Estrutura das Proteínas de Cobre

Adman ET Department of Biological Structure, University of Washington, Seattle 98115. Adv Protein Chem 42: 145-97 (1991)

A comparação estrutural das proteínas que contêm cobre tem proporcionado uma nova dimensão para os relacionamentos sugeridos por similaridade seqüencial. Ryden (1988) sumarizou o suposto relacionamento, sugerindo que um domínio de cupredoxina singular primordial evoluiu em oxidases de cobre de múltiplos domínios. As estruturas têm revelado o fato de que as diferenças residem primariamente em inserções e deleções nas junções entre elementos de estrutura secundária. O mecanismo da evolução (ou seja, a integração de novas sequências dentro de regiões não essenciais para a dobra em Chave grega) permanece desconhecida.

Quais das propriedades de um dobramento de cupredoxina são necessárias para a função é o objeto de estudos de mutagênese direcionada de sítio. Podem dois dos ligantes ser intercambiados (ou seja, a histidina a montante) e parcialmente respondidos pela estrutura de múltiplos domínios da oxidase de cobre? A sequência Tyr,Cys-Thr na plastocianina (na qual a treonina é um membro do par ligante a hidrogênio) é homóloga à sequência His-Cys-His na ascorbato oxidase. Nessa última, a transfência de elétrons acredita-se fluir do cobre de tipo I (ligado pela cisteína) para o conjunto trinuclear, provavelmente por via dos resíduos de histidina. Portanto, deve-se inferir que a tirosina e a treonina têm algum papel na transferência de elétrons.

[Obs.: Oxidação: é a perda de elétron;-Redução: é o ganho de elétron;-Agente oxidante: é a espécie química que provoca a oxidação(sofre redução);-Agente redutor: é a espécie química que provoca a redução(sofre oxidação).]

A tirosina 83 foi previamente implicada em estudos NMR como um sítio primário de transferência de elétron. As estruturas das proteínas de múltiplo cobre revelaram interessantes características novas. Os cobres extra são ligados na interface dos domínios, e podem ser metais singulares ou novos conjuntos tri-nucleares, dependendo da disponibilidade das histidinas ligantes. Um modelo estrutural da ceruloplasmina sugere que ela terá ao menos dois sítios de tipo I e, possivelmente, um terceiro sítio de tipo I como a stellacianina (não ligante a metionina), bem como um sítio de ligação para o conjunto trinuclear.

A similaridade das sequências de N2O redutase (óxido nítrico redutase) e de um domínio de citocromo oxidade para com as sequência de proteínas com estruturas conhecidas sugere que essas também terão domínios de Chave grega. A Galactose oxidade e a hemocianina não têm dobramentos de chave grega em seus domínios funcionais, embora cada um tenha um domínio de Chave Grega. A necessidade do dobramento em Chave grega permanece obscuro. As apoproteínas são claramente estáveis sem metais; existem exemplos outros, além das imunoglobulinas, do dobramento em Chave Grega. Até agora, o cobre parece ser encontrado em um subconjunto muito limitado de estruturas; o zinco e o ferro têm uma variedade muito mais ampla de ambientes na proteína. Pode ser que proteínas contendo Chave- Grega em cobre representem um nicho evolutivo muito pequeno.

O Papel da Micróglia e da Proteína Príon do Hospedeiro na Neurotoxidade de Um Fragmento da Proteína Prion

Brown DR; Schmidt B; Kretzschmar HA Institut fur Neuropathologie, Universitat Gottingen, Germany. Nature 380: 345-7 (1996)

[Obs.: Micróglia são pequenas células da neuroglia que podem tornar-se fagocíticas em áreas de lesão ou inflamação neural. Stedman.]

A proteína príon PrPc é uma glicoproteína de função desconhecida normalmente encontrada nos neurônios e na glia. [Obs.: células não neuronais, com funções metabólicas, interpostas entre os neurônios e os vasos sanguíneos que suprem sistema nervoso. No SNC, as células da oligodendróglia são os astrócitos, células ependimárias e as células da micróglia. As células satélites dos gânglios ao redor das fibras nervosas periféricas podem ser interpretadas como células da oligodendróglia do sistema nervoso periférico. Stedman.] Ela está envolvida em doenças como a encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca), scrapie (encefalopatia esponiforme do SNC transmissível de caprinos caracterizada por um período de incubação muito longo. Stedman) e doença de Creutzfeldt-Jakob.

[Omim 123400: A doença de Gerstmann-Strussler (GSD; 137440) e a insônia familial fatal (FFI; 600072) são duas outras doenças alélicas de príon herdadas causadas por mutação no gene PRNP.

Rosenthal e outros (1976) relatou uma família na qual 16 membros tinham doenças neurológicas oscilando de demência sub-crônica e aguda para várias anormalidades do sistema motor sem demência. A herança era autossômica dominante. Embora o probando tivesse típica doença de Creutzfeldt-Jakob com demonstração neuropatológica de encefalopatia espongiforme, uma primeira prima tinha demência crônica sem mudanças espongiformes. Ambos os pacientes tinham PAS positivo, placas de eosinófilos através do cérebro. Os autores sugeriram que a suscetibilidade para a doença neurológica nessa família foi herdada como um traço autossômico dominante.]

O PrPSc, uma isoforma alterada do PrPC que está associada com a doença, apresenta grande resistência a protease e é parte do agente infeccioso, o príon. As doenças derivadas de Príon são caracterizadas por degeneração neuronal, gliose e acumulação de PrPSc. Camundongos desprovidos de PrPC são resistentes à scrapie. Um framento da PrP humana consistindo dos aminoácidos de 106 a 126 que formam fibrilas ‘in vitro’ é tóxico para neurônios em cultura. Aqui nós mostramos que esse efeito tóxico requer a presença da microglia que responde ao PrP106-126 por aumento da sua produção de radical de oxigênio. Os efeitos combinados do PrP106-126 direto e mediados pela micróglia são tóxicos para neurônios normais mas são insuficientes para destruir neurônios de camundongos que não expressam PrPC.

A sequência do príon bovino, mostrando a repetição octapeptídica da área de ligação de cobre e o fragmento tóxico:

MVKSHIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKPGGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYP

Dissulfetos e Cisteínas no FVIII Humano

McMullen BA; Fujikawa K; Davie EW; Hedner U; Ezban M Department of Biochemistry, University of Washington, Seattle 98195, USA. Protein Sci 4: 740-6 (1995)

As localizações das ligações dissulfeto e das cisteínas livres nas cadeias pesada e leve do Fator VIII recombinante humano foram determinadas por análises seqüenciais de fragmentos produzidos por digestões químicas e enzimáticas. Os domínios A1 e A2 da cadeia pesada e o domínio A3 da cadeia leve contêm uma cisteína livre e duas ligações dissulfeto, enquanto os domínios C1 e C2 da cadeia leve têm somente uma ligação dissulfeto e nenhuma cisteína livre. As posições dessas ligações dissulfeto são conservadas no fator V e na ceruloplasmina exceto que a segunda ligação dissulfeto no domínio A3 está perdida em ambos o fator V e ceruloplasmina. As posições das três cisteínas livres no fator VIII são as mesmas de três das quatro cisteínas presentes na ceruloplasmina, entretanto, as posições das cisteínas livres no fator VIII e na ceruloplasmina não são conservadas no fator V.

Deficiência Hereditária da Ceruloplasmina com Hemossiderose [acúmulo de hemossiderina (proteína amarelo-ouro produzida pela digestão fagocítica da hematina {heme com ferro 3+} nos tecidos, particularmente no fígado e no baço]

Okamoto N; Wada S; Oga T; Kawabata Y; Baba Y; Habu D; Takeda Z; Wada Y Osaka Medical Center and Research Institute for Maternal and Child Health, Japan. Hum Genet 97: 755-8 (1996)

A deficiência hereditária da ceruloplasmina com hemossiderose (aceruloplasminemia) é uma nova doença caracterizada pela hemossiderose sistêmica, diabetes mellitus, anomalias neurológicas e degeneração do pigmento da retina. A perda da atividade de ferroxidase da ceruloplasmina resulta em deposição sistêmica de ferro e dano no tecido. Estudos de neuro-imagem revelam a deposição de ferro nos gânglios basais e em núcleos vermelhos e dentados. A ataxia do cerebelo (ausência total de oxigênio), sinais extrapiramidais (o sistema motor extrapiramidal é uma rede de nervos no cérebro cuja disfunção denota em sinais motores e sentimentais) e demência desenvolvem-se após a meia-idade.Análises da sequência do cDNA da ceruloplasmina a partir desse paciente revelaram uma inserção de adenina no éxon 3; isso produziu um sinal finalizador prematuro.

Expressão Celular da Ceruloplasmina nos Pulmões: Papel Anti-Oxidante

Yang F; Friedrichs WE; deGraffenried L; Herbert DC; Weaker FJ; Bowman BH; Coalson JJ Department of Cellular and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio 78284, USA.

A ceruloplasmina (CP) é um importante anti-oxidante extracelular e reciclador de radical livre. Embora CP seja expressada principalmente no fígado, estudos recentes identificaram os pulmões como outro sítio principal da síntese da CP. Os sítios e tipos celulares que são responsáveis pela expressão da CP nos pulmões do babuíno e do camundongo estão descritos. O mRNA da CP é detectado no epitélio brônquico em fetos de babuínos em sessenta dias de gestação e nas células do duto das glândulas submucosas. Em camundongos em desenvolvimento e maduros, os dados sugerem que as células da via respiratória são a maior fonte de CP no fluido dos pulmões e sustenta o papel crítico da ceruloplasmina na defesa do hospedeiro contra o dano oxidativo e a infecção nos pulmões.

O Papel da Ceruloplasmina na Oxidação do LDL por Células Monocíticas

Ehrenwald E; Fox PL Department of Cell Biology, Cleveland Clinic Research Institute, Ohio 44195, USA. A oxidação de lipídeos e lipoproteínas por macrófagos é um evento importante durante a aterogênese. A ativação de célula monocíticas por zimosan (carboidrato obtido das paredes celulares de leveduras que interfere com o complemento. Stedman) e outros agonistas (concorrentes) resulta na liberação de múltiplas espécies oxidantes e conseqüente oxidação do LDL. Agora nos mostramos evidência de que a ceruloplasmina, um reagente de fase aguda contendo cobre, é secretada por células monocíticas U937 ativadas por zimosan. Em uma abordagem, a ceruloplasmina mostrou exibir atividade oxidante sob condições apropriadas. A adição exógena de ceruloplasmina purificada humana simula a oxidação do LDL pela célula U937 quase na mesma extensão que a ativação pelo zimosan. Em contraste com experimentos prévios sem células, nos quais a ceruloplasmina por si mesma (em solução salina misturada com fosfato) oxida o LDL, sob as condições desse experimento (em meio de cultura celular RPMI 1640) a ceruloplasmina só oxidou a LDL na presença das células; o mecanismo pelo qual as células superaram a inibição por componentes do meio não foi verificado. Em suma, esses resultados são consistentes com um mecanismo no qual a ceruloplasmina derivada da célula participa na oxidação da LDL. Os dados também mostram que fatores celulares em adição à ceruloplasmina, possivelmente espécies de oxigênio ativo e/ou lipo-oxigenases, são essenciais e atuam sinergisticamente com a ceruloplasmina para oxidar o LDL.

Fonte: http://mad-cow.org/~tom/ceruloplasmin.html#Copper

INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL DOS DOMÍNIOS A DO FATOR V DE COAGULAÇÃO SANGUÍEA POR MODELAMENTO MOLECULAR


B. O. Villoutreix and B. Dahlbäck

RESUMO

O Fator V (FV) é um grande (2.196) cofactor não enzimático na cascata da coagulação com uma organização de domínios (A1-A2-B-A3-C1-C2) similar à do Fator VIII (FVIII). O FV é ativado a fator Va (FVa) pela trombina, a qual cliva fora o domínio B levando a uma estrutura heterodimérica composta da cadeia pesada (A1-A2) e da cadeia leva (A3-C1-C2). A proteína C ativada (APC), junto com seu co-fator proteína S (PS), inibe a cascata da coagulação por via de limitada proteólise do FVa e FVIIIa (a APC cliva o FVa nos resíduos R306, R506 e R579). Os domínios A dos fatores Va e VIIIa compartilham importante identidade de sequência com a proteína ligante de cobre, ceruloplasmina (CP). A estrutura em raio X da CP e os modelos teóricos para o FVIII foram relatados recentemente. Essa informação nos permitiu construir um modelo teórico (de 994 resíduos) para os domínios A dos FV/FVa humanos (resíduos de 1 a 656 e de 1546 a 1883). Análises estruturais do modelo FV indicam que: a) os três domínios A são arranjados de modo triangular como no caso da CP e a organização desses domínios deve permanecer essencialmente a mesma antes e depois da ativação; b) o íon de cobre de tipo II está localizado na interface A1-A3; c) os resíduos R306 e R506 (sítios de clivagem pela APC; R é arginina) são ambos expostos a solvente; d) os resíduos 1667 a 1765 dentro do domínio A3, esperados por interagirem com a membrana, são essencialmente cobertos/escondidos; e) a APC não se liga aos resíduos de 1865 a 1874 do fator FVa. Várias outras feições do fator V/Va, como as mutações R506Q e A221V; fator Xa (FXa) e clivagem pela elastase do neutrófilo humano (HNE); proteína S, protrombina e ligação de FXa também são investigados.

TEXTO

A cascata da coagulação envolve a ativação enzimática seqüencial dos zimogênios de protease de serina, com os co-fatores não enzimáticos, FV e FVIII, como elementos críticos. A trombina cliva a fbrinogênio para gerar a fibrina, o produto final da cascata, o qual estabiliza o coágulo hemostático. O FVa, a forma ativada do FV, serve como um co-fator dentro do complexo da protrombinase (PT), uma maquinaria multi-molecular que aumenta significativamente a geração de trombina. O FV é homólogo ao FVIII e ambas as deficiências de FV e FVIII podem levar a desordens de sangramento severas. O FV circula no sangue como uma glicoproteína de única cadeia de peso molecular 333.000 com pouca ou nenhuma atividade pró-coagulante. A estrutura primária do FV humano foi relatada, e começando pelo terminal N (amina), o FV consiste nos domínios A1, A2, B, A3, C1, e C2. Os domínios A têm cada um aproximadamente 310 resíduos, o domínio B tem aproximadamente 840 resíduos e cada domínio C tem aproximadamente 150 resíduos. O FV é clivado pela trombina no domínio B nas posições R709, R1018 e R1545 para dar surgimento ao co-fator ativo (FVa), o qual é composto de uma cadeia pesada (domínios A1 e A2 e um pequeno segmento do domínio B) e uma cadeia leve (domínios A3-C1-C2). As cadeias pesada e leve são ligadas não covalentemente na presença de íons divalentes de metal.

O complexo PT (protrombinase) consiste da protease de serina FXa, do cofator Va não enzimático, íons de cálcio, e uma superfície apropriada de fosfolipídeos. O Fator Va, dentro do complexo PT serve como um receptor de membrana para o Fator Xa, como um efetor que aumenta a atividade catalítica do FXa para a conversão da protrombina em trombina e como promotor da interação entre a protrpmbina e o complexo protrombinase. O complexo protrombinase é aproximadamente de 300.000 a 1.000.000 de vezes mais eficiente na ativação da protrombina do que o Fator Xa sozinho. O FXa liga-se fracamente ao FV intacto mas parece interagir com relativamente alta afinidade com as cadeias pesada e leve do FVa enquanto a protrombina liga-se somente à cadeia pesada do FVa. Sabe-se que a clivagem da APC na R506 do FVa reduz a afinidade do FVa para FXa sugerindo que a área do R506 tem contato com o FXa. A remoção dos resíduos de 683 a 709 do FVa resulta em diminuída interação do FXa com o FVa e reduz grandiosamente a atividade de co-fator do FVa. Ambos FV e FVa ligam-se com alta afinidade de modo independente do cálcio à membranas que contêm fosfolipídeos negativamente carregados. Tem sido proposto que os domínios C2 e A3 do Fva interagem através de forças iônicas e hidrofóicas, respectivamente, com a superfície da membrana.

A inativação proteolítica do FVa pela APC é uma das reações chave na regulação da formação de trombina. A atividade catalítica da APC é estimulada por um co-fator não enzimático, a proteína S (PS), e fosfolipídeos carregados negativamente. A APC cliva o FVa dentro da cadeia pesada em R306, R506 e R679. Deficiências nas proteínas C e S têm sido associadas com risco aumentado de trombose. Recentemente, Dahlbäck e outros (1993) relataram um novo fator genético de risco para a trombose que envolve uma única mutação pontual no gene FV levando à substituição do resíduo R506 para Q (R é arginina e Q é glutamina). Essa anormalidade do FV (FV-R506Q) é referida como resistente a APC e tem sido caracterizada adicionalmente por vários grupos. A APC foi proposta por interagir com a cadeia leve do FVa com contribuição potencial dos resíduos de 1865 a 1874 enquanto dos resíduos de 493 a 506 do FVa poderiam estar envolvidos na ligação da PS e do FXa. A clivagem da APC na R506 é inibida seletivamente pela presença do FXa enquanto a PS é considerada por contra-atuar na capacidade do FXa de proteger o FVa da clivagem pela APC. A PS parece aumentar a clivagem do FVa na R506 pela APC. A PS também tem uma atividade independente da APC já que inibe diretamente a ativação da protrombina através das interações com FVa e Xa.

Recentemente, uma função anticoagulante da o FV foi relatada. O FV intacto tem sido proposto como um co-fator sinergístico para o sistema PS-APC na degradação do FVIIIa. Tem sido sugerido que uma região do domínio B poderia estimular o inativação do FVIIIa pela APC. Varandi e outros (1996) têm mostrado que o FV-R506Q tem reduzida atividade de co-fator na degradação do FVIIIa quando comparado ao FV de tipo selvagem.

Os três domínios A dos fatores V e VIII são homólogos aos três domínios A da ceruloplasmina, a principal proteína de transporte para o cobre no plasma. Interessantemente, o FV e o FVIII também se ligam a íons de cobre. A ceruloplasmina humana é uma glicoproteína de cadeia singular de 1.046 resíduos de aminoácidos. Ela pertence à uma família de oxidases de cobre azul, com sub-unidades estruturais baseadas no domínio cupredoxina (centros de cobre nas proteínas com diferentes classificações e cores). O dobramendo da cupredoxina é em oito faixas de chave grega beta em forma de barrica que foi observada primeiramente na plastocianina (proteína com função redox e de transferência de elétrons, de cor azul e que difere entre algas, bactérias e eucariotos) e na azurina.

[Figura da azurina retirada do texto reproduzido parcialmente na observação ao final desta seção: ]

A instabilidade do FV e glicosilação heterogênea tem até agora estorvado seu estudo estrutural por cristalografia de raio X. Avanços recentes em química computacional combinada com análises de dados experimentais e clínicos previamente relatados podem proporcionar pistas da função da estrutura. No momento, modelos teóricos para o fator VIII foram recentemente relatados usando o método de construção de modelo comparativo bem estabilizado (Greer, 1990). Na presente investigação, um modelo para os domínios A do FV foi desenvolvido usando-se a estrutura da ceruloplasmina como um molde. Esse modelo permitiu-nos propor mecanismos moleculares para o ponto do complexo FV/FVa de preferência para interações e inativação pela APC.



[Obs1.:

Os centros de cobre nas proteínas foram inicialmente classificados em três tipos. A classificação era baseada principalmente em seus formatos espectroscópicos, particularmente aqueles em absorção eletrônica e espetro de ressonância paramagnética de eletron. Desde a classificação inicial, dois novos centros de cobre, CuA 5,6 and Cuz,7 foram descobertos e caracterizados. Suas estruturas únicas não pertencem a nenhum dos três tipos de centros de cobre e agora aqueles centros formam suas próprias classes.


As proteínas de cobre de tipo 1 são a classe de proteínas que deram origem à denominação de cupredoxinas. As proteínas de cobre de tipo 1 incluem ambas as proteínas com função conhecida de transferir elétrons (plastocianina e rusticianina), e proteínas cujas funções biológicas foram determinadas conclusivamente (stelacianina e plantacianina). Embora essas proteínas com funções desconhecidas não possam ser chamadas cupredoxinas por definição funcional estrita, elas têm sido classificadas como cupredoxinas pois compartilham a mesma estrutura geral de dobramento e sítios de ligação a metal das cupredoxinas. Em adição, muitas proteínas de múltiplos domínios como lacase, ascorbato oxidase e ceruloplasmina contêm múltiplos centros de metal, um dos quais é o cobre de tipo 1. Esses centros de cupredoxina também estão incluídos aqui. Finalmente, ambos os centros CuA na citocromo c oxidase (CCO) e na óxido nitroso redutase (N2OR), e o centro de cobre vermelho na nitrocianin serão discutidos nesse capítulo porque seus centros de metal são estruturalmente relacionados com o centro de cobre de tipo 1 e o domínio de proteína que contém ambos os centros compartilham o mesmo motivo geral das cupredoxinas. O centro CuA também funciona como um agente de transferência de elétrons. Como as ferredoxinas, as quais contém ambos os centros ferro-enxofre dinucleares ou tetanucleares, as cupredoxinas podem incluir tanto centros de cobre mononucleares ou dinucleares e seus sítios de ligação a metal.



As cupredoxinas discutidas neste capítulo compartilham uma estrutura de dobramento geralmente similar, comumente chamada a dobra da cupredoxina. É isto apesar do fato de a homologia seqüencial entre as cupredoxinas variar grandemente, algumas delas são menos que 10% homólogas entre si. O dobramento da cupredoxina é um exemplo do motivo estrutural da proteína chamado chave-grega barrilhada, que é um dos motivos estruturais de proteínas mais comuns compartilhado pelas metaloproteínas (tais como a superóxido dismutase e a hemocianina) bem como pelas não-metaloproteínas (tais como imunoglobulinas e piruvirato cinase). Uma chave-grega barrilhada consiste de seis ou oito fitas antiparalelas com uma ou mais conexões que atravessam o topo ou o fundo do barril, mais frequentemente saltando duas faixas de permeio. A topologia relembra o padrão de uma chave-grega. Os laços conectando faixas diferentes variam em lente e identidade de sequência. Eles também podem ser substituídos por hélices. A dobradura da cupredoxina difere do motivo típico de chave-grega barrilhada em que este contém duas faixas paralelas, entre a sua primeira e terceira faixas e entre a oitava e metade da segunda faixa. A segunda faixa paralela pode formar-se porque, nas cupredoxinas, a segunda faixa está sempre quebrada em duas pequenas fitas separadas de modo que a primeira metade é antiparalela à primeira enquanto a segunda é paralela à oitava. Os centros de cupredoxina sempre residem numa bolsa entre três laços conectando as faixas, com dois desses três laços proporcionando ligantes ao centro de cobre. A despeito da sua proximidade com a superfície da proteína, o centro de cupredoxina é completamente protegido de solventes, uma feição estrutural que é importante para sua função de trasferidor de elétrons pois isso contribui para reduzir a reorganização de energia na transferência de elétron.


Uma característica interessante das cupredoxinas é que os membros dessa família apresentam uma variedade de cores intensas e belas, do azul (plastocianina e azurina), ao verde (plantacianina e algumas nitrito redutases), ao vermelho (nitrosocianina), ao amarelo (alguns modelos de proteínas e compostos com cupredoxina), e ao púrpura (o centro CuA da citocromo c oxidase e da óxido nitroso redutase). Esse arco-íris de cores torna as cupredoxinas agradáveis de se trabalhar e desafiadoras para estudo.


Centros de Cobre Azuis em Enzimas Multicobres e de Múltiplos Domínios

O centro de cobre azul as cupredoxinas também é encontrado em enzimas multicobre e de múltiplos domínios tais como ascorbato oxidase (AO), laccase (Lc), ceruloplasmina humana (Cp), e uma sub-família de nitrito redutase contendo cobre. A nitrito redutase (NiR) catalisa a redução do nitrito (NO2) para óxido nítrico (NO), uma etapa do ciclo de denitrificação biológico. Dois tipos distintos de NiR são conhecidos: o NiR multiheme e o NiR multicobre. O NiR multicobre pode ser classificado adicionalmente como NiRs contendo centro de cobre verde e NiRs contendo centro de cobre azul. As enzimas AO, Lc, e Cp são oxidases que catalisam a redução de quatro elétrons do dióxigênio para água in vitro. O papel funcional preciso de cada uma das proteínas não foi determinado conclusivamente.

A NiR multicobre é um homotrímero, no qual cada monômero contém dois domínios. Por outro lado, a AO e a Lc contêm três domínios enquanto a Cp humana contém seis domínios. Cada domínio dessas enzimas tem uma dobra típica de cupredoxina. O centro de cobre azul reside no primeiro domínio da NiR, o terceiro domínio da AO e da Lc, e o segundo, quarto e sexto domínios da Cp humana. O centro de cobre azul no domínio 1 da NiR, domínio 3 da AO e nos domínios quatro e seis da Cp humana são quase similares ao da plastocianina consistindo de CuII(NHis)2SCysSMet em geometria tetraédrica nivelada. Enquanto a distância do CuII–S_(Met) é menor para o centro de cobre na NiR do que na pastocianina, as distâncias na AO e na Cp são em geral mais longas.


Além disso, a metionina axial ligante no domínio três da Lc e no domínio 2 da Cp é substituída por uma leucina. Essa substituição da metionina com um resíduo de leucina mais hidrofóbico pode ser parcialmente responsável pelos altos potenciais de redução da Lc do polyporus versicolor (um fungo de casca de árvore) bem como o domínio dois de cobre azul da ceruloplasmina humana. O potencial de redução no domínio 2 da ceruloplasmina humana é tão alto que ela está sempre na forma reduzida sob condições fisiológicas e não se espera que atue num papel na função de enzima. Com exceção desse centro redox inativo, outros centros de cobre em oxidases multicobre funcionam por transferência de elétrons a partir de parceiros fisiológicos das oxidases para os centros de cobre trinucleares onde as reações de oxidases têm lugar.

“Electron Transfer: Cupredoxins “ Y. U http://montypython.scs.uiuc.edu/papers/08172_final.pdf - 861 KB,
Obs.: http://www.freepatentsonline.com/7511117.html ]

Fonte: Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2144041/?tool=pubmed

INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL DOS DOMÍNIOS A DO FATOR V DE COAGULAÇÃO SANGUÍEA POR MODELAMENTO MOLECULAR

(Continuação)

B. O. Villoutreix and B. Dahlbäck

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A estrutura da ceruloplasmina humana tem sido desvendada e foi encontrado que seus três domínios A estão arranjados de maneira triangular com cada domínio feito de duas dobras de tipo cupredoxina. Investigações em microscopia eletrônica (EM) têm sido descritas para FV/FVa e FV/FVa ligado a membrana mas uma estrutura em terceira dimensão com resolução atômica foi necessária para compreender mais além as funções de co-fator essenciais do FV/FVa e inativação.

VALIDAÇÃO DO MODELO

A estrutura geral do modelo do FV mostra as características básicas de dobras de tipo cupredoxina. Assim, cada domínio A é feito essencialmente de dois barrilhetes beta. O presente modelo (domínios A1, A2 e A3) pertence a um compartimento de 65 X 75 X 85 Å ( 1 Å = 0,1 nanômetros). Quando desprezado o eixo de três dobras, os três domínios A poderiam encaixar-se em um círculo com diâmetro de aproximadamente 80 a 90 Å. Os três módulos foram testados interativamente e suas estruturas em três dimensões bem como a distribuição dos resíduos hidrofóbicos, polares e carregados foram encontrados de acordo com o padrão do raio X e as características da estrutura da proteína foram conhecidas. No momento, os resíduos que se esperava como carregados em pH neutro são expostos a solvente, ou, se ocultados, envolvidos em interações iônicas e/ou ligação de hidrogênio. Nenhuma divergência estérica severa foi notada durante o processo de modelagem dos domínios A indviduais nem nas interfaces, endossando a qualidade da estrutura.

No modelo de FV todas as inserções/deleções em comparação com a ceruloplasmina são áreas expostas a solvente e estruturas em laço. Sabe-se bem que as estruturas em laço e as inserções são mais difíceis de prever. Longos laços também tendem à flexibilidade, e estruturas de alta resolução são raramente obtidas experimentalmente para essas regiões de uma proteína. Na presença do modelo FV, as áreas mais difíceis de modelar envolveram aproximadamente 40 resíduos fora dos 994 (dos domínios A em estudo) e compreende as regiões dos resíduos 302 a 317, 442 a 446, 1659 a 1673, e 1727 a 1736. A inserção 302 a 317 pode ser construída como um laço estendido ou poderia ter como apresentado aqui, vários resíduos em conformação helicoidal como previsto usando sistemas de rede de trabalho de Perfil de agente neural de Heidelberg. Este segmento contém oito resíduos positivamente carregados e um ácido glutâmico e deveria, assim, ser essencialmente exposto a solvente. Todos esses resíduos carregados nessa região estão expostos a solvente, sugerindo que a conformação selecionada é de razoável precisão. Tal estrutura em hélice poderia ser de fato de importância funcional. Com a conformação selecionada, as regiões dos resíduos de 442 a 446 e de 1658 a 1673 mostram contato favorável com partes remanescentes da proteína ou são expostas apropriadamente a solvente. Na CP, o segmento correspondente aos resíduos de 1727 a 1736 do FV foram perdidos da coluna coordenada mas foram relativamente fáceis de construir.

As pontes dissulfeto têm sido relatadas a respeito da cadeia pesada do FV bovino. Elas estão conservadas na estrutura da CP e correspondem àquelas propostas na figura 1 (C139-C165, C220-C301, C472-C498, C575-C656, C1697-C1723) como encontrado após as análises dos modelos. Tomadas juntos, as observações acima sugerem fortemente que o modelo do FV está correto.

SÍTIO DE LIGAÇÃO A COBRE

Os íons de metal das oxidases azuis (ex.: ceruloplasmina) são divididos em três tipos distinguíveis por espetroscopia, aos quais se refere como de Tipo I (cobre “azul”, com intensa absorção óptica por volta de 600nm), de Tipo II (sem absorção visível) e de Tipo III (absorção de 330 nm). Seis átomos de cobre foram identificados na estrutura cristalina da CP. Três íons de cobre ocupam centros mononucleares enquanto os três íons remanescentes formam um conjunto trinuclear. Na CP, existem três sítios de ligação a cobre de tipo I, dois de tipo III e uma de tipo II. Sabe-se que o FVIII contém um íon de cobre por molécula. Tagliavacca e outros (1997) descobriram depois de experimentos de mutagênese do sítio que o íon de cobre liga-se preferencialmente ao sítio de Tipo I (presente na CP) envolvendo no mínimo o C310 (cisteína 310) do FVIII (C319 na CP e S282 no FV (S é serina)) no domínio A1. Esses autores também mostraram que a ligação do cobre nesses sítios é importante para o dobramento do domínio, para a associação apropriada das subunidades e para a atividade do FVIII/FVIIIa. Baseados nesses dados, nós investigamos o modelo do FVIII e encontramos facilmente o sítio de ligação a cobre proposto experimentalmente. Isso sustenta a precisão da estrutura do FVIII e o fato da ceruloplasmina poder ser usada de modo exato como modelo dos domínios A do FVIII e do FV.

O FV e o FVa bovinos mostraram-se ligar a íons de cobre não tipo I e não tipo III por absorção atômica e espectroscopia de emissão. Além disso, tem –se sugerido que o íon de cobre no FVIII é ligante de diferentes resíduos mais do que o íon de cobre do FV. De fato, quando comparadas as sequências do modelo do FV humano e do FV bovino com a estrutura em raio X da ceruloplasmina, somente um sítio de ligação de cobre está conservado e corresponde ao cobre de tipo II da ceruloplasmina, o qual envolve a H101 (histidina) e H978, enquanto na ceruloplasmina a Y107 (tirosina) e S102 (serina), indiretamente envolvidas na ligação do cobre, são respectivamente a Y91 e a P86 (prolina) do FV. O suspeito sítio de ligação de cobre no modelo do FV é consistente com o estudo relatado por Mann e outros (1984). Um íon de cobre, em ambos o FV e FVIII, poderia contribuir para a estabilidade da estrutura do domínio e para a interface A1/A3.

SÍTIO DE LIGAÇÃO A CÁLCIO

Sabe-se que o cálcio liga-se ao FV bovino e humano e que nem a cadeia pesada, nem a leve sozinhas exibem afinidade significativa para com esse íon de metal. No modelo do FV, uma bolsa de ligação a cálcio pôde envolver todos ou alguns dos seguintes resíduos na interface A1-A3 (perto do sítio de ligação a cobre): E96 (ácido glutâmico), D102 (ácido aspártico), E108, D111, D112. Esses resíduos negativamente carregados são essencialmente conservados nas sequências do FV, da CP e do FVIII bovinas. Entretanto, outras regiões não podem ser elencadas com a informação disponível no presente.

PATOLOGIA BIOESTRUTURAL

A ocorrência da para-hemofilia (deficiência de FV) é pouca, em contraste com a hemofilia A (deficiência do FVIII). Duas mutações nos módulos A do FV foram relatadas até agora. Uma envolvia a substituição A221V no domínio A1 e a segunda , a substituição R506Q dentro do domínio A2.

O plasma de pacientes com a substituição A221V teve reduzidos níveis de antígeno FV e reduzida atividade. A alanina 221 está localizada em um laço e é exposta a solvente, assim, sua substituição por uma valina poderia ser tolerada. No alinhamento de múltiplas sequências apresentado por Pemberton e outros (1997), pode-se ver que essa alanina está conservada na ceruloplasmina e no FV mas é substituída por histidina no FVIII. O problema estrutural potencial devido à substituição de A por V poderia ser a perturbação da ponte de sal parcialmente encoberta entre K304 e E275 e/ou choques estéricos direcionados com E275 e/ou perda da ligação dissulfeto C220-C301. Entretanto, baseados nas análises estruturais do modelo, a ocorrência dessas mutações naturais podem não ser a razão para o fenótipo observado. Seria de interesse explorar suplementarmente o papel dessas mutações “in vitro”.

A arginina 506 está acessível ao solvente e localizada no topo (ponta) de um laço. Ela pode ter uma interação iônica com D504. A mutação R506Q pôde induzir algumas ligeiras mudanças conformacionais mas serão essencialmente desfavoráveis para a interação com a APC em D189 (limitante do número de quimio-tripsinogênio, veja Mather e outros, 1996), localizada na base de especificidade da bolsa. O FV intacto tem sido mostrado como um co-fator, junto com a OS, na inativação do FVIIIa pela APC, enquanto a proteína FV R506Q parece ser muito menos efetiva como um co-fator da APC durante este processo. Quatro hipóteses podem ser geradas aqui: 1) a área R506 liga-se à APC em uma região localizada fora do sítio ativo da enzima, 2) a clivagem da APC na R506 é necessária para a atividade anticoagulante do FV, 3) a área R506 interage com a proteína S, e 4) a área R506 interage com FVIIIa.

LIGAÇÃO A MEMBRANA

U FV recombinante sem o domíno C2 perdeu sua capacidade de ligação à membrana. O FVa também pôde interagir com a superfície fosfolípide por via do domínio A3. Os resíduos FVa bovinos de 1654 a 1752 (1667 a 1765 nos humanos), no domínio A3, poderia ser importante para a interação com fosfolipídeos neutros. Após as análises do modelo de FV, pode ser visto que a maioria desses resíduos do A3 estão escondidos do solvente e pertencem ao cerne hidrofóbico da proteína. Tal peptídeo hidrofóbico poderia interagir com os fosfolipídeos neutros mas por caminho não fisiológico. Os aminoácidos expostos a solvente no modelo de FV pertencentes ao segmento peptídico de 1667 a 1765 exigem aproximadamente K1667 (lisina) a Y1678 (tirosina), Q1724 (glutamina) a E740 (ácido glutâmico) e E1757 a R1765 (arginina). A região de 1724 a 1740 está perto de M1883 e possivelmente perto do domínio C2. Assim, se o domínio A3 do FV se liga à membrana, a região mais aceitável envolve apenas os resíduos de 1724 a 1740, enquanto a região em volta dos resíduos R1765 e T1767 (treonina) não deveriam estar envolvidos nesse processo já que esses resíduos são acessíveis ao FXa e à clivagem pela elastase do neutrófilo humana, respectivamente, na presença de fosfolipídeos. A região dos resíduos de 1667 a 1678 contêm principalmente aminoácidos carregados e não é consistente com o fato de as forças hidrofóbicas terem sido mostradas como essenciais para a interação peptídeo-membrana. Baseados nas análises estruturais do modelo do FV, nós sugerimos que somente o C2 (e possivelmente o domínio C1) interage com a membrana. Os dois domínios C serviriam, em parte, como espaçadores/separadores, posicionando os domínios A na distância apropriada do plano da membrana para a atividade funcional ótima. Tal hipótese é consistente com a representação esquemática da ligação do FVa à membrana, como mostrado pelo estudo de EM (microscopia eletrônica) (Stoylova e outros, 1994) ou investigação em EM de Lampe e outros (1984), que apontam que os componentes da cadeia leve (A3-C1-C2) do FVa ligados à superfície da membrana parecem estar em grande parte externamente aos fosfolipídeos.

Foi relatado que a cadeia pesada do FVa pode ter contato direto com fosfolipídeos neutros e que essa interação não é de natureza iônica. Após análises estruturais dos domínios A, nós sugerimos que a partida do domínio A3 de sua organização triangular dentro da estrutura A1-A2-A3 leva à exposição de cadeias laterais hidrofóbicas que são escondidas nas faces internas de A1-A3 e A2-A3. Após a inativação do FV/FVa pela APC, a interação dos domínios A com a membrana, entretanto, poderiam ser de importância fisiológica.

SÍTIO DE LIGAÇÃO DO FATOR Xa COM PROTEÍNA S

Foi relatado que a PS e o FXa poderiam interagir com os resíduos de 493 a 506 do FVa. Neste peptídeo , os resíduos K499, S500, D504, R505 e R506 estão expostos a solvente no modelo. Interessantemente, a remoção dos resíduos de 683 a 709 do FVa ou a clivagem em R506 pela APC resulta em diminuída interação entre FXa e FVa. Esses dados são consistentes pois a localização dessas duas regiões poderia estar relativamente próxima no espaço (possivelmente entre 10 e 20 Å). Os resíduos de 499 a 506 poderiam interagir com FXa, e esse resultado poderia explicar o efeito protetor do FXa observado na clivagem em R506 pela APC. Interessantemente, os resíduos de 558 a 565 e de 1811 a 1818 do FVIII foram propostos por interagirem com o fator IXa. Os segmentos equivalentes no FV envolvem os resíduos de 502 a 509 e de 1677 a 1682, respectivamente, e a maioria deles é exposta a solvente.

Também foi sugerido que os resíduos de 507 a 520 poderiam estar envolvidos na ligação do FXa. Os resíduos I508 (isoleucina), R510, A511, D513, I514 e E515 são expostos a solvente e poderiam assim ter contato com o FXa. O fato de que o FXa liga-se com dificuldade ao FV intacto e os dados acima sugerem que o domínio B poderia ter contato direto ou indireto com as regiões ao redor de R506.

Dois anticorpos monoclonais dirigidos tanto contra os domínios A1 ou A3 do F inibiram a interação FVa-FXa. Tendo sido proposto que a cadeia leve do FVa ligada à membrana não interage com o FXa, informações adicionais são necessárias de acordo a determinar se os anticorpos reconheceram o sítio de ligação do FXa na superfície do FVa ou se eles inibiram a interação FXa-FVa devido a estorvo estérico. Desde após a inativação do FVa pela APC, o domínio A2 dissocia-se, e, porque nesta situação o FV remanescente não se liga a FXa, é aceitável que áreas chave para contato entre o FVa e o FXa envolvem o domínio A2. Tal hipótese poderia ser investigada em futuro próximo desde que um modelo da estrutura do FXa tenha sido relatado.

Sabe-se que a PS estimula a clivagem do FVa em R306 pela APC e que a PS induz a realocação do sítio ativo da APC a 10 Å de proximidade da superfície da membrana. A distância entre a R306 e a R506 na estrutura modelo é de 35 Å. Entretanto, ainda é muito difícil a visualização do mecanismo exato de ação da PS a partir desses dados. Por outro lado, a PS poderia ligar-se aos resíduos de 499 a 506 e poderia assim contra-atuar o efeito protetor do FXa quanto à clivagem da APC na R506 e orientar a APC para a clivagem ótima na R306. Por outro lado, se a PS liga-se aos resíduos de 499 a 506 do FVa, isso poderia proteger ou afetar significativamente a clivagem na R506, ao mesmo tempo parece que a PS não atua num papel neste sito.

SÍTIOS DE LIGAÇÃO DA PROTROMBINA

A protrombina forma um complexo 1:1 com a cadeia pesada do FVa. Essa interação é de moderada afinidade e independente de cálcio na ausência da superfície de membrana. Entretanto o domínio Gla da protrombina atua num papel na interação protrombina FVa quando os fosfolipídios estão presentes. Após a inativação do FVa pela APC, o domínio A2 dissocia-se e a ligação à protrombina é perdida. Porque dentro do complexo protrombinase (FXa + FVa + fosfolipídeo) o FVa está parcialmente protegido da clivagem pela APC, porém para o sítio R306 e desde que o FXa proteja a clivagem da APC na R506, nós sugerimos que a protrombina tenha interação direta com o domínio A2 do FVa, em áreas margeando a R506 mas diferentes do sítio de ligação do FXa. Possivelmente, como no caso da ligação do FXa, os resíduos de 683 a 709 do FVa poderiam atuar num papel na interação com a protrombina.

O FATOR Xa E AS CLIVAGENS DA ELASTASE DO NEUTRÓFILO

A única clivagem do FXa que pôde ser investigada com o presente modelo de estrutura envolve o resíduo R1765 do FV humano. Esse resíduo é exposto a solvente e tendo sido os experimentos realizados na presença de fosfolipídeos, essa região poderia estar a 80Å da superfície da membrana. A elastase do neutrófilo humana cliva o FVa em A341, I508 e T1767. Esses três sítios de clivagem não são influenciados pela presença de fosfolipídeos, indicando que essas regiões estão localizadas fora da área de ligação a membrana. Esses três resíduos foram achados em laços expostos a solvente no modelo de FV. Esses dados também sustentam a acuidade do modelo da estrutura do FV.

OS SÍTIOS DE LIGAÇÃO DA PROTEÍNA C ATIVADA E A INATIVAÇÃO DO FV/FVa

A APC parece ligar-se à cadeia leve do FVa por via de um sítio que abrange os resíduos de 1865 a 1874 do FVa. Esses resíduos, entretanto, estão em sua maior parte escondidos dentro do cerne da proteína. Esse peptídeo, considerado inibidor da inativação do FVa pela APC, deveria assim atuar de modo não fisiológico.

O FVa é clivado pela APC nos resíduos R306, R506 e R679 (Kalafatis e outros, 1994b). Esses autores sugeriram que a clivagem pela APC do FVa ligado à membrana na R506 promove a clivagem na R306 e na R679, mas Nicolaes e outros (1995) mostraram que clivagem anterior na R506 não é requerida para a clivagem na R306 após estudos da proteína R506Q. O papel fisiológico da clivagem da APC no resíduo R679 não está bem definido por contraste com as clivagens nas R306 e R506. No momento, Egan e outros (1997) relataram que a clivagem da APC na R679 não contribui para a inativação do FVa. A taxa de clivagem da APC na R506 é aproximadamente 20 vezes mais alta do que na R306. Em adição, como descrito acima, o FXa parece proteger o FVa da clivagem na R506 enquanto a PS tem sido sugerida como intensificadora da clivagem da APC na R306. Também foi relatado que a clivagem do FVa pela APC leva à dissociação do domínio A2, o que então resulta no fator Va intermediário sem atividade. Essa última reação pareceria a dissociação espontânea do domínio A2 do FVIIIa que se segue à ativação pela trombina. [Obs.: Tanto a trombina quanto o fator Xa (FXa) ativam o FV. A ativação está associada à remoção do domínio B da parte remanescente do FV que constitui o FVa. O FVa é composto de uma cadeia pesada de 105 quilodáltons (A1-A2) e de uma cadeia leve de 71/74 quilodáltons (A3-C1-C2), sendo as duas cadeias presas por ligações não covalentes dependentes de cálcio. O FVa é um co-fator da protease de serina FXa, a qual, na presença de íons de cálcio e de uma superfície de membrana fosfolípide (PL) apropriada , intensifica a ativação da protrombina em trombina por várias ordens de magnitude. O complexo FXa-FVa-PL é chamado de complexo protrombinase. O FVIII ativado (FVIII) tem uma função homóloga à do FVa, servindo como um co-fator no complexo tenase (FVIII + FIX) para a enzima fator IXa (FIXa) na ativação do fator X (FX). PMID 12714495 – O FV e o FX ativam a trombina e o FVIII e o FXI ativam o FX.] Finalmente, o FV intacto ligado à membrana parece ser clivado lenta e sequencialmente pela APC nos resíduos R306, R506, R679 e K994. Tais informações sugeririam que ao menos a R506 e a R679 estão direta ou indiretamente protegidas pelo domínio B.

No presente modelo de estrutura, somente a R306 e a R506 do FV podem sem investigadas. A R306 é exposta a solvente e poderia estar localizada dentro de um segmento helicoidal distorcido entre os domínios A1 e A2 ou em uma estrutura em laço mais facilmente flexível. De fato, esse segmento pode submeter-se a mudanças em sua conformação e adotar ambas as conformações, como no caso do laço reativo de serpina. Em todas as situações, os rearranjos estruturais importantes seriam requeridos para a apropriada ancoragem na fenda do sítio ativo da APC. Como mencionado acima, a estrutura secundária prevista indicou que o segmento R306 poderia estar em conformação helicoidal. Tal estrutura de fita seria consistente com o fato de que, após a clivagem pela APC, o domínio A2 se dissocia. A clivagem do peptídio liado em R306 poderia assim liberar energia e promover a dissociação do domínio A2. Entretanto, o R306 deveria estar todo o tempo acessível à APC e a clivagem em R506 não necessária para ganho de acesso à ligação peptídica 306-307 enquanto, todavia, alguma mudança na conformação após a clivagem em R506 poderia facilitar a clivagem em R306. A arginina 306 tem em sua vizinhança direta vários resíduos positivamente carregados (FV resíduos K299, K303, K309, K310, R313) não diretamente contrabalançados por outros negativamente carregados que pudessem atuar num papel durante a clivagem e ligação da APC.

A R506 é exposta a solvente e pode encaixar-se facilmente para dentro da bolsa específica da APC mas alguns rearranjos de conformação no local seriam necessários, a partir de aproximadamente os resíduos P5-P3 e P2’-P5’ , de modo a igualar-se à estrutura canônica necessária para a ótima interação substrato da protease de serina/ inibidor. Os resíduos P2P1P1’ adotam realmente a conformação canônica no presente modelo, e assim, em contraste com o segmento R306, o peptídeo R506 dentro da estrutura nativa do FV/FVa parece mais apropriado para a interação com a fenda do sítio ativo da APC. Vários resíduos descompensadamente positivamente carregados são encontrados na vizinhança direta da R506. Esses envolvem a R316, R320, R400, R501, R505 e R510. O resíduo 506 está localizado entre duas barricas beta dentro do domínio A2, assim, após a clivagem na R506, as mudanças conformacionais são prováveis de ocorrer e poderiam explicar, em parte, a perda de ligação a FXa.

Interessantemente, o FVIIIa é clivado pela APC na R336 e na R562, e esses resíduos são homólogos aos R306 e R506 do FVa respectiamente. Trabalhos suplementares poderiam envolver a comparação dos modelos estruturais do FV e do FVIII junto com a ancoragem da estrutura APC em raio X em seus respectivos sítios de clivagem.

DO FATOR V AO FATOR Va

Investigações em microscopia eletrônica têm-se reportado ao FV, FVa e FVa ligado à membrana. O FVa foi visto como um composto de dois domínios, cada um tendo um diâmetro de aproximadamente 80 Å. O diâmetro geral do presente modelo do FV, quando despreza os pseudo eixos de três dobras, é de aproximadamente 80 a 90 Å. É possível que os três domínios A representem uma das duas esferas vistas no estudo de microscopia eletrônica. Os dois domínios C intoxicando os domínios A de aproximadamente 80 Å com respeito à superfície de membrana poderiam ser consistentes com o diagrama esquemático feito por Lampe e outros (1994). Isso também é possível de acordo com a distância esperada de 70 a 90 Å entre o plano da membrana e a fenda do sítio ativo de proteases como avaliado por transferência de energia fluorescente.
Mosesson e outros (1990) propuseram que o FV intacto tem uma forma retangular/alongada irregular de aproximadamente 100 a 200 Å que ostenta nenhum rearranjo estrutural principal após a liberação do domínio B. A ausência de rearranjo conformacional estaria consistente com o presente modelo de estrutura. Fowler e outros (1990) e Mosesson e outros (1990) sugeriram que as cadeias pesada e leve do FVa formam uma estrutura globular, enquanto o domínio B tem uma estrutura parecida com uma haste estendida projetando-se para fora da estrutura globular do FV intacto. Junto ao fato de que o domínio B tem vinte e cinco sítios em potencial para glicosilação em N e de que várias regiões são sensíveis à proteases, esses dados sugerem que esse domínio deveria tem contato extensivo com o solvente. Foi relatado após medição de transferência de energia de fluorescência para o FVIII intacto que a distância entre os resíduos C528 (domínio A2) e C1858 (domínio A3) está aproximada em 20 Å (de 25 a 30 Å no modelo da estrutura do FVIII). Essa informação também sugere que os domínios A estão em estreito contato antes da ativação.

Esses dados, juntos com o fato de que o FV e o FVa ligam íons de core igualmente bem, e o estudo do presente modelo, sugerem que, após a ativação pela trombina, o domínio B do FV é removido enquanto os três domínios A permanecem em estreito contato. Devido: ao FV intacto ter reduzida afinidade com o FXa, um sítio de ligação do FXa na superfície do FVa dever estar localizado próximo à R506, a APC catalisar o FV intacto bem lentamente, o FV e o FVa terem essencialmente a mesma afinidade para a superfície fosfolípide apropriada, o domínio C2 liga-se à membrana, ao menos a clivagem do FV intacto na R306 pela APC ser dependente de fosfolipídeo, a área da R1765 e da T1767 não estar em contato com o plano da membrana, os resíduos R306, R506 e R1765 terem que ter aproximadamente 80 Å de distância da membrana, e à possibilidade do domínio A3 inteiro não ter interação direta com os fosfolipídeos, nós sugerimos que somente o domínio C2 poderia interagir com a membrana enquanto o domínio B poderia cobrir parcialmente a região da R506 porém deixar a região da R306 mais exposta.

CONCLUSÕES

A qualidade do presente modelo estrutural do FV/FVa é fortemente sustentada já que o trabalho teórico é um grande acordo com os dados experimentais. Numerosas características estruturais e funcionais do FV/FVa foram analisadas e novos experimentos podem ser projetados com base nesse modelo estrutural.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2144041/?tool=pubmed

A ATIVAÇÃO DA HEMINA MELHORA A INFECÇÃO POR HIV-1 POR VIA DA INDUÇÃO DA HEME OXYGENASE

Krishnakumar Devadas and Subhash Dhawan

RESUMO

A Hemina [cloreto do heme em que o Fe2+ transformou-se em o Fe3+ , cloro-hemina. Stedman] , um componente critico da hemoglobina, é um ingrediente ativo de uma terapêutica biológica aprovada pela Administração de Alimentos e Medicamentos para o tratamento da porfíria [Obs.: A ferroquelatase, ou heme sintase (18q21.3), a enzima terminal da via da biosíntese do heme, catalisa a inserção do ferro na protoporfirina para formar o heme (omim 612386). A porfíria é um grupo de distúrbios envolvendo a biossíntese do heme, caracterizado pela excreção excessiva de porfirina ou seus precursores; a porfina é o núcleo básico não substituído das porfirinas]. Essa matéria descreve uma função biológica dessa molécula na indução da defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV-1 pela via da indução da heme oxigenase-1 (HO-1). O tratamento de monócitos com hemina inibiu substancialmente a replicação do HIV, como evidenciado pelo RNA viral quase indetectável e células livres da proteína p24 do HIV-1 de maneira dependente da dose. A exposição dessas células à hemina antes da infecção, no momento da infecção ou após a infecção causou uma redução de 90% no DNA do HIV com níveis significativamente baixos da p24 do HIV-1 e efeitos citopáticos associados ao HIV. Além disso, o tratamento com hemina suprimiu significativamente a infecção de monócitos e células T inoculadas com as linhagens com tropismo para R5, X4 e R5X4 (R5 deve ser CCR5 e X4 deve ser CXCR4), e de outros HIV isolados com transcriptase reversa resistente, resistência a azidothymidina (AZT), resistência a ddC/ddl, resistência a nivirapine, e outros. A administração intraperitoneal (peritôneo é uma membrana que recobre a parede abdominal e as vísceras) da hemina por quatro dias pós a infecção por HIV reduziu em seis vezes a carga viral no soro de camundongos SCID diabéticos não obesos reconstituído com células mononucleares do sangue periférico humanas. A supressão da replicação do HIV em células ativadas com hemina foi correlacionada com a indução da HO-1 e foi atenuada por tin protoporfirina (SnPP) IX, um inibidor da atividade da HO-1, sugerindo um papel central dessa enzima endógena na regulação da infecção pelo HIV. A indução da HO-1 induzida pela hemina nas células GHOST co-expressando CCR5, CXCR4 e CD4 foi consistente com a inibição da ativação do promotor do longo terminal de repetição (LTR) dependente de Tat levando à reduzida expressão de GFP. Esses achados sugerem um papel importante da atividade da HO-1 induzida pela hemina como um mecanismo de defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV-1.

INTRODUÇÃO

A hemina é a metade protética para um grande número do proteínas que atuam em papéis essenciais no transporte de oxigênio, função mitocondrial, e uma variedade de vias de transduções de sinais. Ela sobre-regula a heme oxigenase-1 (HO-1), uma enzima intracelular que catalisa a etapa inicial e de limitação da taxa da degradação oxidativa do heme, e gera biliverdina, ferro livre (Fe2+), e monóxido de carbono (CO). Ao longo das décadas passadas, investigações sobre o papel funcional da atividade da HO-1 aumentaram grandiosamente nossa compreensão sobre esta enzima como um mecanismo de defesa celular contra condições relacionadas ao estresse e outras condições patogênicas. Os efeitos benéficos da HO-1 também têm sido relatados em uma variedade de respostas imunes e na inflamação. Em desordens inflamatórias auto-imunes experimentais, tais como a encefalomielite e a colite, as funções protetoras da HO-1 têm-se mostrado associadas com a ativação do sistema imune.

Em adição às condições relacionadas com respostas imunes e inflamatórias, o ciclo de vida do HIV-1 está intimamente associado com a ativação do estado de suas células hospedeiras. A infecção pelo HIV-1 é dependente de uma variedade de fatores do hospedeiro para entrada, transcrição e expressão dos genes virais e é controlada por citocinas e pela maquinaria transcricional do hospedeiro. Embora numerosas reportagens publicadas prévia e recentemente tenham demonstrado múltiplas ações proeminentes da indução da HO-1 em vários processos inflamatórios, seu papel na regulação da infecção pelo HIV-1 não é conhecida. O presente estudo investigou o papel da HO-1 induzida pela hemina como um possível fator de proteção contra a infecção pelo HIV-1. Os achados deste estudo demonstram que o aumento da atividade da HO-1 mediado pela hemina suprime substancialmente a replicação do HIV tanto ‘in vitro’ quanto ‘in vivo’ com nenhum efeito tóxico aparente. Desde 1970, quando foi aprovada pela FDA, a hemina tem sido usada para tratar com sucesso uma variedade de desordens, tais como porfíria aguda, falência de transplante do fígado devida à recorrência de protoporfiria eritropoiética, e talassemia [qualquer tipo de distúrbio no metabolismo da hemoglobina caracterizado por comprometimento na síntese de uma ou mais das cadeias polipeptídicas da globina. Stedman] intermediária com mínimos efeitos colaterais. [Obs.: omim 141900 – Os locus alfa e beta determinam a estrutura de dois tipos de cadeias polipeptídicas na hemoglobina adulta, Hb A. A globina beta mutante que dobra como uma foice causa a anemia da célula em forma de foice (omim 603903). A ausência da cadeia beta causa a talassemia beta zero. Quantidades reduzidas de globina beta detectáveis causam a talassemia beta positiva. Por motivos clínicos, as talassemias beta são divididas em talassemia principal (dependente de transfusão), talassemia intermediária (de severidade intermediária) e talassemia menor (assintomática).]Nossos resultados, por isso, podem proporcionar novas estratégias no desenvolvimento de intervenções terapêuticas potencialmente seguras para o tratamento da infecção por HIV.

RESULTADOS

Químicamente conhecida como cloro-[7,12-diethenyl-3,8,13,17-tetramethyl-21H,23H-porfina-2,18-dipropanoato(2-)-N21,N22,N23,N24]ferro, a hemina representa um componente crítico da molécula de hemoglobina, cuja estrutura é mostrada na figura 1A. As vias de sinalização mediadas pela hemina envolvendo a ativação da HO-1 (heme oxigenase) têm sido implicadas numa variedade de desordens inflamatórias. Todavia, sua função na regulação da infecção por HIV permanece desconhecida. Para examinar o papel da ativação da HO-1 na infecção por HIV, monócitos foram expostos à hemina, infectados com HIV-1, e examinados para a replicação viral. Como mostrado na Figura 1B, o tratamento dos monócitos cultivados com hemina inibiram eficientemente a expressão do RNA viral de modo dependente da dose. Consequentemente, a replicação do HIV-1 foi completamente inibida numa concentração ótima de 100-µM(micro mol). A replicação do HIV-1 permaneceu suprimida ainda quando os monócitos foram infectados com alta MOI, como foi evidenciado pela indetectável produção de p24 do HIV livre na célula mensurada no sétimo dia após a infecção.

O tratamento dos monócitos com hemina 24 horas antes da infecção suprimiu significativamente a expressão do DNA viral (figura A). Os níveis do DNA do HIV em células tratadas com hemina no momento da infecção também estavam substancialmente mais baixos em comparação com controles não tratados. Para determinar a capacidade da hemina suprimir a replicação viral após a entrada, as células foram incubadas com hemina quatro horas após a exposição viral, e o DNA genômico foi analisado para a presença de sequências específicas de env por amplificação por PCR em 24 horas. Os resultados desses experimentos mostram que o tratamento com hemina quatro horas depois da inoculação do HIV, o que fornece tempo suficiente para a entrada viral, também reduziu significativamente a expressão do gene viral. O conjunto de iniciadores usados para a amplificação por PCR foi específico para sequências altamente conservadas do envelope do HIV-1. Os produtos do PCR a partir de DNA ou cDNA de células não infectadas usando-se os mesmos iniciadores foram negativas para bandas do HIV, sugerindo que os produtos amplificados por PCR de células não infectadas por HIV eram altamente específicos. O tratamento de monócitos com hemina 24 horas antes da infecção, no momento da infecção, ou ainda vinte e quatro horas após a infecção (+24h) suprimiu a replicação do HIV (Fig.2B). Esses resultados foram consistentes com uma marcada redução de efeitos citopáticos associados ao HIV em monócitos tratados com hemina 24 horas antes da infecção (-24h), no momento da infecção (0h), ou 24 horas após a infecção (+24h) como mostrado na Fig 2C.

Para determinar se a resposta celular induzida por hemina foi um mecanismo de defesa do organismo para refractariedade das células à infecção pelo HIV e, a partir disso, seria independente do tropismo viral, os monócitos tratados com hemina foram desafiados com viroses X4, R5 e de duplo tropismo R5X4 , e a cultura sobrenadante foi examinada para p24 no sétimo dia após a infecção. Como esperado, na ausência da hemina, os monócitos foram infectáveis com as linhagens virais R5 (92US714 HIV-1 com env do subtipo B, e 93IN101 HIV-1 com env do subtipo C) e R5X4 (92RW009 HIV-1 com env do subtipo A e 92HT596 HIV-1 com env do subtipo B). Entretanto, surpreendentemente, exceto para o HIV-1 92UG046 (HIV-1 env do subtipo D), todas as p24 do HIV estavam praticamente indetectáveis na cultura sobrenadante infectada com as outras duas linhagens virais com tropismo para X4 CMU02 (HIV-1 env de subtipo EA) e 98IN017 (HIV-1 env subtipo C). Todavia, a despeito do tropismo viral, o tratamento com hemina inibiu a infecção de monócitos com todos os HIV-1 isolados testados (Fig.3A). Similarmente, em adição aos vírus isolados adaptados em laboratório, o tratamento com hemina inibiu a replicação do HIV em PBL (deve se linha de células do sangue periférico) infectadas com um vírus resistente a azidothimidina (AZT) contendo uma mutação no aminoácido residual 215Y (tirosina) da transcriptase reversa (HIV-1RTMF/MT-2), uma mutação no aminoácido residual 74V (valina) da transcriptase reversa (HIV-174v/MT-2) gerando resistência ao 2’3’-dideoxi-iosina e ao 2’3’-dedeoci-citidina, um vírus resistente a nevirapuna (N119), bem com um vírus isolado de pacientes com tropismo para X4 92UG029 (HIV-1 env de subtipo A) e linhagens virais com tropismo R5X4 93BR (BRASIL)020 (HIV-1 envelope de subtipo F) (Fig.3B).

Para avaliar se a atividade anti-HIV induzida pela hemina é preservada “in vivo”, camundongos NOD-SCID implantados com células monocitóides de sangue periférico foram inoculados com o HIV-1 (105 TCID50/camundongo) e então, cinco dias depois, administrados com uma dose de 4mg/kg por dia. No sétimo dia, os camundongos foram re-injetados com 105 TCID50/camundongo HIV-1 para assegurar a infecção produtiva. Como mostrado na figura 4, os níveis de p24 do HIV-1 no soro dos camundongos infectados foi detectável no quarto dia, um dia antes da administração da hemina. Quatorze dias após a primeira inoculação o nível de p24 estava seis vezes mais baixo do que o dos controles não tratados (Fi.4). A supressão da replicação do HIV pelo tratamento dos camundongos com hemina foi consistente com a inibição “in vitro” da replicação do HV e a reduzida expressão do gene viral.

A hemina é conhecida por induzir a expressão da HO-1 em uma variedade de tipos celulares. O tratamento de monócitos com hemina induziu a expressão da HO-1 de maneira dependente da dose e do tempo (Fg5A). A indução máxima foi observada quando as células foram incubadas com 100 µM (micro mol) de hemina por 18 horas a 37oC. Esses dados foram consistentes com a supressão da replicação do HIV, como descrito acima. Nenhum efeito citotóxico foi observado nessas concentrações (dados não mostrados). Para determinar a especificidade da atividade da HO-1 induzida por hemina na mediação da atividade anti-HIV, monócitos foram incubados com várias concentrações de SnPP IX (protoporfirina IX), um inibidor da função da HO-1, uma hora antes do tratamento com hemina a 25 µM por uma hora, depois foram infectados com HIV-1, e então examinados enquanto células livres de p-24 do HIV-1 cinco dias após a infecção. Os resultados desse experimento mostrados na figura 5B demonstram que o tratamento com SnPP IX em ótima concentração de 6,25 µM atenuou a inibição da infecção por HIV induzida por hemina, sugerindo que a supressão da infecção do HIV mediada por hemina foi mediada pela indução da HO-1. Uma baixa concentração de hemina (25 µM) foi usada nesses experimentos devido aos efeitos citotóxicos do SnPP em altas concentrações. Em outro conjunto de experimentos, 12,5 µM de SnPP atenuou a supressão da replicação do HIV pela hemina a 50 µM (dados não mostrados). O SnPP é um inibidor competitivo para a atividade da enzima HO-1. Por isso, ele atenuou a atividade da enzima HO-1 sem afetar a expressão da proteína (HO-1) (dados não mostrados).

As células GHOST expressam CD4, R5 bem como co-receptores X4, e o cassette reporter de GFP dependente de Tat. Essas células, por isso, representam um sistema modelo ideal para visualizar a infecção com viroses usando um ou mais co-receptores. Similar aos monócitos, o tratamento das células GHOST com hemina induziu a expressão de HO-1 de modo dependente da dose. Essas células foram infectadas com a linhagem do HIV-1 com tropismo para R5X4 e examinadas por proteína verde fosforescente (GFP) por microscopia de fluorescência. Como mostrado na figura 6B, as células GHOST foram produtivamente infectadas como evidenciado pela expressão da GFP dirigida pelo longo terminal de repetição (LTR) do HIV e evidenciado por efeitos citopáticos associados. O tratamento com hemina suprimiu significativament a indução da expressão da GFP, indicando um baixo nível de replicação do HIV. Nenhuma expressão do GFP por observada nas células não infectadas. Consistentemente com essas observações, o tratamento com hemina reduziu substancialmente os efeitos citopáticos associados ao HIV, e como esperado, tais efeitos não foram observados em células não infectadas (Fig. 6B). A expressão da GFP em células GHOST depende da Tat produzida intracelularmente pela infecção produtiva do HIV.

Para confirmar que a indução da GFP em células infectadas produtivamente foi dirigida pela proteína Tat, células GHOST não infectadas foram pré-tratadas com hemina por 24 horas, eletroporadas com proteína Tat do HIV-1 exógena recombinante e depois examinadas para expressão de GFP. Como mostrado na Fig.6C, a expressão da GFP foi induzida pela proteína Tat ainda na ausência da infecção por HIV. Como observado com células infectadas por HIV, o tratamento com hemina inibiu significativamente a expressão da GFP em células eletroporadas com a proteína Tat exógena. A proteína Tat inativada por calor (delta Tat) ou somente com tampão (uma mistura para manter o pH) não causou a indução da GFP. A viabilidade da célula, determinada por teste de exclusão de azul de tripano [corante para células em cultura e tecidos], após a transfecção da Tat foi maior que 90%. A expressão da GFP foi observada em mais de 80% das células, sugerindo a eficiência da transfecção em mais de 80%. A experiência de fluorescência em células transfectadas tanto com Tat inativadas por calor ou somente por tampão foi substancialmente menor do que a das células transfectadas com a proteína de Tat ativa, proporcionando sustentação adicional para essas observações. Esses resultados proporcionam evidências para a inibição da ativação do promotor do LTR dependente de Tat, levando à redução da expressão da GFP e, dessa forma, replicação reduzida do HIV em células GHOST tratadas com hemina.

DISCUSSÃO

O presente estudo demonstra uma função da atividade da HO-1 como potente fator de defesa do hospedeiro para a infecção por HIV-1. Nossos estudos mostram claramente que a ativação da HO-1 por seu substrato hemina os protegeu contra a infecção por HIV com vários HIV isolados clínicos incluindo alguns dos que desenvolveram resistência às drogas anti-retrovirais convencionais. ‘In vivo’, a administração da hemina em camundongos humanizados NOD-SCID suprimiu substancialmente a replicação do HIV. Esses achados sugerem que o indutor de HO-1, a hemina, é um biológico endógeno potencialmente efetivo na indução da resposta de defesa do hospedeiro contra a infecção por HIV. Um componenete crítico de uma variedade de proteínas, incluindo a hemoglobina, a hemina tem sido mostrada por exercer numerosas funções biológicas benéficas. Após ter sido aprovada pela FDA, várias formulações da hemina têm sido usadas desde 1970 para tratar a porfíria com sucesso, para controlar a falência do transplante de fígado devido à recorrência de protoporfiria eritopoiética [distúrbio benigno do metabolismo da porfirina causado por uma deficiência da ferroquelatase associada a aumento da excreção fecal de protoporfirina, urina vermelho-púrpura e aumento da protoporfirina IX nas hemácias, plasma e fezes; caracterizada por urticária solar aguda ou eczema solar mais crônico, desenvolve-se rapidamente quando há exposição à luz solar. Stedman.
Obs.: A protoporfirina de tipo III é a principal protoporfirina encontrada na natureza, caracterizada pela presença de quatro grupos metil, dois grupos vinil e duas cadeias laterais de ácido propiônico, um derivado da porfirina que, com o ferro, forma o heme da hemoglobina e os grupos prostéticos da mioglobina, catalase, citocromos, etc. Stedman.] e em pacientes com talassemia intermédia, com efeitos mínimos. Por isso, sujeita a estudos suplementares, a hemina poderia servir como um novo biológico terapêutico para o tratamento da infecção por HIV.

Embora houvesse infectividade do HIV substancialmente mais baixa relativa aos controles não tratados, o DNA do HIV detectável nas células infectadas pré-tratadas com hemina sugerem que e entrada viral foi substancialmente inibida, mas não completamente bloqueada. Similarmente, a exposição da hemina à células pré-inoculadas com HIV também suprimiu a replicação do vírus por mais de 90%. Por isso, a entrada viral reduzida nas células alvo pode não ser o único fator responsável pela supressão da infecção por HIV. Desde a entrada, há múltiplas etapas no ciclo de vida do HIV, tais como integração viral, transcrição reversa, ou supressão da ativação do LTR do HIV, onde a hemina intracelular ou a HO-1 induzida por hemina poderia interferir e retardar a replicação do vírus. A despeito da presença do DNA viral nas células infectadas, a incapacidade do HIV para replicar-se produtivamente sugere fortemente um suposto papel da hemina na inibição de eventos após a entrada. Nossos dados proporcionam uma correlação direta entre a indução da HO-1 e inibição da replicação do HIV em células ativadas com hemina. A atenuação da replicação do HIV suprimida por hemina através do SnPPIX, um inibidor da atividade da HO-1, sustenta mais ainda essa enzima endogenamente indutível como um importante fator na modulação da infecção por HIV.

A infecção com viroses de tropismo duplo, que usam tanto o co-receptor R5 quanto o X4 para entrada, também foram associadas com a depleção das células T e progressão para a AIDS. Nós temos mostrado que o tratamento com hemina inibiu a infecção das células não somente com vírus isolados em laboratório, mas também com vários isolados clínicos, usando múltiplos co-receptores para sua entrada nas células alvo. Em adição, as células tratadas com hemina foram refratárias à infecção com linhagens do HIV mutantes ou resistentes a AZT ou outras drogas. Esses resultados indicam que indiferente ao tropismo viral, as células ativadas com hemina permaneceram protegidas da infecção por todas as linhagens do HIV-1 testadas neste estudo. A maioria das drogas usadas correntemente para o tratamento da infecção por HIV são compostos sintéticos e elicitam efeitos colaterais altamente indesejáveis nos indivíduos infectados com HIV-1. A terapia anti-retroviral altamente ativada (HAART), embora benéfica em suprimir a viremia em indivíduos infectados, pode contribuir para mutantes às drogas após uso prolongado e induzir efeitos metabólicos adversos, tais como lipodistrofia, hipertensão, diabetis mellitus, osteopenia e hiperlipidemia. A síndrome lipodistrófica afeta mais de 60% dos pacientes infectads por HIV tratados com HAART e, por essa razão, está emergindo como uma séria preocupação médica. A indução da resistência do hospedeiro à infecção por HIV pela hemina, um fator endógeno do hospedeiro relatado no presente estudo, poderia proporcionar uma estratégia alternativa atrativa para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para o tratamento da infecção por HIV. Essa abordagem poderia ser potencialmente muito vantajosa, especialmente para o tratamento de infecções com múltiplos isolados do HIV, linhagens recombinantes, e linhagens do HIV resistentes a drogas. Esses achados significativos poderiam ser explorados suplementarmente em outras linhagens virais resistentes a drogas.

Camundongos Hu-NOD-SCID tem sido amplamente aceitos como um modelo válido para estudar a patogênese do HIV e testar drogas anti-retrovirais. Nossos dados demonstram que a administração da hemina suprimiu significativamente a infecção do HIV em camundongos hu-NOD-SCID sem mudanças de comportamento, perda de peso ou outra toxicidade aparente. Esses resultados foram consistentes com achados ‘in vitro’. A dose usada da hemina nesse estudo é tipicamente usada para tratar pacientes com uma variedade de sintomas clínicos. Por isso, o tratamento com hemina pode proporcionar uma terapêutica biológica potencialmente segura. Outros efeitos patogênicos causados pela infecção do HIV em camundongos hu-NOD-SCID e possível atenuação ou reconstituição do sistema imune pelo tratamento com hemina estão sendo explorados e serão objeto de futuros estudos.

Pacientes com AIDS costumam desenvolver vários anomalias hematológicas, tais como anemia, leucopenia, trombocitopenia e alterações na plasticidade das células tronco no microambiente da medula óssea. Essas condições clínicas sugerem que a infecção pelo HIV-1 pode afetar processos envolvidos nos primeiros estágios da hemopoiese ou diferenciação das células-tronco. O último pode ser resultante dos altos níveis de citocinas pró-inflamatórias circulantes nos indivíduos infectados com HIV-1. Recentemente, a indução da HO-1 tem sido mostrada por mediar a resposta anti-inflamatória ‘in vivo’. Assim, é aceitável que a indução da HO-1 pela hemina pode suprimir os efeitos deletérios das citocinas pró-inflamatórias na infecção por HIV.
Correntemente, a hemina é usada com sucesso para o tratamento de porfírias agudas. Por isso, objeto de futuros estudos, o uso limitado desse componente biológico poderia proporcionar potencialmente a conseqüência do benefício clínico com efeitos adversos controlados.

Em conclusão, os achados do presente estudo proporcionam forte evidência para a HO-1 como um novo componente biológico endógeno com atividade anti-HIV. A inibição ‘in vitro’ junto com a atividade supressora do HIV ‘in vivo’ garante que o substrato hemina indutor da HO-1 seja desenvolvido como um agente terapêutico potencial para o tratamento da infecção por HIV-1.

FONTE: http://www.jimmunol.org/cgi/content/full/176/7/4252

A Vitamina E Suprime a Geração de Trombina Dependente do Fator VIII em Condições de Hipóxia Sistêmica.

Wang JS, Cheng ML, Yen HC, Lou BS, Liu HC

EXPERIÊNCIA E OBJETIVO:

A atividade aumentada da trombina é um componente essencial das reações hemostáticas. Esse estudo elucida como várias intervenções hipóxicas (de falta de oxigênio) provocam a geração endógena de trombina (TG) após o tratamento com e sem a vitamina E antioxidante e lipofílica.

MÉTODOS:

Vinte e quatro homens saudáveis e sedentários foram escolhidos aleatoriamente para grupos com vitamina E (n=12) e placebo (n=12). Esses sujeitos foram expostos aleatoriamente a 12% (hipóxia severa), 15% (hipóxia moderada) 18% (hipóxia leve) e 21% (normoxia [estado em que a pressão parcial do oxigênio no gás inspirado é igual à do nível do mar, de cerca de 150 mm Hg. Stedman.]) O(2) por duas horas em um gabinete de hipóxia normobárico [refere-se a uma pressão barométrica equivalente à pressão ao nível do mar]. Uma nova abordagem de trombinografia automatizada calibrada foi usada para medir a geração de trombina no plasma.

RESULTADOS:

No grupo placebo, a hipóxia severa aumentou o nível plasmático de FVIII sobre atividade e a TG, o que foi acompanhado por aumento no nível de 15-F2t-8-isoprostano (um tipo de prostaglandina) urinário e decréscimo no conteúdo total de antioxidante do pasma e de atividade da superóxido dismutase. Entretanto, a depleção do FVIII por incubação com anticorpos anti-FVIII no plasma suprimiu o aumento da TG por hipóxia severa. Após a adminstração de 1000 IU de vitamina E, a hipóxia severa não alterou significativamente o nível de 15-F(2t)-8- isoprostano e o conteúdo de antioxidante total do plasma, atividade de superoxido dismutase, o nível de FVIII sobre atividade, ou a TG. Além disso, o estado de redox, nível de FVIII sobre atividade e a TG estiveram constantes em resposta à hipóxia moderada, leve ou normoxia nos grupos placebo e com vitamina E.

CONCLUSÕES:

Nós concluímos que a hipóxia severa promove a TG dependente de FVIII, possivelmente por elevação do estresse oxidativo; esse efeito da hipóxia foi melhorado pelo pré-tratamento com vitamina E.

PMID: 18948612

[Obs1.: Estresse oxidativo: é causado por um desequilíbrio entre a produção de oxigênio reativo e a capacidade do sistema biológico em desintoxicar realmente os reagentes intermediários ou reparar facilmente o dano resultante. Todas as formas de vida mantém um ambiente redutor dentro de suas células. Esse ambiente redutor é preservado por enzimas que mantêm o estado reduzido através de um constante fornecimento de energia metabólica. Distúrbios do estado redox normal podem causar efeitos tóxicos através da produção de peróxidos e radicais livres que danificam todos os componentes da célula, incluindo proteínas, lipídios e DNA. Wikipédia

Obs2.: O monóxido de carbono pode conter a respiração celular, porém, paradoxalmente, ele é sintetisado endogenamente pela heme oxigenase de tipo 1 em resposta ao estresse isquêmico. Camundongos sem o gene Homox1 (da heme oxigenase) exibiram lesão isquêmica letal nos pulmões, mas foram salvos da morte pela inalação de monóxido de carbono. O monóxido de carbono dirigiu a proteção isquêmica pela ativação da guanilato sintase e dessa forma suprimiu a indução, por hipóxia, do gene codificador do inibidor de ativador de plasminogênio-1 (PAI1; omim 173360) em fagócitos mononucleares, o que reduziu o acréscimo de fibrina microvascular. A proteção isquêmica mediada pelo monóxido de carbono observada em camundongos de tipo selvagem não ocorreu em camundongos nulos para o gene codificador da PAI1. Fujita e outros (2001) concluíram que seus dados estabeleceram uma ligação fundamental entre o monóxido de carbono e a prevenção da injúria isquêmica baseada na habilidade do monóxido de carbono desreprimir o eixo fibrinolítico. Omim 141250

Obs3.: Isoprostanos são uma família de compostos produzidos a partir de ácidos graxos polinsaturados por via de um mecanismo de radical livre catalisado. Os F2-isoprostanos são isômeros das prostaglandinas F2 alfa derivadas do ácido araquidônico. Esses compostos induzem potente vasoconstrição...
Os isoprostanos são uma família de compostos produzidos a partir de ácidos graxos poli-insaturados por via de um mecanismo de radical livre catalisado. Os idoprostanos derivados dos ácidos eicosapentaenóico e decosahexaenóico foram descobertos “in vivo”, mas o interesse principal foi focalizado em isopropanos derivados do ácido araquidônico devido a sua maior abundância. Embora a geração “in vitro” de produtos de auto-oxidação derivados de ácidos poli-insaturados tenha sido descrita há vinte e cinco anos atrás, a primeira demonstração de que esses compostos eram produzidos em humanos foi feita em 1990 por Morrow e outros. Eles relataram a descoberta dos compostos parecidos com a prostaglandina F2, chamados F2-isopropanos, gerados pela peroxidação do ácido araquidônico induzida por radicais livres. Desde então, os F2-isoprostanos têm sido usados extensivamente como marcadores de peroxidação de lipídios em doenças humanas, seus níveis elevados sugerindo um papel importante da geração de radicais livres na patofisiologia das doenças vasculares. Além disso, F2-isoprostanos têm sido mostrados por exercerem atividade biológica potente nos vasos humanos e de animais, sugerindo um papel patogênico nas doenças vasculares.

http://content.karger.com/ProdukteDB/produkte.asp?Aktion=ShowFulltext&ArtikelNr=51036&Ausgabe=227752&ProduktNr=224160]

DUAS LECTINAS HOMÓLOGAS A LIGANTES DE MANOSE E PROTEASES DE SERINA ASSOCIADAS A MBL SÃO EXPRESSADAS NO EPITÉLIO INTESTINAL DE ESPÉCIES UROCORDADO CIONA INTESTINALIS.

A via do complemento pela lectina tem funções importantes na defesa do hospedeiro vertebrado e a acumulação de evidências dos componentes primordiais do complemento remete sua emergência para o filo invertebrado. Nós introduzimos duas lectinas supostamente homólogas a ligantes de manose (CioMBLs) da espécie urocordata Ciona intestinalis. As CioMBLs apresentam similaridades com as MBLs dos vertebrados e compreendem uma região de tipo colágeno, fitas espiraladas em hélice alfa e um domínio de reconhecimento de carbo-hidrato (CDR) com resíduos conservados envolvidos na ligação a cálcio e carbo-hidrato. Análises estruturais revelaram uma oligomerização através das pontes dissulfídicas intercadeias entre os resíduos de cisteína no terminal N e cisteínas localizadas entre a região do “pescoço” e o domínio de reconhecimento de carbo-hidrato. A PCR de trascriptase reversa mostrou uma expressão específica da CioMBL no tecido do intestino e por análises de imunohistoquímica nós também demonstramos que a CioMBL co-localiza-se com proteases de serina associadas a MBL nas células do epitélio de revestimento do estômago e do intestino. Em conclusão nós apresentamos duas MBLs do urocordado e identificamos uma protease de serina associada, o que dá sustentação ao conceito de uma origem evolucionária ancestral da via do complemento pela lectina.

PMID: 19699760

OBS.: http://en.wikipedia.org/wiki/Urochordata

ENDOCITOSE E DEGRADAÇÃO DOS COMPLEXOS ALFA 1- ANTITRIPSINA-PROTEASE POR MEIO DO RECEPTOR DE COMPLEXOS SERPINA-ENZIMA (SEC)


A alfa-1-antitripsina (alfa 1-AT) é similar a outros membros da super-família de inibidores de protease de serina (serpinas) em que esta se submete a rearranjo estrutural durante a formação de complexos inibitórios estabilizados covalentemente com sua enzima correspondente, a elastase do neutrófilo. Recentemente nós demonstramos um receptor de superfície celular abundante de alta afinidade nas células de hepatoma humanas e fagócitos mononucleares humanos as quais reconhecem o domínio específico de conformação do complexo alfa1-AT-elasase bem como de outros complexos enzima-serpina (Perlmutter, D.H., Glover, G.I., Rivetna, M., Schasteen, C.S. e Fallo, R.J.(1990). A ligação ao receptor do complexo serpina-enzima (SEC) ativa uma via de transdução de sinal para aumentar a expressão do gene alfa1-AT e pode ser responsável pela remoção dos complexos serpina-enzima. Neste estudo. Neste estudo, nós mostramos que existe uma internalização dependente de tempo e saturável dos complexos alfa1-AT-elastase e alfa1-AT-tripsina nas células HepG2 de hepatoma humanas. A internalização é mediada pelo receptor SEC (complexo de serpina-enzima) como definido pela inibição pelos peptídeos sintéticos correspondentes aos resíduos 359-374 da alfa1-AT. Análises de eletroforese em gel poliacrilamida de sulfato sódico de dodecila (sulfato sódico de lauril, usado na pasta de dentes) da radioatividade intracelular demonstraram que complexos intactos de alfa1-AT de 75 e 66 quilodáltons foram internalizados. Análises cinéticas da internalização a 37oC mostraram que uma única sub-classe dos complexos 125I-alfa1-AT-tripsina, pré-ligados às células a 4oC, desapareceram da superfície celular e acumularam-se intracelularmente dentro de 5 a 15 minutos a 37oC. A concentração intracelular dos complexos radio-etiquetados então decresceu rapidamente coincidentemente com o surgimento de produtos de degradação solúvel em ácido no fluido de cultura extracelular. A degradação intracelular foi inibida pela internalização a 18oC ou pela internalização a 37oC na presença de fracas bases de cloreto de amônio (NH4+CL), primaquina e cloroquina, indicando que a deradação é no lisossomo. Esses resultados indicam que em adição ao seu papel na transdução de sinal, o receptor SEC participa na internalização de todos os complexos alfa1-At-protease para degradação no lisossomo.
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Sendo a elastase do neutrófilo capaz de degradar muitos componentes da matriz do tecido conectivo, pensa-se que seu inibidor alfa1-antitripsina (α1-AT) atua num papel crítico na manutenção da “balança elastase-antielastase” e na regulação da renovação do tecido conectivo. A atividade não contraposta da elastase do neutrófilo provavelmente é a responsável pela doença destrutiva dos pulmões em indivíduos com deficiências herdadas da alfa1-AT e contribui para a lesão dos pulmões em estados de enfermidade (fibrose cística, síndrome da dificuldade respiratória em adultos) associada com inativação da alfa1-AT proteolítica ou oxidativa. A alfa1-AT é o arquétipo de uma família de proteínas, as serpinas, que formam complexos covalentemente estabilizados com suas proteases de serina relacionadas, ou com seus hormônios ligantes relacionados no caso das globulinas ligantes de corticosteróide e hormônio da tireóide. Durante a formação do complexo alfa1-AT-elastase há a inativação da elastase e o rearranjo estrutural da molécula alfa1-AT. Recentemente, nós demonstramos um receptor de superfície celular que reconhece o domínio específico da conformação do complexo alfa1-AT-elastase. O domínio de ligação ao ligante é altamente conservado entre os membros da família das serpinas e o receptor reconhece ao menos três outras serpinas e suas enzimas relacionadas. Por isso nós propusemos o nome receptor SEC (complexo enzima-serpina). A ligação ao receptor SEC media um aumento na expressão do gene alfa1-AT. A especificidade do ligante do receptor SEC é similar à especificidade previamente demonstrada na remoção de complexos serpina-enzima “in vivo”, emergindo a possibilidade de que o receptor SEC está envolvido na remoção/catabolismo dos complexos serpina-enzima. No estudo a seguir, nós mostramos que o receptor SEC media a internalização e a degradação intracelular dos complexos alfa1-AT-elastase e alfa1-AT-tripsina.


RESULTADOS E DISCUSSÃO

A ligação dos complexos 125I-alfa1-AT-Elastase às células HepG2 –
Mono-camadas separadas de células HepG2 foram incubadas por duas horas a 4oC com várias concentrações diferentes de complexos 125I-alfa1-AT-Elastase na ausência ou presença de complexos alfa1-AT-elastase não etiquetados em excesso molar de 100 vezes. Existe ligação específica e saturável, com a metade da saturação máxima em 30 a 40 nM (nano mol= 10-9 M). Complexos alfa1-AT-elastase e Valina 358 recombinantes derivados de levedura e etiquetados com 125I e complexos 125I-tripsina-alfa1-AT-Elastase tinham características de ligação idênticas (dados não mostrados). O grau relativamente alto de ligação não específica nesses experimentos é devido provavelmente à dificuldade da reação no preparado com ligante etiquetado e competidor não etiquetado. Já que a tripsina pôde ser iodada em uma atividade de alta especificidade, retendo ainda sua capacidade de formar um complexo com a alfa1-AT, nós usamos complexos 125I-tripsina-alfa1-AT para experimentos remanescentes.



A especificidade de ligação dos complexos foi examinada adicionalmente por ensaios de ligação competitiva. A ligação dos complexos 125I-tripsina-alfa1-AT foi bloqueada em uma extensão similar por complexos alfa1-AT-elastase não etiquetados, complexos alfa1-AT-tripsina, peptídeo 105Y, mas não pela alfa1-AT nativa ou pelo peptídeo PB154. O peptídeo PB105Y corresponde aos resíduos alfa1-AT 359-374 (SIPPEVKFNKPFVYLI) e o peptídeo PB154 corresponde aos resíduos alfa1-AT 375-394 (IEQNTKSPLFMGKVVNPTQK). Esses dados indicam que a alfa1-AT no complexo com cada uma das proteases de serina elastase de neutrófilo ou tripsina pancreática têm idênticas características de ligação. Esses dados também mostram que ao menos parte do domínio correspondente à sequência do peptídeo sintético PB105Y constitui o domínio de ligação ao receptor do complexo alfa1-AT-protease.



A ligação do complexo 125I-alfa1-AT-elastase é similar à ligação de 125I-peptídeo PB105Y. Existe ligação específica e saturável de 105Y com metade da saturação máxima a 40 nano mol. Análises de gráficos de Scatchard (representação da concentração do ligante unido dividida pela concentração do ligante livre, contraposta ao ligante unido), como mostrado numa publicação prévia, prevê um Kd de 40 nM e 4,5xIo5 de receptores de membrana por célula. Há um grau muito baixo de ligação não específica porque um único peptídeo é usado como ligante etiquetado e competidor não etiquetado. A especificidade de ligação do peptídeo PB105Y é similar àquela dos complexos 125I-alfa1-AT-elastase. A ligação 125I-peptídeo PB105Y está bloqueada pelo peptídeo PB105Y não etiquetado, complexos 125I-alfa1-AT-elastase não etiquetados, mas não pela alfa1-AT nativa, elastase nativa ou peptídeo PB154. A ligação do 125I-peptídeo PB105Y também está bloqueada por complexos alfa1-AT-tripsina não etiquetados (dados não mostrados).



A captura e internalização dos Complexos-

Depois nós investigamos o destino dos complexos serpina-enzima ligados na superfície e examinamos a possibilidade de os complexos serem internalizados por células HepGP. As células HepGP foram incubadas a 37oC com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT por diferentes intervalos de tempo. O fluido de cultura celular foi coletado e as monocamadas de células enxaguadas e então incubadas a 4oC com solução salina protegida de fosfato (com pouco fosfato?) contendo a proteinase K para remover ligantes ligados à superfície. Há internalização dos complexos etiquetados específica e dependente do tempo. O experimento foi repetido por 60 minutos na ausência ou presença de vários competidores diferentes. Os resultados indicaram que a internalização dos complexos tripsina-alfa1-AT etiquetados é bloqueada por complexos tripsina-alfa1-AT não etiquetados, elastase-alfa1-AT não etiquetados, peptídeo PB105Y, mas não pela Alfa1-AT nativa ou peptídeo PB154. Para determinar a espécie molecular internalizada pelo receptor SEC, as células HepG2 que foram incubadas com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT foram lisadas e parte do lisado celular submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (sulfatoto de sódio dodecil) seguida de auto-radiografia. Os resultados indicaram que complexos de tripsina-alfa1-AT de alto peso molecular de 75 e 66 quilodáltons ficam intactos na ligação de superfície celular e frações internas. Existe uma acumulação dependente de tempo dos complexos etiquetados na fração interna entre 60 e 240 minutos.


Nós também determinamos a distribuição de complexos 125I-tripsina-alfa1-AT durante um único ciclo de endocitose nas células HepG2. As células HepG2 foram incubadas por duas horas a 4oC com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT em concentrações de saturação. As monocamadas celulares foram enxaguadas extensivamente e depois incubadas a 37oC em meio de captação sem nenhum ligante etiquetado para examinar o destino das sub-classes agora pré-ligadas de ligantes etiquetados. Em vários intervalos de tempo diferentes o fluido de cultura celular foi colhido, e as monocamadas celulares foram enxaguadas extensivamente de novo e incubadas a 4oC por uma hora adicional em solução salina protegida de fosfato contendo proteinase K para determinar a captação total, captação resistente à proteinase K (fração interna), e captação sensível à proteinase (fração ligada à superfície). O fluido da cultura celular foi submetido à contagem de cintilação (cintilador é uma substância que emite luz quando atingida por uma substância subatômica ou por raios X ou gama. Stedman) antes e depois da precipitação com ácido para determinar a cinética da dissociação do ligante pré-ligado e a cinética do aparecimento de produtos de degradação do ligante solúvel com ácido, respectivamente. Os resultados mostram que uma vez ligados ao receptor de superfície celular, os complexos de tripsina-alfa1-AT etiquetados desaparecem da superfície celular em 5 a 10 minutos (fração resistente a proteinase ). Durante os próximos 40 minutos a concentração intracelular de complexos tripsina-alfa1-AT etiquetados decresceu coincidentemente com o surgimento de produtos da degradação do ligante no fluido extracelular (ligante extracelular solúvel em ácido). Houve também surgimento de produtos de degradação do ligante em dependência ao tempo no fluido extracelular após as células HepG2 terem sido inclubadas a 37oC com complexos 125I-alfa1-AT-tripsina (dados não mostrados). Isso indica que há deradação de ambos a enzima e seu inibidor. As cinéticas da endocitose e degradação mostrada aqui são similares às previamente descritas em células de hepatoma para complexos de inibidor de ativador de plasminogênio com ativador de plasminogênio de tipo de tecido e para o assialoorosomucóide, um ligante para o receptor da assialoglicoproteína (é uma proteína sem uma porção do ácido siálico; sialo é saliva. Stedman) que também é direcinado ao lisossomo para degradação. Uma via similar tem sido demonstrada recentemente em células U937 para complexos de inibidor 1 de ativador de plasminogênio com a urocinase ativador de plasminogênio.


Finalmente, nós examinamos o efeito da temperatura e bases frágeis na degradação intracelular dos complexos 125I-tripsina-alfa1-AT. Primeiro, as células HepG2 foram incubadas por duas horas com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT em concentrações de saturação a 38 e 18oC. A incubação a 18oC resultou em uma redução de 95,8% na radioatividade solúvel em ácido liberada no fluído extracelular. Em segundo lugar, as células epG2 foram incubadas por duas horas a 37oC com complexos 125I-tripsina-alfa1-AT na ausência ou presença das bases frágeis. A radioatividade solúvel em ácido no fluido extracelular decresceu em 45,2, 35,8 e 39,3% na presença de cloreto de amônio, primaquina e cloroquina, respectivamente. Esses dados indicam que a degradação dos complexos alfa1-AT-protease requerem a entrega ao ou o tráfego através de compartimentos ácidos. O efeito inibitório da incubação a 18oC sugere adicionalmente que os primeiros compartimentos endossômicos não são o sítio de degradação do complexo. Os dados são mais consistentes com a entrega do ligante ao lisossomo ou compartimentos endossômicos posteriores como um requisito para degradação.


Tomados juntos, os resultados dessas experiências demonstram a internalização mediada pelo receptor e a degradação intracelular de todos os complexos alfa1-AT-protease. Além disso, a ligação competitiva e estudos de captura indicam que a internalização e degradação intracelular de complexos alfa1-AT-protease é mediada pelo receptor SEC. O receptor SEC foi identificado originalmente como um componente da via de transdução de sinal para aumento da expreção do gene alfa1-AT em resposta aos complexos alfa1-AT-elastase. Ele reconhece um domínio dentro da alfa1-AT (os resíduos de 359 a 374) o qual está disponível para ligação ao receptor somente quando a alfa1-AT forma um complexo com a protease de serina ou quando é proteoliticamente modificado por uma combinação de oxidação e protease de serina ou por metaloprotease. O receptor SEC reconhece esse mesmo domínio altamente conservado em outros complexos serpina-enzima, antitrombina III- trombina, catepsina G – alfa1-antiquimiotripsina e em menor extensão inibidor de C1- C1 (obs.: o fator XIII da coagulação tem um domínio de inibidor de C1). Estudos prévios têm sugerido que esses outros complexos serpina-enzima competem pela remoção dos complexos alfa1-AT-protease “in vivo”. Baseados nessa similaridade em especificidade do ligante e nos estudos correntes mostrando a endocitose e a degradação dos complexos alfa1-AT-protease mediada pelos receptores SEC, é altamente aceitável que o receptor SEC esteja envolvido na remoção/catabolismo dos complexos alfa1-AT-protease e outros complexos serpina-enzima.


Acknowledgments-We are grateful to Dr. Harvey Colten

Fonte: http://www.jbc.org/content/265/28/16713.long