparinas marcadas com H pela ligação com GST-Tat imobilizada em contato com gotas de agarose de glutationa. Como mostrado na figura 4A, seletivas heparinas dessulfatizadas -2-O, heparina dessulfatizada-6-0, e heparinas dessulfatizadas N/acetiladas N mostram uma significativa redução em sua capacidade de competir pela ligação com GST-Tat (ID50 > 330μM) quando comparadas com a heparina convencional (ID50 = 10µM). Além disso, a dessulfatização total O- aboliu completamente a capacidade da heparina interagir com Tat. Finalmente, uma mistura de heparinas dessulfatizadas 2-O-, -6-o e dessulfatizadas N/acetiladasN, cada uma em concentração de 110μM (concentração total de heparinas = 330 μM), inibe a ligação de heparinas marcadas com H a GST-Tat imobilizada por somente 30%. Tomados juntos, os dados sugerem que ao menos alguns grupos -2-O, -6-O, e sulfatos-N Têm que estar organizados na mesma cadeia de heparina para permitir uma interação ótima com a GST-Tat.
Para confirmar a necessidade dos grupos sulfato 2-O-, 6-O- e N- para a ótima interação de Tat com heparina, heparinas convencionais e seletivamente dessulfatizadas foram conjugadas a gel de sefarose . A capacidade da fusão protéica GST-Tat ligar-se a diferentes colunas de heparina-sefarose foi então avaliada (veja “Procedimentos Experimentais” para mais detalhes). Como mostrado na figura 5A, GST-Tat liga-se a heparinas convencionais imobilizadas onde esta elui em 1,5M de NaCl. Um perfil de eluição similar foi obtido quando Tat foi carregada em contato com a coluna após a clivagem da fusão protéica GST-Tat por trombina. É interessante notar que sob as mesmas condições experimentais, o fator prototípico de ligação a heparina, bFGF, eluiu das colunas a 2,2M de NaCl. Em contraste, GST recombinante sem Tat e a fusão protéica GST-Tat desnaturada por calor não se ligou a gotas de heparina-sefarose e eluiu com o fluxo através da coluna. Esses dados indicam que a alta afinidade da interação de GST-Tat com heparinas imobilizadas reflete a capacidade de ligação da heparina à metade Tat e ocorre somente quando a proteína está presente na própria conformação nativa.
Concordando com os estudos de competição por ligação, a fusão protéica GST-Tat não ligou-se a heparinas totalmente –O-dessulfatizadas , 2-O-dessulfatizadas, -O-dessulfatizadas, e dessulfatizadasN/acetiladasN quando carregadas a 0,15M NaCl. Em contraste, bFGF ainda ligou-se a diferentes heparinas dessulfatizadas, embora, de acordo com observações prévias em diferentes sistemas experimentais, com uma reduzida afinidade, sendo eluídos em concentrações de NaCl atingindo de 0,9 a 1,5M. Concluindo, os dados confirmam o pré-requisito de grupos sulfato 2-O-, 6-O- e grupos sulfato N para interação de heparina com Tat, de alta afinidade e ótima.
As heparinas dessulfatizadas seletivamente foram então avaliadas por sua capacidade de inibir a atividade trans-ativadora do LTR exercida pela fusão protéica GST-Tat nas células HL3T1. Como esperado a partir dos estudos de competição por ligação, as heparinas totalmente ‑O‑dessulfatizadas apresentaram uma capacidade muito limitada (ID50 = 10 μM) em inibir a atividade trans-ativadora de GST, quando comparadas com a heparina convencional (ID50 = 0,8 μM). Um decréscimo significativo da atividade antagonista da heparina também foi causada pela dessulfatização 2-O-seletiva (ID50 =100 μM). Surpreendentemente, heparinas dessulfatizadas 6-O- ou dessulfatizadas N/acetiladas N inibiram significativamente a atividade transativadora de GST-Tat, em aparente contraste com sua reduzida atividade nos estudos de competição pela ligação.

EFEITOS DO PESO MOLECULAR NAS INTERAÇÕES DE Tat

A influência do tamanho da cadeia de heparina na interação com os GST-TAt imobilizados foi investigada por ensaios de competição de ligação. Heparinas de massa molecular muito baixas não marcadas (3,0 e 2,1 quilo-dáltons) foram comparadas com a heparina convencional (13.6 quilo-dáltons) por sua capacidade de competir com heparinas marcadas com H pela ligação com GST-Tat‑glutationa‑agarose. Quando as diferentes moléculas de heparina foram comparadas com uma base molar, a capacidade das heparinas de massa molecular muito baixas de interagir com a GST‑Tat imobilizada foi dramaticamente reduzida (ID50 igual a 10.200, e 330 μM para heparinas de 13,6; 3,0 e 2,1 quilo-dáltons, respectivamente). De acordo com estes estudos de competição por ligação, heparinas de 3,0 e 2,1 quilo-dáltons apresentaram reduzida capacidade de inibir a atividade transativadora do LTR exercida pela fusão protéica GST-Tat nas células HL3T1 (ID50 igual a 50-100 μM comparadas com 1,0 μM para heparinas convencionais de 13,6 quilo-dáltons).
Para selecionar componentes de alta afinidade presentes no preparado de heparina de moléculas de massa molecular muito baixa, a heparina de 3,0 quilo-dáltons foi fracionada por afinidade cromatográfica a GST-Tat. Uma coluna de 200 μl de GST-Tat‑glutationa-agarose foi carregada com amostra de 100 μg, lavada extensivamente, e eluída com um lavado de 3,0M NaCl. Quinze por cento (15%) da amostra carregada em contato com a coluna foi recuperada na fração de 3,0M de NaCl. Eletroforese em gel de policrilamida (polímero ramificado de acrilamida usado na eletroforese em gel) confirmaram que a fração de ligação a Tat na heparina tinha uma massa molecular média de aproximadamente 3,0 quilo-dáltons (dados não mostrados). Quando as frações ligadas e não-ligadas foram avaliadas por sua capacidade de inibir a atividade transativadora de GST-Tat, a fração ligada foi aproximadamente 20 vezes mais potente do que o composto parecido e > 1000 vezes mais efetiva do que a fração não‑ligada. Assim, a atividade inibidora da fração ligada a Tat parece ser também mais alta d que o esperado de acordo com sua concentração relativa em heparinas parecidas, sugerindo que moléculas não-ligadas no preparo inicial podem interferir com a interação Tat-heparina e/ou com a transativação do LTR. Experimentos adicionais são necessários para esclarecer este ponto. Em conclusão, os dados demonstraram que a afinidade cromatográfica (afinidade cromatográfica é onde o absorvente tem uma afinidade química única por um determinado componente da solução de passagem. Sin. coluna de passagem) pode ser usada para isolar cadeias de oligossacarídeos de heparina de massa molecular muito baixa com potente atividade antagônica a Tat.

DISCUSSÃO

Esta é a primeira caracterização bioquímica das interações entre HIV-Tat com heparina/sulfato de heparan. A composição de dissacarídeos, grau de sulfatização, e arranjo das cargas ao longo da cadeis de polissacarídeo são todas importantes em determinar a capacidade de um glicosaminoglicano ligar-se à proteína Tat e inibir sua atividade transativadora. Compostos com carga de baixa densidade, tais como o polissacarídeo K5 e o ácido hialurônico, não interagem com Tat. Também, uma diferente capacidade de ligação é mostrada por glicosaminogliconos pouco sulfatados com uma taxa similar de SO3-/COO- mas que diferem na conformação de sua espinha dorsal (deve ser a estrutura primária?) e distribuição de carga (heparan sulfato versus dermatan sulfato e sulfatos de crondroitina). Finalmente, as dessulfatizações 2-O-, 6-O- ou N seletivas todas impedem a interação Tat-heparina “in vitro” indicando que grupos sulfato 2-O-, 6-O- e N nas heparinas/sulfato de heparan são requeridos para ligações de alta afinidade a Tat. Unidades de dissacarídeo contendo grupos sulfato 2-O-, 6-O- e N estão predominantemente presentes na heparina e em menor extensão no sulfato de heparan. Isso parece estar em conformidade com a capacidade ligeiramente reduzida dos sulfatos de heparina ligarem-se a GST-Tat imobilizadas em ensaios de competição de ligação. O fator angiogênico de ligação a heparina, bFGF, liga-se avidamente a uma região pentassacarídica composta de tais unidades repetidas de dissacarídeos, embora apenas grupos sulfato N e um único grupo sulfato 2-O- sejam essenciais para a interação com bFGF enquanto os grupos sulfato 2-O- remanescentes e grupos sulfato 6-O- na estrutura pentassacarídica são redundantes. Em contraste, grupos sulfato 6‑O- são principalmente envolvidos na interação com o fator de crescimento de hepatócitos. Esses achados sugerem que diferentes citocinas de ligação a heparina/sulfato de heparan podem ligar-se a licosaminoglicanos sulfatados de maneira distinta e possivelmente específica. Embora seqüências de ligação específicas ao fator possam estar escondidas na heparina devido a seu alto grau de sulfatização, a grande heterogeneidade na estrutura do sulfato de heparan permite um formato/ofício mais refinado das regiões de ligação seletivas que pode influenciar a atividade biológica e a bio-avaliabilidade de fatores de crescimento de ligação a heparina/sulfato de heparan, incluindo a proteína Tat. Essa possibilidade é exemplificada pela transferência das propriedades do proteoglicano de sulfato de heparan (HSPG) na superfície celular de um fenótipo ligante a bFGF para ligante a FGF ácido em células neuronais murinas durante o desenvolvimento embrionário.

Estudos prévios têm mostrado que a interação da heparina com bFGF depende do peso/massa molecular dos polissacarídeos e que uma seqüência pentassacarídica representa o sítio de ligação mínimo para bFGF. Aqui, usando preparados de heparina com diferentes pesos moleculares médios, nós observamos que a afinidade da heparina para a proteína Tat diminui com a redução do tamanho do polissacarídeo. Conseqüentemente, uma reduzida capacidade de inibir a atividade trans-ativadora da Tat extracelular também foi encontrada. Embora nenhuma tentativa tenha sido feita para determinar o tamanho mínimo requerido para ligação com Tat, nós demonstramos que o funcionamento de heparinas com peso molecular muito baixo por afinidade cromatográfica a Tat isolam uma sub-população de cadeias de oligossacarídeos que retém a capacidade de ligar-se a Tat e inibir sua atividade trans-ativadora com alta potência. Estudos adicionais estão em progresso em nosso laboratório para caracterizar essa sub-população e para determianar a estrutura mínima de ligação.

As heparinas dessulfatizadas-N/acetiladas-N e dessulfatizadas em 6-O- retiveram a capacidade de inibir a atividade trans-ativadora de Tat embora tivessem perdido a habilidade de ligarem-se a Tat com alta afinidade. Isso sugere que a inibição da trans-ativação do LTR pode requerer somente interações parciais entre a Tat e a heparina/sulfato de heparan. Alternativamente, múltiplas interações com a superfície celular podem estar envolvidas na inibição da atividade trans-ativadora do LTR do HIV pela heparina. A Tat extracelular liga-se a integrina e Flk-1/KDR (é um receptor para ponto de inserção de uma quinase de tirosina para fator de crescimento; OMIM 191306) na superfície celular e a heparina tem sido noticiada por afetar a capacidade dos ligantes a ligarem-se a seus receptores. Observações similares têm sido feitas para interações de heparina com bFGF. Neste sistema, a cadeia de polissacarídeos mais longa do que a seqüência mínima de ligação a bFGF são requeridas para a modulação da atividade biológica do fator de crescimento. Em adição, os grupos 6-O- sulfato atuam num papel na formação do receptor do complexo ternário bFGF-heparina-FGF embora não estejam envolvidos na interação com bFGF.

Nossos estudos sobre as propriedades bioquímicas das quimeras GST-Tat demonstraram que as formas de 1 éxon e de 2 éxons de Tat exercem a mesma atividade trans-ativadora e são similarmente inibidos pela heparina. Eles também ligam-se a heparina/heparan sulfato com a mesma afinidade quando imobilizados em contato com colulas de agarose de glutationa (dados não mostrados). Em contraste com o aparentemente dispensável segundo éxon, várias observações pontuam para um papel dos resíduos de aminoácidos de 49 a 57 do primeiro éxon de Tat na interação de Tat com heparina. Este altamente carregado e básico domínio é crítico em ambas as atividades trans-ativadora e estabilizadora da proteína e tem sido implicado na interação de Tat com integrina αvβ5. Peptídeos que cercam o domínio básico de Tat induzem o crescimento e a migração das células endoteliais em cultura, potencializam a captura de Tat e a trans-ativação, e ativam os receptores de quinase de tirosina (quinase que fosforila resíduos de tirosina). O alinhamento do domínio com outros fatores de ligação a heparina proporcionam uma seqüência consensual rude para a interação de heparina com resíduos de Arg e Lys em conjuntos. Estudos de mutagênese de sítio direcionada da proteína Tat serão necessários para validar esta hipótese.

Tat é um potente trans-ativador essencial para a replicação viral. Ela pode ser liberada das células infectadas e entrar em novas células em uma forma ativa, onde estimula a atividade transcricional do LTR do HIV. Esse mecanismo pode explicar a explosão de replicação associada com as fases iniciais da infecção por HIV, onde a replicação sincronizada dos vírions tomam lugar. Tat também parece ter um número de efeitos biológicos aparte da trans-ativação do LTR os quais podem ser responsáveis por algumas síndromes associadas à AIDS. A expressão do gene HIV-1 Tat em camundongos transgênicos resulta em lesões angiogênicas na pele e aumento de incidência de adeno-carcinomas, linfomas e hepatocarcinomas. Tat é um fator de crescimento para as células derivadas do sarcoma de Kaposi e para as células endoteliais e exerce atividade angiogênica ‘in vivo’. A Tat pode atuar num importante papel na metástase tumoral, possivelmente por modulação da produção da protease por células transformadas. Finalmente a Tat parece mediar as afecções neurológicas que freqüentemente ocorrem na AIDS possivelmente como conseqüência de um efeito tóxico direto sobre os neurônios, ou ativação anormal do endotélio no sistema nervoso central.

Essas observações indicam que a interferência farmacológica das interações Tat-HS podem ser um alvo para o bloqueio de patologias associadas à AIDS, incluindo o sarcoma de Kaposi, e possivelmente a replicação do HIV por si mesmo. A este respeitos, é interessante notar que os polissacarídeos sulfatados, incluindo heparina e sulfato de dextran, tem sido noticiados por seus efeitos inibidores da infecção por HIV ‘in vitro’. Polissacarídeos sulfatados podem agir no nível da ligação viral e penetração na célula hospedeira e previnem a interação de gp120 com CD4. Nossos dados emergem a possibilidade de que polissacarídeos sulfatados possam inibir a replicação do HIV também por inibição da atividade de Tat. Tat tem sido recentemente proposta como um alvo específico para a vacina contra a AIDS. Essa observação suporta fortemente o potencial de uso de antagonistas de Tat na infecção por HIV. Assim a elucidação das bases moleculares da interação Tat-heparina (e heparan sulfato) ajudarão a sintetizar sacarídeos análogos com feitios especificamente designados para terapias farmacológicas.


Fonte : Interaction of HIV-1 Tat Protein with Heparin

ROLE OF THE BACKBONE STRUCTURE, SULFATION, AND SIZE*
(Received for publication, November 14, 1996, and in revised form, January 16, 1997)

Marco Rusnati, Daniela Coltrini, Pasqua Oreste‡, Giorgio Zoppetti‡, Adriana Albini§,
Douglas Noonan§, Fabrizio d’Adda di Fagagna¶, Mauro Giacca¶, and Marco Prestai

603799 CARBOHYDRATE SULFOTRANSFERASE 3; CHST3
Alternative titles; symbols
CHONDROITIN 6-SULFOTRANSFERASE; C6ST
C6ST1

Lócus 10q22.1

Sulfato de condroitina proteoglicanas, os quais consistem de um cerne proteico com ao menos uma cadeia de glicosaminoglicano (GAG) unida covalentemente, são distribuídos nas superfícies da maioria das células e a matriz extracelular em praticamente todos os tecidos . Veja 118661 (OMIM). O sulfato de condroitina tem uma estrutura de polímero linear que possui unidades de dissacarídeo sulfatados repetitivas contendo ácido glucurônico (GlcA) [ácido urônico da glicose no qual o carbono seis é oxidado a um grupamento carboxila; o isômero D inativa diversas substâncias, como o ácido benzóico, o fenol, a cânfora e os hormônios sexuais femininos, sofrendo conjugação com tais substâncias. Os glicuronídeos assim formados são excretados na urina] e N-acetilgalactosamina (GalNAc). O principal sulfato de condroitina encontrado nos tecidos de mamíferos têm grupos sulfato nas posições 4 ou 6 dos resíduos GalNAc. A sulfo-transferase 6 de condroitina (C6ST) catalisa a transferência do sulfato de PAPS (da primeira fosfo-adeosina na ponta 3 e primeiro fosfo-sulfato da ponta 5) para a posição 6 dos resíduos de GalNAs. Por rastreamento de uma biblioteca de placenta com um cDNA de C6ST de galinha, Tsutsumi e outros (1998) isolaram cDNAs codificando a C6ST humana. As proteínas previstas em 479 aminoácidos apresentara, 74% e 36% de identidade com a C6ST do frango e sulfo-transferase-6-gal de sulfato de queratano (CHST1), respectivamente. Enzimas recombinantes humanas expuseram atividade de C6ST com uma marcada especificidade para uma seqüência Glc-A-GalNAc. Adicionalmente, a C6ST catalisou a sulfatização do sulfato de queratano. Eles notaram que a deficiência em C6ST têm estado associada com uma forma herdável de displasia espôndilo [vértebras] epifisea [epífise é a parte de um osso desenvolvida a partir de um centro de ossificação distinto daquele da diáfise (a parte longa do osso) e separado inicialmente desta última por uma camada de cartilagem].

Independentemente, Fukuta e outros (1998) clonaram cDNAs de C6ST humanos. Usando análises de Northern blot, eles descobriram que 7,8 quilobases de mRNA de C6ST eram ubíquos. Os menores transcritos também foram observados no músculo esquelético e no coração.

ESTRUTURA DO GENE

Tsutsumi e outros (1998) noticiaram que o gene C6ST contém 3 éxons e expande-se por mais de 20 quilobases.

GENÉTICA MOLECULAR

Iida e outros (2002) caracterizaram polimorfismos de único nucleotídeo e polimorfismos de inserção-deleção em ambos os genes CHST1 e CHST3.

Hermans e outros (2008) identificaram homogosidade ou heterozigosidade composta para nove mutações diferentes no gene CHST3 em seis pacientes não aparentados nascidos com deslocamentos nas juntas, alguns dos quais traziam diagnóstico da síndrome recessiva de Larsen e outros, disostose úmero(osso do braço)-espinhal. Notando o espectro fenotípico relativamente estreito dessas condições, Hermanns e outros (2008) sugeriram que a displasia espôndilo-epifisária de tipo Omani, a desostose úmero-espinhal e a síndrome de Larsen recessiva podem ser descrições diferentes da mesma condição relacionadas com a idade.

IgG de ligação específica para Tat e progressão da doença em sujeitos infectados com HIV-1 em Uganda.

Publicado em abril de 2008

Senkaali D, Kebba A, Shafer LA, Campbell GR, Loret EP, Van Der Paal L, Grosskurth H, Yirrell D, Kaleebu P.
MRC/UVRI Uganda Research Unit on AIDS, Entebbe, Uganda.

Existem dados para sugerir que ambas as respostas imunes humoral e cellular direcionadas contra Tat são benéficas em atrasar a progressão da síndrome do HIV. Nós examinamos a associação entre a ocorência de anticorpos de ligação específica (Abs) a Tat e diferentes parâmetros da progressão da doença do HIV-1. Nós geramos oito proteínas Tat, derivadas de HIV-1 de sub-tipos A, B, C, e D, e a forma recombinante em circulação CRF01_AE. Essas proteínas foram usadas para proteger a ligação específica do Abs a Tat por ELISA. Usando cinco proteínas Tat, nós investigamos se a ocorrência da ligação específica de Tat com o Abs dentro de dois anos após a soro-conversão para a maioria afetou a progressão da doença excede o tempo entre 126 participantes, usando análises de sobrevivência e taxa de declínio de CD4. Destes, 52 participantes com um exemplo de 1,5 e 4,5 anos de soro-conversão foram analisados mais além para estudar o efeito da perda de Ab específico para Tat ou a manutenção na progressão da doença.


Finalmente, usando todas as oito proteínas Tat, nós também investigamos se Abs específicos para proteínas Tat entre 48 participantes, agrupados como progressores rápidos (RP, n =26) e sobreviventes de longo tempo (LTS, n=22) de acordo com seu declínio de CD4 ao sobre o tempo, afetou a progressão da doença. Análises de sobrevivência não revelaram nenhuma evidência da proteção à progressão por Abs específicos para Tat. Comparações da taxa de declínios de CD4 entre indivíduos com e sem Abs para a proteína Tat mostraram somente uma pequena e fronteiriça significativa vantagem em ter Abs específico para Tat (p=0.043). Não houve correlação entre a perda e amanutenção de Abs específicos para Tat e a progressão da doença. Comparações de LTS com RP não mostraram evidência de que Abs específico para Tat tornasse a progressão da doença dos participantes mais lenta. Esse estudo não mostrou evidência de um efeito protetor em ter Abs específico para Tat entre os sujeitos de Uganda.
PMID: 18366309 [PubMed - indexed for MEDLINE]

Anticorpos monoclonais

Fonte:

http://bioisolutions.blogspot.com/2007/09/monoclonal-antibodies.html

Monoclonal antibodies

Anticorpos monoclonais (mAb ou moAb) são anticorpos que são idênticos porque eles são produzidos por um tipo de células imunes e são todos clones de uma única célula parental. Dada (quase) qualquer substância, é possível criar anticorpos monoclonais que ligam-se específicamente àquela substância; eles podem, então, servir para detectar ou depurar aquela substância. Isso tem se tornado um instrumento importante na bioquímica, biologia molecular e medicina. Quando usado como medicação.

A idéia de uma “bala mágica” foi proposta primeiro por Paul Ehrlich que nos inícios do século 20 (1900) postulou que se um composto pudesse ser feito que alvejasse seletivamente o organismo causador da doença, então uma toxina para aquele organismo poderia ser entregue junto ao agente da seletividade.

Nos anos 1970 o câncer de células B da medula óssea era conhecido, e foi compreendido que essas células B cancerosas todas produziam um único tipo de anticorpo (uma para-proteína). Isso foi usado para estudar a estrutura dos anticorpos, mas ainda não era possível produzir anticorpos idênticos específicos para um dado antígeno.

O processo de produção de anticorpos monoclonais descrito acima foi inventado por Georges Köhler César Milstein, e Neils Kaj Jerne em 1975; eles dividiram o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1984 pela descoberta. A idéia-chave de usar uma linha de células de mieloma (células cancerosas da medula óssea) que tinham perdido sua habilidade para secretar anticorpos, veio à tona com a técnica de fusão dessas células com células B saudáveis produtoras de anticorpos, e serem capazes de selecionar as células fundidas com sucesso.

In 1988 Greg Winter and his team pioneered the techniques to humanize monoclonal antibodies,removing the reactions that many monoclonal antibodies caused in some patients.

Em 1988, Greg Winter e seu time foram pioneiros nas técnicas para humanizar anticorpos monoclonais, removendo as reações que muitos anticorpos monoclonais causavam em alguns pacientes.

Hibridoma
{Tumor de células híbridas}

Anticorpos monoclonais podem ser produzidos em cultura celular ou em animais vivos. Se uma substância externa (um antígeno) é injetado dentro de um vertebrado tais como um camundongo ou um humano, algumas células B do sistema imune tornar-se-ão células do plasma e começarão a produzir anticorpos que reconhecem antígenos. Cada célula B produz somente um tipo de anticorpo (IgA, IgG, IgM etc?), mas células B diferente produzirão anticorpos estruturalmente diferentes que ligam-se a diferentes segmentos (“epítopos”) do antígeno. Essa mistura natural de anticorpos encontrados no soro é conhecida como anticorpos policlonais.

Para produzir anticorpos monoclonais, as células B do baço ou dos linfonodos são removidas de um animal que tenha sido submetido várias vezes com o antígeno de interesse. Essas células B são então fundidas com células tumorais de mieloma que podem crescer indefinidamente em cultura (mieloma é um câncer de células B ou mais especificamente um plasmacitoma {massa de plasmócitos neoplásicos no osso ou em um dos vários locais extremamedulares; em seres humanos, essas lesões são a fase inicial do mieloma de plasmócitos em desenvolvimento.}) e que perderam a habilidade de produzir anticorpos. Essa fusão é feita tornando as membranas celulares mais permeáveis por uso de polietilenoglicol (PEG) {variam em consistência de acordo com o tamanho, um deles é um líquido viscoso, outro tem a consistência da cêra e são solúveis em água}, eletroporação {um choque elétrico breve aplicado às células abre poros na membrana plasmática permitindo a entrada de macromoléculas} ou, de histórica importância, infecção com alguns vírus. A fusão hibrida das células (chamadas hibridomas), sendo células de câncer, multiplicará rápida e indefinidamente. Grandes quantidades de anticorpos podem por isso ser produzidas. Os hibridomas são suficientemente diluídos para assegurar a clonalidade (todas as células na cultura tronco de uma mesma célula singula) e crescer. Os anticorpos dos diferentes clones são então testados por sua habilidade de ligarem-se ao antígeno (por exemplo com um teste como ELISA ou Ensaio de micro-série (?) de antígenos) ou immuno-dot blot {borrão de imuno-mancha}, e o mais sensitivo deles é escolhido. Quando as células de hibridoma são injetadas nos camundongos (na cavidade peritoneal, as tripas {peritônio é o mesotélio e uma camada de tecido conjuntivo irregular que reveste a cavidade abdominal e cobre as vísceras; mesotélio é uma camada única de células achatadas formando um epitélio que reveste cavidades serosas (peritônio e pleura)}, eles produzem tumores contendo um fluido rico em anticorpos chamado fluido ascite (?).


No processo acima, a linha de células de mieloma que perderam sua capacidade de produzir seus próprios anticorpos ou cadeias de anticorpos são usadas, para não contaminar os anticorpos alvo. Além disso, somente as células de mieloma que perderam uma enzima específica chamada hipoxantina-guanina-fosforribositransferase (HGPRT) e por isso não podem crescer sob certas condições (isto é, na presença de um meio seleto chamado meio HAT) são usadas; essas células são pré-selecionadas tanto por uso de 8-azaguanina quanto de 6-thioguanina (8-azaguanina tem sido mostrada por produzir resultados duvidosos. (van Diggelen e outros 1979)) antes da fusão, uma vez que as células que processam as HGPRT serão mortas pela 8-azaguanina. Durante o processo de fusão muitas células podem fundir-se: células de mieloma com células de mieloma, células do baço, com células do baço, células do baço com células de mieloma, etc. As fusões desejadas para produzir hibridomas estão entre células B saudáveis, que produzem anticorpos contra o antígeno de interesse e uma célula de mieloma. Nestas fusões relativamente raras, a célula B saudável formará uma enzima HGPRT que permitirá à célula fundida sobreviver em meio HAT de modo que somente as células fundidas com sucesso crescerão em cultura. O meio deve ser enriquecido durante a seleção para favorecer o crescimento do hibridoma. Isso pode ser conseguido com uso de uma camada de células alimentadoras ou meios suplementares como briclone (?). A produção em cultura celular é usualmente preferida pois as técnicas de ascites podem ser muito penosas para o animal e se as técnicas de substituição existem, as últimas podem ser consideradas anti-éticas.

Recombinante

A produção de anticorpos monoclonais recombinantes envolve tecnologias, referidas como um repertório de clonagem ou exposição de fago/exposição de levedura. A engenharia de anticorpos recombinantes envolve o uso de viroses um leveduras para criar anticorpos, mais do que os camundongos. Essas técnicas dependem da rápida clonagem de segmentos genéticos de imunoglobulinas para criar bibliotecas de anticorpos com seqüências de aminoácidos ligeiramente diferentes das quais os anticorpos com especificidades desejadas podem ser selecionados. Essas técnicas podem ser usadas para aumentar: a especificidade com que os anticorpos reconhecem antígenos, sua estabilidade em várias condições ambientais, sua eficácia terapêutica, e sua detectabilidade na aplicação diagnóstica. Câmaras de fermentação têm sido usadas para produzir esses anticorpos em larga escala.

Aplicações

Uma vez que os anticorpos monoclonais para uma dada substância tenham sido produzidos, eles podem ser usados para detectar a presença e a quantidade dessa substância, por exemplo em testes de Western Blot (para detectar uma proteína ou uma membrana) ou um teste de imunofluorescência (para detectar uma substância numa célula). Eles também são muito úteis na imuno-histoquímica, os quais detectam antígenos fixos em secções teciduais. Os anticorpos monoclonais também podem ser usados para purificar (separar) uma substância com técnicas chamadas imuno-precipitação e afinidade cromatográfica.

{8-azaguanina é guanina com um nitrogênio no lugar do carbono a posição 8.}

DESSULFATIZAÇÃO NA SUPERFÍCIE CELULAR

Referência:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2248377

J Cell Biol. 2003 July 21

PMCID: PMC2248377

Desulfation on the cell surface
Nicole LeBrasseur

As interações de ligantes de Wnt com seus receptores são ajudadas por proteínas sulfatadas extracelulares chamadas Sulfato de heparina proteoglicana (HSPGs). As HSPGs em estado de sulfatização regulam a ativação do desenvolvimento de rotas de sinalização, mas não está claro como a sulfatização é controlada. Um candidato recentemente identificado, QSulf1, é transitoriamente expressado em células precursoras miogênicas (do músculo) e é requerido para a expressão de genes específicos do músculo dependentes de Wnt. {GLUCOSAMINE-6-SULFATASE; G6S; lócus gênico 12q14, OMIM 607664: Dhoot e outros (2001) noticiaram a identificação de QSulf1, um ortólogo aviário de GNS. A expressão de QSulf1 é induzida por vibrações em progenitores miogênicos (miogênico é o que começa no músculo) de somitos (massas celulares pares que começam na região do metencéfalo na terceira ou quarta semana de gestação) no ouriço cacheiro , em embrião de codorna, e é requerido para a ativação de MyoD, um regulador induzido por Wnt de especificação muscular. QSulf1está localizado na superfície celular e regula a sinalização de Wnt dependente de heparan em células miogênicas progenitoras C2C12 através de um mecanismo que requer sua atividade catalítica, proporcionando evidências de que QSulf1 regula a sinalização de Wnt através da dessulfatização de sulfatos de heparina proteoglicanos na superfície celular. } Na página 341, Ai e outros demonstraram que a QSulf1 é uma sulfatase única que remodela a superfície celular para torná-la aberta à sinalização de Wnt.
QSulf1 tem um domínio catalítico que assemelha-se a uma exosulfatase 6-O lisossômica. Porém Ai e seus colegas mostraram que a QSulf1 é uma endosulfatase 6-O: a primeira enzima relatada por remover sulfatos dos dissacarídeos internos. Células expressando QSulf1 tinham HSPGs extensivamente diferentes na superfície que foram altamente dessulfatados comparados com aqueles nas células vizinhas.
A dessulfatização teve um efeito positivo na transferência do sinal de Wnt. Heparinas sulfatadas, em contraste, inibiram a ativação de Wnt de receptores Frizzled (Fz). A sulfatização parece afetar a sinalização por regulação da afinidade de HSPGs com Wnt. A versão dessulfatizada de um HSPG chamado Glipicana 1ligou-se menos firmemente a Wnt do que Glipicana 1 permanentemente sulfatado. Os autores sugerem o Glipicano 1 sulfatado tende a capturar um Wnt seguro. A dessulfatização permite a passagem de Wnt para Fz e assim ativa a transcrição do gene Wnt.
HSPGs são conhecidas por promover, mais do que inibir, a sinalização de FGF (fator de crescimento de fibroblastos). O grupo espera que as HSPGs que interagem com FGF também possam ser substratos de QSulf1, e assim, QSulf1 pode, neste contexto, ter uma função regulatória negativa.
Embora a QSulf1 normalmente transite com HSPGs através do Golgi para a superfície celular, as QSulf1 presas ao Golgi foram capazes de dessulfatizar HSPGs e ativar a sinalização de Wnt. Se QSulf1 é ativa somente no Golgi, a sulfatização provavelmente não é dinamicamente regulada. Mas se QSulf1 também trabalha na superfície celular , será mais fácil modular sua atividade e assim regular a sinalização de Wnt para propósitos terapêuticos.

HEPARAN SULFATO PROTEOGLICANOS, RECEPTORES DE Fc E SUPRESSÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

(tradução amadorística com referências explicativas ao site OMIM)

Blood. 2008 August 1; 112(3): 915–916.
doi: 10.1182/blood-2008-05-156091.
PMCID: PMC2481544

Correspondence
Heparan sulfate proteoglycans, Fc receptors, and DC suppression

Eddy Roosnek, Pascal Schneider, and Bertrand Huard


To the editor: Em seu artigo recente em “Blood”, V.Sa e outros hipotetizaram o mecanismo pelo qual o receptor decoy 3 (DCR3) {DCR3: OMIM 603361: o ligante de Fas é produzido em células T ativadas e células matadoras naturais, e induz a apoptose (morte celular programada) em células alvo através do receptor de Fas. Um importante papel para o ligante de Fas (FasL) e para Fas é mediar a morte imuno-citotóxica de células que são potencialmente prejudiciais ao organismo, tais como as infectadas por vírus ou tumorais. Pitti e outros (1998) identificaram ESTs que mostraram homologia com a super-família de receptores do fator de necrose tumoral (TNFR). Usando PCR com iniciadores de transcrição baseados na região consenso de EST, eles isolaram um cDNA codificador de um receptor decoy solúvel, chamado receptor decoy 3 (DCR3), a partir de uma biblioteca de cDNA de pulmão fetal humano.... Pitti e outros (1998) detectaram um transcrito de 1.2 quilo-bases no pulmão, cérebro e fígado fetal e no baço, cólon (o intestino do ceco até o reto) e pulmão adultos. Pitti e outros demonstraram que a DCR3 liga-se a FASL e inibe a apoptose induzida por FASL. Como a osteoprotegerina (uma proteína secretada que inibe a diferenciação do osteoclasto; osteoclasto é uma célula multinucleada, possivelmente de origem monocítica, com citoplasma acidófilo abundante, que atua na absorção e remoção do tecido ósseo) outro membro da superfamília de TNFR, a DCR3 carece de uma seqüencia transmembranal aparente, indicando que a DCR3 pode ser uma molécula secretada, ao contrário de uma molécula associada à membrana. Fas é CD95: OMIM *134637: O antígeno Faz apresenta homologia estrutural com um número de receptores de superfície celular, incluindo os receptores de fator de necrose tumoral (TNF) e com o receptor de fator de crescimento nerval de baixa afinidade},um membro da família dos receptores de fator de necrose tumoral (TNF-R), poderia promover o crescimento de tumor em pacientes com câncer. Eles noticiaram que a CdR3 induz a apoptose de células dendríticas (DCs) por ligação a seus proteoglicanos de heparan sulfato (HSPG). Eles argüíram que a supressão imune resultante poderia explicar por que altos níveis de DcR3 são associados com reduzida sobrevivência em pacientes com câncer. Esse efeito da DcR3 foi mostrado por uso de uma forma recombinante de DcR3 fundido com a porção Fc (DC16) da IgG humana (DcR3-Fc). Entretanto, é sabido que a metade Ig da fusão protéica liga-se a receptores de Fc (FcR, CD32).

{CD32 OMIM 146790: Receptores para a porção Fc da IgG desempenham um papel essencial na proteção do organismo aos antígenos externos por removerem complexos antígeno-anticorpo da circulação. Os receptores estão presentes em monócitos, macrófagos e neutrófilos, células matadoras naturais (NK) e linfócitos T e B, e eles participam em diversas funções tais como fagocitose de imuno-complexos e modulação de produção de anticorpos pelas células B. Hibbs e outros (1998) isolaram clones de cDNA para o gene FcGR por hibridização cruzada de espécies por sondagem de bibliotecas de cDNA com um clone de cDNA de FcGR beta-1 de baixa afinidade do camundongo, assim como um grupo de oligonucleotídeos construído a partir da seqüência nucleotídica desses FcGR. Análises da seqüência de aminoácidos pronosticada dos clones de cDNA indicaram que a proteína humana FcR é sintetizada com uma guia de 34 aminoácidos e que a proteína madura é composta de 281 aminoácidos. A região extracellular dessas FcGR foi dividida em dois domínios, os quais foram muito similares entre si e às regiões correspondents de ambos os FcGRs alfa e beta do camundongo e mostrou claro relacionamento com as regiões variáveis da imunoglobulina.}

Porque as DCs expressam FcR de alta afinidade que podem produzir um forte sinal dentro das células, os resultados de V.Sa e outros não demonstra que, sem a interação Ig-FcR, a ligação de DcR3 a HSPG é suficiente para induzir a apoptose de DC ou, alternativamente, por esta atividade de decoy em moléculas pró-apoptóticas tais como ligante de Fas.

Usando outro membro da família TNF-R, o atiivador transmembranal, modulador de cálcio, e interator com o ligante de ciclofilina (TACI)-Fc, nós observamos uma inibição similar da geração de DC a partir de monócitos do sangue periférico, como a noticiada por V.Sa. e outros com DcR3-Fc. É notável que TACI, assim como DcR3, tenha um domínio de ligação a HSPG. Por contraste, a maturação do antígeno na célula B (BCMA)-Fc que liga-se aos mesmos ligantes como TACI-Fc mas não tem domínio de ligação a HSPG e controla IgG1 não afetou a geração de DC. Tal inibição da geração de DC também foi observada com um membro da família TNF, um ligante indutor de proliferação (APRIL) também transportando um domínio de ligação a HSPG fusionado com o mesmo Fc de IgG1 (Fc-APRIL). Um mutante da segunda molécula (APRIL) sem o domínio de ligação a HSPG, Fc-APRIL H98, ou a molécula de tipo selvagem oligomerizada por uma metade não Ig, o domínio de colágeno da adiponectina, ACRP-APRIL, falhou em inibir a geração a despeito da ligação muito eficiente a DC. Portanto, a ligação a HSPG é essencial, mas uma interação adicionaç com FcR é um pré-requisito para afetar as DCs.


O achado de que a ligação cruzada simultânea de FcR e HSPG e/ou a formação de uma ponte entre FcR e HSPG elimina DCs e pode causar supressão imune é de grande interesse. De fato, alguma proteína carregando um domínio de ligação a HSPG fundida com uma porção Fc da IgG pode levar à cabo a imunossupressão. Tal imunossupressão é aceitável por constituir uma vantagem no andamento de testes clínicos com TACI-Fc em desordens auto-imunes.

Estrutura, Expressão de Regulação do Genoma do HIV
(Tradução com observações)

Structure, Expression, and Regulation of the HIV Genome
HIV InSite Knowledge Base ChapterNovember 2000
Thomas J. Hope, PhD, The Salk InstituteDidier Trono, MD, The Salk Institute

http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-01-02


Introdução

A forma integrada do HIV-1, também conhecida como pró-vírus, e uma lente de aproximadamente 9.8 quilibases. Ambas as extremidades do pró-vírus são flanqueadas por uma seqüência repetitiva conhecida como os longos terminais de repetição (LTRs). Os genes do HIV estão localizados na região central do DNA pró-viral e codifical ao menos nove proteínas (figura 1). Essas proteínas são divididas em três classes:

1. As principais proteínas estruturais, Gag, Pol e Env (obs.:env contém as seqüências da GP120 e da GP41);

2. As proteínas regulatórias, Tat e Ver;

3. As proteínas assessórias, Vpu,Vpr, Vip e Nef.

A primeira parte do capítulo revisa as proteínas virais individualmente e suas funções. A segunda parte discute fatores que regulam a transcrição e o processamento do mRNA viral.



PROTEÍNAS VIRAIS E SUAS FUNÇÕES

PROTEÍNAS ESTRUTURAIS

GAG

Os genes de gag dão origem a uma proteína precursora de Gag com 55 quilodáltons (de massa), também chamada de p55, a qual é expressada de um mRNA não processado por splicing. Durante a tradução, o terminal N (a extremidade que apresenta NH2 ,grupo amina, livre, em sentido oposto à extremidade que apresenta COOH, carboxila,livre) de p55 é miristolado (?) {ácido miristoleico é um ácido graxo insaturado de 14 carbonos, com uma ligação dupla entre os carbonos 9 e 10; é o análogo de 14 carbonos de ácido oléico} disparando sua associação com o aspecto citoplasmático das membranas celulares. A poli-proteína Gag associada à membrana recruta duas cópias do genoma viral de RNA junto a outras proteínas virais e celulares que disparam o brotamento da partícula viral a partir da superfície de uma célula infectada. {Obs.: o RNA viral para produção de novos vírions é exportado do núcleo celular em partes que precisam ser reunidas no citoplasma}. Após o brotamento, a p55 é clivada por uma protease codificada pelo vírus (um produto do gene Pol) durante o processo da maturação viral em quatro pequenas proteínas designadas MA (matrix[p17]), CA (capsid[p24]), NC (nucleocapsídeo [p9]), e p6.
O polipeptídeo MA é derivado do terminal N, miristolado , da extremidade de p55. A maioria das moléculas MA permanecem coladas na superfície interna da camada dupla lipídica do vírion, estabilizando esta partícula. Um subconjunto de MA é recrutado dentro das camadas profundas do vírion onde tornam-se parte do complexo que escolta o DNA viral para o núcleo. Essas moléculas MA facilitam o transporte nuclear do genoma viral pois um sinal cariofílico na MA é reconhecido pela maquinaria de importação nuclear. Esse fenômeno permite ao HIV infectar células que não estejam em divisão, uma propriedade incomum para um retro-vírus.
A proteína p24 (CA) forma o cerne cônico das partículas virais. A ciclofilina A tem sido demonstrada por interagir com a região p24 de p55 levando à sua incorporação para dentro das partículas virais. A interação entre Gag e ciclofilina A é essencial pois a ruptura dessa interação pela ciclosporina A inibe a replicação viral.
{ Obs.: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=123840
A ciclofilina A (também designada como peptidil-prolil cis/ trans isomerase A ou PPIA, CYPA, CYPH.Obs.: assim sendo, um peptídico com grupamento prolina cis/trans, sendo cis- prefixo itálico que significa deste lado, oposto de trans- ; em química orgânica, uma forma de isomerismo geométrico em que grupos funcionais semelhantes estão fixados no mesmo lado do plano que inclui dois átomos de carbono fixos, estes grupamentos são cis -; e sendo prolina ácido pirrolidina-2-carboxílico; o L-isômero é encontrado em proteínas, principalmente os colágenos) é um membro da classe de proteínas imunofilinas (proteínas receptoras de alta afinidade no citoplasma, que se combinam com agentes imunossupressores, resultando em inibição da rotamase e, nas células T, em interrupção da ativação celular) que possuem todas atividade de peptidil-prolil cis/trans isomerase (isomerase é uma classe de enzimas que catalisam a conversão de uma substância numa forma isomérica, formas que são idênticas quanto à composição percentual mas que diferem quanto a posição de um ou mais átomos nas moléculas, ou quanto a suas propriedades físico-químicas) e, por este motivo, acredita-se que estejam envolvidas no entrelaçamento/junção protéica e ou transporte intra-celular de proteínas. Luban e outros (1993) mostraram que a ciclofilina A liga-se à proteína Gag do HIV-1. Essa interação pode ser inibida pelo imuno supressor ciclosporina A e também, de modo não imuno-supressor , a ciclofilina A ligada a derivativos da ciclosporina A, os quais também foram apresentados por exibir pitente atividade anti-HIV. Assim, a ciclofilina A pode ter uma função essencial na replicação do HIV-1.
Pushkarsky e outros (2001) identificaram CD147 (BSG) como um receptor para CYPA extra-celular. Eles acharam que CD147 aumentou a infecção por HIV-1 através da interação com CYPA incorporada nos vírions. A CYPA associada aos vírus co-imuno-precipitou com CD147 de células infectadas, e anticorpos para CD147 inibiram a entrada do HIV-1. Viroses cuja replicação não requer CYPA são resistentes ao efeito iniidor de anti-CD147. Pushkarsky e outros (2001) concluíram que a entrada o HIV-1 depende de uma interação entre a CYPA associada ao vírus e CD147 em células alvo.
Towers e outros (2003) demonstraram que a senditividade do HIV-1 a fatores de transcrição é modulada por CYPA. Em certas células primatas não-humanas, a interação da proteína do capsídeo do HIV-1(CA) com CYPA é essencial para a restrição: a infectividade do HIV-1 é aumentada mais de 100 vezes pela ciclosporina A, um inibidor competitivo da interação, ou por alguma mutação na proteína CA do HIV-1 que rompa a ligação com CYPA. Inversamente, o rompimento da interação CA-CYPA em células humanas revela que a CYPA protege o HIV-1 do fator de restrição Ref-1. Towers e outros (2003) concluíram que seus achados sugerem que o HIV-1 tem cooptado proteínas das células hospedeiras para neuralizar fatores de restrição expressados por células humanas e essa adaptação pode conferir sensibilidade à restrição em outros hospedeiros. }

A região NC de Gag é responsável por um reconhecimento específico chamado sinal de empacotamento do HIV. O sinal de empacotamento consiste de quatro estruturas em laço perto do final 5’ do RNA viral, e é suficiente para mediar a incorporação de um RNA heterólogo (relativo a elementos citológicos ou histológicos que ocorrem onde normalmente não são encontrados; ex.: o soro do cavado é heterólogo ao soro do coelho) dentro dos vírions. A NC liga-se ao sinal de empacotamento através de interações mediadas por dois motivos de dedos de zinco. A NC também facilita a transcrição reversa.

O a região do poli-peptídeo p6 media interações entre p55 (Gag) e a proteína assessória Vpr, levando à incorporação do Vpr dentro de vírions que estão se reunindo. A região p6 também contém um domínio chamado domínio tardio o qual é requerido para a liberação de vírions brotantes de uma célula infectada.



PRECURSOR DE GAG-POL

A protease viral (Pro), integrase (IN), RNase H, e transcriptase reversa (RT) são sempre expressadas dentro do contexto de uma fusão das proteína Gag-Pol. O precursor Gag-Pol (p160) é gerado por um evento de mudança da estrutura ribossômica, a qual é disparada por um motivo de RNA de atividade cis (uma seqüência de hepta-nucleotídeo seguida de um pequeno talo em laço na região distante do RNA de Gag). Quando os ribossomos encontram este motivo, eles alteram aproximadamente 5% do tempo para a estrutura de leitura de pol sem interrupção na tradução. A freqüência da estrutura de deslocamento ribossomal explica porque a Gag e a precursora Gag-Pol são produzidas em uma proporção de 20:1.

Durante a maturação viral, a protease codificada viral cliva o polipeptídio Pol para fora de Gag e rapidamente digere este para separar as atividades de protease (p10), RT (p50), RNaseH (p15), e integrase (p31). Essas clivagens não ocorrem com eficiência, por exemplo, grosseiramente 50% da proteína RT permanece ligada à RNaseH como um polipeptídeo único (p65).




Pro

A protease do HIV-1 é uma protease aspartil (radical aminoacil do ácido aspártico) que atua como um dímero. A atividade de protease é requerida para a clivagem das poli-proteínas precursoras de Gag e Gag-Pol durante a maturação do vírion como descrito anteriormente. A estrutura tri-dimensional do dímero da protease está sendo determinada. O conhecimento dessa estrutura tem levado a uma classe de drogas direcionadas para inibição da função da protease do HIV.


RT

O gene Pol codifica a Transcriptase Reversa. Pol tem atividades dependentes de RNA e dependents de DNA. Durante o processo da transcrição reversa, a polimerase produz uma cópia de DNA em fita dupla do dímero da fita singular do RNA genômico presente no vírion. A RNase H remove o molde original de RNA da primeira fita de DNA, permitindo a síntese da fita complementar de DNA. O DNA viral pode ser completamente sintetizado dentro de seis horas após a entrada viral, embora o DNA possa permanecer não integrado por períodos prolongados. Muitos elementos de ação cis no RNA viral são requeridos para a geração do DNA viral. Por exemplo, o elemento TAR, uma pequena estrutura de fita em laço de RNA localizada na extremidade 5’ dos RNAs virais e contendo o sítio de ligação para Tat, é requerida para a iniciação da transcrição reversa. A espécie funcional predominante da polimerase é um heterodímero de p65 e p50. Todos os genes produtos de Pol podem ser encontrados dentro do capsídio de vírions do HIV-1 livres. Porque a polimerase não contém uma atividade de revisão (correção), a replicação é propensa a erros e introduz vários pontos de mutação dentro de cada nova cópia do genoma viral. A estrutura em cristal da Transcriptase Reversa do HIV-1 tem sido determinada.



Integrase (In)

A proteína IN media a inserção do HIV pró-viral de DNA dentro do DNA genômico da célula infectada. Esse processo é mediado por três funções distintas da integrase. A primeira, uma atividade de exonuclease apara (corta fora) dois nucleotídeos a partir de cada extremidade 3’ da fita dupla de DNA viral. Então, uma atividade de endonuclease de fita dupla cliva o DNA do hospedeiro no sítio de integração. Finalmente, a atividade de ligase gera uma ligação covalente única em cada extremdade do DNA pró-viral. Acredita-se que enzimas celulares restaurem o sítio de integração. Nenhum tipo de energia exógena, tal como ATP, é requerida para esta reação. A acessibilidade ao DNA cromossômico dentro da cromatina, mais do que as seqüências específicas de DNA, parece influenciar a escolha de sítios de integração. (Observar a atividade da endonuclease emerim : O gene EMD codifica uma proteína ubíqua, a emerim, que é achada ao longo da borda nuclear de muitos tipos de células e é um membro da família de proteínas associadas à lamina nuclear. Jacque e Stevenson (2006) examinaram a suscetibilidade à infecção de macrófagos primários pelo HIV-1 seguinte ao silenciamento de laminas nucleares e várias proteínas associadas a lamina mediado por pequenos RNAs de interferência. Eles acharam que o silenciamento de emerin e BAF impediu a infecção por HI-1, mas não o vírus da leucemia murina, através do impedimento da integração do vírus dentro do DNA do hospedeiro. Análises de imuno-precipitação da cromatina identificaram a emerim e a BAF como co-fatores cooperativos do HIV-1, e análises de mutação mostraram que o cDNA viral não se associa a BAF deficiente do sítio de ligação a emerim ou à emerim sem o domínio LEM. Jacque e Stevenson (2006) concluíram que o cDNA do HIV-1, à entreda no núcleo, precisa interagir com a emerim para contactar a cromatina, e eles sugeriram que moléculas que impedem essa interação devem promover a infecção abortiva do HIV-1 em uma célula. OMIM - 300384) Sítios de torção do DNA dentro da cromatina são assim “locais quentes” para integração, ao menos “in vitro”. É possível promover a integração dentro de regiões específicas do DNA pela fusão da integrase a proteínas de ligação a seqüências específicas do DNA. A integração preferencial a regiões de cromatina abertas (ativas para transcrição) pode facilitar a expressão do pró-vírus. Genes virais não são expressados eficientemente a partir do DNA pró-viral não integrado.


ENV

Os 160 quilo-dáltons de Env (gp160) são expressados de um mRNA processado por splicing uma única vez. Primeiro sintetizado no retículo endoplasmático, o Env migra através do complexo de Golgi onde este sofre glicosilação com adição de um complexo de 25 a 30 cadeias de carbo-hidratos ligado ao lado N, que são adicionados nos resíduos de asparaginase (asparginase é uma β-amina do ácido aspártico [HOOC-CH2-CH-NH2)-COOH], o L-isômero é um aminoácido nutricionalmente não essencial que ocorre em proteínas, um diurético). A glicosilação de Env é requerida para a infectividade. Uma protease cliva a gp160 para gerar gp41 e gp120. A metade da gp41 contém o domínio transmembranal de Env, enquanto agp 120 é localizada na superfície das células infectadas e dos vírions atraés de interações não covalentes com gp41. A Env existe como um trímero na superície de células infectadas e vírions.

Interações entre o HIV e o receptor viral, CD4, são mediadas através de domínios específicos da gp 120. A estrutura da gp 120 tem sido determinada recentemente. A metade de gp120 tem nove ligações dissulfídicas intra-cadeia altamente conservadas. Também estão presentes na gp 120 cinco regiões hiper-variáveis, designadas de V1 até V5, cujas seqüêcias de aminoácidos podem variar grandemente entre os HIV-1 isolados. Uma dessas regiões, chamada laço de V3, não está envolvida na ligação a CD4, mas é mais um determinante importante para o tropismo do HIV-1 tanto para a linhagem para linfócitos T ou para macrófagos primários. Seqüências dentro do laço V3 interagem com os co-receptores do HIV CXCR4 e CCR5, os quais pertencem à família dos receptores de citocinas e determinam parcialmente a suscetibilidade dos tipos de células para dadas linhagens virais. O laço V3 também é o principal alvo para anticorpos neutralizantes que bloqueiam a infectividade do HIV-1. A metade de gp120 também interage com a proteína DC-SIGN ( obs.:lectina C) a qual é expressada na superfície das células dendríticas. A interação com a DC-SIGN aumenta a eficiência da infecção das células T CD4 positivas. Além disso, acredita-se que a DC-SIGN pode facilitar a transmissão pela membrana mucosa pelo transporte do HIV para os tecidos linfóides. A metade de gp41 contém um domínio fusogênico no terminal N que media a fusão das membranas viral e celular, dessa forma permitindo a entrega dos componentes internos do vírion dentro do citoplasma de células recém-infectadas. Uma nova classe de terapêuticas anti-virais, as quais impedem a fusão da membrana, estão apresentando promessas em testes clínicos .

[Obs.: OMIM 300017 – Filamin A; Xq28- Usando análises de leveduras duplamente híbridas e ensaios de abatimento, Jimenez-Baranda e outros (2007) demonstraram que o receptor do vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1, CD4, e os co-receptores do HIV-1 CCR5 e CXCR4 interagiram com FLNA (finamina) , a qual regulou a aglomeração dos receptores do do HIV-1 na superfície celular. A ligação de gp120 do HIV-1 aos receptores induziu uma inativação da transitória da fosforilação da cofilina (OMIM 601442) através de um mecanismo dependente de RHOA-ROCK (omim 165390 e 601702). O bloqueio da interação de FLNA com CD4 e/ou os co-receptores inibiu a ativação de gp120 induzida por RHOA e a inativação da cofilina. Jimenez-Baranda e outros (2007) concluíram que FLNA é uma proteína adapatadora que liga os receptors do HIV-1 à maquinaria de remodelação do esqueleto de actina, possivelmente facilitando a infecção pelo vírus.]



PROTEÍNAS REGULATÓRIAS

TAT

A tat é um transativador transcricional que é essencial para a replicação do HIV-1. As formas longas de Tat de 72 e de 101 aminoácidos são expressadas por mRNAs submetidos a muitos procedimentos de splicing precocemente ou mRNAs que passaram por processo incompleto de splicing tardio, respectivamente. Ambas as formas funcionam como ativadores transcricionais e são encontradas dentro dos núcleos ou nucléolos de células infectadas. A Tat é uma proteína de ligação a RNA, diferente dos fatores de transcrição convencionais que interage com DNA. A tat liga-se a uma estrutura de pequeno talo em laço, conhecida como elemento de reação de trans-ativação (TAR), que está licalizado na extremidade 5’ dos RNAs de HIV. A ligação de Tat ocorre em conjunção com proteínas celulares que contribuem para os efeitos de Tat. A ligação de Tat com TAR ativa a transcrição a partir do LTR do HIV em ao menos 1000 vezes.

O mecanismo de funcionamento de Tat tem sido elucidada recentemente. A Tat atua principalmente para promover a fase de alongamento (transcrição da extensão do genoma, a lente) da transcrição do HIV-1, assim os transcritos de lente completa podem ser produzidos. Na ausência da expressão de Tat, o HIV gera curtos transcritos primários (maiores do que 100 nucleotídeos). A estimulação do alongamento da polimerase é efetivado pelo recrutamento de uma quinase deserina que fosforila o domínio terminal carboxila (terminal-C : CTD) da RNA polimerase II. Essa quinase, a qual é conhecida como CDK9, é parte de um complexo que liga-se diretamente a Tat. A função de Tat requer um co-fator celular, conhecido como ciclina T, o qual facilita o reconhecimento da região do laço de TAR pelo complexo Ciclina T- Tat. O levantamento celular da liberação de Tat por células infectadas tem sido observado, embora o impacto deste fenômeno na patogênese seja desconhecido. Tat tem sido mostrada por ativar a expressão de um número de genes celulares incluindo o fator de necrose tumoral beta, e o fator de transformação de crescimento beta, e por regular para menos a expressão de genes incluindo bcl-2 e a citocina MIP-1 alfa.



Rev

A Rev é uma proteína de 13 quilo-dáltons, de ligação a seqüências específicas de RNA. Produzidas a partir de mRNAs fartamente submetidos a procedimentos de splicing, a Rev atua para induzir a transição da fase inicial à fase final de expressão dos genes do HIV. A Rev, a qual é codificada por dois éxos, acumula-se dentro do núcleo e do nucléolo de células infectadas. A Rev liga-se a uma região de base 240 da estrutura secundária do complexo de RNA, chamada elemento de reação de Rev (RRE), que jaz dentro do segundo íntron do HIV. A Rev liga-se a uma “bolha” dentro de uma hélice de fita dupla de RNA contendo um par de bases G-G não Watson-Crick. Essa estrutura, conhecida como sítio de ligação de alta afinidade a Rev, está localizado na região de RRE conhecida como haste em laço 2.

A ligação de Rev à RRE facilita a exportação de RNAs virais, que passaram por processo incompleto de splicing ou RNAs não processados por splicing, do núcleo celular para o citoplasma. Normalmente, os RNAs contém íntrons (isto é, RNA não processados por splicing ou não spliceados) são retidos no núcleo. Altos níveis de expressão de Rev podem levar à exportação de tantos RNAs virais contendo íntros que a quantidade de RNA disponível para splicing completo fica diminuída, o que, por outro lado, reduz os níveis de expressão de Ver. Dessa forma, essa capacidade de Revpara diminuir a taxa de processo de splicing de RNA viral gera um retorno negativo do circuito pelo qual os níveis de expressão de Rev são regulados escassamente.
A Rev tem sido apresentada contend ao todo três domínios funcionais. Um RNA rico em arginina media interações com RRE. Um domínio de multimerização é requerido para o funcionamento de Rev. Rev é crida por existir como um tetrâmero homogêneo em solução. Rev também contém um domínio efetor, o qual é um sinal específico de exportação nuclear (NES). A exportação do RNA viral por Rev ocorre através de uma via tipicamente usada pelos pequenos RNAs nucleares (snRNAs) e o RNA ribossômico 5s mais do que a via normal para mRNAs celulares. A exportação por Rev é mediada através de interações com o receptor NES conhecido como CRM1. NES mutantes de Rev são dominantes negativos. A inibição é causada pela formação do multímeros não funcionais entre o NES mutante e os monômeros de tipo selvagem de Ver. Ver é absolutamente requerida para a replicação do HIV-1: as pró-viroses que não têm a função de Ver são transcricionalmente ativas, mas não expressam os derradeiros genes virais e assim não produzem vírions.


PROTEÍNAS ASSESSÓRIAS

Em adição aos genes gag, pol e env contidos em todas as retroviroses, e os genes regulatórios tat e Rev, o HIV-1 contém quatro genes adicionais: nef, vif, vpr e vpu., codificadores das também chamadas proteínas assessórias. O HIV-2 não contém o vpu, mas a despeito disso, contém outro gene, vpx. As proteínas assessórias não são absolutamente requeridas para a replicação viral em todos so sistemas “in vitro”, mas representam fatores de virulência críticos “in vivo”. A Nef é expressada a partir de mRNAs multiplamente processados por splicing e é, por isso, independente de Rev. Em contraste, Vpr, Vpu e Vif são o produto de mRNAs processados por splicing incompleto, e assim são expressados somente durante a tardia fase de infecção dependente de Rev, a partir de mRNAs processados uma única vez por splicing. A maioria das pequenas proteínas assessórias do HIV tem múltiplas funções como descrito adiante.


Nef (um acrônimo para fator negativo) é uma proteína miristolada de 27 quilo-dáltons que é codificada por um único éxon que se extende dentro do LTR da extremidade 3’. Nef, um gene prematuro do HIV, é a primeira proteína viral a acumular-se em níveis detectáveis numa célula após a infecção pelo HIV-1. Seu nome é uma conseqüência das primeiras notícias afirmando a a atividade transcricional regulada para menos de Nef do LTR do HIV-1. Não é de longa data que se acredita, entretanto, que a Nef tenha um efeito direto na expressão do gene do HIV. A Nef tem sido apresentada por ter múltiplas atividades, incluindo a regulação para menos da expressão de CD4 na superfície celular, a perturbação da ativação das células T e a estimulação da infectividade do HIV.

A Nef atua pós-trancricionalmente no decréscimo da expressão de superfície da CD4, o receptor primário do HIV. A Nef aumenta a taxa de endocitose e degradação lisossômica da CD4. A cauda citoplasmática de CD4, a em particular uma seqüência repetida de di-leucina contida em sua região próxima à membrana, é a chave para o efeito de Nef sobra a CD4. A regulação para menos da CD4 parece ser vantajosa para a produção viral pois um excesso de CD4 na superfície celular tem sido considerada por inibir a incorporação de Env e o vírion em ascensão. A Nef também regula para menos a expressão do MHC de classe I, não obstante para um grau menor. A regulação para menos do MHC de classe I diminui a eficiência da morte de células infectadas pelo HIV por células T citotóxicas.

A Nef perturba a ativação da célula T. Estudos sobre a linhagem de células T Jurkat indicaram que a expressão de Nef tem um efeito negativo na indução da transcrição do fator NF-kappa B (OMIM 300248 – NEMO;Xq28: Yamaoka e outros (1998) caracterizaram uma linhagem de células mutantes , 5R, originalmente isoladas como uma variante irrelevante dos fibroblastos Rat-1 transformados pela proteína Tax do vírus da leucemia das células T humanas de tipo 1(HTLV-1). A linha de células 5R não respondeu a nenhum dos estímilos de ativação de NF-kappa-B (NFKB 164011) testados. Usando uma abordagem de complementação genética, Yamaoka e outros (1998) clonaram um componente da quinase do complexo I-kappa-B que eles denominaram NEMO para “ modulador essencial para NF-kappa-B” de células 5R. O cDNA de NEMO, de 2.8 quilo-bases, codifica uma proteína de 412 aminoácidos que á acídica, rica em ácido glutâmico e resíduos de glutamina (cada 13%), e contém um motivo de zipper de leucina nos aminoácidos 315 a 342. Yamaoka e outros (1998) determinaram que o fenótipo defeituoso da scéluls 5R resultava da ausência da proteína NEMO. A NEMO também complementou a linha de células mutantes 1.3E, na qual o NFKB não é ativado em resposta a grande estado de estimulação.) e na expressão de IL-2 (OMIM 308380: A IL2 afeta o crescimento e a diferenciação das células T, células B,células matadoras naturais (NKiller), células gliomas (células do tecido intersticial do cérebro, da medula espinal, da neuro-hipófise, da glêndula pineal e da retina) e células de linhagem monocítica após a específica interação com seus receptores. O receptor de IL2 (IL2R) consiste de duas sub-unidades (IL2RA e IL2RB). Takeshita e outros (1992) identificaram uma terceira sub-unidade, a cadeia gama, e isolaram o correspondente cDBA a partir de uma linhagem de células T umanas. A proteína deduzida em 369 aminoácidos tem uma massa molecular de 39.9 quilo-dáltons e apresenta similaridade seqüencial com membros da família de receptores de citocina. Análises de Northern blot (RNA) detectaram um transcrito de mRNA dominante de 1.8 quilo-bases nas células T e B humanas; um Segundo transcrito de mRNA de 3.6 quilo-bases também foi detectado. Nenhum transcrito de mRNA de IL2RG foi detectado em células humanas não linfóides, taiscomo pró-monócitos, células epiteliais ou hepatócitos). Em contraste, resultados obtidos em camundongos trangênciso em Nef revelaram que a Nef leva à elevada sinalização de células T. A expressão de uma molécula quimérica de CD8-Nef em células Jurkat teve tanto efeito positivo quanto negativo dependendo da localização celular da molécula Nef híbrida. Quando a proteína CD8-Nef acumulou-se no citoplasma, existia um bloqueio na sinalização normal através do receptor de célula T. Quando a quimera CD8-Nef foi expressada em altos níveis na superfície celular, entretanto, a ativação espontânea seguida por apoptose foi detectada. Juntas, essas observações sugerem que a Nef pode exercer efeitos pleiomórficos ( de mais numeroso morfismo) na ativação de células T dependendo do contexto da expressão. Consistente com esse modelo, a Nef tem sido encontrada em associação com várias quinases celulares diferentes que estão presentes nos linfócitos T auxiliares.

A Nef também estimula a infectividade de vírions do HIV. As partículas do HIV-1 produzidas na presença de Nef podem ser mais do que dez vezes mais infecciosas do que vírions produzidos na ausência de Nef. A Nef está empacotada dentro dos vírions, onde é clivada pela protease viral durante a maturação. A importância deste evento, entretanto, não está clara. Vírions produzidos na ausência de Nef são menos eficientes para a síntese de DNA pró-viral, embora a Nef não pareça influenciar diretamente o processo da transcrição reversa. A regulação para menos de CD4 e o efeito da infectividade do vírion por Nef são geneticamente distintos como demonstrado por certas mutações que afetam somente uma dessas duas atividades.

Existe uma evidência genética convincente de que a proteína Nef do vírus da imuno-deficiência síma é absolutamente requerido para o crescimento de altos títulos e o típico desenvolvimento da doença em animais adultos. É possível, entretanto, para mutantes de SIV com Nef defeituosa causar a doença e animais recém-nascidos. Além disso, os vírions defeituosos em Nef ainda causam a doença similar à AIDS em animais infectados embora o começo seja atrasado.


Vpr

A proteína Vpr é incorporada dentro de partículas virais. Aproximadamente 100 cópias de Vpr estão associadas com cada vírion. A incorporação de Vpr dentro de vírions é mediada através de interções específicas com a região terminal em carboxila de p55 Gag, a qual corresponde a p6 na proteína processada proteoliticamente.

A Vpr desempenha um papel na habilidade do HIV para infectar células que não estejam em divisão por facilitar a localização nuclear do complexo de pré-integração (PIC). A Vpr está presente no PIC. Entretanto, mais do que prender sinais adicionais de localização nuclear ao PIC, a Vpr pode atuar como um fator de transporte nucleo-citoplasmático por prender diretamente o genoma viral no poro nuclear. Consistente com este modelo, a Vpr expressada em células é encontrada associada com o poro nuclear e pode ser bioquimicamente demonstrada ligando-se a componentes do complexo do poro nuclear. A Vpr também pode bloquear a divisão celular. Células que expressam Vpr acumulam-se (multiplicam-se) na fase G2 do ciclo celular . A expressão de Vpr tem sido mostrada por prevenir a ativação do complexo p34cdc2/ciclina B, o qual é um regulador do ciclo celular importante para a entrada na fase de mitose. De acordo com isso, a expressão de um mutante ativo de p34cdc2, constitutivamente, impede a multiplicação de células induzida por Vpr na fase G2 do ciclo celular.

A Vpr também tem sido mostrada por interagir com a proteína celular uracil-DNA glicosilase (UNG). As conseqüências biológicas desse fenômeno ainda tem de ser determinadas. Outra enzima envolvida com a modificação de desóxi-uracil (dUTP), desóxi-uracil fosfatase (dUTPase), é expressada por duas lentiviroses que não contêm o gene vpr: o vírus da anemia infecciosa eqüina e o vírus da imuno-deficiência felina. Acredita-se que a dUTPase esgota a dUTP dentro da célula assim impedindo as conseqüências nocivas da incorporação de dUTP no DNA viral.


[Obs.: OMIM 601266 dUTPase; 15q15-q21.1 : Desoxiuridina trifosfato nucleotideohidrolase (dUTPase) hidrolisa dUTP para formar dUMP e pirofosfato. Mutações na dUTPase de E.Coli levaram ao aumento dos níveis de dUTP e a níveis incomuns de incorporação de dUMP no DNA durante a replicação e reparo o que, por outro lado, causa a fragmentação do DNA e a morte celular (Lindahl, 1982; El-Hajj e outros, 1998). Possivelmente por esta razão, mutações nulas de dUTP em leveduras são letais. Uma segunda função de dUTPase é proporcionar dUMP para a síntese de timidilato (timidilato sintase é uma enzima que catalisa a conversão de desoxiuridina 5’- monofosfato em timidina 5’-monofosfato, em que o grupamento metil provém do N5,N10 – metilenotetraidrofolato.) Canman e outros (1992,1994) mostraram que níveis aumentados de de dUTPase em algumas linhagens de células cancerígenas contribuem para sua resistência ao inibidor de timidina sintase fluorodesoxiuridina (FUdR).

McIntosh e outros (1992) clonaram duas dUTP pirofosfatases funcionais a partir da expressão do cDNA de uma biblioteca por complementação genética em E.coli. Os dois cDNAs de diferentes tamanhos cada um contendo um único longo ORF (open reading frame: fase de leitura aberta) codificando um polipeptídeo de 141 aminoácidos com uma massa molecular calculada em 16.6 quilo-dáltons. A proteína humana compartilha 35% de homologia com a dUTPase de E.coli e 53% com a enzima do Saccharomyces cerevisiae. McIntosh e outros (1992) detectaram a expressão do gene de dUTPase numa variedade de tecidos.Devido a seu possível papel essencial na replicação do DNA, os autores sugeriram que quimioterápicos poderiam ser designados para alvejar a dUTPase em cânceres humanos. ]


Vpu

O polipeptídeo de 16 quilo-dáltons Vpu é uma fosfoproteína integral de membrana que está localizada primariamente no lado interno das membranas celulares. A Vpu é expressada a partir do mRNA que tamém codifica env. Vpu é traduzido a partir desse mRNA em níveis dez vezes mais baixos que Env porque o códon de iniciação da tradução de Vpu não é eficiente. As duas funções de Vpu, a modulação para menos de CD4 e o intensificação da liberação de vírions, podem ser geneticamente separadas.
Em células infectadas pelo HIV, complexos formam-se entre o receptor viral, CD4, e a proteína do envelope viral no retículo endoplasmático causando a captura de ambas as proteínas para dentro desse compartimento. A formação de complexos Env-CD4 intracelular interfere dessa forma com a reunião do vírion (Obs.:o RNA formado no núcleo para gerar novos vírions é transportado em partes e depois unido no citoplasma da célula para formar o vírion, seguindo-se a isso o empacotamento das fitas duplas de RNA no capsídio.) A Vpu libera o envelope viral pelo disparo da degradação de moléculas CD4 complexadas com Env mediado por ubiqüitina.
A Vpu também aumenta a liberação do HIV a partir da superfície de uma célula infectada. Na ausência de Vpu, um grande número de vírions pode ser visto colado à superfície de células infectadas.


Vif

A Vif é um polipeptídeo de 23 quilo-dáltons que é essencial para a replicação do HIV em linfóctos do sangue periférico, macrófagos, e certas linhagens celulares. Na maioria das linhagens celulares, a Vif não é requerida, sugerindo que essas células podem expressar uma proteína que pode complementar a função de Vif. Essas linhagens celulares são chamadas permissivas para Vif mutantes do HIV. Vírions gerados em células permissivas podem infectar células não permissivas porém os vírus produzidos subseqüentemente não são infecciosos.
Estudos complementares indicam que é possível restaurar a infectividade do HIV mutante em Vif por expressão de Vif em células produtoras, mas não em células alvo. Esses resultados indicam que Vif precisa estar presente durante a reunião (das seqüências de RNA que formarão o) do vírion. A Vif está incorporada dentro de vírions do HIV. Este fenômeno, entretanto, precisa ser não-específico pois a Vif também é incorporada dentro de retroviroses heterólogas tais como a virose da leucemia murina. Estudos produzindo HIV a partir de heterocárions (células contendo diversos núcleos no interior de um citoplasma comum, geralmente resultante da fusão artificial de duas células de espécies diferentes) geraradas pela fusão de células permissivas e não permissivas revelaram que as células não permissivas contém uma ocorrência natural de fatores anti-virais que é dominado por Vif. Sustentações adicionais para o modelo de que Vif está cointrariando um fator anti-viral celular chega através da observação de que proteínas de Vif de diferentes lentiviroses são específicas para espécies. Até o momento, a Vif do HIV pode modular a infectividade do HIV-2 e de SIV em células humanas enquanto a proteína Vif de SIV não funciona em células humanas. Essa observação sugere que fatores celulares, mais do que componentes virais, são alvejados por ação de Vif. As fitas de HIV defeituosas em Vif podem entrar nas células mas não podem sintetizar eficientemente o DNA pró-viral. Não está claro se o defeito de Vif afeta a transcrição reversa por si, o des-revestimento viral, ou a estabilidade geral do complexo de nucleoproteínas viral. Os vírions mutantes em Vif têm cernes de nucleoproteínas impropriamente compilados como foi revelado por análises de microscopia eletrônica.

Regulação da Expressão do Gene do HIV
A regulação da expressão do gene do HIV é completada por uma combinação de fatores celulares e virais. A expressão do gene do HIV é regulada em ambos os níveis transcricional e pós-transcricional. Os genes do HIV podem ser divididos em genes precoces de tardios. OS genes precoces, tat, ver, e nef, são expressados de maneira independente de Ver. Os mRNAs codificadores dos últimos genes, gag, pol, env, vpr, vpu e vif, requerem Rev de acordo a serem localizados citoplasmaticamente e expressados.

TRANSCRIÇÃO DO GENOMA PRÓ-VIRAL

A transcrição do HIV é mediada por um único promotor no LTR da extremidade 5’. A expressão a partir do LTR 5’ gera um transcrito primário de 9 quilo-dáltons que tem potencial para codificar todos os nove genes do HIV. O transcrito primário é grosseiramente mais curto que o pró-vírus em 600 bases. O transcrito primário pode ser submetido a splicing dentro de uma das mais de 30 espécies de mRNA ou compilado sem maior modificação em partículas virais (para servir como genoma viral em RNA)
Os LTRs são compostos de três sub-regiões designadas U3, R e U5. Essas regiões são nomeadas devido a sua localização dentro do transcrito primário do HIV. A região U3 (para uma única seqüência em 3’) está aproximadamente em 450 pares de base (bp) na lente (extensão) e é localizado no final 5’ de cada LTR. A região U3 contém a maioria dos elementos de ação cis em DNA, os quais são sítios de ligação para fatores de transcrição celulares. A região central de cada LTR contém a região de 100 pares de base R (de seqüências repetidas). A transcrição começa nas primeiras bases da região R e a poliadenilação ocorre imediatamente após a última base de R (a poliadenilação é a adição de adeninas na extremidade 3’ de um transcrito primário). A região U5 (para a seqüência única em 5’) está em 180 pares de base da lente e contém o sítio de ligação a Tat e seqüências compiladoras do HIV. O final 3’ de U5 é definido pela locação de um sítio de ligação de tRNA lysyl (tRNA do aminoácido lisina). O tRNA lysyl atua como um ponto de iniciação para a transcrição reversa.





REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO

O LTR doHIV contém sítios de ligação a DNA para vários fatores de transcrição celulares. As chaves entre os sítios de ligação ao DNA requeridas para a ativação da transcrição do pró-vírus do HIV são aquelas para a família NF-kappa B de fatores de transcrição. Dois sítios adjacentes a NF-kappa B estão presentes na região U3 do LTR do HIV-1. A proteína NF-kappa B permite ao vírus ser reativo à ao estado de ativação das células T infectadas. A estimulação do receptor de células T (TCR) causa a forma inativa de NF-kappa B, localizado no citoplasma, para ser translocado para dentro do núcleo onde induz a expressão de uma série de genes específicos de ativação das células T. A NF-kappa B e a subseqüente ativação da transcrição do HIV também pode ser induzida pelas citocinas fator de necrose tumoral alfa (TNF alfa) e interleucina-1 (IL-1). O LTR do HIV também contém sítios de ligação para os fatores de transcrição indutíveis NF-AT e AP-1. Lef e NF-At são todos fatores específicos de células T. Os sítios de ligação SP-1 são essenciais para o funcionamento do promotor do HIV.
A ativação inicial do LTR do HIV é uma conseqüência de fatores de transcrição celulares constitutivos e indutíveis. A ativação do LTR por fatores de transcrição celular leva primariamente a geração de transcritos curtos. Esses transcritos curtos são causados em parte por um elemento localizado a jussante a partir do sítio de iniciação da transcrição (mais para o lado 3’), conhecido com o indutor dos transcritos curtos (IST). Alguns transcritos completos, entretanto, são gerados e permitem a produção da proteína Tat. A proteína Tat então atua num papel chave na ativação de manutenção de altos níveis de transcrição a partir do DNA pró-viral.



PROCESSO DE SPLICING DE mRNA e LOCALIZAÇÃO CELULAR
O transcrito primário do HIV-1 contém múltiplos sítios doadores de Splice (Obs.:sítios de splice em 5’, um par de bases a GT é cortado no final de um éxon e início de um íntron, e levado até uma base A formando uma alça num sítio próximo a um par de bases AG contido neste íntron a jussante, no sentido 5’ para 3’; o par de bases AG é cortado e o íntron é removido do mRNA; todo o processo ocorre dentro dos spliceossomos, complexos de snRNP - pequenas ribonucleoproteínas nucleares que carregam snRNAs – pequenos RNAs nucleares) e aceptores (Obs.: sítios de Splice em 3’, onde se conclui a alça), os quais podem ser processados para produzir mais de 30 mRNAs alternativos. Muitos dos mRNAs são policistrônicos ; isto é, eles contém uma fase de leitura aberta de mais de uma proteína. Os mRNAs policistrônicos expressam tipicamente um único produto gênico. A escolha da fase de leitura aberta é governada pela eficiência do códon de iniciação e a proximidade do códon de iniciação ao final 5’ (por onde começa a leitura das seqüências na maioria dos casos). Os mRNAs do HIV-1 ocorrem em classes de três tamanhos:

1. RNA não processado por splicing: O transcrito primário de 9 quilo-bases não processado por splicing pode ser expressado para gerar as proteínas precursoras de Gag e Gag-Pol ou ser empacotados dentro de vírions servindo como RNA genômico.

2. RNA processado por splicing incompleto. Esses mRNAs usam os sítios doadores de splicing localizados mais perto do final 5’ do genoma de RNA do HIV em combinação com algum dos aceptores de splicing localizado na região central do vírus. Esses RNAs podem expressar potencialmente Env, Vif, Vpu, Vpr e a forma de Tat com um único éxon. Esses mRNAs heterogêneos têm o comprimento de 4 a 5 quilo-bases e retêm o segundo íntron do HIV.


3. RNA fartamente processado por splicing. Esses mRNAs são processados por splicing em ambos os íntrons do HIV e têm potencial para expressar Ver, Nef e a forma de Tat em dois éxons, Esses mRNAs heterogêneos não requerem a expressão da proteína Ver.
Normalmente, RNAs contend íntrons precisam ser completamente processados por splicing antes de que possam sair do núcleo. Essa regulação é essencial pois previne a translação de seqüências intrônicas contidas em mRNAs parcialmente processados por splicing. A proteína Rev liga-se aos RNAs virais e retém as seqüências intrônicas, e direciona sua exportação do núcleo. Essa exportação permite a RNAs virais não convencionais um desvio dos “pontos de controle” de splicing de RNA. Os mRNAs virais muito processados por splicing saem do núcleo usando a via de exportação seguida pela maioria dos mRNAs celulares. Níveis iniciais de Ver são necessários para a exportação de mRNAs do HIV que contêm íntrons, explicando por que aqueles codificam os produtos dos genes mais tardios. Em contraste, as proteínas codificadas pelos mRNAs fartamente spliceados, Nef, Tat, e Ver, podem ser produzidas imediatamente, e são então os primeiros produtos do gene viral.