Modulação da Expressão da Sintase de Óxido Nítrico Indutível pela Sumoilação

Candan A Akar e Douglas L Feinstein

RESUMO


EXPERIÊNCIA

Nos astrócitos (uma das grandes células da neuroglia do tecido nervoso – macroglia spider cell. Stedman), a indução da Sintase de Óxido Nítrico de Tipo 2 (NOS2) inflamatória é inibida pela noradrenalina (NA) no nível transcricional, mas seus efeitos em fatores de transcrição específicos não são totalmente conhecidos. [Obs.: a Noradrenalina também é chamada de Norepinefrina. A Noradrenalina é produzida nos nervos enquanto a adrenalina é formada na glândula supra-renal acima dos rins. O prefixo ‘nor’ indica: 1) eliminação de um grupamento metileno de uma cadeia; 2) contração de um anel; 3) prefixo químico que significa normal, isto é, cadeia não ramificada de átomos de carbono. Stedman. O prefixo nor- é derivado da abreviação germânica de ‘N ohne Radikal’, onde se lê N, o símbolo de nitrogênio, sem radical, em referência à ausência do grupo metil functional no átomo do nitrogênio. http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Norepinephrine_structure_with_descriptor.svg] Estudos recentes mostram que a atividade de vários fatores de transcrição incluindo C/EBPβ (proteína de ligação ao estimulador de CCAAT), o qual é necessário para a máxima expressão de NOS2, é modulado pela conjugação da proteína de pequeno peso molecular SUMO (Small Ubiquitin Like Modifier – pequeno modificador de tipo ubiquitina). Nós examinamos se a expressão dos genes relacionados a SUMO (SRGs: SUMO-1, a enzima de conjugação Ubc9, e a protease SENP1) é afetada pelas condições inflamatórias ou por noradrenalina e se a SUMO-1 regula a NOS2 através da interação com C/EBPβ.



[OBS.: Ubc9 – omim 601661 – 16p13.3 – As enzimas de conjugação a ubiquitina (E2s) são uma família de proteínas envolvidas no sistema de degradação de proteínas dependente de ubiquitina. Nas leveduras, ao menos 10 E2s diferentes têm sido identificadas; elas estão envolvidas nos processos celulares essenciais tais como reparo de DNA, controle do ciclo celular e resposta ao estresse. Usando o sistema de híbridos de duas leveduras com o domínio repressor do produto do gene tumoral de Wilms ( WT1 omim 607102) como isca, Wang e outros (1996) isolaram um cDNA codificador da enzima 9 de conjugação a ubiquitina (UBC9) da levedura homóloga à humana. O seqüenciamento da UBC9 humana revelou que ela tem 56% de identidade com a ubc9 da levedura e contém o sítio ativo de resíduo de cisteína necessário para a atividade de conjugação a ubiquitina de todas as enzimas E2.



A forma sumoilada da RANGAP1 (omim 602362) associa-se com o complexo do poro nuclear e é requerida para importação de proteínas para dentro do núcleo. Okuma e outros (1999) mostraram que a SUA1 (SAE1; omim 613294), UBA2 (613295) e a UBC9 catalizaram a sumoilação da RANGAP1 ‘in vitro’. Tênue modificação na RANGAP1 foi observada na ausência da UBC9. Okuna e outros (1999) concluíram que, em contraste com a reação de ubiquitinação de três etapas, a qual requer uma enzima E1 de ativação da ubiquitina, uma enzima E2 de conjugação a ubiquitina, e uma ligase E3 de ubiquitina, a sumoilação é uma reação de duas etapas na qual o dímero SUA1/UBA2 funciona como uma enzima E1 e a UBC9 funciona como uma enzima E2.


O trio frágil de histidina (FHIT; omim 601153), um gene candidato a supressor de tumor , localizado no 3p14.2, está deletado em muitos tipos de câncer. Usando uma sonda em híbridos de duas leveduras para procurar proteínas que interagem com a proteína FHIT ‘in vivo’, Shi e outros (2000) descobriram que a UBC9 se associa especificamente com a FHIT. Os últimos 21 aminoácidos no terminal C da UBC9 parecem não ser importantes para sua atividade biológico, já que uma UBC9 mutante abrigando a deleção desses aminoácidos pôde ainda assim restabelecer o crescimento normal da levedura contendo uma mutação no gene homólogo a UBC9 sensível à temperatura. Análises mutacionais indicaram que a UBC9 estava associada com a porção terminal C da FHIT. A interação entre a FHIT e a UBC9 pareceu ser independente da atividade enzimática de FHIT. Dado que a UBC9 da levedura está envolvida na degradação das ciclinas nas fases S e M, Shi e outros (2000) concluíram que a FHIT pode estar envolvida no controle do ciclo celular através de sua interação com a UBC9.]


[OBS.: RANGAP1 – omim 602362 – Proteína de ativação de GTPase : As pequenas proteínas de ligação a GTP parentes de RAS (GTPBPs), tais como RAN (omim 601179), participam em várias vias de transdução de sinal intracelulares. A forma ligada a GTP usualmente representa uma forma de sinalização ativa da proteína. A hidrólise do GTP em GDP e fosfato ocorre na ativação de uma atividade de GTPase latente na GTPBP e retona esta para sua forma inativa, o estado ligada a GDP. Essa atividade de GTPase latente é induzida na interação das GTPBPs ligadas a GTP com proteínas de ativação de GTPase (GAPs). Bischoff e outros (1994) purificaram uma GAP de um extrato de célula HeLa. A proteína, designada RanGAP1, é um polipeptídeo de 65 quilo-bases homodimérico. A RanGAP1 induziu especificamente a atividade de GTPase de RAN, mas não de RAS (omim 190020), em aproximadamente 1000 vezes. Boschoff e outros (1994) acreditaram que a RanGAP1 seja um antagonista imediato de RCC1 (omim179710), uma molécula reguladora que prende a RAN no estado ligado a GTP ativo.]


[OBS.: SENP1 – OMIM 612157 – 12q13.1 – A modificação covalente de proteínas pela proteína SUMO de tipo pequena ubiquitina (UBB; omim191339) (veja SUMO1; 601912) está implicada na regulação do transporte nucleocitoplasmático, estabilidade genômica, transcrição de genes, e outros processos. A sumoilação é catalisada em resíduos alvo de lisina por um processo de múltiplas enzimas e é revertido pelas enzimas desumoizadoras tais como sENP1 (Yamaguchi e outros, 2005).

A SUMO, um modificador pós-transcricional, atua num papel importante em vários processos celulares chave e é clivada de seu substrato pela SENP1 de tipo selvagem.


Xu e outros (2008) descobriram que as atividades da SENP1, SENP2 (608261), e Ulp1 eram inibidas pela oxidação. O peróxido induziu a formação de uma ligação dissulfeto intermolecular na SENP1 pela via de sítios ativos de cisteínas nas posições 603 e 613. Essa modificação reversível, também observada na Ulp1 da levedura, mas não na SENP2, conferia uma alta recuperação da atividade da enzima seguindo a inibição, bem como a proteção contra oxidação irreversível adicional e inibição da enzima. A formação de um dímero de SENP1 com ligações dissulfeto também foi detectada em células cultivadas em resposta ao estresse oxidativo. Experimentos examinando as estruturas em cristal da Ulp1 sob oxidação crescente de uma cisteína catalítica revelaram que a Ulp1 era extremamente sensível à oxidação média, ainda que ao nível do oxigênio atmosférico. Xu e outros (2008) concluíram que a SENP1 pode atuar como um sensor de redox e modular a desumoilação e as respostas celulares ao estresse oxidativo.

Gong e outros (2000) determinaram que o gene SENP1 contém 18 éxons e se expande por 61 quilobases. O éxon três contém o códon de iniciação transcricional.]



MÉTODOS

A endotoxina lipopolissacarídica da bacteria (LPS) foi usada para induzir respostas inflamatórias incluindo a expressão de NOS2 nos astrócitos primários. Os níveis de mRNA dos SRGs (Genes Relacionados a SUMO-1) foram determinados por QPCR (reação em cadeia da polimerase, quantitativa). Um papel funcional para a SUMOilação foi avaliada por efeitos determinantes da sobre-expressão dos SRGs no promotor da NOS2 e elementos repórter de ligação a NFkB construídos. Interações de SUMO-1 e C/EBPβ com o promotor da NOS2 foram examinados por ensaios de imunoprecipitação da cromatina. Interações de SUMO—1 com C/EBPβ foram examinadas por imunoprecipitação e análises de pigmentação Western e por ensaios de ressonância de transferidor de energia fluorescente (FRET).


RESULTADOS

O LPS diminuiu os níveis de mRNA de SUMO-1, Ubc9 e SENP1 em astrócitos primários e um decréscimo similar ocorreu durante o envelhecimento normal no cérebro. A noradrenalina atenuou as reduções induzidas pela LPS e aumentou os níveis de SUMO-1 acima dos níveis básicos. A sobre-expressão da SUMO-1, de Ubc9 ou de SENP1 reduziram a ativação do promotor da NOS2, enquanto a ativação de um elemento repórter de ligação a NFkB foi reduzido somente pela SUMO-1. Estudos de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) revelaram interações deSUMO-1 e C/EBPβ com sítios de ligação da C/EBPβ no promotor da NOS2 que eram modulados pela LPS e noradrenalina. A SUMO-1 co-precipitou com a C/EBPβ e uma íntima proximidade foi confirmada por análises de FRET.

CONCLUSÃO

Nossos resultados demonstram que a SUMOilação regula a expressão de NOS2 em astrócitos, e apontam para a modificação de C/EBPβ como um possível mecanismo de ação. O alvejamento da via da SUMOilação pode oferecer, dessa forma, um novo meio para regular a expressão da NOS2 inflamatória em condições neurológicas e doenças.




INTRODUÇÃO

O Óxido Nítrico gerado pela Sintase de Óxido Nítrico de Tipo 2 (NOS2, também chamada iNOS) contribui para a progressão da doença em uma variedade de distúrbios e condições neurológicas. A NOS2 é a forma independente de cálcio da família NOS cuja expressão é geralmente restrita, mas é alta e rapidamente induzida na ativação por uma variedade de estímulos, entre eles citocinas e a endotoxina lipopolissacarídica bacteriana (LPS). Vários investigadores têm confirmado a expressão da NOS2 em astrócitos primários na indução inflamatória bem como nas doenças neurológicas incluindo a Esclerose Múltipla (MS), seu modelo animal EAE, isquemia cerebral e doença de Alzheimer.

[OBS.:
1) 1999 Jun;72(6):2415-25.

A Sobre-regulação da Sintase Indutível de Óxido Nítrico em um Modelo de Camundongo Transgênico com Esclerose Lateral Amiotrófica

Mutações na superóxido dismutase de cobre/zinco (SOD1) são associadas com a forma familial da esclerose lateral amiotrófica (ALS), e sua expressão em camundongos transgênicos produzem a síndrome do tipo ALS. Aqui nós mostramos que, durante o curso da doença, a medula espinhal dos camundongos transgênicos expressando a SOD1 mutante (mSOD1) é o sítio não só de uma progressiva perda de neurônios motores, mas também de uma dramática gliose [crescimento exagerado de astrócitos em uma área de lesão no cérebro ou na medula espinhal. Stedman] caracterizada por astrócitos reativos e células microgliais ativadas. Essas mudanças estão ausentes da medula espinal de camundongos trangênicos de idades misturadas expressando a SOD1 normal e camundongos de tipo selvagem. Nós também demonstramos que, durante o curso da doença, a expressão da sintase de óxido nítrico indutível (iNOS) aumentou. Em ambos os primeiros e últimos estágios sintomáticos dos camundongos transgênicos com a SOD1 mutante, numerosas células com a aparência de células gliais são fortemente imuno-reativas a iNOS. Em adição, os níveis de mRNA de iNOS e a atividade catalítica desta estão aumentados significativamente na medula espinhal desses camundongos transgênicos com a iNOS mutante. Nenhuma dessas alterações é vista no cerebelo desses animais, uma região não afetada pela SOD1 mutante. Similarmente, nenhuma sobre-regulação da iNOS é detectada na medula espinhal de camundongos transgênicos de idades misturadas expressando a SOD1 normal ou camundongos de tipo selvagem. O curso de tempo da gliose da medula espinhal e da sobre-regulação da iNOS paraleliza o da perda de neurônios motores em camundongos transgênicos com SOD1 mutante. A expressão da sintase de óxido nítrico neuronal (nNOS) só é vista em neurônios na medula espinhal de camundongos transgênicos com SOD1 mutante, apesar do estágio da doença, e de camundongos transgênicos de idade misturada expressando SOD1 normal e de camundongos de tipo selvagem. Coletivamente, esses dados sugerem que as alterações observadas não iniciam a morte dos neurônios motores, mas podem contribuir para a propagação do processo degenerativo. Além disso, a sobre-regulação da iNOS, a qual por seu turno pode estimular a produção de óxido nítrico, proporciona sustentação adicional para o presumido papel deletério do óxido nítrico na patogênese da ALS. Essa observação também sugere que a iNOS pode representar um alvo valioso para o desenvolvimento de vias terapêuticas para a ALS. PMID10349851]

2) 2009 Sep 11;387(1):202-6. Epub 2009 Jul 4.

Regulação Diferencial da Sintase Indutível de Óxido Nítrico (iNOS) Neuronal na Medula Espinahl de Camundongos Mutantes em SOD1 (G93A) com ALS

A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é uma desordem neurológica fatal caracterizada pela degeneração de neurônios motores por toda parte do sistema nervoso central. Mutações na enzima recicladora de radicais livres a superoxido dismutase-1 (SOD1) são a causa da ALS familial mas não se sabem quais mutações levam à morte celular. Radicais livres tais como o óxido nítrico (NO) são considerados como agentes chaves de um papel patogênico. A NO é sintetizada pelas sintases de NO (NOSs) a partir da arginina, a qual é um fator limite da taxa de produção da NO. Nós encontramos que os neurônios motores positivos em NOS neuronal (nNOS) estavam esgotados enquanto as células gliais ativadas positivas para NOS indutível (iNOS) estavam aumentadas nos camundongos transgênicos com SOD1 mutante (G93A) com ALS. A expressão da iNOS foi sobre-regulada em consistência com o aumento da perda de neurônios motores e ativação glial e níveis de citrulina e NO enquanto a expressão de nNOS foi diminuída nos camundongos G93A com ALS. A administração de I-arginina aos camundongos G93A (mutação de glicina para alanina) reduziu a severidade do esgotamento dos neurônios motores e a ativação glial. Em animais tratados, a expressão da nNOS foi preservada enquanto a citrulina e o NO foram reduzidos, possivelmente devido à reduzida ativação da glia expressando iNOS. Nossos achados mostram que altas concentrações de NO correlacionam-se com a expressão de iNOS mais do que com a expressão de nNOS nos camundongos G93A com ALS. Isso sugere que a terapia focalizada na inibição da iNOS deveria ser uma direção frutificadora para a testes terapêuticos para ALS no futuro. PMID 19580782]



A transcrição do gene NOS2 tem-se mostrado requerer a ativação do fator de transcrição NFkB (Fator Nuclear kappa B); entretanto, em muitos tipos de células a ativação de proteínas de ligação do intensificador de CCAAT (C/EBPs) é necessária para a expressão máxima de NOS2. As C/EBPs constituem uma família de fatores de transcrição de zíper de leucina simples que formam homo e hetero-dímeros que se ligam a elementos regulatórios em cis (do mesmo lado da molécula) com afinidades variadas. O motivo de zíper de leucina constitui o domínio de dimerização da proteína C/EBP onde a região básica é a área de contato com o DNA que determina a especificidade da ligação. As isoformas da C/EBP incluem a C/EBPalfa, C/EBP beta (também conhecida como NF-IL6, Proteína de ligação a DNA dependente de IL-6, LAP, AGP/EBP ou CRP2), a C/EBP delta (também chamada de CRP3, CELF, ou NF-IL6b), a C/EBP gama (IgEBP), a C/EBP épsilon (CRP1) e C/EBP zeta (CHOP). A C/EBP beta é por si mesma composta de várias variantes devido ao uso de sítios alternativos de iniciação da tradução, resultando na C/EBPβ1 (a proteína de lente total também chamada LAP*), C/EBPβ2 (LAP, mais curta por 23 aminoácidos em contraposição a LAP*), e C/EBPβ-20 (LIP, a qual carece de domínio de transativação e é considerada uma isoforma negativa.


A expressão da NOS2 tem-se mostrado regulada pelo neurotransmissor noradrenalina (NA), por via da ativação de receptores adrenérgicos beta e de um aumento dos níveis de cAMP resultante. Embora o efeito da NA ocorra no nível transcricional, isso não inibe a ativação do NFkB ou sua ligação ao DNA. Uma região de 27 pares de base do promotor do gene NOS2 contendo um sítio CRE quase consenso (identidade de 6/7) e uma sítio de ligação consenso para C/EBP foi mostrado por ser crítico para a inibição pela NA levantando a possibilidade de regulação através desses fatores de transcrição.




A atividade dos membros da família C/EBP, como vários fatores e co-fatores de transcrição, é regulada pelo Modificador do Tipo Pequena Ubiquitina (SUMO). A ligação covalente da SUMO aos sítios aceptores em proteínas alvo envolve várias etapas de iniciação com a conversão do precursor em SUMO madura por uma hidrolase do terminal C (SENP). A Enzima de Ativação da SUMO (SAE) E1 transfere a SUMO a uma enzima de conjugação E2 (Ubc9) que então catalisa a formação de uma ligação isopeptídica entre a glicina do terminal C da SUMO e um grupo amino-ε de uma lisina alvo. A maioria das lisinas alvo está dentro dos motivos de consenso da SUMO, entretanto, proteínas sem tais motivos também podem ser SUMOiladas. As ligases E3 de SUMO (PIAS, RanBP2) aumentam a eficiência das reações possivelmente facilitando também a SUMOilação de alvos que carecem do motivo de consenso. As proteases (SENP) envolvidas na maturação também são responsáveis pela remoção da SUMO de seus substratos.


Relatos recentes implicando a SUMOilação na regulação da inflamação, bem como a transcrição de NOS2 combinados com nossos achados de que os efeitos da Noradrenalina na expressão de NOS2 envolve mais aceitavelmente a C/EBPβ nos capacitou investigar se a SUMO-1 está envolvida na reulação da transcrição da NOS2 através da modificação da C/EBPβ. Neste estudo nós mostramos que a expressão da SUM- e de duas enzimas críticas na SUMOilação (coletivamente referidas aqui como SRGs para abreviar Genes Relacionados a SUMO) bem como C/EBPβ são reguladas sob condições pró- e anti-inflamatórias, e que esses genes modulam a ativação do promotor do NOS2. Nossos dados sustentam além disso que as interações da SUMO-1 e da C/EBPβ ocorre no promotor do NOS2 e são importantes para a modulação da NOS2.


RESULTADOS

A Expressão dos SRG é Modulada por Estímulos Inflamatórios e por Noradrenalina

Os níveis de mRNA dos SGRs SUMO-1, Ubc9, e SENP1 foram determinados sob condições naïve (de virgindade celular) ou inflamatórias nos astrócitos primários. O tratamento com LPS resultou em uma queda de aproximadamente 50% nos níveis de mRNA de Ubc9 e SENP1, e numa queda de aproximadamente 30% nos níveis de mRNA de SUMO-1 em comparação com células de controle não tratadas. A presença da Noradrenalina alterou o efeito do LPS nessas enzimas e na SUMO-1 em vários graus. O efeito inibitório do LPS na SENP1 foi atenuado por aproximadamente 50% enquanto o nível de mRNA de Ubc9 foi restaurado de volta aos níveis de não tratamento. A Noradrenalina não somente reverteu o efeito do LPS nos níveis de mRNA de SUMO-1 mas causou um aumento de aproximadamente 20%. O efeito inflamatório do LPS foi verificado por um aumento no mRNA de NOS2. Os níveis de mRNA de C/EBPβ também foram aumentados pelo LPS, consistente com seu envolvimento na ativação inflamatória. Como mostrado previamente, o co-tratamento com Noradrenalina reduziu o efeito do LPS na NOS2, mas não teve efeito nos níveis de mRNA de C/EBPβ.


A Expressão dos SGR Diminui com a Idade

Durante a idade, ocorre uma redução nos níveis de Noradrenalina no cérebro, o que poderia contribuir para o dano neurológico aumentado. Análises da expressão de SUMO-1 e dos níveis de mRNA da enzima conjugadora Ubc9 revelaram uma mudança significativa dependente da idade nos níveis de mRNA de SUMO-1 e de Ubc9 no córtex frontal de camundongos C57BL/6 de tipo selvagem entre três e quinze meses de idade, com valores aos quinze meses reduzidos em aproximadamente 70% em comparação com os valores medidos aos três meses. Durante esse tempo, também havia uma mudança significativa dependente da idade nos níveis de mRNA de C/EBPβ e de NOS2 , com aumentos de três a cinco vezes medidos entre os três e quinze meses de idade, sugerindo um aumento dependente da idade no estado inflamatório geral.



Sobre-expressão de SRGs Modula a Atividade do Promotor de NOS2

Para determinar se a SUMOilação estava envolvida na ativação inflamatória, células de glioma do rato C6 firmemente transfectadas com construções de pNFkB (elemento de ligação a 4 vezes NFkB) com repórter de luciferase ou com pGL3-2.2 (contendo a sequência 2.2 kB do promotor de NOS2) foram transitoriamente transfectadas com plasmídios de expressão de SRG e a ativação do promotor por LPS foi determinada. A sobre-expressão da SUMO-1 diminuiu o aumento dependente de LPS na atividade de ambas as construções. O aumento nos níveis de Ubc9 não afetou a atividade do pNFkB mas diminuiu a atividade do pGL3-2.2. Similarmente, a sobre-expressão da protease de SUMO, SENP1, não afetou o pNFkB mas diminuiu a atividade do pGL3-2.2.



Efeitos do LPS e da Noradrenalina na Associação de C/EBPβ e SUMO-1 com o Promotor de NOS2.

O envolvimento da C/EBPβ e da SUMO-1 na transcrição de NOS2 foi investigado mais além usando-se ensaios ChIP (imuno-precipitação na cromatina) para detectar a associação dessas proteínas com regiões do promotor de NOS2 contendo tanto o sítio de C/EBP-2 ou de C/EBP-3. A C/EBPβ foi encontrada em associação com amos os sítios de C/EBP-2 e C/EBP-3 sob todas as condições, entretanto a ligação a C/EBP2 foi aumentada pelo tratamento com LPS mais Noradrenalina. A SUMO-1 foi detectada em ambos os sítios, embora um sinal mais forte fosse obtido com o fragmento do promotor de NOS2 contendo o sítio C/EBP-3. O tratamento com LPS reduziu a associação da SUMO-1 com esse sítio enquanto a adição de Noradrenalina o restaurou. A re-precipitação dos fragmentos de interação de SUMO-1 com anticorpos anti-C/EBPβ mostraram que sob todas as condições, o sítio C/EBPβ também interagiu com a C/EBPβ. Em contraste houve pouca evidência para a associação simultânea de ambas SUMO-1 e C/EBPβ no sítio C/EBP-2. Uma interação da SUMO-1 com a C/EBPβ foi confirmada por pigmentação Western que mostrou que a SUMO-1 imuno-precipitou com a C/EBPβ, e essa interação foi aumentada na presença de Noradrenalina.



A Interação da SUMO-1 com a C/EBPβ

A possibilidade de que a C/EBPβ possa ser SUMOilada nos astrócitos primários foi testada além usando-se análises FRET (ressonância de transferência de energia fluorescente). Os astrócitos primários foram co-transfectados com plasmídios de expressão codificando C/EBPβ etiquetada com CFP e SUMO-1 etiquetada com YFP, e a FRET medida pelo aumento no doador de fluorescência (CFP-C/EBPβ) após o foto-branqueamento da molécula aceptora (YFP-SUMO-1). O foto-branqueamento aceptor de ROIs (intermediários de oxigênio reativo) seletivos nas células expressando ambos fluoroporos resultou em um aumento significativo de doadores de fluorescência, consistente com a íntima proximidade da C/EBPβ e a SUMO-1 já que a FRET só pode ocorrer entre um par de doador e aceptor a distâncias menores que 10 nanômetros.

[OBS.: Fluoroporos: Um fluoroporo, em analogia com um cromoporo, é um componente de uma molécula que a torna fluorescente. Ele é um grupo funcional em uma molécula que absorverá energia de um comprimento de onda específico e a re-emite em um comprimento de onda diferente (mas igualmente específico). A quantidade e o comprimento de onda de energia emitido depende de ambos o fluoroporo e o ambiente químico do fluoroporo. Essa tecnologia tem importância particular no campo da boquímica e dos estudos de proteínas, ou seja na imuno-fluorescência e na imuno-histoquímica. http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore]

DISCUSSÃO

Nesse estudo, nós demonstramos que a SUMO-1 e as enzimas Ubc9 e SENP1 do processo de SUMOilação são expressadas nos astrócitos primários e que sua expressão é modificada sob condições inflamatórias. Nós também mostramos que a sobre-expressão dessas proteínas modifica a resposta dos astrócitos ao LPS, demonstrando um papel funcional para a SUMOilação nos astrócitos. Para nosso conhecimento, esse é o primeiro relato a caracterizar a SUMO-1 e as SGRs nos astrócitos, confirmando a existência e funcionalidade dessa importante via de sinalização em um dos tipos de células mais abundantes no cérebro.




Nossos dados mostram que as condições pró-inflamatórias que são induzidas por LPS ou durante o envelhecimento normal, e, como evidenciado por um significativo aumento na expressão de NOS2 bem como de C/EBPβ, diminuem os níveis de expressão da SUMO-1, Ubc9 e da protease SENP1, sugerindo um papel anti-inflamatório para a SUMO-1 no cérebro. Embora um decréscimo na expressão da SENP1 deva ser esperado para promover a inflamação (pela redução geral do estado e SUMOilação), essa enzima também está envolvida na maturação da SUMO-1. O fato de que a Noradrenalina, um neurotransmissor anti-inflamatório, atenua os efeitos do LPS em ambos SRGs e NOS2 sustenta ainda mais um papel anti-inflamatório para a SUMO-1, e sugere que a SUMOilação contribui para os efeitos da Noradrenalina. A redução nos níveis de Noradrenalina que ocorre durante o envelhecimento poderia dessa forma contribuir para o decréscimo das SRGs dependente da idade.



Em nossos experimentos a atividade do promotor de NOS2 foi diminuída quando a SUMO-1, Ubc9, ou SENP1 estavam sobre-expressadas, sugerindo um papel inibidor nos astrócitos primários. A sobre-expressão da SUMO-1 também diminuiu a atividade de um plasmídeo repórter de pNFkB que só pode ligar NFkB, o qual, por si mesmo, não é um alvo da SUMO, por isso implicando a modulação da atividade de NFkB através da interação com outros fatores como NEMO, IKK, ou a proteína inibidora IĸBα. Já que a Noradrenalina aumenta ambos os SRGs bem como a IĸBα, isso ergue a possibilidade de que a SUMOilação da IĸBα contribua para os efeitos inibidores da Noradrenalina. Entretanto, o fato de que a sobre-expressão da Ubc9 ou da SENP1 não afeta a atividade do pNFkB sugere que sua habilidade em inibir a NOS2 envolve a SUMOilação de proteínas outras que as moléculas relacionadas com NFkB.



O aumento que nós observamos nos níveis de mRNA de C/EBPβ causado pelo estímulo inflamatório está de acordo com estudos prévios. Interessantemente, e, como nós mostramos antes para a ativação do NFkB, a Noradrenalina não afeta os níveis de mRNA de C/EBPβ embora reduza os de mRNA de NOS2. Várias reportagens têm mostrado que a atividade da C/EBPβ é controlada pela modulação de sua ligação ao DNA e em muitos tipos de células a NFkB e a C/EBPβ cooperam na regulação da transcrição de NOS2. Isso sugere que a Noradrenalina poderia inibir a ativação de NOS2 pela alteração na interação da C/EBPβ com o DNA e/ou com NFkB.




Embora algumas reportagens sugiram que outras C/EBPs possam estar envolvidas na regulação da expressão de NOS2, neste papel nós focalizamos a atenção na isoforma C/EBPβ já que na maioria dos estudos a transcrição de NOS2 tem-se mostrado envolver a C/EBPβ. Nas células de glioma do rato C6, a indução da NOS2 pela sobre-expressão de MAPKs foi bloqueada por uma forma negativa da C/EBPβ. Nos astrócitos humanos, a ativação pela proteína tat do HIV-1 induziu a expressão de C/EBPβ e uma forma dominante negativa da C/EBPβ bloqueou a produção de óxido nítrico. Nas células do músculo liso a indução da NOS2 era acompanhada pela ligação da C/EBPβ ao promotor de NOS2, quando induzida por LPS e IFNgama. Nas células do fígado, a sobre-expressão do LIP inibidor 20 de C/EBPβ suprimiu a atividade do promotor da NOS2 humana. Outros inibidores também têm sido apresentados por reduzirem a expressão de NOS2 associada com um decréscimo nos níveis de C/EBPβ ou ligação ao promotor.



Embora vários papéis para a SUMOilação no cérebro tenham sido relatados, os estudos são limitados na descrição da capacidade da SUMOilação em regular a inflamação no cérebro. A SUMOilação pode ter ações pró- ou anti-inflamatórias, dependendo da isoforma específica da SUMO que está conjugada e da proteína alvo. Os níveis de SUMO-1 são mostrados baixos nas amostras de doença de Parkingson e de Alzheimer; enquanto as SUMO-2 e 3 foram detectadas em altos níveis no córtex após a isquemia. Estudos de transfecção têm mostrado que a SUMOilação da proteína precursora da amilóide reduziu a produção de amilóide beta nos neurônios humanos e nas células HeLa; e que a modificação pela SUMO-1 aumentou a estabilidade da superóxido dismutase 1 e a agregação. A proteína IRAK1 (cinase de tipo 1 associada a receptor de interleucina1) a qual transduz a sinalização da IL1 e respostas imunes de receptores Toll-like é SUMOilada no cérebro, o que poderia influenciar sua habilidade em modular a inflamação.





A SUMOilação é conhecida por modular fator de transcrição: interações com DNA e em muitos casos tem sido mostrada como atenuante de respostas inflamatórias, A SUMOilação de JunB modifica sua habilidade em induzir a expressão de citocinas, a SUMOilação de PPARgama aumenta sua interação com o co-repressor NCoR e impede respostas inflamatórias, a SUMO-e pode modificar vários membros da via de sinalização de NFkB, incluindo NEMO (modulador essencial de NFkB) necessário para a ativação de NFkB, bem como a proteína IĸBα inibitória, e sua cinase IKK; e a SUMOilação da STAT1 reduz a transcrição mediada por STAT1 dependente de IFN (interferón). A SUMOilação das C/EBPs tem-se mostrado modular a transcrição, e em muitos casos associada com atividade reduzida. Um aumento na C/EBPβ SUMOilada reduz a transcrição da albumina. Similarmente, os elementos de controle sinérgico da C/ENPα são considerados requerentes da SUMOilação para atividade. Por isso nós consideramos a possibilidade de que a Noradrenalina alterava a atividade da C/EBPβ através da SUMOilação.




Existem vários sítios de ligação para membros da família C/EBP no promotor da NOS2 do rato, dois dos quais estão localizados junto ao sítio de ligação a NFkB próximo (C/EBP-2 está localizada a montante e a C/EBP-3 a jusante). Resultados de ChIP (imunoprecipitação na cromatina) mostram que o tratamento com LPS está associado com níveis diminuídos de associação de SUMO-1 com CEBP-3; e que a Noradrenalina restaura esses níveis (ou impede a perda induzida pelo LPS). Isso sugere que a SUMO-1 neste sítio exerce efeitos supressores. Nós observamos que a C/EBPβ estava ligada em ambos os sítios 2 e 3, e não era significativamente modificada por LPS; entretanto na presença de Noradrenalina houve um claro aumento da C/EBPβ neste sítio 2. Embora a C/EBPβ seja geralmente considerada pró-inflamatória, como indicado acima, existem também estudos mostrando que ela pode suprimir a transcrição. A C/EBPβ reprime a ativação do promotor da ciclina D; a ativação da expressão de c-Myc nas células T.




Experimentos de imuno-precipitação sequencial mostrando ambas C/EBPβ e SUMO-1 interagindo com o sítio C/CBP-3 sugerem que o fator SUMOilado neste sítio pode ser C/EBPβ. Os resultados de análises de pimentação Western e FRET indicam fortemente que a C/EBPβ é SUMOilada entretanto esses resultados também podem indicar a presença de um complexo contendo ambos C/EBPβ e fatores SUMOilados. Assim, nós concluímos que os efeitos supressores da Noradrenalina na expressão de NOS2 envolve uma aumentada SUMOilação no promotor de NOS2.



Já que neste papel nós focalizamos a atenção na modificação da C/EBPβ pela SUMO-1, nossos resultados não endereçam a possibilidade de o estímulo inflamatório ou a Noradrenalina modificar as interações da SUMO-2 ou da SUMO-3 com o promotor da NOS2 ou com C/EBPβ, como recentemente relatado ocorrer em células de ovário de ramster 1 (COS1). Além disso, nesses estudos, nós usamos um anticorpo direcionado contra o terminal amina da C/EBPβ o qual não distingue as isoformas da C/EBPβ; entretanto o achado de que a C/EBPβ é um alvo preferencial para a SUMOilação sugere que nossos resultados podem refletir primariamente a SUMOilação dessa isoforma.

CONCLUSÃO

Nossos resultados demonstram um papel importante para a SUMOilação na regulação da expressão da NOS2 nos astrócitos, e apontam para a modificação do C/EBPβ como um determinante crítico. Entretanto, existem possivelmente outros alvos de SUMO envolvidos na regulação da transcrição da NOS2 os quais podem também contribuir para os efeitos supressores da Noradrenalina que precisam ser caracterizados. Em vista do conhecido envolvimento da NOS2 em uma variedade de doenças neurológicas e condições neurológicas, o conhecimento de que o aumento dos processos de SUMOilação podem reduzir a expressão de NOS2 proporciona novos alvos para intervenções terapêuticas.

LISTA DE ABREVIATURAS

EAE: experimental acute encephalomyelitis; NFκB: nuclear factor κB; C/EBP: CCAAT enhancer-binding protein; MAPK: mitogen activated protein kinase; PIAS: protein inhibitors of activated stat; CRE: cAMP response element; CFP: cyan fluorescent protein; YFP: yellow fluorescent protein; CREB: cAMP response element binding protein; IL1: interleukin1; PPARγ: peroxisome-proliferator-activated-receptorγ; NCoR: nuclear receptor co-repressor; IκB: inhibitor of nuclear factor κB; IKK: IκB kinase; STAT: signal transducers and activators of transcription; QPCR: quantitative polymerase chain reaction; GDH: glyceraldehyde dehydrogenase.

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2667488/?tool=pubmed