MIM *147100
Lócus da Cadeia Pesada de IgG; IGHG1
Lócus do gene mapeado: 14q32.33
Texto
Ao menos dois lócus autossômicos separados determinando o tipo sorológico da globulina gama foram identificados nas décadas de 1950 e 1960. Um foi referido como lócus Gm e o outro como lócus Inv. A genética das globulinas gama têm-se como reveladoras de princípios gerais como tem sido as das hemoglobinas. O sistema Gm está associado com as cadeias pesadas das moléculas IgG codificadas, como foram encontradas mais tarde, pelo cromossomo 14; o sistema Inv está associado com as cadeias kappa leves (147200). (Veja Anônimo, 1966 para notação recomendada para tipos Gm e Inv.)
Hood e Ein (1968) apresentaram evidências de que as cadeias leves são uma exceção à regra de “um gene, uma cadeia polipeptídica”. Dois lócus separados (um lócus de região específica e um lócus de região comum) pareciam codificar uma única e contínua cadeia polipeptídica. Três lócus intimamente ligados (IgG1, IgG2 e IgG3) foram considerados responsáveis pelas especificidades do Gm. Van Loghem e outros (1970) apresentaram evidência do relacionamento da ligação dos marcadores de imunoglobulinas (gama 1, 2, 3, Am). Que os lócus gama G3 e gama G1 estavam intimamente ligados foi indicado pelos achados em uma proteína de mieloma de tipo Lepore (Kunkel e outros, 1969). Um quarto lócus IgG (gamma-G4) era identificável no conjunto. A possibilidade de uma família sustentando a sequência (do começão ao terminal N) da alfa-2, gama-4, gama-2, gama-3 e gama-1 foi apresentada por Lefranc e outros (1977).
Gedde-Dahl e outros (1972, 1975) apresentaram dados sobre a ligação da Gm no PI (Alfa-1-antitripsina 107400). Eles consideraram a heterogeneidade da fração de recombinação entre homens de diferentes tipos de PI como muito parecida. A maior diferença parecia ser entre o alelo Z do PI (inibidor de protease) e outros alelos. As possíveis explicações incluíam uma deleção cromossômica, inversão ou lócus de regulação de recombinação em desequilíbrio de ligação com o lócus da PI. Bender e outros (1979) excluíram a Gm (gama globulina), a PI e o C3 do seguimento 6q25-qter e a Gm e a PI do 6p. Veja 182870 para evidência da ligação com a esferocitose (presença de eritrócitos esféricos no sangue; Stedman) hereditária. Croce e outros (1979) estudaram células somáticas híbridas entre células de mieloma de camundongo e tanto linfócitos periféricos humanos e células humanas linfoblastóides ou de mieloma. Eles observaram que a presença ou ausência do cromossomo 14 correlacionava-se com a formação das cadeias pesadas mu, gamma e alfa. Smith e outros (1981) confirmaram a assinatura da família dos genes da cadeia pesada da imunoglobulina no cromossomo 14.
Green (1979) revisaram a genética das imunoglobulinas em camundongos e propuseram uma nomenclatura. A partir do estudo de células somáticas híbridas, Hengartner e outros (1978) concluíram que o lócus para as cadeias pesadas de imunoglobulinas estão no cromossomo 12 do camundongo. Meo e outros (1980) relataram o mapeamento conclusivo da Igh-1 e o lócus ligado da pré-albumina no cromossomo 12 do camundongo. No camundongo, as regiões variável e constante da cadeia pesada, Igh-V e Igh-C (Green, 1979), ocupam um segmento cromossômico de ao menos 7 a 11 unidades de comprimento (Pesetsky e Sachs, 1977), e estam ligadas, provavelmante no final da cadeia Igh-C, com o lócus da pré-albumina sérica a uma distância de 11 unidades (Taylor e outros, 1975). Steinberg e outros (1975) descreveram polimorfismos das duas Gm e Inv nos babuínos do Kênia.
No homem e no camundongo, o fino mapeamento do gene da imunoglobulina progrediu mais rápido do que a assinatura no cromossomo e na respectiva região. Pensava-se que os lócus da imunoglobulina estavam localizados em três regiões cromossômicas diferentes carregando os lócus da cadeia pesada, da cadeia leve kappa e da cadeia leve lambda. Pensava-se que cada região continha um ou mais lócus especificando a região constante e um número maior de lócus especificando a região variável de uma cadeia de imunoglobulina particular. Evidências do camundongo indicaram que as sequências códon de cada cadeia leve, kappa e lambda, são construídas durante a diferenciação das células precursoras do plasma pela junção de segmentos do DNA previamente separadas e distantes. Davis e outros (1980) mostraram que os genes da cadeia pesada contêm três segmentos de genes, V(H), J(H) e C(H), análogos aos três segmentos dos genes da cadeia leve e que ao menos dois eventos de recombinação têm lugar durante a diferenciação da produção de anticorpos ou da célula B. A estrutura dos genes da imunolobulina e seus rearranjos durante a maturação do linfócito foram revisados por Robertson (1981); veja também Marx (1981). No homem. A família de genes da cadeia pesada da imunoglobulina tem, começando do final da ponta 5, 250 ou mais genes variáveis, 5 genes J (quatro são ativos), ao menos 10 genes D (para diversidade), e os genes da parte constante das cadeias pesadas mu, delta, gama, épsilon e alfa da IgM, IgD, IgE e IgA respectivamente. No camundongo, a organização do gene C(H) é 5-prime-J(H)-(6,5 quilobases)-mu-(4,5 quilobases)-delta-(quilobases desconhecidas)-gama-3-(34 quilobases)-gama-1-(21 quilobases)-gama-2-(15 quilobases)-gama 2a-(14,5 quilobases)-epsilon-(12,5 quilobases)-alfa-3-prime (Shimizu e outros 1981). De acordo com o dogma corrente pelos 1981, um gene da cadeia H completa é formado por ao menos dois tipos de eventos combinacionais: (1) a recombinação entre uma V(H) dada, uma J(H) dada, e um segmento de gene D dado para formar a região V do gene, e (2) uma substituição (troca/alternação) de classe a um gene C(H) particular começando com um e a última troca de qualquer um dos outros. Klein (1981) descobriu que os tumores derivados de células B (mieloma do camundongo, linfoma de Burkitt humano e leucemia linfoblástica aguda da célula B) têm padrões anômalos de síntese de imunoglobulina que correlacionam-se com o tipo de aberração cromossômica. Observações similares foram feitas por Lenoir e outros (1982) que tinham coletado o maior número de translocações no linfoma de Burkitt. Dos dez testados, todos concordavam com a hipótese da expressão da cadeia leve: todas as células com translocações de 8 para 12 produziam a lambda como a única cadeia leve; todas as células com translocação do 8 para o 22 produziam somente a cadeia kappa; e as células com translocação do 8 para o 14 produziam tanto a cadeia kappa quanto a lambda, com uma taxa aproximada de 2 para 1.
A amiloidose de cadeia leve (AL; veja 254500; amiloidose relacionada a imunoglobulina primária – amiloidose é uma doença caracterizada por acúmulo extracelular de amilóide em vários órgãos e tecidos do corpo; Stedman) está associada com discrasia das células clonais do plasma que estão frequentemente imperceptíveis e não proliferativas. Translocações ilegítimas envolvendo o gene da cadeia pesada da imunoglobulina no 14q32 e deleções do braço longo do cromossomo 13 comumente ocorrem no mieloma múltiplo, gamopatia monoclonal e sinificância indeterminada (MGUS), e leucemia das células do plasma. Em um estudo de 32 pacientes com amiloidose (24 com doença sistêmica e 8 com doença localizada), Harrison e outros (2002) descobriram translocações envolvendo a IGH e adicionalmente encontraram deleções no 13q, usando interface de duas cores em fluorescência em sítio de hibridização. As translocações da IGH foram observadas em 11 pacientes, dos quais nove tinham a fusão IGH/CCND1 (168461) da translocação (11;14)(q13;q32).
Kawamata e outros (2002) demonstraram o envolvimento do gene IHG1 em uma translocação (1;14)(q25;q32) encontrada na leucemia linfoblástica aguda da célula B. O rearranjo dos genes IGHG1 e LHX4 (602146) resultou em uma região regulatória na ponta 5 do LHX4 sendo substituída pela região intensificadora do gene IGHG1 no cromossomo 14q32. Isso levou à sobre-expressão do gene LHX4 nas células leucêmicas.
Veja também entradas para as regiões constante, variável, J e D de cada uma das cadeias de imunoglobulina pesada, lambda e kappa, em 147200. Pode-se, com certeza, ver cada uma das três como um super-gene e os segmentos codificadores C, V, J e D do DNA como éxons de um super-gene (VAM).
Os genes da imunoglobulina estão em uma região cromossômica notada por sua alta freqüência de quebras associada com rearranjo cromossêmico, ocorrendo tanto espontâneamente em linfócitos cultivados quanto em certas malignidades. Por meio da mesma translocação de X para 14 (conhecida como KOP para Kirby, Opitz e Pallister, o paciente, interprete e descobridor, respectivamente) que foi usada para mapear os genes G6PD e HGPRT no braço longo do cromossomo X (Ricciuti e Ruddle, 1973), Balazs e outros (1982) concluíram que a D14S1 está intimamente ligada ao lócus da cadeia pesada da imunoglobulina e distante do 14q32, isto é, na região sub-telomérica do 14q. O estudo de ligação em cadeia em uma família mostrou que a probabilidade máxima de recombinação entre D14S1 e Gm era de 3,1% com 90% acima do limite de 11,5%. Cox e outros (1982) relataram sobre a família de uma pessoa com um cromossomo 14 em anel no qual um ponto de quebra estava localizado no 14q32.3. A pessoa afetada não expressava o marcador da cadeia pesada alotípica gama-C, Gm, do haplótipo materno indicando que o material genético necessário para a expressão da Gm está localizado a distância do 14q32.3. A partir do estudo de duas famílias com anomalias no braço longo do cromossomo 14, Cox e outros (1982) localizaram o GM em 14q32.3 e a PI (alfa-1-antitripsina) em uma posição mais próxima entre 14q24.3 e 14q32.1. Cox e outros (1984) refinaram a assinatura em 14q32.33-qter. Linsley e outros (1983) descobriram RFLPs associadas com os genes da cadeia pesada gama-C. A pessoa com o cromossomo 14 em anel não tinha o complemento maternal dos fragmentos de hibridização do gene gama-C. Um pseudogene da gama-C foi identificado. O D14S1 (107750) não foi deletado do 14 em anel.
[D14S1 107750: Rif Lip: Um número signo foi usado nesta entrada porque ela não representa um gene expressado. Ela está incluída aqui principalmente por propósitos históricos, já que o D14S1 foi o primeiro RFLP a ser identificado (após o polimorfismo de DNA descoberto por Kan e Dozy (1978)).
Botstein e outros (1980) sugeriram que a variação nas sequências de nucleotídos resultantes da variação da clivagem por endonucleases em sítios específicos (enzimas de restrição) são suficientemente freqüentes no genoma humano bem como são altamente úteis como marcadores no mapeamento do cromossomo. Eles sugeriram a designação polimorfismo na lente do fragmento de restrição (acrônimo, RFLP, pronunciado ‘rif-lip’). Para ser útil, o polimorfismo deveria estar numa sequência de cópia única. Uma coleção de 150 a 200 desses polimorfismos distribuída pelo genoma poderia ter o potencial para aumentar grandiosamente o poder dos estudos de ligação em cadeia de uma família. Desordens de reduzida penetração e com múltiplos fatores de causa estariam facilitadas à análise genética. O polimorfismo da HpaI (143020) em um segmento não codificador na ponta 3 flanqueando o gene da beta-globina foi o primeiro a ser achado, por Kan e Dozy (1978). O polimorfismo foi então definido na parte não codificadora dos genes da globina gama (142200). Antes, o papel de Botstein e outros (1980), Solomon e Bodmer (1979) tinha sugerido a utilidade dos polimorfismos de restrição como marcadores nos estudos de ligação em cadeia.]
Burrows e outros (1983) mostraram que um rearranjo, e não um processamento diferencial do RNA, ocorre na troca de classe da cadeia pesada. Eles demonstraram a perda de sequências de DNA entre os segmentos J(H) e C(G2b) do gene em uma linha celular do camundongo. Deleções de genes específicos da região constante são propensas a ocorre através de pareamento não-homólogo e crossing over desigual. Este é um mecanismo da evolução e um mecanismo da patogênese de deficiências de imunoglobulina seletiva. O estudo das deleções tem sido útil para a confirmação da ordem do gene demonstrada pela clonagem de DNA (este gênero, Ellinson e Hood, 1982; Flanagan e RAbbitts, 1982; Hisajima e outros, 1983; Max e outros, 1982) e por análises de ligação com ambos os marcadores de DNA e alotípicos (este gênero, Bech-Hansen e outros, 1983; Migone e outros, 1983). Lefranc e outros (1983) acharam, em membros aparentemente saudáveis de comunidades altamente consanguíneas dos Bérberes da Tunísia, dois tipos de deleções do gene IgHC. Uma deleção encontrada por Keyeux e outros (1989) em seis indivíduos em duas famílias diferentes (família HASS e família TOU) representavam uma ausência simultânea das imunoglobulinas IgG1, IgG2, IgG4 e IgA1. Essa deleção permitiu a determinação da ordem dos genes da imunoglobulina IgCH e a localização do pseudogene gama entre A1 e G2. A família TOU tinha uma segunda deleção que incluía somente o peseudoene-1 epsilon, A1 e pseudogene gama. Keyeux e outros (1989) demonstraram que a deleção multigênica no conjunto IgCH envolve duas regiões altamente homólogas, chamadas hsg3 e hsg4, as quais são pontos quentes de recombinação, e troca de sequências do lado de fora. (Hsg3 está localizado a jusante do G3 e a hsg4 está localizada a jusante do G4; daí a sua designação.) Migone e outros (1984) identificaram dois tipos adicionais de deleções múltipas no gene da cadeia pesada. Uma incluía o gene IgE. As deleções eram transmitidas de modo mendeliano e a despeito da homozigosidade pareciam não ter efeitos nocivo. (A ausência seletiva de uma única sub-classe de IgG foi encontrada ocasionalmente por teste imunológico para alótipos e isótipos.) Migone e outros (1984) puderam confirmar a localização do gene pseudo gama entre os genes alfa-1 e gama-2. É possível que algumas instâncias de hipogamaglobulinemia variável combinada ou deficiência na seleção de imunoglobulinas sejam causadas pela deleção ou outras mudanças nesta região.
Hofker e outros (1989) determinaram o mapa físico completo da região constante da cadeia pesada por meio de eletroforese com campo de pulsação em gel. Os genes dessa região estão contidos dentro de um segmento de 300 quilobases. Em ambos, o homem e o camundongo, a ordem é ponta 5-IGHM—IGHD—IGHG—IGHE—IGHA—ponta 3. O gene gama-C foi duplicado produzindo quatro cópias no camundongo. No homem, após uma duplicação inicial do gama-C, todo o segmento gama-C/gama-C/épsilon-C/alfa-C foi duplicado. Hofker e outros (1989) descobriram que um segmento de 60 quilobases separa o lócus do delta-C e a ponta final 5 do conjunto contendo IGHG3, IGHG1, IGHCEP1, e IGHCA1 nesta ordem. A uma distância de 80 quilobases da ponta 3 ao IGHA1 jaz o segundo conjunto de IGHG2, IGHG4, IGHE e IGHA2. O pseudogene gama-C resida a aproximadamente 35 quilobases ao lado do IGHA1 no sentido da ponta 3.
Zelaschi e outros (1983) usaram anticorpos monoclonais surgidos nos camundongos para definir ‘novos’ determinantes de Gm. Jazwinska e outros (1988) demonstraram que análises de RFLP podem ser substituídas por determinação sorológica do tipo de Gm e ressaltaram várias vantagens do método genético molecular. Ghanem e outros (1989) descobriram extensas variações no tipo de RFLP em africanos negros envolvendo principalmente os genes IGHG3 e IGHG1, a maior parte dos membros da família IGHG na ponta 5. Polimorfismos são muito mais presentes em africanos negros do que em caucasóides. O mesmo resultado foi sugerido pelo estudo dos haplótipos Gm os quais tem sido referidos como 1m, G3m, A2m e Em, correspondendo às sub-classes IgG e IgA e à classe IgE para as quais eles são marcadores. Os alelos nos lócus respectivos são herdados em combinações fixas, ou haplótipos Gm-Am-Em. Embora as freqüências do gene Km mostrassem uma distribuição aleatória na população estudada, Zhao e Lee (1989) encontraram que os haplótipos Gm eram altamente úteis no mapeamento das origens da nação chinesa. Uma comparação com as frequências do haplótipo Gm em outras populações sugeriu que durante a evolução humana o grupo negróide e o grupo mongolóide-caucasóide divergiram primeiro, seguidos por uma divergência entre o mongolóide e o caucasóide. Os dados pareceram indicar dois sub-grupos distintos da raça mongolóide, do norte e do sul, correspondendo a populações que se originaram no vale do rio Amarelo e no vale do rio Yangtze, respectivamente. Zhao e Lee (1989) descobriram que as populações mongolóides do norte e do sul têm os haplótipos Gm (1;21) e Gm (1,3;5) como marcadores associados à raça, respectivamente. Eles atribuíram a presença do haplótipo associado ao caucasóide Gm(3;5) em várias minorias vivendo na parte noroeste da China à mistura ao longo da Estrada da Seda. A quantidade de mistura caucasiana foi estimada.
O lócus da região constante da cadeia pesada mostra organização em múltiplos níveis de homologia interna, sugerindo uma história evolutiva complexa com repetidos eventos de duplicação. A instabilidade genética persistente da região é sobressaltada pela observação não incomum de deleções ou duplicações, as quais provavelmente originaram-se através de eventos desiguais de crossing over. Bottaro e outros (1989), por análises de tais deleções em campo de gel pulsado, determinaram o sequinte mapa: --um-5quilobases – delta—gama-3 – 26 quilobases—gama-1—19 quilobases—psi-epsilon—13 quilobases—alfa-1--?60 quilobases—psi-gama--?40quilobases—gama-2—18 quilobases—gama-4—23 quilobases – épsilon—10 quilobases—alfa-2.
Peschon e outros (1994) descobriram uma redução de aproximadamente 10 vezes nas células B precursoras com rearranjos completos de IgH e em linfócitos B com superfície IgM+ em camundongos -/- IL7R-alfa (IL7R; 146661) quando comparados a heterosigotos de controle com idades misturadas. Em tais camundongos, Corcoran e outros (1998) mostraram que a recombinação D(H)-J(H) procedia normalmente mas que a junção V(H)-D(H)-J(H) estava diminuída; esse de decréscimo foi maior com o aumento na distância do segmento V(H) dos segmentos D(H)/J(H). Transcritos da linha germinativa de segmentos V distantes e não rearranjados, um marcador de mudanças na cromatina que precede a recombinação estavam especificamente silenciados. Assim, ligantes do receptor de IL7 entregam um sinal extrínseco que mira a recombinação do segmento V no lócus da cadeia pesada pela alteração da acessibilidade do substratos de DNA à recombinase. (HAT e HDAC?)
Usando FISH, Kosak e outros (2002) demonstraram que os lócus IH e I-Kappa, mas não o menor lócus Ig-lambda, o qual só tem três segmentos de gene V, tem uma distribuição nuclear inversa nas células progenitoras hematopoiéticas do camundongo e nos pró-linfócitos T em comparação com pró-linfócitos B. Nas células pró-T, nas quais esses grandes lócus multi-segmentados estão inativos, eles estão preferencialmente posicionados na periferia nuclear, enquanto nas células pró-B, as quais expressam os lócus Ig ativamente, eles têm uma configuração central e submetem-se à compactação em larga escala dependente de IL7R. Kosak e outros (2002) propuseram que um posicionamento periférico desses lócus inibe sua transcrição e rearranjo por serem seqüestrados para fora do aparato de transcrição e recombinação e/ou pela reunião de uma estrutura refratária. Em adição, a compactação central em larga escala pode funcionar para facilitar o rearranjo de grande extensão do V(D)J.
Roix e outros (2003) examinaram a questão de por quê as translocações entre os cromossomos tendem a repetir-se em pontos de quebra específicos no genoma. Eles proporcionaram evidência de que a mais alta ordenação espacial da organização do genoma é um fator de contribuição na formação de translocações recorrentes. Eles mostraram que os lócus de MTC (190080), BCL (168461) e da imunoglobulina, os quais estão recorrentemente translocados em vários linfomas de células B, estão preferencialmente posicionados em íntima proximidade espacial relativa entre si nas células B normais. Lócus em proximidade espacial são posicionados não aleatoriamente junto ao interior do núcleo nas células B normais. Essa proximidade de lócus é a conseqüência da mais alta ordem na estrutura do genoma mais do que de uma propriedade individual dos genes. Os resultados sugeriram que a formação de translocações específicas em linfomas humanos, e talvez em outros tecidos, é determinada em parte pela mais alta ordem na organização espacial do genoma. Roix e outros (2003) avaliaram primeiro a organização nuclear global dos genes propensos à translocação por localizarem-nos usando fluorescência em sítio de hibridização. O posicionamento de preferência que eles encontraram era estatísticamente distindo de uma distribuição uniforme casual. Então eles mediram a distância física entre o MYC e seus vários parceiros de translocação em células cariotípicamente normais e compararam sua proximidade física com as freqüências clinicamente observadas de translocações. Eles encontraram que o MYC estava separado de seus parceiros de translocação mais freqüentes, IgH e IgL (147220), por 40,7% 41,0% do diâmetro nuclear, respectivamente, enquanto sua separação do seu parceiro mais raro de translocação, a IgK (147200), era de 47,1%. Esse último valor era similar àquele observado para o lócus de controle negativo, TBR2 (190182), o qual nunca tina sido relatado em translocação com o MYC; sua separação média era de 49,4% do diâmetro nuclear.
Streubel e outros (2005) notaram que translocações do cromossomo 3 , t(11;18)(q21;q21), t(14;18)(q32;q21) e t(1;14)(p22;q32) estão associadas com linfomas de tecido linfóide associado à mucosa (MALT). Eles identificaram uma translocação (3;14)(p14;q32) em um caso de linfoma MALT da tireóide. Estudos FISH mostraram que o lócus IGH estava rearranjado, e que a PCR inversa de longa distância identificou o FOXP1 (605515) como o gene parceiro no cromossomo 3. Usando ensaios FISH para sondar 91 linfomas MALT quanto à negatividade para três translocações comuns, Streubel e outros (2005) identificaram t(3;14)(p14;q32) em nove casos (três de tireóides, quatro oculares e dois de pele). A maioria dos linfomas MALT positivos para t(3;14)(p14;q32) também abrigavam anormalidades genéticas adicionais, tais como trissomia do cromossomo três. Todas as translocações associadas à MALT eram mutuamente exclusivas. Análises de PCR-RT de tempo real mostraram expressão sobre-regulada de FOXP1 em casos de MALT com t(3;14)(p14;q32) ou trissomia do cromossomo 3. Streubel e outros (2005) concluíram que o FOXP1 é um parceiro de translocação do IGH em um sub-cojunto de linfomas MALT dependente de sítio.
Kaneko e outros (2006) demonstraram que propriedades distintas do fragmento Fc da IgG, resultando em efeitos pró-inflamatórios de certos imunocomplexos, e o fato de que a terapia com gama globulina intravenosa e seus fragmentos Fc são anti-inflamatórios, resultam de sialização diferenciada do polissacarídeo no cerne do Fc. A IgG adquire propriedades anti-inflamatórias na sialização do Fc, enquanto é reduzida na indução de resposta de uma resposta imune específica a antígeno. Essa sialização diferenciada pode proporcionar uma troca da atividade anti-inflamatória inata no estado estável para gerar efeitos pró-inflamatórios adaptativos no desafio antigênico.
Yan e outros (2007) avaliaram se a via clássica do final de junção não homólogo (NHEJ) é crítica para a recombinação de troca de classe (CRS) através de ensaio de CSR em células B de camundongos deficientes em Xrcc4 (194363) ou Lig4 (601837). Os NHEJ de fato catalisaram as junções CSR, pois as células B deficientes em NHEJ clássico tinham níveis de CSR diminuídos e níveis substanciais de quebras cromossômicas no lócus da IgH. Entretanto, uma via alternativa da junção de final, a qual está marcadamente distorcida em relação as junções de micro-homologia, sustentam o CSR em níveis inesperadamente robustos nas células B deficientes em NHEJ. Na ausência da NHEJ clássica, essa via alternativa de junção de final também junta frequentemente as quebras no lócus IgH a outros cromossomos para gerar translocações.
Usando FISH e células B de baço de camundongo deficiente em NHEJ ativadas, Wang e outros (2009) observaram uma acumulação de quebras associadas à recombinação V(D)J no lócus da IgI, bem como quebras em Igh associadas a CSR, frequentemente na mesma célula. As quebras em II e em Igh frequentemente juntavam-se para formar translocações, um fenômeno associado com a co-localização específica das Igh e IgI. A Igh e o Myc também localizaram-se em comum nessas células, e a introdução de quebras de fita dupla no gene Myc promoveu translocações de Igh-Myc.
Gostissa e outros (2009) endereçaram o papel oncogênico da região regulatória da ponta 3 da Igh pela inativação desta em dois modelos de camundongo para linfoma de célula B com translocações Igh-c-Myc (190080). Gostissa e outros (2009) mostraram que a região regulatória da ponta 3 do Igh é dispensável para linfomas de células pró-B com translocações inicaiadas na recombinação do V(D)J, mas é requerida para linfomas de células B periféricas com translocações associadas a recombinação de troca de classe. Como a região regulatória da ponta 3 não é requerida para as quebras de Igh associadas com recombinação de troca de classe ou com translocações de Igh-c-Myc nos linfomas de células B progenitoras, Gostissa e outros (2009) concluíram que esta região regulatória confere atividade oncogênica pela ativação de genes c-Myc translocados de longa extensão e de desenvolvimento de estado específico desenvolvimento.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/147100
domingo, 9 de maio de 2010
domingo, 2 de maio de 2010
179835 PROTEÍNA DE REPLICAÇÃO A1, 70-KD; RPA1
Símbolos
RPA70
REPA1
Lócus do Gene Mapeado 17p13.3
TEXTO
CLONAGEM
A proteína de replicação A (RPA) é uma proteína de ligação da DNA de uma fita só (ssDNA) de três unidades que foi isolada das células humanas e considerada essencial para replicação ‘in vitro’ do papovavírus SV40. Erdile e outros (1991) relataram a sequencia de um cDNA codificando a sub-unidade de 70 quilobases. O cDNA humano direcionou a produção na E.coli de uma proteína de 70 quilobases que reagiu com um anticorpo monoclonal direcionado contra a sub-unidade de 70 quilobases da proteína humana. A sub-unidade recombinante, purificada da bactéria, exibia uma atividade de ligação a DNA de fita singular comparável à do complexo RPA completo. Ela pôde substituir o complexo completo estimulando a atividade da primase alfa da DNA polimerase, mas não pôde substituir o complexo por completo na replicação do DNA do SV40 in vitro, sugerindo um papel funcional importante para outras sub-unidades.
[Omim 174761 – Lydeard e outros (2007) mostraram que em leveduras haplóides em germinação, a replicação induzida pela endonuclease HO induzida pela quebra dependente de Rad51 requer o escoramento do complexo primase da DNA polimerase alfa bem como da polimerase delta para iniciar nova síntese de DNA.]
[A Primase catalisa a síntese de um curto segmento de RNA (chamado primer) complementar a um modelo de fita singular de DNA. A primase é de importância chave na replicação do DNA porque nenhuma DNA polimerase conhecida pode iniciar a síntese de uma fita de DNA sem um primer de RNA ou de DNA. http://en.wikipedia.org/wiki/Primase]
FUNÇÃO DO GENE
Gomes e Wold (1996) construíram uma série de deleções do terminal N da RPA70 para explorar a função da proteína. Seus dados indicaram que a RPA70 é composta de três domínios funcionais: um domínio terminal N que não é requerido para a ligação a DNA de fita singular ou replicação do SV40, um domínio de ligação a DNA central, e um domínio terminal C que é essencial para as interações das sub-unidades.
O dobramento do mRNA influencia uma extensão de diversos eventos biológicos tais como splicing de mRNA e processamento e controle e regulação da tradução. Devido à estrutura do mRNA ser determinada por sua sequência de nucleotídeos e seu meio ambiente, Shen e outros (1999) examinaram se o dobramento do mRNA poderia ser influenciado pela presença de polimorfismos de um só nucleotídeo (SNPs). Eles relataram marcadas diferenças na estrutura secundária do mRNA associadas com SNPs na região codificadora de dois mRNAs humanos: a sintetase de tRNA alanil (601065) e a sub-unidade de 70 quilo-dáltons da proteína de replicação A. A prova enzimática dos fragmentos contendo SNP dos mRNAs revelou pronunciadas diferenças alélicas no padrão de clivagem nos sítios dos nucleotídeos 14 e 18 fora do SNP, sugerindo que uma única variação do nucleotídeo pode dar lugar a diferentes dobramentos do mRNA. Usando oligo-desóxirribonucleotídeos complementares à região das estruturas alélicas no mRNA da RPA70, mas não extendendo ao SNP em si, eles encontraram que o SNP exercia um efeito alelo-específico na acessibilidade ao seu sítio flanqueador no mRNA da RPA70 humana endógeno. Os resultados demonstraram a contribuição da variação genética comum através da diversidade estrutural do mRNA e sugeriu um papel mais amplo do que os previamente pensados para os efeitos dos SNPs na estrutura do mRNA e, no final das contas, na função biológica.
Nakayama e outros (1999) relataram que uma mutação de T para C na posição 786 na região promotora do gene da eNOS (sintase de óxido nítrico) reduzia a transcrição do gene e estava fortemente associada com a angina coronária espástica (relativo a espasmo) e infarto do miocárdio. Para elucidar o mecanismo molecular para a reduzida transcrição do gene de eNOS, Miyamoto e outros (2000) purificaram uma proteína que se liga especificamente ao alelo mutante nos extratos nucleares das células HeLa. A proteína purificada era idêntica à RPA1, conhecida como uma proteína de ligação à DNA de uma fita só essencial para o reparo do DNA, replicação, e recombinação. Nas células endoteliais da veia umbilical humana, a inibição da expressão da RPA1 usando-se oligo-nucleotídeos restaurou a transcrição dirigida pela sequência do promotor mutada, enquanto a sobre-expressão da RPA1 a reduzia ainda mais. Os níveis de nitrito/nitrato no soro entre indivíduos carregando a mutação de T para C na posição 786 estavam significativamente mais baixos do que entre aqueles sem a mutação. Os autores concluíram que a RPA1 funciona aparentemente como uma proteína repressora na redução da transcrição do gene eNOS relacionada com a mutação de T para C na posição 786 associada com o desenvolvimento da doença da artéria coronária.
A função do complexo de proteína cinase ATR (601215)-ATRIP(606605) é crucial para a resposta celular ao estresse de replicação e dano no DNA. Zou e Elledge (2003) demonstraram que o complexo RPA, o qual está associado com uma fita singular de DNA, é requerido para o recrutamento da ATR aos sítios de dano noDNA e para a ativação da CHK1 (603078) mediada pela ATR nas células humanas. “In vitro”, a RPA estimula a ligação da ATRIP ao DNA de uma fita só. A ligação da ATRIP à RPA coberta com a fita singular do DNA habilita o complexo ATR-ATRIP em associar-se com o DNA e estimula a fosforilação da proteína RAD17 (603139) que está ligada ao DNA. Além disso, a Ddc2, a homóloga da ATRIP nas leveduras, é recrutada especificamente às quebras de fita dupla de DNA de modo dependente de RPA. Uma mutante da RPA deficiente no ponto de controle, rfa1-t11, é defeituosa para o recrutamento da Ddc2 às fitas de DNA singulares tanto ‘in vivo’ quanto ‘in vitro’. Zou e Elledge (2003) concluíram que o DNA de fita singular coberto pela RPA é a estrutura crítica nos sítios de dano de DNA que recruta o complexo ATR-ATRIP e facilita seu reconhecimento de substratos para fosforilação e a iniciação da sinalização no ponto de controle.
A desaminase de citidina induzida por ativação (AID; 605257) é uma desaminase de pequena fita singular de DNA requerida para a hipermutação somática e recombinação de troca de classe dos genes das imunoglobulinas. A recombinação de troca de classes envolve a transcrição através de regiões de troca, as quais geram pequenos DNAs singulares dentro do laços com formato de R. Chaudhuri e outros (2004) caracterizaram o mecanismo de alvejamento da AID em substratos transcritos ‘in vitro’ abrigando motivos de hipermutação somática. Eles mostraram que a atividade de alvejamento da AID é devida à RPA, uma proteína heteroquímica de ligação a pequeno DNA singular envolvida na replicação, recombinação, e reparo. A sub-unidade de 32 quilo-dáltons da RPA (179836) interage especificamente com a AID de células B ativadas de uma maneira que parece ser dependente da modificação pós-tradução da AID. Chaudhuri e outros (2004) concluíram que a RPA está implicada enquanto um novo fator envolvido na diversificação da imunoglobulina, e propuseram que os complexos AID-RPA específicos das células B se ligam preferencialmente aos pequenos DNA singulares de pequenas bolhas de replicação nos pontos quentes de hipermutação somática, levando à desaminação mediada pela AID e recrutamento mediado pela RPA das proteínas de reparo do DNA.
Maga e outros (2007) analisaram os efeitos dos antígenos nucleares de células humanas em proliferação (PCNA; 176740) e da RPA em seis polimerases de DNA humanas diferentes pertencentes às classes B, Y e X durante o desvio ‘in vitro’ de lesões diferentes. A lesão mutagênica da guanina-oxo-8 tem alto potencial para codificação errada. O efeito principal e específico foi encontrado para o desvio 8-oxo-G com a polimerase de DNA lamda (606343) e eta (603968). A PCNA e a RPA permitiram a correta incorporação de desóxi CTP em oposição a um molde de 8-oxo-G 1.200 vezes mais eficientemente do que o dATP incorreto pela polimerase de DNA lamba, e 68 vezes do que pela polimerase de DNA eta, respectivamente. Por outro lado, a polimerase de DNA iota junto com a polimerase de DNA alfa, delta e beta, mostrou uma eficiência de desvio de correção muito mais baixa. Maga e outros (2007) concluíram que seus achados mostraram a existência de um mecanismo acurado para reduzir conseqüências prejudiciais do dano oxidativo e, em adição, apontaram um papel importante para a PCNA e aRPA na determinação de uma hierarquia funcional entre as diferentes polimerases de DNA no desvio lesional.
Gupta e outros (2007) descobriram que a FANCJ (BRIP1;605882) imunoprecipitou com a RPA. FANCJ e RPA co-localizaram-se em focos nucleares após o dano no DNA ou o estresse da replicação. A FANCJ e a RPA ligaram-se com alta afinidade por via da sub-unidade 70 da RPA. Embora a FANCJ mostrasse limitada capacidade para desprender-se até mesmo de um duplex em forca de 47 pares de base, a presença da RPA capacitou a FANCJ a agir como uma helicase muito mais processante.
MAPEAMENTO
Usando amplificação de DNA genômico por PCR de linhas celulares de roedores e humanas, Umbricht e outros (1993) mapearam o gene para a sub-unidade de 70 quilodáltos no cromossomo 17. Pelo mesmo método, eles mapearam os genes das sub-unidades de 32 e de 14 quilo-dáltons (179837) nos cromossomos 1 e 7, respectivamente. Usando uma combinação de amplificação por PCR de células somáticas híbridas e radiação híbrida contendo fragmentos do cromossomo 17, Umbricht e outros (1994) mapearam a RPA1 em 17p13.3. A perda da região cromossômica 17p13.3 tem estado repetidamente implicada em várias malignidades incluindo cânceres colo-retais, cânceres de mama, linfomas e leucemias (Wang e outros, 2005).
MODELO ANIMAL
Wang e outros (2005) demonstraram que camundongos heterozigotos para uma mutação de sentido trocado em um dos domínios de ligação ao DNA da Rpa1 desenvolveram tumores linfóides e que seus irmãos de barriga homozigotos sucumbiram à letalidade embrionária precoce. Uma série comparativa de hibridização genômica dos tumores identificou mudanças em grande escala no cromossomo bem como ganhos e perdas em segmentos. A mutação na RPA1 resultou em defeitos no reparo da quebra da dupla fita de DNA e precipitou as quebras cromossômicas bem como a aneuploidia em fibroblastos de camundongos mutantes heterozigotos embrionários. A mutação equivalente nas leveduras é hipomórfica e semi-dominante e aumentou a formação de rearranjos grosseiros no cromossomo em múltiplas bases genéticas de segundo plano.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=179835
Símbolos
RPA70
REPA1
Lócus do Gene Mapeado 17p13.3
TEXTO
CLONAGEM
A proteína de replicação A (RPA) é uma proteína de ligação da DNA de uma fita só (ssDNA) de três unidades que foi isolada das células humanas e considerada essencial para replicação ‘in vitro’ do papovavírus SV40. Erdile e outros (1991) relataram a sequencia de um cDNA codificando a sub-unidade de 70 quilobases. O cDNA humano direcionou a produção na E.coli de uma proteína de 70 quilobases que reagiu com um anticorpo monoclonal direcionado contra a sub-unidade de 70 quilobases da proteína humana. A sub-unidade recombinante, purificada da bactéria, exibia uma atividade de ligação a DNA de fita singular comparável à do complexo RPA completo. Ela pôde substituir o complexo completo estimulando a atividade da primase alfa da DNA polimerase, mas não pôde substituir o complexo por completo na replicação do DNA do SV40 in vitro, sugerindo um papel funcional importante para outras sub-unidades.
[Omim 174761 – Lydeard e outros (2007) mostraram que em leveduras haplóides em germinação, a replicação induzida pela endonuclease HO induzida pela quebra dependente de Rad51 requer o escoramento do complexo primase da DNA polimerase alfa bem como da polimerase delta para iniciar nova síntese de DNA.]
[A Primase catalisa a síntese de um curto segmento de RNA (chamado primer) complementar a um modelo de fita singular de DNA. A primase é de importância chave na replicação do DNA porque nenhuma DNA polimerase conhecida pode iniciar a síntese de uma fita de DNA sem um primer de RNA ou de DNA. http://en.wikipedia.org/wiki/Primase]
FUNÇÃO DO GENE
Gomes e Wold (1996) construíram uma série de deleções do terminal N da RPA70 para explorar a função da proteína. Seus dados indicaram que a RPA70 é composta de três domínios funcionais: um domínio terminal N que não é requerido para a ligação a DNA de fita singular ou replicação do SV40, um domínio de ligação a DNA central, e um domínio terminal C que é essencial para as interações das sub-unidades.
O dobramento do mRNA influencia uma extensão de diversos eventos biológicos tais como splicing de mRNA e processamento e controle e regulação da tradução. Devido à estrutura do mRNA ser determinada por sua sequência de nucleotídeos e seu meio ambiente, Shen e outros (1999) examinaram se o dobramento do mRNA poderia ser influenciado pela presença de polimorfismos de um só nucleotídeo (SNPs). Eles relataram marcadas diferenças na estrutura secundária do mRNA associadas com SNPs na região codificadora de dois mRNAs humanos: a sintetase de tRNA alanil (601065) e a sub-unidade de 70 quilo-dáltons da proteína de replicação A. A prova enzimática dos fragmentos contendo SNP dos mRNAs revelou pronunciadas diferenças alélicas no padrão de clivagem nos sítios dos nucleotídeos 14 e 18 fora do SNP, sugerindo que uma única variação do nucleotídeo pode dar lugar a diferentes dobramentos do mRNA. Usando oligo-desóxirribonucleotídeos complementares à região das estruturas alélicas no mRNA da RPA70, mas não extendendo ao SNP em si, eles encontraram que o SNP exercia um efeito alelo-específico na acessibilidade ao seu sítio flanqueador no mRNA da RPA70 humana endógeno. Os resultados demonstraram a contribuição da variação genética comum através da diversidade estrutural do mRNA e sugeriu um papel mais amplo do que os previamente pensados para os efeitos dos SNPs na estrutura do mRNA e, no final das contas, na função biológica.
Nakayama e outros (1999) relataram que uma mutação de T para C na posição 786 na região promotora do gene da eNOS (sintase de óxido nítrico) reduzia a transcrição do gene e estava fortemente associada com a angina coronária espástica (relativo a espasmo) e infarto do miocárdio. Para elucidar o mecanismo molecular para a reduzida transcrição do gene de eNOS, Miyamoto e outros (2000) purificaram uma proteína que se liga especificamente ao alelo mutante nos extratos nucleares das células HeLa. A proteína purificada era idêntica à RPA1, conhecida como uma proteína de ligação à DNA de uma fita só essencial para o reparo do DNA, replicação, e recombinação. Nas células endoteliais da veia umbilical humana, a inibição da expressão da RPA1 usando-se oligo-nucleotídeos restaurou a transcrição dirigida pela sequência do promotor mutada, enquanto a sobre-expressão da RPA1 a reduzia ainda mais. Os níveis de nitrito/nitrato no soro entre indivíduos carregando a mutação de T para C na posição 786 estavam significativamente mais baixos do que entre aqueles sem a mutação. Os autores concluíram que a RPA1 funciona aparentemente como uma proteína repressora na redução da transcrição do gene eNOS relacionada com a mutação de T para C na posição 786 associada com o desenvolvimento da doença da artéria coronária.
A função do complexo de proteína cinase ATR (601215)-ATRIP(606605) é crucial para a resposta celular ao estresse de replicação e dano no DNA. Zou e Elledge (2003) demonstraram que o complexo RPA, o qual está associado com uma fita singular de DNA, é requerido para o recrutamento da ATR aos sítios de dano noDNA e para a ativação da CHK1 (603078) mediada pela ATR nas células humanas. “In vitro”, a RPA estimula a ligação da ATRIP ao DNA de uma fita só. A ligação da ATRIP à RPA coberta com a fita singular do DNA habilita o complexo ATR-ATRIP em associar-se com o DNA e estimula a fosforilação da proteína RAD17 (603139) que está ligada ao DNA. Além disso, a Ddc2, a homóloga da ATRIP nas leveduras, é recrutada especificamente às quebras de fita dupla de DNA de modo dependente de RPA. Uma mutante da RPA deficiente no ponto de controle, rfa1-t11, é defeituosa para o recrutamento da Ddc2 às fitas de DNA singulares tanto ‘in vivo’ quanto ‘in vitro’. Zou e Elledge (2003) concluíram que o DNA de fita singular coberto pela RPA é a estrutura crítica nos sítios de dano de DNA que recruta o complexo ATR-ATRIP e facilita seu reconhecimento de substratos para fosforilação e a iniciação da sinalização no ponto de controle.
A desaminase de citidina induzida por ativação (AID; 605257) é uma desaminase de pequena fita singular de DNA requerida para a hipermutação somática e recombinação de troca de classe dos genes das imunoglobulinas. A recombinação de troca de classes envolve a transcrição através de regiões de troca, as quais geram pequenos DNAs singulares dentro do laços com formato de R. Chaudhuri e outros (2004) caracterizaram o mecanismo de alvejamento da AID em substratos transcritos ‘in vitro’ abrigando motivos de hipermutação somática. Eles mostraram que a atividade de alvejamento da AID é devida à RPA, uma proteína heteroquímica de ligação a pequeno DNA singular envolvida na replicação, recombinação, e reparo. A sub-unidade de 32 quilo-dáltons da RPA (179836) interage especificamente com a AID de células B ativadas de uma maneira que parece ser dependente da modificação pós-tradução da AID. Chaudhuri e outros (2004) concluíram que a RPA está implicada enquanto um novo fator envolvido na diversificação da imunoglobulina, e propuseram que os complexos AID-RPA específicos das células B se ligam preferencialmente aos pequenos DNA singulares de pequenas bolhas de replicação nos pontos quentes de hipermutação somática, levando à desaminação mediada pela AID e recrutamento mediado pela RPA das proteínas de reparo do DNA.
Maga e outros (2007) analisaram os efeitos dos antígenos nucleares de células humanas em proliferação (PCNA; 176740) e da RPA em seis polimerases de DNA humanas diferentes pertencentes às classes B, Y e X durante o desvio ‘in vitro’ de lesões diferentes. A lesão mutagênica da guanina-oxo-8 tem alto potencial para codificação errada. O efeito principal e específico foi encontrado para o desvio 8-oxo-G com a polimerase de DNA lamda (606343) e eta (603968). A PCNA e a RPA permitiram a correta incorporação de desóxi CTP em oposição a um molde de 8-oxo-G 1.200 vezes mais eficientemente do que o dATP incorreto pela polimerase de DNA lamba, e 68 vezes do que pela polimerase de DNA eta, respectivamente. Por outro lado, a polimerase de DNA iota junto com a polimerase de DNA alfa, delta e beta, mostrou uma eficiência de desvio de correção muito mais baixa. Maga e outros (2007) concluíram que seus achados mostraram a existência de um mecanismo acurado para reduzir conseqüências prejudiciais do dano oxidativo e, em adição, apontaram um papel importante para a PCNA e aRPA na determinação de uma hierarquia funcional entre as diferentes polimerases de DNA no desvio lesional.
Gupta e outros (2007) descobriram que a FANCJ (BRIP1;605882) imunoprecipitou com a RPA. FANCJ e RPA co-localizaram-se em focos nucleares após o dano no DNA ou o estresse da replicação. A FANCJ e a RPA ligaram-se com alta afinidade por via da sub-unidade 70 da RPA. Embora a FANCJ mostrasse limitada capacidade para desprender-se até mesmo de um duplex em forca de 47 pares de base, a presença da RPA capacitou a FANCJ a agir como uma helicase muito mais processante.
MAPEAMENTO
Usando amplificação de DNA genômico por PCR de linhas celulares de roedores e humanas, Umbricht e outros (1993) mapearam o gene para a sub-unidade de 70 quilodáltos no cromossomo 17. Pelo mesmo método, eles mapearam os genes das sub-unidades de 32 e de 14 quilo-dáltons (179837) nos cromossomos 1 e 7, respectivamente. Usando uma combinação de amplificação por PCR de células somáticas híbridas e radiação híbrida contendo fragmentos do cromossomo 17, Umbricht e outros (1994) mapearam a RPA1 em 17p13.3. A perda da região cromossômica 17p13.3 tem estado repetidamente implicada em várias malignidades incluindo cânceres colo-retais, cânceres de mama, linfomas e leucemias (Wang e outros, 2005).
MODELO ANIMAL
Wang e outros (2005) demonstraram que camundongos heterozigotos para uma mutação de sentido trocado em um dos domínios de ligação ao DNA da Rpa1 desenvolveram tumores linfóides e que seus irmãos de barriga homozigotos sucumbiram à letalidade embrionária precoce. Uma série comparativa de hibridização genômica dos tumores identificou mudanças em grande escala no cromossomo bem como ganhos e perdas em segmentos. A mutação na RPA1 resultou em defeitos no reparo da quebra da dupla fita de DNA e precipitou as quebras cromossômicas bem como a aneuploidia em fibroblastos de camundongos mutantes heterozigotos embrionários. A mutação equivalente nas leveduras é hipomórfica e semi-dominante e aumentou a formação de rearranjos grosseiros no cromossomo em múltiplas bases genéticas de segundo plano.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=179835
quarta-feira, 21 de abril de 2010
*606868 Proteína Cinase 2 de Interação a Homeodomínio; HIPK2
Lócus do Gene Mapeado 7q33-q34
TEXTO
DESCRIÇÃO
A HIPK2 é uma cinase nuclear conservada de serina/treonina que interage com fatores de transcrição de homeodomínio.
[Homeodomínio é sinônimo de homeobox, é uma sequência de DNA bastante conservada de cerca de 180 pares de bases próximos à extremidade 3’ de genes homeóticos {que têm domínios homólogos} específicos; codifica um domínio de ligação a DNA, permitindo que as proteínas do homeoboxe se liguem à expressão gênica no desenvolvimento e a regulem; Stedman
2)Um homeoboxe tem o comprimento de 180 pares de bases. Ele codifica um domínio protéico (o homeodomínio) que, quando expressado como uma proteína, pode se ligar ao DNA.
A cadeia de 60 peptídeos correspondente ao domínio homeobox é, com posições típicas de íntrons, anotada a seguir:
RRRKRTA-YTRYQLLE-LEKEFLF-NRYLTRRRRIELAHSL-NLTERHIKIWFQN-RRMK-WKKEN.
Os genes do homeobox codificam fatores de transcrição que tipicamente interrompem cascatas de outros genes. O homeodomínio se liga ao DNA de modo específico à sequência.
Entretanto, a especificidade de uma única proteína de homeodomínio não é normalmente o suficiente para reconhecer somente seus genes alvo desejados. Na maioria das vezes, proteínas de homeodomínio atuam na região promotora de seus genes alvo como um complexo com outros fatores de transcrição. Tais complexos tem uma especificidade de alvo muito mais alta do que uma proteína de homeodomínio.
Os homeodomínios são codificados tanto por genes dos conjuntos de genes Hox como por outros genes distribuídos pelo genoma.
http://en.wikipedia.org/wiki/Homeobox#cite_note-2]
CLONAGEM
Por busca em banco de dados e PCR de uma biblioteca de cDNA do cérebro, Hofmann e outros (2000) obtiveram um cDNA codificador da HIPK2. A proteína deduzida em 1.191 aminoácidos contém um domínio de cinase no terminal N com um motivo DYRK (omim 604556), uma sequência de localização nuclear, e um domínio PEST. Os autores mostraram que a atividade de cinase da HIPK2 é dependente da presença de um resíduo de lisina na posição 221.
Usando uma peneira de leveduras duplamente híbridas de biblioteca de cDNA do fígado com a região citoplasmática da CD95 (TNFRSF6; omim134637) como isca, seguida do primer da ponta 5 do gene RACE de uma biblioteca de cDNA de testículo, Wang e outros (2001) isolaram cDNAs codificando FADD (omim 602457) e HIPK2. A proteína HIPK2 prevista em 1.198 aminoácidos é 96% idêntica à proteína do camundongo e tem um sítio de ligação a CD95 entre os resíduos 754 e 899. Análises de pigmentação Northern e salpicada revelaram a expressão fraca porém ubíqua de um transcrito de 11.0 quilobases que era mais forte no tecido neuronal. Um transcrito de 7,8 quilobases também foi detectado no útero, e um forte transcrito de 1,4 quilobases foi encontrado no pâncreas. A microscopia confocal demonstrou um ponto de localização nuclear ainda com uma deleção do terminal C ou da cinase mutante defeituosa. A HIPK2 expressada em células não se associa diretamente com a CD95 ou com o TNFR1 (omim 191190), mas se associa com a TRADD (603500)
Pierantoni e outros (2002) mostraram que a expressão do mRNA da Hipk2 é detectávem em embriões de camundongo no décimo quinto dia e está forte nos embriões do camundongo no décimo sétimo dia. Análises de hibridização em sítio demonstraram a expressão na retina neural, telencéfalo [divisão anterior do prosencéfalo que se transforma nos lobos olfatórios, no córtex dos hemisférios cerebrais e nos núcleos telencefálicos subcorticais e gânglios da base (núcleos), sobretudo o estiado e a amígdala; Stedman], e músculo no décimo sexto dia e meio. Análises de PCR-RT detectaram expressão ubíqua mas variável nos camundongos adultos. A expressão nos humanos era mais baixa, com expressão relativamente forte restrita ao coração, músculo e rins. A expressão estava sub-regulada na maioria dos cânceres de mama e carcinomas de tireóide testados. Pierantoni e outros (2002) propuseram que a sub-regulação e a perda de heterozigozidade observada no cromossomo 7q32-q33 em alguns neoplasmas sugere que a HIPK2 seja um gene candidato a supressor de tumor.
FUNÇÃO DO GENE
Hofman e outos (2002) demonstraram que a HIPK2 localiza-se e interage com a p53 (omim 191170) e coma proteína de ligação à CREB (CBP; 600140) dentro dos corpos nuclares da leucemia promielocítica. A ativação da HIPK2 pela radiação ultravioleta (UV) levou à fosforilação seletiva da p53 na serina 46, facilitando a acetilação mediada pela CBP da p53 na lisina 382 e promovendo a expressão genética dependente da p53. Hofmann e outros (2002) concluíram que a função de cinase da HIPK2 aumenta a expressão de genes alvos da p53, resultando na retenção do crescimento e aumento da apoptose induzida por UV. A apoptose induzida por UV pôde ser inibida pelo antisenso ao HIPK2.
[Obs.: Omim 600140 – Quando os níveis de cAMP (AMP cíclico) aumentam na célula, uma cascata de eventos leva à indução de genes que contém elementos regulatórios em cis (do mesmo lado da fita) chamados elementos de resposta a cAMP (CREs). Os níveis elevados de cAMP causam a estimulação e a translocação nuclear da proteína cinase A (PKA; veja 176911), a qual ativa o fator de transcrição CREB (proteína de ligação a CRE; veja 123810) pela fosforilação desta em um único resíduo, a serina 133 (Gonzalez e Montminy, 1989).
Chrivia e outros (1993) relataram a descoberta de uma proteína co-ativadora de transcrição nuclear, a proteína de ligação à CREB (CBP), que se liga especificamente à forma da proteína CREB fosforilada pela PKA. A CBP é uma grande proteína com uma massa molecular de aproximadamente 250 quilo-dáltons que contém um domínio de bromo, isto é, uma unidade estrutural conservada importante para as interações proteína-proteína. Na Drosófila e na levedura, esse domínio é encontrado em proteínas co-ativadoras envolvidas na transcrição dependente de sinal mas não na transcrição básica (Nordheim, 1994).]
Independentemente, D’Orazi e outros (2002) também mostraram que a HIPK2 fosforila a p53 na serina 46. Eles observaram a colocalização da HIPK2 com a p53 e a PML3, uma isoforma da PML (omim 102578), nos corpos nucleares e a ativação da HIPK2 após a exposição à UV.
Por análise de leveduras triplamente híbridas, Zhang e outros (2003) encontraram que a Hipk2 do camundongo interagiu com o complexo E1A-Ctbp (CTBP1; 602618). A expressão da Hipl2 ou exposição à radiação ultra violeta reduziu os níveis de Ctbp pela via de uma rota mediada por proteossomo. A co-expressão da cinase Hipk2 inativa ou redução nos níveis de Hipk2 mediada por pequeno RNA de interferância impediu o efeito da UV. A mutação da Ctbp na serina 422 impediu a fosforilação bem como a remoção da Ctbp direcionada por UV e Hipk2. A deleção da Ctbp ou redução nos níveis de Ctbp promoveu a apoptose nas células deficientes em p53.
[Omim 602618 – A região E1a das adenoviroses do grupo C codifica duas proteínas proximamente idênticas que são largamente responsáveis pelas propriedades oncogênicas das adenoviroses. Enquanto a metade terminal N dessas proteínas E1A é suficiente para a transformação, a metade terminal C parece modular negativamente a transformação, a gênese tumoral e a metástase. Boyd e outros (1993) purificaram uma proteína da célula HeLa, designada CTBP1, que liga-se especificamente à metade terminal C das proteínas E1A. A CTBP1 é uma fosfoproteína que migra como uma dupla de 48 quilo-dáltons por SDS-PAGE. Katsanis e Fisher (1998) sugeriram que a dupla consiste da CTBP1 e da sua parente íntima CTBP2 (omim 602619).]
Rinaldo e outros (2007) estabeleceram que a fosforilação da p53 na serina46 transfere a afinidade da p53 para promotores de genes envolvidos na retenção do ciclo celular para promotores de genes envolvidos na apoptose. Eles observaram que o dano letal no DNA aumenta a expressão da HIPK2, enquanto o dano sub-letal no DNA reprime a expressão. Rinaldo e outros (2007) identificaram a HIPK2 como um alvo para a degradação dependente de ubiquitina mediada pela MDM2 (164785) e encontraram que a degradação da HIPK2 somente ocorria em condições de retenção do crescimento quando a MDM2 era eficientemente induzida pela p53.
[Obs.: Omim 164785 – Momand e outros (1992) descobriram que o gene MDM2 aumenta o potencial de gênese tumoral das células quando ele está sobre-expressado e codifica um suposto fator de transcrição. Formando um firme complexo com o gene p53, o oncogene MDM2 pode inibir a transativação mediada pela p53.]
Pierantoni e outros (2007) acharam que a sobre-expressão da HMGA1 (600701) interferiu com a apoptose induzida pela p53 pelo impedimento à localização nuclear da HIPK2 e fosforilação da serina 46 da p53. Esses eventos puderam ser restaurados pela sobre-expressão da HIPK2 ou tratamento com anti-senso de HMGA1. Análises imuno-histoquímicas de cânceres de mama demonstraram uma associação significativa da sobre-expressão da HMGA, localização citoplasmática da HIPK2, e queda da apoptose espontânea na presença de p53 de tipo selvagem. Pierantoni e outros (2007) concluíram que a HMGA1 exerce sua atividade de gênese tumoral forçando a localização citoplasmática da HIPK2, assim inibindo a função apoptótica da p53.
[Obs.: Omim 600701 – HIGH MOBILITY GROUP AT-HOOK 1- As proteínas cromossômicas não histona dos mamíferos HMGIY/C (HMGA; veja também 600698), as quais são frequentemente referidas como proteínas de arquitetura, participam em uma ampla variedade de processos celulares incluindo a regulação da transcrição indutível de genes, integração de retroviroses para dentro dos cromossomos, e indução de transformação neoplásica e promoção da progressão metastásica das células de câncer.]
[Os dados mostram que conformações alternativas permitem uma curta sequência do DNA trocar de baixa para alta afinidade de ligação a sítio pela CREB. Essa região do gene da encefalina humana contém ambas as CREs requeridas para a resposta transcricional a cAMP e a CREB. A CREB liga-se com baixa afinidade ao duplex nativo, o qual tem um sítio para CREB em CRE2. A CREB se liga com alta afinidade ao grampo G-T que se forma de um intensificador sintético de 23 pares de base. No grampo G-T, a Cre-1 e a CRE-2 (elementos de resposta a cAMP) juntas formam o sítio de alta afinidade para CREB. A mudança conformacional é um mecanismo dinâmico pelo qual uma única proteína atuando no que parece um ser um único sítio pode gerar complexos de diferentes propriedades.
A preferência da CREB para os sítios de ligação de hairpin (grampo) favorece termodinamicamente a estrutura alternativa. Além disso a proteína 1 do grupo de alta mobilidade (HMG1), uma proteína nuclear eucariótica essencial abundante e evolutivamente conservada, liga-se especificamente a estruturas crusciformes de maneira independente da sequência.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC46561/?tool=pubmed]
Em células de câncer do cólon humano, Nardinocchi e outros (2007) descobriram que a derrubada da HIPK2 usando-se pequeno RNA de interferência reduziu a ligação da p53 e a ativação da p53R2 (RRM2B omim 604712), resultando numa reduzição do reparo de DNA induzido por UV. A expressão exógena da p53 foi capaz de superar este defeito.
ESTRUTURA DO GENE
Zhang e outros (2005) determinaram que o gene HIPK2 contém 13 éxons e se expande por mais de 59 quilobases.
MAPEAMENTO
Hofmann e outros (2000) mapearam o gene HIPK2 no cromossomo 7q32-34 por fluorescência em sítio de hibridização (FISH). Eles mapearam o gene do camundongo no cromossomo 6B. Wang e outos (2001) mapearam o gene HIPK2 no cromossomo 7q33-q35 por FISH.
GENÉTICA MOLECULAR
Li e outros (2007) identificaram duas mutações aparentemente somáticas no gene HIPL2, a R868W e a N958I, em um dos oitenta casos de síndrome mielodisplástica (MDS) e em um dos cinqüenta casos de leucemia mielóide aguda (AML; 601626), respectivamente. Ambas as mutações ocorreram no domínio de sinal de retenção de pinta da HIPK2. Estudos de localização sub-celular mostraram que dois mutantes estavam localizados em regiões nucleares com formatos canônico ou de anel e estavam localizados principalmente nas pintas. As proteínas mutantes mostraram atividade diminuída e um efeito negativo dominante sobre a proteína de tipo selvagem na transcrição dependente de AML1 (151385) e p53. Os achados sugeriram que a disfunção da HIPK2 pode atuar num papel na patogênese da leucemia.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=606868
Lócus do Gene Mapeado 7q33-q34
TEXTO
DESCRIÇÃO
A HIPK2 é uma cinase nuclear conservada de serina/treonina que interage com fatores de transcrição de homeodomínio.
[Homeodomínio é sinônimo de homeobox, é uma sequência de DNA bastante conservada de cerca de 180 pares de bases próximos à extremidade 3’ de genes homeóticos {que têm domínios homólogos} específicos; codifica um domínio de ligação a DNA, permitindo que as proteínas do homeoboxe se liguem à expressão gênica no desenvolvimento e a regulem; Stedman
2)Um homeoboxe tem o comprimento de 180 pares de bases. Ele codifica um domínio protéico (o homeodomínio) que, quando expressado como uma proteína, pode se ligar ao DNA.
A cadeia de 60 peptídeos correspondente ao domínio homeobox é, com posições típicas de íntrons, anotada a seguir:
RRRKRTA-YTRYQLLE-LEKEFLF-NRYLTRRRRIELAHSL-NLTERHIKIWFQN-RRMK-WKKEN.
Os genes do homeobox codificam fatores de transcrição que tipicamente interrompem cascatas de outros genes. O homeodomínio se liga ao DNA de modo específico à sequência.
Entretanto, a especificidade de uma única proteína de homeodomínio não é normalmente o suficiente para reconhecer somente seus genes alvo desejados. Na maioria das vezes, proteínas de homeodomínio atuam na região promotora de seus genes alvo como um complexo com outros fatores de transcrição. Tais complexos tem uma especificidade de alvo muito mais alta do que uma proteína de homeodomínio.
Os homeodomínios são codificados tanto por genes dos conjuntos de genes Hox como por outros genes distribuídos pelo genoma.
http://en.wikipedia.org/wiki/Homeobox#cite_note-2]
CLONAGEM
Por busca em banco de dados e PCR de uma biblioteca de cDNA do cérebro, Hofmann e outros (2000) obtiveram um cDNA codificador da HIPK2. A proteína deduzida em 1.191 aminoácidos contém um domínio de cinase no terminal N com um motivo DYRK (omim 604556), uma sequência de localização nuclear, e um domínio PEST. Os autores mostraram que a atividade de cinase da HIPK2 é dependente da presença de um resíduo de lisina na posição 221.
Usando uma peneira de leveduras duplamente híbridas de biblioteca de cDNA do fígado com a região citoplasmática da CD95 (TNFRSF6; omim134637) como isca, seguida do primer da ponta 5 do gene RACE de uma biblioteca de cDNA de testículo, Wang e outros (2001) isolaram cDNAs codificando FADD (omim 602457) e HIPK2. A proteína HIPK2 prevista em 1.198 aminoácidos é 96% idêntica à proteína do camundongo e tem um sítio de ligação a CD95 entre os resíduos 754 e 899. Análises de pigmentação Northern e salpicada revelaram a expressão fraca porém ubíqua de um transcrito de 11.0 quilobases que era mais forte no tecido neuronal. Um transcrito de 7,8 quilobases também foi detectado no útero, e um forte transcrito de 1,4 quilobases foi encontrado no pâncreas. A microscopia confocal demonstrou um ponto de localização nuclear ainda com uma deleção do terminal C ou da cinase mutante defeituosa. A HIPK2 expressada em células não se associa diretamente com a CD95 ou com o TNFR1 (omim 191190), mas se associa com a TRADD (603500)
Pierantoni e outros (2002) mostraram que a expressão do mRNA da Hipk2 é detectávem em embriões de camundongo no décimo quinto dia e está forte nos embriões do camundongo no décimo sétimo dia. Análises de hibridização em sítio demonstraram a expressão na retina neural, telencéfalo [divisão anterior do prosencéfalo que se transforma nos lobos olfatórios, no córtex dos hemisférios cerebrais e nos núcleos telencefálicos subcorticais e gânglios da base (núcleos), sobretudo o estiado e a amígdala; Stedman], e músculo no décimo sexto dia e meio. Análises de PCR-RT detectaram expressão ubíqua mas variável nos camundongos adultos. A expressão nos humanos era mais baixa, com expressão relativamente forte restrita ao coração, músculo e rins. A expressão estava sub-regulada na maioria dos cânceres de mama e carcinomas de tireóide testados. Pierantoni e outros (2002) propuseram que a sub-regulação e a perda de heterozigozidade observada no cromossomo 7q32-q33 em alguns neoplasmas sugere que a HIPK2 seja um gene candidato a supressor de tumor.
FUNÇÃO DO GENE
Hofman e outos (2002) demonstraram que a HIPK2 localiza-se e interage com a p53 (omim 191170) e coma proteína de ligação à CREB (CBP; 600140) dentro dos corpos nuclares da leucemia promielocítica. A ativação da HIPK2 pela radiação ultravioleta (UV) levou à fosforilação seletiva da p53 na serina 46, facilitando a acetilação mediada pela CBP da p53 na lisina 382 e promovendo a expressão genética dependente da p53. Hofmann e outros (2002) concluíram que a função de cinase da HIPK2 aumenta a expressão de genes alvos da p53, resultando na retenção do crescimento e aumento da apoptose induzida por UV. A apoptose induzida por UV pôde ser inibida pelo antisenso ao HIPK2.
[Obs.: Omim 600140 – Quando os níveis de cAMP (AMP cíclico) aumentam na célula, uma cascata de eventos leva à indução de genes que contém elementos regulatórios em cis (do mesmo lado da fita) chamados elementos de resposta a cAMP (CREs). Os níveis elevados de cAMP causam a estimulação e a translocação nuclear da proteína cinase A (PKA; veja 176911), a qual ativa o fator de transcrição CREB (proteína de ligação a CRE; veja 123810) pela fosforilação desta em um único resíduo, a serina 133 (Gonzalez e Montminy, 1989).
Chrivia e outros (1993) relataram a descoberta de uma proteína co-ativadora de transcrição nuclear, a proteína de ligação à CREB (CBP), que se liga especificamente à forma da proteína CREB fosforilada pela PKA. A CBP é uma grande proteína com uma massa molecular de aproximadamente 250 quilo-dáltons que contém um domínio de bromo, isto é, uma unidade estrutural conservada importante para as interações proteína-proteína. Na Drosófila e na levedura, esse domínio é encontrado em proteínas co-ativadoras envolvidas na transcrição dependente de sinal mas não na transcrição básica (Nordheim, 1994).]
Independentemente, D’Orazi e outros (2002) também mostraram que a HIPK2 fosforila a p53 na serina 46. Eles observaram a colocalização da HIPK2 com a p53 e a PML3, uma isoforma da PML (omim 102578), nos corpos nucleares e a ativação da HIPK2 após a exposição à UV.
Por análise de leveduras triplamente híbridas, Zhang e outros (2003) encontraram que a Hipk2 do camundongo interagiu com o complexo E1A-Ctbp (CTBP1; 602618). A expressão da Hipl2 ou exposição à radiação ultra violeta reduziu os níveis de Ctbp pela via de uma rota mediada por proteossomo. A co-expressão da cinase Hipk2 inativa ou redução nos níveis de Hipk2 mediada por pequeno RNA de interferância impediu o efeito da UV. A mutação da Ctbp na serina 422 impediu a fosforilação bem como a remoção da Ctbp direcionada por UV e Hipk2. A deleção da Ctbp ou redução nos níveis de Ctbp promoveu a apoptose nas células deficientes em p53.
[Omim 602618 – A região E1a das adenoviroses do grupo C codifica duas proteínas proximamente idênticas que são largamente responsáveis pelas propriedades oncogênicas das adenoviroses. Enquanto a metade terminal N dessas proteínas E1A é suficiente para a transformação, a metade terminal C parece modular negativamente a transformação, a gênese tumoral e a metástase. Boyd e outros (1993) purificaram uma proteína da célula HeLa, designada CTBP1, que liga-se especificamente à metade terminal C das proteínas E1A. A CTBP1 é uma fosfoproteína que migra como uma dupla de 48 quilo-dáltons por SDS-PAGE. Katsanis e Fisher (1998) sugeriram que a dupla consiste da CTBP1 e da sua parente íntima CTBP2 (omim 602619).]
Rinaldo e outros (2007) estabeleceram que a fosforilação da p53 na serina46 transfere a afinidade da p53 para promotores de genes envolvidos na retenção do ciclo celular para promotores de genes envolvidos na apoptose. Eles observaram que o dano letal no DNA aumenta a expressão da HIPK2, enquanto o dano sub-letal no DNA reprime a expressão. Rinaldo e outros (2007) identificaram a HIPK2 como um alvo para a degradação dependente de ubiquitina mediada pela MDM2 (164785) e encontraram que a degradação da HIPK2 somente ocorria em condições de retenção do crescimento quando a MDM2 era eficientemente induzida pela p53.
[Obs.: Omim 164785 – Momand e outros (1992) descobriram que o gene MDM2 aumenta o potencial de gênese tumoral das células quando ele está sobre-expressado e codifica um suposto fator de transcrição. Formando um firme complexo com o gene p53, o oncogene MDM2 pode inibir a transativação mediada pela p53.]
Pierantoni e outros (2007) acharam que a sobre-expressão da HMGA1 (600701) interferiu com a apoptose induzida pela p53 pelo impedimento à localização nuclear da HIPK2 e fosforilação da serina 46 da p53. Esses eventos puderam ser restaurados pela sobre-expressão da HIPK2 ou tratamento com anti-senso de HMGA1. Análises imuno-histoquímicas de cânceres de mama demonstraram uma associação significativa da sobre-expressão da HMGA, localização citoplasmática da HIPK2, e queda da apoptose espontânea na presença de p53 de tipo selvagem. Pierantoni e outros (2007) concluíram que a HMGA1 exerce sua atividade de gênese tumoral forçando a localização citoplasmática da HIPK2, assim inibindo a função apoptótica da p53.
[Obs.: Omim 600701 – HIGH MOBILITY GROUP AT-HOOK 1- As proteínas cromossômicas não histona dos mamíferos HMGIY/C (HMGA; veja também 600698), as quais são frequentemente referidas como proteínas de arquitetura, participam em uma ampla variedade de processos celulares incluindo a regulação da transcrição indutível de genes, integração de retroviroses para dentro dos cromossomos, e indução de transformação neoplásica e promoção da progressão metastásica das células de câncer.]
[Os dados mostram que conformações alternativas permitem uma curta sequência do DNA trocar de baixa para alta afinidade de ligação a sítio pela CREB. Essa região do gene da encefalina humana contém ambas as CREs requeridas para a resposta transcricional a cAMP e a CREB. A CREB liga-se com baixa afinidade ao duplex nativo, o qual tem um sítio para CREB em CRE2. A CREB se liga com alta afinidade ao grampo G-T que se forma de um intensificador sintético de 23 pares de base. No grampo G-T, a Cre-1 e a CRE-2 (elementos de resposta a cAMP) juntas formam o sítio de alta afinidade para CREB. A mudança conformacional é um mecanismo dinâmico pelo qual uma única proteína atuando no que parece um ser um único sítio pode gerar complexos de diferentes propriedades.
A preferência da CREB para os sítios de ligação de hairpin (grampo) favorece termodinamicamente a estrutura alternativa. Além disso a proteína 1 do grupo de alta mobilidade (HMG1), uma proteína nuclear eucariótica essencial abundante e evolutivamente conservada, liga-se especificamente a estruturas crusciformes de maneira independente da sequência.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC46561/?tool=pubmed]
Em células de câncer do cólon humano, Nardinocchi e outros (2007) descobriram que a derrubada da HIPK2 usando-se pequeno RNA de interferência reduziu a ligação da p53 e a ativação da p53R2 (RRM2B omim 604712), resultando numa reduzição do reparo de DNA induzido por UV. A expressão exógena da p53 foi capaz de superar este defeito.
ESTRUTURA DO GENE
Zhang e outros (2005) determinaram que o gene HIPK2 contém 13 éxons e se expande por mais de 59 quilobases.
MAPEAMENTO
Hofmann e outros (2000) mapearam o gene HIPK2 no cromossomo 7q32-34 por fluorescência em sítio de hibridização (FISH). Eles mapearam o gene do camundongo no cromossomo 6B. Wang e outos (2001) mapearam o gene HIPK2 no cromossomo 7q33-q35 por FISH.
GENÉTICA MOLECULAR
Li e outros (2007) identificaram duas mutações aparentemente somáticas no gene HIPL2, a R868W e a N958I, em um dos oitenta casos de síndrome mielodisplástica (MDS) e em um dos cinqüenta casos de leucemia mielóide aguda (AML; 601626), respectivamente. Ambas as mutações ocorreram no domínio de sinal de retenção de pinta da HIPK2. Estudos de localização sub-celular mostraram que dois mutantes estavam localizados em regiões nucleares com formatos canônico ou de anel e estavam localizados principalmente nas pintas. As proteínas mutantes mostraram atividade diminuída e um efeito negativo dominante sobre a proteína de tipo selvagem na transcrição dependente de AML1 (151385) e p53. Os achados sugeriram que a disfunção da HIPK2 pode atuar num papel na patogênese da leucemia.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=606868
600375 X-RAY REPAIR, COMPLEMENTING DEFECTIVE, IN CHINESE HAMSTER, 2; XRCC2
Lócus do Gene Mapeado 7q36.1
TEXTO
CLONAGEM
Thacker e outros (1995) fundiram linhas celulares irs1 de ramster V79, que é um mutante deficiente em reparo que apresenta hipersensitividade à um número de diferentes agentes de dano em DNA (Jones e outros, 1987), à células humanas, resultando na complementação do defeito. Os híbridos resultantes foram analisados por PCR-Alu, pigmentação de cromossomo e marcadores de DNA para mapear o gene complementar, designado XRCC2, em uma região específica do cromossomo. As células híbridas mostraram correção de sensitividade a ambos raio X e mitomicina C e continham o cromossomo humano 7, frequentemente como seu único componente humano. Os híbridos mostrando instável retenção de cromossomos humanos foram sub-clonados para mostrar que a perda do cromossomo 7 e a perda da resistência à mitomicina C ocorreu concordantemente. Dois híbridos separados foram encontrados tendo um pedaço menor do cromossomo 7, e provas de DNA específic o marcadores de micro-satélite definiram este como uma região contígua em 7q35-q36. Métodos de fusão de irradiação híbrida foram usados para reduzir ainda mais o tamanho da região de complementação genômica e localizar o gene em uma região de aproximadamente 3 a 5 mega-bases em 7q36.1.
Jones e outros (1995) mapearam o gene XRCC2 em 7q36 estudando a complementação de um defeito na linha irs1 de células de ramster descrita por Jones e outros (1987). Jones e outros (1995) fomaram híbridos de células somáticas pela fusão das células irs1 com linfócitos humanos e selecionando por complementação em meio contendo concentrações de mitomicina C que são tóxicos para células irs1 mas não para suas parceiras humanas de fusão. A retenção do cromossomo 7 ou da região 7q36 resultou em células que eram resistentes à mitomicina C.
Tambini e outros (1997) trabalharam na redução de radiação dos híbridos humano/ramster para localizar o gene XRCC2 em uma região genômica ainda menor definida por um único micro-satélite marcador D7S483. Cromosomos artificiais de levedura (YACs) carregando esses marcadores foram então fundidos às células da linha irs1 de ramster e uma YAC portadora do gene complementar foi identificada. Essa YAC foi usada para experimentos de seleção de cDNA para identificar o gene XRCC2. O gene foi considerado por compartilhar homologia com o gene RAD51 e seu homólogo humano (omim 179617), os quais estão envolvidos no reparo recombinante do dano no DNA. Forte sustentação para a candidatura desse gene como sendo o XRCC2 foi obtida de sua posição refinada no mapa e pela total complementação da sensitividade da irs1 com um cosmídeo de 40 quilobases carregando o gene. Tambini e outros (1997) notaram que, embora o gene candidato XRCC2 no cromossomo 7 mostrasse homologia à RAD51 da levedura, ele deveria ser distinto da RAD51 humana homóloga, a qual está localizada no cromossomo 15.
FUNÇÃO DO GENE
Johnson e outros (1999) demonstraram que a XRCC2 é essencial para o reparo eficiente das quebras de dupla fita de DNA pela recombinação homóloga entre cromátides irmãs. Células de ramster deficientes em XRCC2 mostraram um decréscimo de mais de 100 vezes na recombinação homóloga induzida nas quebras de fita dupla em comparação com a linha celular parente. Esse efeito foi corrigido aos níveis próximos do tipo selvagem pela transfecção transitória com um plasmídeo expressando XRCC2. O defeito no reparo nas células mutantes em XRCC2 pareceu estar restrito a um reparo recombinante pois junções de finais (extremidades) não homólogas estavam normais. Johnson e outros (1999) concluíram que o XRCC2 está envolvido no reparo das quebras de dupla fita de DNA por recombinação homóloga.
Usando um ensaio de duas leveduras híbridas, Braybrooke e outros (2000) identificaram uma interação direta da XRCC2 com a RAD51L3 (omim 602954 – Os autores estabeleceram que se a mutação com ausência de registro for ignorada, a proteína de 289 aminoácidos na lente total compartilha 71% de identidade sequencial com a proteína prevista do camundongo, e que os genes do camundongo e humanos da RAD51D têm dois domínios conservados de ligação de ATP similares aos dos outros genes relacionados com RecA – 15q15.1 – omim 179617), e eles confirmaram a interação por ensaios de abatimento entre XRCC2 recombinante e RAD51L3 endógena em extratos de células HeLa. A cromatografia de exclusão de tamanho seguida por análises de pigmentação Western sugeriu que as duas proteínas existem como um heterodímero de 70 quilodáltons.
Masson e outros (2001) descobriram que anticorpos dirigidos contra a RAD51L3 imunoprecipitaram um complexo de um lisado de células HeLa que incluía XRCC2, RAD51B (RAD51L1; omim 602948), e RAD51C (omim 602774), juntamente com RAD51L3. Interações entre estas proteínas foram confirmadas em ensaios de abate usando-se proteínas recombinantes expressadas em células sf9 de inseto. A filtração dos complexos em gel indicou uma massa molecular aparente de aproximadamente 180 quilo-dáltons, sugerindo uma estoquiometria [determinação das quantidades relativas das substâncias envolvidas em qualquer reação química; Stedman] de 1:1:1:1 das quatro sub-unidades. Ensaios de ligação, confirmados por micoscopia eletrônica, indicaram que os complexos purificados ligaram-se a DNA de uma fita só ou DNA cortado. Essa ligação era dependente de magnésio (2+) mas independente de ATP. A atividade de ATPase do complexo estimulada pelo DNA foi extremamente baixa. Masson e outros (2001) também identificaram um segundo complexo protéico heterodimérico entre a RAD51C e a XRCC3 (omim 600675). Usando ensaios de co-precipitação e abate múltiplo, Liu e outros (2002) confirmaram a interação entre os mesmos parálogos de RAD51 nos mesmos dois complexos protéicos distintos.
Em uma peneira de levedura duplamente híbrida de uma biblioteca de cDNA do cérebro humano usando a XRCC2 como isca, Kurumizaka e outros (2002) também encontraram que a RAD51L3 interage diretamente com a XRCC2. Usando um ensaio de formação de laço D, eles encontraram que a RAD51L3 e a XRCC2, co-expressadas e purificadas de culturas bacterianas, catalisam o pareamento homólogo ente um oligonucleotídeo de uma fita só e um DNA de dupla fita super-helicoidal. Significativos DNA de uma fita só e de dupla fita foram ligados pelo complexo na ausência de ATP, mas o pareamento homólogo era dependente de ATP e de Mg(2+). Por microscopia eletrônica, eles descobriram que a RAD51L3 e a XRCC2 formam uma estrutura em anel multimérica na ausência do DNA, e elas formam estruturas filamentosas na presença do DNA de uma fita só.
MAPEAMENTO
Thacker e outros (1995) e Jones e outros (1995) mapearam o gene XRCC2 no cromossomo 7q36.1.
GENÉTICA MOLECULAR
Kuschel e outros (2002) desempenharam estudos de associação genética em um estudo de controle de caso de câncer de mama baseado em população analisando polimorfismos em sete genes envolvidos no reparo do DNA. A associação de uma variante rara no XRCC2 (R188H) foi marginalmente significativa. Em uma sub-classe comparável inglesa, Rafii e outros (2002) descobriram que o porte da R188H estava associado com o câncer de mama de um modo geral, e essa associação era aumentada quando casos estabelecidos em mais jóvens com um histórico familiar positivo eram comparados com controles mais idosos sem histórico familiar. Usando mutagênese direcionada ao sítio do XRCC2, Rafii e outros (2002) mostraram além que a substituição ou deleção não conservativa do aminoácido 188 da XRCC2 poderia afetar significativamente a sensibilidade celular ao dano no DNA. Os autores hipotetizaram que a variação sutil na capacidade de reparo do DNA pode influenciar a suscetbilidade ao câncer na população.
A perda do reparo de combinação (MMR) leva a um complexo fenótipo mutador que parece dirigir o desenvolvimento de um sub-conjunto de cânceres de cólon (veja Peltomaki, 2001). Mohindra e outros (2002) mostraram que linhas celulares de tumor defeituosas em MMR eram defeituosas no reparo de recombinação homóloga (HRR) induzido por quebras da fita dupla do DNA (DSBs). Uma mutação sem sentido (342delT) no XRCC2 encontrada em uma linha celular de tumor uterino deficiente em MMR, SKUT-1, conferia sensitividade à timidina quando intruduzida em uma linha proficiente em MMR. Como outras células com XRCC2 defeituosa, as células SKUT-1 eram sensíveis à mitomicina C, e as células proficientes em MMR expressando o alelo XRCC2 mutante também se tornaram mais sensíveis a este agente. Os autores sugeriram que a sensitividade à timidina das linhas celulares de tumor deficientes em MMR pode ser uma conseqüência dos defeitos na via de reparo de recombinação homóloga. Mohindra e outros (2004) intruduziram 342delT em células proficientes em HRR contendo um substrato repórter de recombinação. Em um conjunto de trasnfectantes, a expressão da 342delT conferiu senstividade à timidina e à mitomicina C e suprimiu a HRR induzida no repórter de recombinação pela timidina, mas não pelas DSBs somente. Em um segundo conjunto de transfectantes, a expressão de 342delT foi acompanhada por um decréscimo no nível da lente total da XRCC2, e essas células eram defeituosas na indução do HRR tanto por timidina quanto por DSBs. Mohindra e outros (2004) concluíram que a 342delT suprime a recombinação induzida pela timidina de maneira negativa dominante, enquanto a recombinação induzida pelas DSBs parece depender do nível de XRCC2, bem como da expressão do alelo XRCC2 mutante. Os autores sugeriram que as vias do HRR respondendo à forquilhas de replicação estragadas ou DSBs são geneticamente distinguíveis e que a XRCC2 tem um papel crítico no HRR nas forquilhas de replicação, possivelmente no transporte da RAD51 sobre a fenda no DNA.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=600375
Obs.: A mitomicina C é um potente ligador em cruzamento do DNA. Uma única ligação cruzada por genoma mostrou ser efetiva para matar uma bactéria. Isso é conseguido pela ativação redutora seguida por duas alquilações em N. Ambas as alquilações são sequências específicas par um nucleosídeo de guanina na sequência 5’-CpG-3’. Quinonas heterocíclicas duplamente alquilantes foram sintetizadas de acordo a explorar suas atividades anti-tumorais pela alquilação bio-redutora. http://en.wikipedia.org/wiki/Mitomycin {Alquilação é a substituição de um radical alquila (CnH2n+1) por um átomo de hidrogênio; Stedman}
A Timidina (mais precisamente chamada desoxitimidina; também pode ser cunhada de desoxirribosiltimina e timina desoxiribosídeo) é um composto químico, mais precisamente um desoxinucleotídeo pirimidina. A desoxitimidina é o nucleosídto T do DNA, a qual parelha com a desoxiadenosina (A) na fita dupla de DNA. Em biologia celular é usada para sincronizar as células na fase S.
http://en.wikipedia.org/wiki/Thymidine
Lócus do Gene Mapeado 7q36.1
TEXTO
CLONAGEM
Thacker e outros (1995) fundiram linhas celulares irs1 de ramster V79, que é um mutante deficiente em reparo que apresenta hipersensitividade à um número de diferentes agentes de dano em DNA (Jones e outros, 1987), à células humanas, resultando na complementação do defeito. Os híbridos resultantes foram analisados por PCR-Alu, pigmentação de cromossomo e marcadores de DNA para mapear o gene complementar, designado XRCC2, em uma região específica do cromossomo. As células híbridas mostraram correção de sensitividade a ambos raio X e mitomicina C e continham o cromossomo humano 7, frequentemente como seu único componente humano. Os híbridos mostrando instável retenção de cromossomos humanos foram sub-clonados para mostrar que a perda do cromossomo 7 e a perda da resistência à mitomicina C ocorreu concordantemente. Dois híbridos separados foram encontrados tendo um pedaço menor do cromossomo 7, e provas de DNA específic o marcadores de micro-satélite definiram este como uma região contígua em 7q35-q36. Métodos de fusão de irradiação híbrida foram usados para reduzir ainda mais o tamanho da região de complementação genômica e localizar o gene em uma região de aproximadamente 3 a 5 mega-bases em 7q36.1.
Jones e outros (1995) mapearam o gene XRCC2 em 7q36 estudando a complementação de um defeito na linha irs1 de células de ramster descrita por Jones e outros (1987). Jones e outros (1995) fomaram híbridos de células somáticas pela fusão das células irs1 com linfócitos humanos e selecionando por complementação em meio contendo concentrações de mitomicina C que são tóxicos para células irs1 mas não para suas parceiras humanas de fusão. A retenção do cromossomo 7 ou da região 7q36 resultou em células que eram resistentes à mitomicina C.
Tambini e outros (1997) trabalharam na redução de radiação dos híbridos humano/ramster para localizar o gene XRCC2 em uma região genômica ainda menor definida por um único micro-satélite marcador D7S483. Cromosomos artificiais de levedura (YACs) carregando esses marcadores foram então fundidos às células da linha irs1 de ramster e uma YAC portadora do gene complementar foi identificada. Essa YAC foi usada para experimentos de seleção de cDNA para identificar o gene XRCC2. O gene foi considerado por compartilhar homologia com o gene RAD51 e seu homólogo humano (omim 179617), os quais estão envolvidos no reparo recombinante do dano no DNA. Forte sustentação para a candidatura desse gene como sendo o XRCC2 foi obtida de sua posição refinada no mapa e pela total complementação da sensitividade da irs1 com um cosmídeo de 40 quilobases carregando o gene. Tambini e outros (1997) notaram que, embora o gene candidato XRCC2 no cromossomo 7 mostrasse homologia à RAD51 da levedura, ele deveria ser distinto da RAD51 humana homóloga, a qual está localizada no cromossomo 15.
FUNÇÃO DO GENE
Johnson e outros (1999) demonstraram que a XRCC2 é essencial para o reparo eficiente das quebras de dupla fita de DNA pela recombinação homóloga entre cromátides irmãs. Células de ramster deficientes em XRCC2 mostraram um decréscimo de mais de 100 vezes na recombinação homóloga induzida nas quebras de fita dupla em comparação com a linha celular parente. Esse efeito foi corrigido aos níveis próximos do tipo selvagem pela transfecção transitória com um plasmídeo expressando XRCC2. O defeito no reparo nas células mutantes em XRCC2 pareceu estar restrito a um reparo recombinante pois junções de finais (extremidades) não homólogas estavam normais. Johnson e outros (1999) concluíram que o XRCC2 está envolvido no reparo das quebras de dupla fita de DNA por recombinação homóloga.
Usando um ensaio de duas leveduras híbridas, Braybrooke e outros (2000) identificaram uma interação direta da XRCC2 com a RAD51L3 (omim 602954 – Os autores estabeleceram que se a mutação com ausência de registro for ignorada, a proteína de 289 aminoácidos na lente total compartilha 71% de identidade sequencial com a proteína prevista do camundongo, e que os genes do camundongo e humanos da RAD51D têm dois domínios conservados de ligação de ATP similares aos dos outros genes relacionados com RecA – 15q15.1 – omim 179617), e eles confirmaram a interação por ensaios de abatimento entre XRCC2 recombinante e RAD51L3 endógena em extratos de células HeLa. A cromatografia de exclusão de tamanho seguida por análises de pigmentação Western sugeriu que as duas proteínas existem como um heterodímero de 70 quilodáltons.
Masson e outros (2001) descobriram que anticorpos dirigidos contra a RAD51L3 imunoprecipitaram um complexo de um lisado de células HeLa que incluía XRCC2, RAD51B (RAD51L1; omim 602948), e RAD51C (omim 602774), juntamente com RAD51L3. Interações entre estas proteínas foram confirmadas em ensaios de abate usando-se proteínas recombinantes expressadas em células sf9 de inseto. A filtração dos complexos em gel indicou uma massa molecular aparente de aproximadamente 180 quilo-dáltons, sugerindo uma estoquiometria [determinação das quantidades relativas das substâncias envolvidas em qualquer reação química; Stedman] de 1:1:1:1 das quatro sub-unidades. Ensaios de ligação, confirmados por micoscopia eletrônica, indicaram que os complexos purificados ligaram-se a DNA de uma fita só ou DNA cortado. Essa ligação era dependente de magnésio (2+) mas independente de ATP. A atividade de ATPase do complexo estimulada pelo DNA foi extremamente baixa. Masson e outros (2001) também identificaram um segundo complexo protéico heterodimérico entre a RAD51C e a XRCC3 (omim 600675). Usando ensaios de co-precipitação e abate múltiplo, Liu e outros (2002) confirmaram a interação entre os mesmos parálogos de RAD51 nos mesmos dois complexos protéicos distintos.
Em uma peneira de levedura duplamente híbrida de uma biblioteca de cDNA do cérebro humano usando a XRCC2 como isca, Kurumizaka e outros (2002) também encontraram que a RAD51L3 interage diretamente com a XRCC2. Usando um ensaio de formação de laço D, eles encontraram que a RAD51L3 e a XRCC2, co-expressadas e purificadas de culturas bacterianas, catalisam o pareamento homólogo ente um oligonucleotídeo de uma fita só e um DNA de dupla fita super-helicoidal. Significativos DNA de uma fita só e de dupla fita foram ligados pelo complexo na ausência de ATP, mas o pareamento homólogo era dependente de ATP e de Mg(2+). Por microscopia eletrônica, eles descobriram que a RAD51L3 e a XRCC2 formam uma estrutura em anel multimérica na ausência do DNA, e elas formam estruturas filamentosas na presença do DNA de uma fita só.
MAPEAMENTO
Thacker e outros (1995) e Jones e outros (1995) mapearam o gene XRCC2 no cromossomo 7q36.1.
GENÉTICA MOLECULAR
Kuschel e outros (2002) desempenharam estudos de associação genética em um estudo de controle de caso de câncer de mama baseado em população analisando polimorfismos em sete genes envolvidos no reparo do DNA. A associação de uma variante rara no XRCC2 (R188H) foi marginalmente significativa. Em uma sub-classe comparável inglesa, Rafii e outros (2002) descobriram que o porte da R188H estava associado com o câncer de mama de um modo geral, e essa associação era aumentada quando casos estabelecidos em mais jóvens com um histórico familiar positivo eram comparados com controles mais idosos sem histórico familiar. Usando mutagênese direcionada ao sítio do XRCC2, Rafii e outros (2002) mostraram além que a substituição ou deleção não conservativa do aminoácido 188 da XRCC2 poderia afetar significativamente a sensibilidade celular ao dano no DNA. Os autores hipotetizaram que a variação sutil na capacidade de reparo do DNA pode influenciar a suscetbilidade ao câncer na população.
A perda do reparo de combinação (MMR) leva a um complexo fenótipo mutador que parece dirigir o desenvolvimento de um sub-conjunto de cânceres de cólon (veja Peltomaki, 2001). Mohindra e outros (2002) mostraram que linhas celulares de tumor defeituosas em MMR eram defeituosas no reparo de recombinação homóloga (HRR) induzido por quebras da fita dupla do DNA (DSBs). Uma mutação sem sentido (342delT) no XRCC2 encontrada em uma linha celular de tumor uterino deficiente em MMR, SKUT-1, conferia sensitividade à timidina quando intruduzida em uma linha proficiente em MMR. Como outras células com XRCC2 defeituosa, as células SKUT-1 eram sensíveis à mitomicina C, e as células proficientes em MMR expressando o alelo XRCC2 mutante também se tornaram mais sensíveis a este agente. Os autores sugeriram que a sensitividade à timidina das linhas celulares de tumor deficientes em MMR pode ser uma conseqüência dos defeitos na via de reparo de recombinação homóloga. Mohindra e outros (2004) intruduziram 342delT em células proficientes em HRR contendo um substrato repórter de recombinação. Em um conjunto de trasnfectantes, a expressão da 342delT conferiu senstividade à timidina e à mitomicina C e suprimiu a HRR induzida no repórter de recombinação pela timidina, mas não pelas DSBs somente. Em um segundo conjunto de transfectantes, a expressão de 342delT foi acompanhada por um decréscimo no nível da lente total da XRCC2, e essas células eram defeituosas na indução do HRR tanto por timidina quanto por DSBs. Mohindra e outros (2004) concluíram que a 342delT suprime a recombinação induzida pela timidina de maneira negativa dominante, enquanto a recombinação induzida pelas DSBs parece depender do nível de XRCC2, bem como da expressão do alelo XRCC2 mutante. Os autores sugeriram que as vias do HRR respondendo à forquilhas de replicação estragadas ou DSBs são geneticamente distinguíveis e que a XRCC2 tem um papel crítico no HRR nas forquilhas de replicação, possivelmente no transporte da RAD51 sobre a fenda no DNA.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=600375
Obs.: A mitomicina C é um potente ligador em cruzamento do DNA. Uma única ligação cruzada por genoma mostrou ser efetiva para matar uma bactéria. Isso é conseguido pela ativação redutora seguida por duas alquilações em N. Ambas as alquilações são sequências específicas par um nucleosídeo de guanina na sequência 5’-CpG-3’. Quinonas heterocíclicas duplamente alquilantes foram sintetizadas de acordo a explorar suas atividades anti-tumorais pela alquilação bio-redutora. http://en.wikipedia.org/wiki/Mitomycin {Alquilação é a substituição de um radical alquila (CnH2n+1) por um átomo de hidrogênio; Stedman}
A Timidina (mais precisamente chamada desoxitimidina; também pode ser cunhada de desoxirribosiltimina e timina desoxiribosídeo) é um composto químico, mais precisamente um desoxinucleotídeo pirimidina. A desoxitimidina é o nucleosídto T do DNA, a qual parelha com a desoxiadenosina (A) na fita dupla de DNA. Em biologia celular é usada para sincronizar as células na fase S.
http://en.wikipedia.org/wiki/Thymidine
*607312 PROTEÍNA CONTENDO DOMÍNIO DE DEDOS DE ZINCO ANTIVIRAL; ZC2HAV1
Títulos Alternativos
ZINC FINGER ANTIVIRAL PROTEIN; ZAP
Lócus do Gene Mapeado 7q34
TEXTO
DESCRIÇÃO
ZC3HAV1 é uma protein de dedos de zinco de tipo CCCH que impede a infecção por retroviroses.
CLONAGEM
Em suas análises de genes expressados no fígado humano fetal, Yu e outros (2001) identificaram o ZC3HAV1, ao qual eles chamaram ZAP, como um cDNA de 1.524 pares de bases com uma sequência aberta de leitura de 264 aminoácidos.
Gao e outros (2002) sondaram bibliotecas de cDNA de mamíferos para genes que impedem a infecção por um retrovíus marcado geneticamente. As células resistentes a vírus foram selecionadas de reservatórios de clones transduzidos, e um cDNA antiviral ativo foi descoberto. O gene codifica uma proteína de dedos de zinco de tipo CCCH designada ZAP para proteína antiviral de dedos de zinco. Gao e outros (2002) clonaram a lente total do cDNA da Zap, a qual continha 776 códons. Análises de pigmentação Northern da Zap do rato mostraram que o mRNA era altamente expressado nos rins e no fígado, mas indetectável no cérebro e nos testículos. Dois mRNAs (de 3,5 e 4,5 quilobases) foram observados na maioria dos tecidos possivelmente correspondendo a variantes de Splice alternativo. A expressão do gene causou perda profunda e específica de mRNAs virais do citoplasma das células do rato de do camundongo sem afetar os níveis de mRNAs nucleares. Essa observação sugeriu a existência de um mecanismo previamente desconhecido para a inibição da replicação viral atingindo uma etapa da expressão do gene viral.
Por busca em bancos de dados com sequências evolutivamente conservadas no gene TIPARP (omim 612480), Katoh e Katoh (2003) identificaram dois genes humanos, FLJ22693 (PARP12; omim 612481) e ZC3HAV1, codificadores de proteínas deduzidas com os mesmos domínios conservados: um domínio WWE e um domínio de tipo PARP, e um domínio TPH. O domínio terminal N do domínio TPH nos três genes contém um dedo de zinco de tipo CCCH. Katoh e Katoh (2003) notaram que a PARP12 e a ZCH3HAV1 cmpartilham 27,5% e 26% de identidade na sequência de aminoáciodos em geral com a TIPARP, respectivamente. Eles estabeleceram que a proteína ZC3HAV1 contém 902 aminoácidos.
MAPEAMENTO
Yu e outros (2001) assinaram o gene ZAP no cromossomo 7. Por análises de sequências genômicas do camundongo, Gao e outros (2002) mapearam o gene Zap no cromossomo 6.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=607312
2009 Aug 28;4(8):e6819.
Mirando a Hipóxia nas Células do Câncer pela Restauração da Proteína Cinase 2 de Interação a Homeodomínio e da Atividade da p53 e Supressão da HIF-1 Alfa.
Argumento: A proteína cinase 2 de interação a homeodomínio [sinônimo de homeobox, é uma sequência de DNA bastante conservada de cerca de 180 pares de bases próximos à extremidade 3’ de genes homeóticos {que têm domínios homólogos} específicos; codifica um domínio de ligação de DNA, permitindo que as proteínas do homeoboxe se liguem à expressão gênica no desenvolvimento e a regulem; Stedman] supressor de tumor (HIPK2) pela fosforilação da serina 46 é um regulador cruscial da função apoptótica da proteína p53. A HIPK2 também é um co-repressor transcricional do fator 1 alfa indutível por hipóxia (HIF-alfa) restringindo a angiogênse tumoral e a quimioresistência. Aqui nós procuramos alvejar a hipóxia restaurando a função da HIPK2 e suprimindo o HIF-1alfa, de modo a proporcionar evidência para o envolvimento de ambas a HIPK2 e a p53 na contramão da quimio-resistência induzida por hipóxia.
Metodologia e Principais Achados: Na exposição de células de câncer de cólon e de pulmão à hipóxia, tanto por baixo oxigênio ou cobalto, a função da HIPK2 foi diminuída permitindo o aumento da expressão da HIF-1 alfa e inibindo a resposta apoptótica da p53 à droga. O cobalto suprimiu o recrutamento da HIPK2 ao promotor da HIF-1alfa. A expressão da p53 induzida por hipóxia alveja MDM2 que sub-regula a HIPK2, assim a inibição da MDM2 por siRNA restaurou a resposta da HIPK2/p53Ser46 à droga. A suplementação de zinco à células tratadas com hipóxia aumentou a estabilidade da proteína HIPK2 e a acumulação nuclear, levando à restauração da ligação da HIPK2 com o promotor da HIF-1 alfa. Repressão dos genes da MDR1, Bcl2 e VEGF, e ativação da resposta apoptótica da p53 à droga. A combinação de zinco e ADR suprimiu fortemente o crescimento do tumor in vivo pela inibição da via HIF-1 e sobre-regulando genes alvo da p53 apoptótica.
Conclusão: Nós mostramos aqui pela primeira vez que a desregulação da HIPK2 induzida por hipóxia foi contrabalançada por zinco que restaurou a supressão da via HIF-1 pela HIPK2 e reativou a resposta apoptótica da p53 à droga, desvendando o uso potencial da suplementação de zinco em combinação com a quimioterapia para direcionar a hipóxia e melhorar o tratamento do tumor.
PMID: 19714248
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2729407/?tool=pubmed
Títulos Alternativos
ZINC FINGER ANTIVIRAL PROTEIN; ZAP
Lócus do Gene Mapeado 7q34
TEXTO
DESCRIÇÃO
ZC3HAV1 é uma protein de dedos de zinco de tipo CCCH que impede a infecção por retroviroses.
CLONAGEM
Em suas análises de genes expressados no fígado humano fetal, Yu e outros (2001) identificaram o ZC3HAV1, ao qual eles chamaram ZAP, como um cDNA de 1.524 pares de bases com uma sequência aberta de leitura de 264 aminoácidos.
Gao e outros (2002) sondaram bibliotecas de cDNA de mamíferos para genes que impedem a infecção por um retrovíus marcado geneticamente. As células resistentes a vírus foram selecionadas de reservatórios de clones transduzidos, e um cDNA antiviral ativo foi descoberto. O gene codifica uma proteína de dedos de zinco de tipo CCCH designada ZAP para proteína antiviral de dedos de zinco. Gao e outros (2002) clonaram a lente total do cDNA da Zap, a qual continha 776 códons. Análises de pigmentação Northern da Zap do rato mostraram que o mRNA era altamente expressado nos rins e no fígado, mas indetectável no cérebro e nos testículos. Dois mRNAs (de 3,5 e 4,5 quilobases) foram observados na maioria dos tecidos possivelmente correspondendo a variantes de Splice alternativo. A expressão do gene causou perda profunda e específica de mRNAs virais do citoplasma das células do rato de do camundongo sem afetar os níveis de mRNAs nucleares. Essa observação sugeriu a existência de um mecanismo previamente desconhecido para a inibição da replicação viral atingindo uma etapa da expressão do gene viral.
Por busca em bancos de dados com sequências evolutivamente conservadas no gene TIPARP (omim 612480), Katoh e Katoh (2003) identificaram dois genes humanos, FLJ22693 (PARP12; omim 612481) e ZC3HAV1, codificadores de proteínas deduzidas com os mesmos domínios conservados: um domínio WWE e um domínio de tipo PARP, e um domínio TPH. O domínio terminal N do domínio TPH nos três genes contém um dedo de zinco de tipo CCCH. Katoh e Katoh (2003) notaram que a PARP12 e a ZCH3HAV1 cmpartilham 27,5% e 26% de identidade na sequência de aminoáciodos em geral com a TIPARP, respectivamente. Eles estabeleceram que a proteína ZC3HAV1 contém 902 aminoácidos.
MAPEAMENTO
Yu e outros (2001) assinaram o gene ZAP no cromossomo 7. Por análises de sequências genômicas do camundongo, Gao e outros (2002) mapearam o gene Zap no cromossomo 6.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=607312
2009 Aug 28;4(8):e6819.
Mirando a Hipóxia nas Células do Câncer pela Restauração da Proteína Cinase 2 de Interação a Homeodomínio e da Atividade da p53 e Supressão da HIF-1 Alfa.
Argumento: A proteína cinase 2 de interação a homeodomínio [sinônimo de homeobox, é uma sequência de DNA bastante conservada de cerca de 180 pares de bases próximos à extremidade 3’ de genes homeóticos {que têm domínios homólogos} específicos; codifica um domínio de ligação de DNA, permitindo que as proteínas do homeoboxe se liguem à expressão gênica no desenvolvimento e a regulem; Stedman] supressor de tumor (HIPK2) pela fosforilação da serina 46 é um regulador cruscial da função apoptótica da proteína p53. A HIPK2 também é um co-repressor transcricional do fator 1 alfa indutível por hipóxia (HIF-alfa) restringindo a angiogênse tumoral e a quimioresistência. Aqui nós procuramos alvejar a hipóxia restaurando a função da HIPK2 e suprimindo o HIF-1alfa, de modo a proporcionar evidência para o envolvimento de ambas a HIPK2 e a p53 na contramão da quimio-resistência induzida por hipóxia.
Metodologia e Principais Achados: Na exposição de células de câncer de cólon e de pulmão à hipóxia, tanto por baixo oxigênio ou cobalto, a função da HIPK2 foi diminuída permitindo o aumento da expressão da HIF-1 alfa e inibindo a resposta apoptótica da p53 à droga. O cobalto suprimiu o recrutamento da HIPK2 ao promotor da HIF-1alfa. A expressão da p53 induzida por hipóxia alveja MDM2 que sub-regula a HIPK2, assim a inibição da MDM2 por siRNA restaurou a resposta da HIPK2/p53Ser46 à droga. A suplementação de zinco à células tratadas com hipóxia aumentou a estabilidade da proteína HIPK2 e a acumulação nuclear, levando à restauração da ligação da HIPK2 com o promotor da HIF-1 alfa. Repressão dos genes da MDR1, Bcl2 e VEGF, e ativação da resposta apoptótica da p53 à droga. A combinação de zinco e ADR suprimiu fortemente o crescimento do tumor in vivo pela inibição da via HIF-1 e sobre-regulando genes alvo da p53 apoptótica.
Conclusão: Nós mostramos aqui pela primeira vez que a desregulação da HIPK2 induzida por hipóxia foi contrabalançada por zinco que restaurou a supressão da via HIF-1 pela HIPK2 e reativou a resposta apoptótica da p53 à droga, desvendando o uso potencial da suplementação de zinco em combinação com a quimioterapia para direcionar a hipóxia e melhorar o tratamento do tumor.
PMID: 19714248
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2729407/?tool=pubmed
domingo, 18 de abril de 2010
Engenheirando Proteína Permeável à Célula
Bernhard Münst, Christoph Patsch, Frank Edenhofer
Stem Cell Engineering Group, Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn - Life & Brain Center and Hertie Foundation
28/12/2009
RESUMO
A técnica de transdução de proteína permite a entrega direta de material biologicamente ativo para dentro de células de mamíferos. Para isso pode-se fazer uso da habilidade de translocação dos peptídeos assim chamados de penetração celular (CPPs), também designados como proteínas de domínios de transdução (PTDs). A TAT-CPP derivada da proteína Tat (transativadora de transcrição) do vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1) tem sido amplamente usada. A TAT positivamente carregada promove a permeabilidade celular deste modo superando as barreiras da membrana celular por endocitose ou/e penetração direta da membrana. Em combinação com um sinal de localização nuclear (NLS) proteínas em fusão são capazes de entrar no núcleo exibindo funcionalidade. Nosso vídeo demonstra, como uma exemplificação da engenharia de proteínas permeáveis às células, a construção, produção e aplicação de uma versão de enzima Cre de modificação do DNA permeável à célula.
A Cre é uma recombinase de sítio específico que é capaz de reconhecer e recombinar sítios loxP de 34 pares de bases nas células dos mamíferos in vitro e in vivo. Por isso o sistema Cre/loxP é amplamente usado para induzir condicionalmente mutações no genoma de células vivas. A entrega de uma recombinase Cre ativa às células, entretanto, representa uma limitação.
Nós descrevemos o sistema do vetor pSESAME, o qual permite uma inserção direta de um gene de interesse e proporciona uma plataforma para rapidamente clonar domínios diferentes e etiquetas usados dentro de um vetor de maneira conveniente e padronizada. O rearranjo de diferentes etiquetas tem sido mostrado como um modificador das propriedades bioquímicas de proteínas fundidas proporcionando uma possibilidade para atingirem-se produção mais alta e melhores solubilidades. Nós demonstramos como expressar e purificar proteínas recombinantes permeáveis à células na e da E.coli. A funcionalidade da proteína recombinante Cre é finalmente validade em cultura celular pela disponibilização de sua atividade de recombinase intracelular.
RESULTADOS REPRESENTATIVOS
No dia seguinte a solução de coloração X-Gal foi aspirada e as células foram cobertas com uma camada de PBS para análises microscópicas. 80 a 100% das células recombinadas puderam ser observados dentro das células ES murinas a julgar pela atividade da β-galactosidase.
DISCUSSÃO
Durante o processo de purificação da proteína de fusão com Cre é importante não omitir a adição de gelo ao buffer TBS antes de centrifugar. De outra forma a recombinase Cre tende a precipitar dentro do buffer de glicerol.
Se a fração de eluato (que emerge da solução) parecer tornar-se turva/densa devido à alta concentração de proteínas fundidas, um bufer de eluição adicional deverá ser adicionado antes da solução ter clareado de novo.
A aplicação de 10μM de proteína de fusão com Cre resulta tipicamente em uma recombinação com eficiência de 80 a 100%. O Soro de Feto de Vitelo (FCS) sendo um componente principal do meio de células ES inibe fortemente a transdução de proteínas. Por isso altas concentrações de recombinase Cre tiveram que ser usadas. Ao trabalhar com condições livres de soro menos proteína (0.5 - 2 μM) pode ser usada para alcançar similar eficiência de recombinação.
Com o sistema de vetor pSESAME na mão pode-se aplicar a técnica de transdução de proteína para outras proteínas incluindo fatores de transcrição tais como Oct4 e Sox2 e Scl/Tal1.
FONTE: http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1627
Bernhard Münst, Christoph Patsch, Frank Edenhofer
Stem Cell Engineering Group, Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn - Life & Brain Center and Hertie Foundation
28/12/2009
RESUMO
A técnica de transdução de proteína permite a entrega direta de material biologicamente ativo para dentro de células de mamíferos. Para isso pode-se fazer uso da habilidade de translocação dos peptídeos assim chamados de penetração celular (CPPs), também designados como proteínas de domínios de transdução (PTDs). A TAT-CPP derivada da proteína Tat (transativadora de transcrição) do vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1) tem sido amplamente usada. A TAT positivamente carregada promove a permeabilidade celular deste modo superando as barreiras da membrana celular por endocitose ou/e penetração direta da membrana. Em combinação com um sinal de localização nuclear (NLS) proteínas em fusão são capazes de entrar no núcleo exibindo funcionalidade. Nosso vídeo demonstra, como uma exemplificação da engenharia de proteínas permeáveis às células, a construção, produção e aplicação de uma versão de enzima Cre de modificação do DNA permeável à célula.
A Cre é uma recombinase de sítio específico que é capaz de reconhecer e recombinar sítios loxP de 34 pares de bases nas células dos mamíferos in vitro e in vivo. Por isso o sistema Cre/loxP é amplamente usado para induzir condicionalmente mutações no genoma de células vivas. A entrega de uma recombinase Cre ativa às células, entretanto, representa uma limitação.
Nós descrevemos o sistema do vetor pSESAME, o qual permite uma inserção direta de um gene de interesse e proporciona uma plataforma para rapidamente clonar domínios diferentes e etiquetas usados dentro de um vetor de maneira conveniente e padronizada. O rearranjo de diferentes etiquetas tem sido mostrado como um modificador das propriedades bioquímicas de proteínas fundidas proporcionando uma possibilidade para atingirem-se produção mais alta e melhores solubilidades. Nós demonstramos como expressar e purificar proteínas recombinantes permeáveis à células na e da E.coli. A funcionalidade da proteína recombinante Cre é finalmente validade em cultura celular pela disponibilização de sua atividade de recombinase intracelular.
RESULTADOS REPRESENTATIVOS
No dia seguinte a solução de coloração X-Gal foi aspirada e as células foram cobertas com uma camada de PBS para análises microscópicas. 80 a 100% das células recombinadas puderam ser observados dentro das células ES murinas a julgar pela atividade da β-galactosidase.
DISCUSSÃO
Durante o processo de purificação da proteína de fusão com Cre é importante não omitir a adição de gelo ao buffer TBS antes de centrifugar. De outra forma a recombinase Cre tende a precipitar dentro do buffer de glicerol.
Se a fração de eluato (que emerge da solução) parecer tornar-se turva/densa devido à alta concentração de proteínas fundidas, um bufer de eluição adicional deverá ser adicionado antes da solução ter clareado de novo.
A aplicação de 10μM de proteína de fusão com Cre resulta tipicamente em uma recombinação com eficiência de 80 a 100%. O Soro de Feto de Vitelo (FCS) sendo um componente principal do meio de células ES inibe fortemente a transdução de proteínas. Por isso altas concentrações de recombinase Cre tiveram que ser usadas. Ao trabalhar com condições livres de soro menos proteína (0.5 - 2 μM) pode ser usada para alcançar similar eficiência de recombinação.
Com o sistema de vetor pSESAME na mão pode-se aplicar a técnica de transdução de proteína para outras proteínas incluindo fatores de transcrição tais como Oct4 e Sox2 e Scl/Tal1.
FONTE: http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1627
*603499 TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY, MEMBER 11A; TNFRSF11A
Títulos Alternativos
RECEPTOR ACTIVATOR OF NF-KAPPA-B; RANK
OSTEOCLAST DIFFERENTIATION FACTOR RECEPTOR; ODFR
PDB2 GENE
TRANCER
Lócus do Gene Mapeado 18q22.1
TEXTO
CLONAGEM
Células dendríticas são células hematopoiéticas raras que capturam, processam e apresentam antígenos às células T. Anderson e outros (1997) identificaram cDNAs em células dendríticas codificando uma proteína com homologia ao domínio extracelular de um membro da super-família o receptor de fator de necrose tumoral (TNFR). Eles designaram a proteína RANK prevista em 616 aminoácidos, como ‘ativador do receptor de NF-kappa-B’ (veja 164011). A RANK é uma proteína transmembrana de tipo I. Como outros membros da super-família de TNFR, ela contém quarto pseudo-repetições extra-celulares ricas em cisteína. As proteínas RANK do camundongo e humana são 70% idênticas. Análises de pigmentação Northern indicaram que o mRNA da RANK humana é expressado ubíquamente. Em algumas linhas celulares humanas, os autores detectaram transcritos adicionais que foram derivados do uso de sinais alternativos de poli-adenilação no gene RANK. Anderson e outros (1997) também isolaram o ligante de RANK, a RANKL (TNFSF11; omim 602642). Complexos NF-kappa-B/DNA foram induzidos em linfócitos T positivos em RANK incubados com RANKL, indicando a ativação específica do NF-kappa-B por RANK em células T humanas. A RANKL aumentou a capacidade das células dendríticas em estimular a proliferação de células T novas (virgens) em uma reação de linfócitos misturada e aumentou a sobrevivência de células T positivas em RANK geradas com IL4 (omim 147780) e TGF-beta (190180). Anderson e outros (1997) concluíram que a RANK e a RANKL parecem ser importantes reguladores de interações entre as células T e as células dendríticas.
FUNÇÃO DO GENE
O remodelamento do osso envolve a reabsorção do osso pelos osteoclastos e a síntese do osso pelos osteoblastos. O fator de diferenciação dos osteoclastos (ODF ou RANKL) media um sinal essencial para a osteoclastogênese. O ODF é um ligante da osteoprotegerina (OPG; 602643), um membro da família de receptores de fator de necrose tumoral secretado que inibe a osteoclastogênese. Usando uma linha celular protenitora de osteoclasto de tipo macrófago, Nalagawa e outros (1998) identificaram a RANK como ODFR, o receptor de ODF ligado à membrana nas progenitoras de osteoclasto. Na presença do fator estimulador de colônia de macrófagos (omim 120420 – o CSF1 é uma citocina requerida para a diferenciação de células da linhagem dos monócitos (macrófagos dos tecidos, osteoclastos e micróglia [pequenas células da neuroglia que podem se tornar fagócitos em áreas de inflamação ou lesão neural; Stedman] durante o desenvolvimento.), um anticorpo policlonal contra o domínio extra-celular da RANK induziu a osteoclastogênese em células do baço. Os autores demonstraram que a OPG atua como um receptor isca para a RANKL para competir contra a RANK. Eles concluíram que a RANK é o receptor de sinalização essencial para a osteoclastogênese mediada pela RANKL.
Jones e outros (2006) demonstraram que a citocina RANKL dispara a migração de células de câncer epitelial humanas e células de melanona que expressam o receptor RANK. A RANK é expressada em linhas de células cancerosas e células de câncer de mama de pacientes. Em um modelo de camundongo de metástase de melanoma, a neutralização da RANKL ‘in vivo’ pela osteoprotegerina resulta na proteção completa contra a paralisia e uma marcada redução no brotamento do tumor em ossos mas não em outros órgãos. Jones e outros (2006) concluíram que seus dados mostram que fatores de diferenciação local tais como RANKL tem um papel importante na migração celular e no comportamento metastásico de células de câncer em tecido específico.
Hanada e outros (2009) relataram que a RANKL e a RANK tem um papel essencial no cérebro. Em ambos camundongo e rato, injeções de RANKL central (deve ser no sistema nervoso central) dispararam febre severa. Usando camundongos com rank (flanqueada por loxP) eliminável com nestina (600915)-Cre {promotor da nestina com DNA de Cre recombinase} e GFAP-Cre específicas do tecido, Hanada e outros (2009) mapearam geneticamente a função da RANK na resposta de febre aos astrócitos. Importantemente os camundongos com nestina-Cre e GFAP-cre com rank (flanqueada por loxP) deletável são resistentes à febre induzida por lipopolissacarídeo bem como febre em resposta a citocinas inflamatórias IL-1-beta (147720) e TNF-alfa (191160). Mecanicamente, a RANKL ativa regiões do cérebro envolvidas na termo-regulação e induz a febre por via da rota COX2-PGF2 (veja 600262)/EP3R(176806). Além disso, camundongos fêmea com rank floxada e nestina-Cre e GFAP-Cre exibiram temperaturas corporais básicas aumentadas, sugerindo que a RANKL e a RANK controlam a termo-regulação durante a fisiologia normal feminina. Hanada e outros (2009) também acharam que duas crianças com mutações na RANK exibiam febre diminuída durante a pneumonia. Hanada e outros (2009) concluíram que seus dados identificaram uma função inteiramente nova e inesperada para os fatores de diferenciação chave dos osteoclastos RANKL/RANK na termo-regulação feminina e na resposta central de febre na inflamação.
[Obs.: Etimologia: Abbreviation of "flanked by loxP" > abreviatura de “flanqueado por loxP”
Fonte: http://en.wiktionary.org/wiki/flox
Em biologia molecular significa fazer um sanduíche com uma sequência de DNA entre duas sequências de ligação a recombinase tais como “loxP”]
[OBS.: O sistema Cre-loxP deve ter alguma semelhança com o mecanismo de Cre (Elemento de Resposta a AMP cíclico) e CREB, e quiçá com o mecanismo de recombinação dos anticorpos, segundo esta que vos escreve.
http://www.jbc.org/content/279/35/37040.long e http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC46561/?tool=pubmed
Omim 123810: Todos os promotores de genes responsivos a AMP cíclico têm em comum um intensificador de oito bases conhecido como elemento de resposta a AMP cíclica (CRE) contendo uma sequência central conservada, 5’– TGACG- 3’, primeiro descrita no gene da somatostatina por Montminy e outros (1986). Montminy e Bilezikjian (1987) purificaram uma fosfoproteína nuclear de 43 quilo-bases que se liga a CRE com alta afinidade. Hoeffler e outros isolaram clones cDNA para a CREB humana.]
[Obs.: Sistema de recombinação Cre-loxP:
A Cre é uma recombinase de sítio específico do bacteriófago P1. Ela é um membro da família de integrases de tirosina e catalisa a recombinação recíproca entre 34 pares de bases específicos chamados loxP. Para analisar os relacionamentos entre estrutura e função dessa enzima, nós desempenhamos mutagêneses de inserção de penta-peptídeo em larga escala para gerar inserções de cinco aminoácidos em posições aleatórias na proteína. A alta densidade de mutações de inserção na Cre nos permitiu identificar um grau inesperado de tolerância funcional para inserções dentro de quatro a cinco hairpin beta e dentro do laço entre as hélices J e K (ambos os quais contactam o DNA no sulco menor) e também na hélice A.
A recombinase Cre do fago P1 é um membro da família de integrases de tirosina das recombinases de sítio específico cujos membros usam um resíduo conservado de tirosina como um nucleófilo [um átomo doador de um par de elétrons numa reação química, em que o par de elétrons é capturado por um eletrófilo; qualquer reação ou reagente ou substância atraída para uma região de baixa densidade eletrônica; Steddman] catalítico. Análises moleculares da Cre têm proporcionado uma profusão de informações sobre a bioquímica e estrutura nos mecanismos de recombinação, e esta enzima também é extensivamente usada para engenharia nos cromossomos dos eucariotos superiores.
A proteína Cre catalisa a recombinação precisa entre duas cópias de sua sequência alvo o sítio loxP de 34 pares de bases. Duas moléculas Cre ligam-se específicamente a um único sítio loxP, e um par desses sítios loxP ocupados por Cre juntam-se para formar um complexo sináptico. Uma junção Holliday intermediária é então produzida pela clivagem e subseqüente religação das fitas de DNA, seguida pela isomerização, clivarem e religação das fitas de DNA cruzadas para formar os produtos da recombinação.
http://www.jbc.org/content/279/35/37040.long]
MAPEAMENTO
Por análises de células somáticas e radiação de painéis híbridos, Anderson e outros (1997) mapearam o gene de RANK em 18q22.1.
GENÉTICA MOLECULAR
O gene TNFRSF11A, o qual codifica o receptor ativador do fator-kappa B nuclear (RANK), mapeia na mesma região que a osteólise expansível familiar (FEO;omim 174810) e uma forma da doença de Paget do osso (veja 602080). Por esta razão, Hughes e outros (2000) procuraram mutações no gene TNFRSF11A em uma grande família do norte da Irlanda com FEO na qual a ligação a marcadores em 18q tinha sido estabelecida. Eles também recrutaram uma família americana um pouco menor com FEO com indivíduos afetados em quatro gerações, e uma pequena família Alemã. Nas famílias do Norte Irlandês e Americana com FEO, duplicações seguidas (uma atrás da outra, em tanden) idênticas das bases de 84 a 101 (84dup18) no primeiro éxon do gene TNFRSF11A foram encontradas em todos os indivíduos afetados testados. Uma duplicação 84dup18 idêntica foi encontrada no DNA de um membro afetado da família Alemã. Eles estudaram quatro famílias PDB com evidência de possível ligação ao 18q. Em somente uma dessas foi encontrada uma anormalidade no TNFRSF11A: uma duplicação ligeiramente maior envolvendo as bases de 75 a 101. Nenhuma mutação foi encontrada nas outras três famílias PDB ou no cDNA preparado dos cinco pacientes com osso afetado com PDB esporádica. Ambas as duplicações compartilhavam um ponto de finalização na ponta 3 na base 101 e considerou-se que surgiram por combinação reversa durante a replicação do DNA.
Marco-Mingot e outros (2001) estudaram 18 pacientes espanhóis com doença de Paget do osso e não encontraram exemplo da doença causada por mutação na sequência codificadora do gene RANK. Hocking e outros (2000), Good e outros (2001), Sparks e outros (2001) e Wuyts e outros (2001) apresentaram dados das análises de ligação e mutação indicando que as mutações na RANK não eram comuns tanto na PDB familiar quanto na esporádica (Hocking e outros, 2001).
Em oito pacientes das sete famílias não aparentadas com severa osteopetrose pobre em osteoclasto (OPTB7; omim 612301), as quais eram conhecidas por carecerem de mutações em genes associados com a osteopetrose recessiva autossômica, Guerrini e outros (2008) identificaram homozigozidade ou heterogozidada composta para sete mutações diferentes no gene TNFRSF11A. Os níveis de imunoglobulinas no soro foram encontrados reduzidos em três dos quatro pacientes testados. Guerrini e outros (2008) concluíram que as mutações no TNFRSF11A podem causar uma condição clínica na qual a osteopetrose severa autossômica recessiva está associada a defeitos na produção de imunoglobulina.
MODELO ANIMAL
Dougall e outros (1999) geraram camundongos Rank-/- e encontraram que eles tinham osteopetrose profunda resultante de um bloqueio na diferenciação do osteoclasto mielóide. Entretanto, a Rank não era requerida para a contenção das rotas para o macrófago, granulócito ou células dendríticas. Os camundongos Rank-/- também exibiram deficiência de célula B no baço. Os linfonodos periféricos, exceto os tecidos linfóides associados à mucosa, estavam ausentes nos camundongos Rank -/-. Dougall e outros (1999) concluíram que a RANK é crítica para a organogênese do linfonodo e a diferenciação do osteoclasto.
Li e outros (2000) geraram camundongos nulos em Rank para determinar as interações genéticas moleculares entre a osteoprotegerina, a ligante da osteoprotegerina e a RANK durante a reabsorção do osso e processos de remodelamento. Os camundongos Rank-/- careciam de osteoclastos a tinham um profundo defeito na reabsorção e remodelamento do osso e no desenvolvimento das placas de crescimento cartiloginosas do osso endrocrondral (intra-cartiloginoso). A osteopetrose observada nesses camundongos pôde ser revertida pelo transplante de medula óssea de camundongos nulizigotos do gene 1 de ativação da recombinase (RAG1; omim 179615), indicando que os camundongos Rank -/- têm um defeito intrínseco na função dos osteoclastos.
Hormônios calciotrópicos e citocinas pró-reabsorção que são conhecidas por induzir a reabsorção do osso em camundongos e humanos foram administradas aos camundongos Rank-/- sem indução de hiper-calcemia, embora o tratamento com fator alfa de necrose tumoral levasse ao raro aparecimento de células de tipo osteoclasto perto do sítio de injeção. A osteoclastogênese pôde ser iniciada nos camundongos Rank -/- pela transferência do cDNA da Rank de volta a precursoras hematopoiéticas, sugerindo um meio para avaliar criticamente feições estruturais da RANK na superfície de células determinantes que mediam os efeitos do ligante de osteoprotegerina na reabsorção e remodelamento do osso bem como os efeitos fisiológicos e patológicos dos hormônios calciotrópicos e citocinas pró-reabsorsivas.
Kapur e outros (2004) relataram o surgimento espontâneo de camundongos com osteopetrose maligna e ausência de linfonodos em uma colônia altamente inata (consangüínea). A herança era autossômica recessiva, e o fenótipo relembrava o dos camundongos nocauteados para Rankl ou Rank, exceto pela morte inexplicada da maioria dos camundongos entre duas e três semanas após o desmame. Análises de mutação revelaram homozigosidade para uma deleção de oito pares de bases no éxon dois do gene Rank; os autores sugeriram que algumas formas de osteopetrose maligna (omim 159700) poderiam resultar de um defeito similar no gene Rank.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=603499
Títulos Alternativos
RECEPTOR ACTIVATOR OF NF-KAPPA-B; RANK
OSTEOCLAST DIFFERENTIATION FACTOR RECEPTOR; ODFR
PDB2 GENE
TRANCER
Lócus do Gene Mapeado 18q22.1
TEXTO
CLONAGEM
Células dendríticas são células hematopoiéticas raras que capturam, processam e apresentam antígenos às células T. Anderson e outros (1997) identificaram cDNAs em células dendríticas codificando uma proteína com homologia ao domínio extracelular de um membro da super-família o receptor de fator de necrose tumoral (TNFR). Eles designaram a proteína RANK prevista em 616 aminoácidos, como ‘ativador do receptor de NF-kappa-B’ (veja 164011). A RANK é uma proteína transmembrana de tipo I. Como outros membros da super-família de TNFR, ela contém quarto pseudo-repetições extra-celulares ricas em cisteína. As proteínas RANK do camundongo e humana são 70% idênticas. Análises de pigmentação Northern indicaram que o mRNA da RANK humana é expressado ubíquamente. Em algumas linhas celulares humanas, os autores detectaram transcritos adicionais que foram derivados do uso de sinais alternativos de poli-adenilação no gene RANK. Anderson e outros (1997) também isolaram o ligante de RANK, a RANKL (TNFSF11; omim 602642). Complexos NF-kappa-B/DNA foram induzidos em linfócitos T positivos em RANK incubados com RANKL, indicando a ativação específica do NF-kappa-B por RANK em células T humanas. A RANKL aumentou a capacidade das células dendríticas em estimular a proliferação de células T novas (virgens) em uma reação de linfócitos misturada e aumentou a sobrevivência de células T positivas em RANK geradas com IL4 (omim 147780) e TGF-beta (190180). Anderson e outros (1997) concluíram que a RANK e a RANKL parecem ser importantes reguladores de interações entre as células T e as células dendríticas.
FUNÇÃO DO GENE
O remodelamento do osso envolve a reabsorção do osso pelos osteoclastos e a síntese do osso pelos osteoblastos. O fator de diferenciação dos osteoclastos (ODF ou RANKL) media um sinal essencial para a osteoclastogênese. O ODF é um ligante da osteoprotegerina (OPG; 602643), um membro da família de receptores de fator de necrose tumoral secretado que inibe a osteoclastogênese. Usando uma linha celular protenitora de osteoclasto de tipo macrófago, Nalagawa e outros (1998) identificaram a RANK como ODFR, o receptor de ODF ligado à membrana nas progenitoras de osteoclasto. Na presença do fator estimulador de colônia de macrófagos (omim 120420 – o CSF1 é uma citocina requerida para a diferenciação de células da linhagem dos monócitos (macrófagos dos tecidos, osteoclastos e micróglia [pequenas células da neuroglia que podem se tornar fagócitos em áreas de inflamação ou lesão neural; Stedman] durante o desenvolvimento.), um anticorpo policlonal contra o domínio extra-celular da RANK induziu a osteoclastogênese em células do baço. Os autores demonstraram que a OPG atua como um receptor isca para a RANKL para competir contra a RANK. Eles concluíram que a RANK é o receptor de sinalização essencial para a osteoclastogênese mediada pela RANKL.
Jones e outros (2006) demonstraram que a citocina RANKL dispara a migração de células de câncer epitelial humanas e células de melanona que expressam o receptor RANK. A RANK é expressada em linhas de células cancerosas e células de câncer de mama de pacientes. Em um modelo de camundongo de metástase de melanoma, a neutralização da RANKL ‘in vivo’ pela osteoprotegerina resulta na proteção completa contra a paralisia e uma marcada redução no brotamento do tumor em ossos mas não em outros órgãos. Jones e outros (2006) concluíram que seus dados mostram que fatores de diferenciação local tais como RANKL tem um papel importante na migração celular e no comportamento metastásico de células de câncer em tecido específico.
Hanada e outros (2009) relataram que a RANKL e a RANK tem um papel essencial no cérebro. Em ambos camundongo e rato, injeções de RANKL central (deve ser no sistema nervoso central) dispararam febre severa. Usando camundongos com rank (flanqueada por loxP) eliminável com nestina (600915)-Cre {promotor da nestina com DNA de Cre recombinase} e GFAP-Cre específicas do tecido, Hanada e outros (2009) mapearam geneticamente a função da RANK na resposta de febre aos astrócitos. Importantemente os camundongos com nestina-Cre e GFAP-cre com rank (flanqueada por loxP) deletável são resistentes à febre induzida por lipopolissacarídeo bem como febre em resposta a citocinas inflamatórias IL-1-beta (147720) e TNF-alfa (191160). Mecanicamente, a RANKL ativa regiões do cérebro envolvidas na termo-regulação e induz a febre por via da rota COX2-PGF2 (veja 600262)/EP3R(176806). Além disso, camundongos fêmea com rank floxada e nestina-Cre e GFAP-Cre exibiram temperaturas corporais básicas aumentadas, sugerindo que a RANKL e a RANK controlam a termo-regulação durante a fisiologia normal feminina. Hanada e outros (2009) também acharam que duas crianças com mutações na RANK exibiam febre diminuída durante a pneumonia. Hanada e outros (2009) concluíram que seus dados identificaram uma função inteiramente nova e inesperada para os fatores de diferenciação chave dos osteoclastos RANKL/RANK na termo-regulação feminina e na resposta central de febre na inflamação.
[Obs.: Etimologia: Abbreviation of "flanked by loxP" > abreviatura de “flanqueado por loxP”
Fonte: http://en.wiktionary.org/wiki/flox
Em biologia molecular significa fazer um sanduíche com uma sequência de DNA entre duas sequências de ligação a recombinase tais como “loxP”]
[OBS.: O sistema Cre-loxP deve ter alguma semelhança com o mecanismo de Cre (Elemento de Resposta a AMP cíclico) e CREB, e quiçá com o mecanismo de recombinação dos anticorpos, segundo esta que vos escreve.
http://www.jbc.org/content/279/35/37040.long e http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC46561/?tool=pubmed
Omim 123810: Todos os promotores de genes responsivos a AMP cíclico têm em comum um intensificador de oito bases conhecido como elemento de resposta a AMP cíclica (CRE) contendo uma sequência central conservada, 5’– TGACG- 3’, primeiro descrita no gene da somatostatina por Montminy e outros (1986). Montminy e Bilezikjian (1987) purificaram uma fosfoproteína nuclear de 43 quilo-bases que se liga a CRE com alta afinidade. Hoeffler e outros isolaram clones cDNA para a CREB humana.]
[Obs.: Sistema de recombinação Cre-loxP:
A Cre é uma recombinase de sítio específico do bacteriófago P1. Ela é um membro da família de integrases de tirosina e catalisa a recombinação recíproca entre 34 pares de bases específicos chamados loxP. Para analisar os relacionamentos entre estrutura e função dessa enzima, nós desempenhamos mutagêneses de inserção de penta-peptídeo em larga escala para gerar inserções de cinco aminoácidos em posições aleatórias na proteína. A alta densidade de mutações de inserção na Cre nos permitiu identificar um grau inesperado de tolerância funcional para inserções dentro de quatro a cinco hairpin beta e dentro do laço entre as hélices J e K (ambos os quais contactam o DNA no sulco menor) e também na hélice A.
A recombinase Cre do fago P1 é um membro da família de integrases de tirosina das recombinases de sítio específico cujos membros usam um resíduo conservado de tirosina como um nucleófilo [um átomo doador de um par de elétrons numa reação química, em que o par de elétrons é capturado por um eletrófilo; qualquer reação ou reagente ou substância atraída para uma região de baixa densidade eletrônica; Steddman] catalítico. Análises moleculares da Cre têm proporcionado uma profusão de informações sobre a bioquímica e estrutura nos mecanismos de recombinação, e esta enzima também é extensivamente usada para engenharia nos cromossomos dos eucariotos superiores.
A proteína Cre catalisa a recombinação precisa entre duas cópias de sua sequência alvo o sítio loxP de 34 pares de bases. Duas moléculas Cre ligam-se específicamente a um único sítio loxP, e um par desses sítios loxP ocupados por Cre juntam-se para formar um complexo sináptico. Uma junção Holliday intermediária é então produzida pela clivagem e subseqüente religação das fitas de DNA, seguida pela isomerização, clivarem e religação das fitas de DNA cruzadas para formar os produtos da recombinação.
http://www.jbc.org/content/279/35/37040.long]
MAPEAMENTO
Por análises de células somáticas e radiação de painéis híbridos, Anderson e outros (1997) mapearam o gene de RANK em 18q22.1.
GENÉTICA MOLECULAR
O gene TNFRSF11A, o qual codifica o receptor ativador do fator-kappa B nuclear (RANK), mapeia na mesma região que a osteólise expansível familiar (FEO;omim 174810) e uma forma da doença de Paget do osso (veja 602080). Por esta razão, Hughes e outros (2000) procuraram mutações no gene TNFRSF11A em uma grande família do norte da Irlanda com FEO na qual a ligação a marcadores em 18q tinha sido estabelecida. Eles também recrutaram uma família americana um pouco menor com FEO com indivíduos afetados em quatro gerações, e uma pequena família Alemã. Nas famílias do Norte Irlandês e Americana com FEO, duplicações seguidas (uma atrás da outra, em tanden) idênticas das bases de 84 a 101 (84dup18) no primeiro éxon do gene TNFRSF11A foram encontradas em todos os indivíduos afetados testados. Uma duplicação 84dup18 idêntica foi encontrada no DNA de um membro afetado da família Alemã. Eles estudaram quatro famílias PDB com evidência de possível ligação ao 18q. Em somente uma dessas foi encontrada uma anormalidade no TNFRSF11A: uma duplicação ligeiramente maior envolvendo as bases de 75 a 101. Nenhuma mutação foi encontrada nas outras três famílias PDB ou no cDNA preparado dos cinco pacientes com osso afetado com PDB esporádica. Ambas as duplicações compartilhavam um ponto de finalização na ponta 3 na base 101 e considerou-se que surgiram por combinação reversa durante a replicação do DNA.
Marco-Mingot e outros (2001) estudaram 18 pacientes espanhóis com doença de Paget do osso e não encontraram exemplo da doença causada por mutação na sequência codificadora do gene RANK. Hocking e outros (2000), Good e outros (2001), Sparks e outros (2001) e Wuyts e outros (2001) apresentaram dados das análises de ligação e mutação indicando que as mutações na RANK não eram comuns tanto na PDB familiar quanto na esporádica (Hocking e outros, 2001).
Em oito pacientes das sete famílias não aparentadas com severa osteopetrose pobre em osteoclasto (OPTB7; omim 612301), as quais eram conhecidas por carecerem de mutações em genes associados com a osteopetrose recessiva autossômica, Guerrini e outros (2008) identificaram homozigozidade ou heterogozidada composta para sete mutações diferentes no gene TNFRSF11A. Os níveis de imunoglobulinas no soro foram encontrados reduzidos em três dos quatro pacientes testados. Guerrini e outros (2008) concluíram que as mutações no TNFRSF11A podem causar uma condição clínica na qual a osteopetrose severa autossômica recessiva está associada a defeitos na produção de imunoglobulina.
MODELO ANIMAL
Dougall e outros (1999) geraram camundongos Rank-/- e encontraram que eles tinham osteopetrose profunda resultante de um bloqueio na diferenciação do osteoclasto mielóide. Entretanto, a Rank não era requerida para a contenção das rotas para o macrófago, granulócito ou células dendríticas. Os camundongos Rank-/- também exibiram deficiência de célula B no baço. Os linfonodos periféricos, exceto os tecidos linfóides associados à mucosa, estavam ausentes nos camundongos Rank -/-. Dougall e outros (1999) concluíram que a RANK é crítica para a organogênese do linfonodo e a diferenciação do osteoclasto.
Li e outros (2000) geraram camundongos nulos em Rank para determinar as interações genéticas moleculares entre a osteoprotegerina, a ligante da osteoprotegerina e a RANK durante a reabsorção do osso e processos de remodelamento. Os camundongos Rank-/- careciam de osteoclastos a tinham um profundo defeito na reabsorção e remodelamento do osso e no desenvolvimento das placas de crescimento cartiloginosas do osso endrocrondral (intra-cartiloginoso). A osteopetrose observada nesses camundongos pôde ser revertida pelo transplante de medula óssea de camundongos nulizigotos do gene 1 de ativação da recombinase (RAG1; omim 179615), indicando que os camundongos Rank -/- têm um defeito intrínseco na função dos osteoclastos.
Hormônios calciotrópicos e citocinas pró-reabsorção que são conhecidas por induzir a reabsorção do osso em camundongos e humanos foram administradas aos camundongos Rank-/- sem indução de hiper-calcemia, embora o tratamento com fator alfa de necrose tumoral levasse ao raro aparecimento de células de tipo osteoclasto perto do sítio de injeção. A osteoclastogênese pôde ser iniciada nos camundongos Rank -/- pela transferência do cDNA da Rank de volta a precursoras hematopoiéticas, sugerindo um meio para avaliar criticamente feições estruturais da RANK na superfície de células determinantes que mediam os efeitos do ligante de osteoprotegerina na reabsorção e remodelamento do osso bem como os efeitos fisiológicos e patológicos dos hormônios calciotrópicos e citocinas pró-reabsorsivas.
Kapur e outros (2004) relataram o surgimento espontâneo de camundongos com osteopetrose maligna e ausência de linfonodos em uma colônia altamente inata (consangüínea). A herança era autossômica recessiva, e o fenótipo relembrava o dos camundongos nocauteados para Rankl ou Rank, exceto pela morte inexplicada da maioria dos camundongos entre duas e três semanas após o desmame. Análises de mutação revelaram homozigosidade para uma deleção de oito pares de bases no éxon dois do gene Rank; os autores sugeriram que algumas formas de osteopetrose maligna (omim 159700) poderiam resultar de um defeito similar no gene Rank.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=603499
quarta-feira, 7 de abril de 2010
Mudanças de Expressão de Genes Relacionados com o Sistema Imune no Tecido Ósseo Humano Após a Menopausa
2009 Nov
Kósa JP, Balla B, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry A, Nagy Z, Bácsi K, Karsai A, Speer G, Lakatos P.
INTRODUÇÃO: As interações moleculares e celulares entre o sistema imune e o tecido ósseo foram estabelecidas. A deficiência no hormônio sexual após a menopausa tem papel multifuncional pela influência no crescimento, diferenciação e metabolismo do esqueleto e do sistema imune.
DISCUSSÃO: Nós usamos análises de padrão de expressão não paramétrica e multidimensional para determinar o perfil de mRNA significativamente alterado de genes associados ao sistema imune no osso na pós-menopausa e na pré-menopausa. Dez amostras de tecido ósseo de pacientes Pós e seis amostras de tecido ósseo de mulheres Pré foram examinadas em nosso estudo. As diferenças na transcrição dos 50 genes selecionados foram analisadas em sistema de reação em cadeia da polimerase em transcrição reversa em tempo real quantitativa. O teste Mann-Whitney indicou significativamente a atividade de transcrição sub-regulada de três genes (CD14, HLA-A/MHCI, ITGAN/CD11b) e expressão sobre-regulada de seis genes (C3, CD86/B&-2, IL-10, IL-6, TGFB3, TNFSF11/RANKL) no osso após a menopausa. De acordo com resultados de análise de variáveis canônicas, os grupos de mulheres após e pré menopausa são separáveis por genes codificadores de citocinas, moléculas co-estimulatórias, e receptores de superfície celular envolvidos em processos de apresentação de antígenos e estimulação de célula T que tem alto poder discriminatório. Baseados em análises de um complexo padrão de expressão de genes do tecido ósseo humano, nós pudemos distinguir estados Pós e Pré a partir do aspecto imunológico. Nossos dados devem proporcionar vislumbres adicionais para as mudanças da conversa cruzada de sistemas entre a homeostase imune e do esqueleto, bem como para resposta imune local no micro-ambiente alterado do osso após a menopausa.
PMID: 19662520
2009 Nov
Kósa JP, Balla B, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry A, Nagy Z, Bácsi K, Karsai A, Speer G, Lakatos P.
INTRODUÇÃO: As interações moleculares e celulares entre o sistema imune e o tecido ósseo foram estabelecidas. A deficiência no hormônio sexual após a menopausa tem papel multifuncional pela influência no crescimento, diferenciação e metabolismo do esqueleto e do sistema imune.
DISCUSSÃO: Nós usamos análises de padrão de expressão não paramétrica e multidimensional para determinar o perfil de mRNA significativamente alterado de genes associados ao sistema imune no osso na pós-menopausa e na pré-menopausa. Dez amostras de tecido ósseo de pacientes Pós e seis amostras de tecido ósseo de mulheres Pré foram examinadas em nosso estudo. As diferenças na transcrição dos 50 genes selecionados foram analisadas em sistema de reação em cadeia da polimerase em transcrição reversa em tempo real quantitativa. O teste Mann-Whitney indicou significativamente a atividade de transcrição sub-regulada de três genes (CD14, HLA-A/MHCI, ITGAN/CD11b) e expressão sobre-regulada de seis genes (C3, CD86/B&-2, IL-10, IL-6, TGFB3, TNFSF11/RANKL) no osso após a menopausa. De acordo com resultados de análise de variáveis canônicas, os grupos de mulheres após e pré menopausa são separáveis por genes codificadores de citocinas, moléculas co-estimulatórias, e receptores de superfície celular envolvidos em processos de apresentação de antígenos e estimulação de célula T que tem alto poder discriminatório. Baseados em análises de um complexo padrão de expressão de genes do tecido ósseo humano, nós pudemos distinguir estados Pós e Pré a partir do aspecto imunológico. Nossos dados devem proporcionar vislumbres adicionais para as mudanças da conversa cruzada de sistemas entre a homeostase imune e do esqueleto, bem como para resposta imune local no micro-ambiente alterado do osso após a menopausa.
PMID: 19662520
domingo, 4 de abril de 2010
Duas Novas Cucurbitacinas, Neocucurbitacinas A e B, da “Buchinha do Norte” (Luffa operculata) da Medicina Popular Brasileira e Seus Efeitos na Expressão dos Genes PEBP2αA e OCIF na Linha Celular Saos-2 do Tipo Osteoblasto Humano.
[OBS.: Cucurbitacina: http://quimicanova.sbq.org.br/qn/qnol/2004/vol27n6/18-RV03188.pdf - 740 KB ]
A massa óssea é regulada coordenadamente pelas células formadoras do osso (osteoblastos) e pelas células de reabsorção do osso (osteoclastos). Usando um bio-ensaio baseado em RT-PCR com células humanas Saos-2 de tipo osteoblastos, nós estivemos procurando por químicos que podem modular a expressão do gene da proteína 2αA de ligação ao intensificador de polioma (PEBP2αA) e do fator de inibitório da osteoclastogênese (OCIF).[Obs.: As viroses Poliomas são um gênero da família Papovaviridae que inclui o vírus símio 40 e o poliomavírus, ambos os quais causam tumores em roedores em têm sido extensivamente estudados como modelos de viroses de DNA oncogênicas. O vírus do tipo polioma pode causar uma doença aguda em aves psitacinas (papagaio). O nome polioma refere-se à propriedade de produção múltiplos (poli-) tumores (-oma). http://www.answers.com/topic/polyomavirus] O (complexo) PEBP2αA/AML3/CBFA1 é um regulador de transcrição da diferenciação do osteoblasto, e camundongos eliminados (sem o gene funcionante) nos quais o gene PWNP2αA tinha sido mutado não mostraram osteogênese. OCIF/OPG é uma proteína secretada dos osteoblastos ou células do estroma e atua como um instigador para o receptor do fator de diferenciação do osteoclasto (ODF), que proporciona meios para um sinal essencial aos osteoclastos precursores para sua diferenciação em osteoclastos. Camundongos deficientes em OCIF exibem osteoporose severa. Nosso objetivo no trabalho de sondagem é obter compostos naturais que possam ser usados como provas para estudos farmacológicos na via de transdução de sinal intra-celular direcionando a expressão do gene de PEBP2αA e OCIF.
O exame de plantas medicinais da América do Sul pelo ensaio usando células Saos-2 indicou que um extrato de MeOH(metanol) da Luffa operculata (Cucurbitaceae), uma planta medicinal bienal que cresce na região da Amazônia, inibiu a expressão dos gene de ambas PEBP2αA e OCIF. A planta é conhecida comumente como Buchinha ou Bucha dos paulistas no Brasil [Obs.: Buchinha do Norte] e o extrato aquoso da fruta tem sido usado como remédio para uretrite e empiema (pus em uma cavidade corporal), e no tratamento de edema. Purificação guiada por Bio-ensaio de um extrato bruto de L. opeculata levou ao isolamento de duas novas cucurbitacinas designadas como neo-cucurbutacinas A(1) e B(2), juntamente com as cucurbitacinas B, D, E e a isocucurbitacina B. A elucidação da estrutura dos compostos acima 1 e 2 estão relatadas nesse comunicado.
O extrato de MeOH (metanol) (16,35g) do fruto da L.operculata (200g) foi dissolvido em CH2Cl2 (diclorometano). A fração solúvel de CH2Cl2 (8,52g) foi submetida a cromatografia em colunas de gel de sílica usando-se um sistema solvente de CHCl3-MeOH (50:1), seguido de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) com CHCl3 (clorofórmio) sozinho para produzir 1 (curcubitacina A) (8 mg). Usando-se um sistema solvente CHCl3-MeOH seguido de HPLC com CHCl3-MeOH também produziu 2 (cucurbitacina B).
O composto 1, na forma de um pó menos colorido e amorfo, teve a fórmula molecular determinada como C31H42O8. O espectro em imagem de ressonância sugeriu a presença de grupos hidroxila e grupos carbonila. O espectro por H-NMR do composto 1 exibiu 40 prótons não permutáveis, incluindo nove grupos metil terciários, e quatro prótons olefínicos (olefina é alqueno). O espectro do composto 1 exibiu nove metilas, três metilenos, três metinas incluindo um carbono oxigenado, seis carbonos quaternários e quatro carbonos carbonil. O grupo metil e o grupo carbonil éster sugeriram a presença de uma metade acetóxica na molécula. Sete das 11 insaturações foram correspondentes, implicando que o composto 1 consistia de um sistema de quatro anéis.
...
A exposição de células Saos-2 a 25 μM do composto 1 por seis horas resultou em um significativo decréscimo nos níveis de mRNA de PEBP2αA e de OCIF, enquanto a exposição ao composto 2 (sugerindo-se fortemente como a metade desacetil do composto 1) teve quase nenhum efeito em sua expressão. O composto 3 (cucurbitacina B) apresentou a atividade mais potente. O relacionamento estrutura-atividade das cucurbitacinas será relatado algures. A reduzida expressão de PEBP2αA e de OCIF pode levar à inibição da formação do osso e aumento da reabsorção do osso, respectivamente, resultando consequentemente na perda da densidade óssea. Nós pretendemos identificar os alvos celulares das cucurbitacinas para compreender parte do mecanismo regulador do remodelamento do osso.
PMID: 15305007
http://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb/52/8/52_1018/_article
[OBS.: Cucurbitacina: http://quimicanova.sbq.org.br/qn/qnol/2004/vol27n6/18-RV03188.pdf - 740 KB ]
A massa óssea é regulada coordenadamente pelas células formadoras do osso (osteoblastos) e pelas células de reabsorção do osso (osteoclastos). Usando um bio-ensaio baseado em RT-PCR com células humanas Saos-2 de tipo osteoblastos, nós estivemos procurando por químicos que podem modular a expressão do gene da proteína 2αA de ligação ao intensificador de polioma (PEBP2αA) e do fator de inibitório da osteoclastogênese (OCIF).[Obs.: As viroses Poliomas são um gênero da família Papovaviridae que inclui o vírus símio 40 e o poliomavírus, ambos os quais causam tumores em roedores em têm sido extensivamente estudados como modelos de viroses de DNA oncogênicas. O vírus do tipo polioma pode causar uma doença aguda em aves psitacinas (papagaio). O nome polioma refere-se à propriedade de produção múltiplos (poli-) tumores (-oma). http://www.answers.com/topic/polyomavirus] O (complexo) PEBP2αA/AML3/CBFA1 é um regulador de transcrição da diferenciação do osteoblasto, e camundongos eliminados (sem o gene funcionante) nos quais o gene PWNP2αA tinha sido mutado não mostraram osteogênese. OCIF/OPG é uma proteína secretada dos osteoblastos ou células do estroma e atua como um instigador para o receptor do fator de diferenciação do osteoclasto (ODF), que proporciona meios para um sinal essencial aos osteoclastos precursores para sua diferenciação em osteoclastos. Camundongos deficientes em OCIF exibem osteoporose severa. Nosso objetivo no trabalho de sondagem é obter compostos naturais que possam ser usados como provas para estudos farmacológicos na via de transdução de sinal intra-celular direcionando a expressão do gene de PEBP2αA e OCIF.
O exame de plantas medicinais da América do Sul pelo ensaio usando células Saos-2 indicou que um extrato de MeOH(metanol) da Luffa operculata (Cucurbitaceae), uma planta medicinal bienal que cresce na região da Amazônia, inibiu a expressão dos gene de ambas PEBP2αA e OCIF. A planta é conhecida comumente como Buchinha ou Bucha dos paulistas no Brasil [Obs.: Buchinha do Norte] e o extrato aquoso da fruta tem sido usado como remédio para uretrite e empiema (pus em uma cavidade corporal), e no tratamento de edema. Purificação guiada por Bio-ensaio de um extrato bruto de L. opeculata levou ao isolamento de duas novas cucurbitacinas designadas como neo-cucurbutacinas A(1) e B(2), juntamente com as cucurbitacinas B, D, E e a isocucurbitacina B. A elucidação da estrutura dos compostos acima 1 e 2 estão relatadas nesse comunicado.
O extrato de MeOH (metanol) (16,35g) do fruto da L.operculata (200g) foi dissolvido em CH2Cl2 (diclorometano). A fração solúvel de CH2Cl2 (8,52g) foi submetida a cromatografia em colunas de gel de sílica usando-se um sistema solvente de CHCl3-MeOH (50:1), seguido de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) com CHCl3 (clorofórmio) sozinho para produzir 1 (curcubitacina A) (8 mg). Usando-se um sistema solvente CHCl3-MeOH seguido de HPLC com CHCl3-MeOH também produziu 2 (cucurbitacina B).
O composto 1, na forma de um pó menos colorido e amorfo, teve a fórmula molecular determinada como C31H42O8. O espectro em imagem de ressonância sugeriu a presença de grupos hidroxila e grupos carbonila. O espectro por H-NMR do composto 1 exibiu 40 prótons não permutáveis, incluindo nove grupos metil terciários, e quatro prótons olefínicos (olefina é alqueno). O espectro do composto 1 exibiu nove metilas, três metilenos, três metinas incluindo um carbono oxigenado, seis carbonos quaternários e quatro carbonos carbonil. O grupo metil e o grupo carbonil éster sugeriram a presença de uma metade acetóxica na molécula. Sete das 11 insaturações foram correspondentes, implicando que o composto 1 consistia de um sistema de quatro anéis.
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A exposição de células Saos-2 a 25 μM do composto 1 por seis horas resultou em um significativo decréscimo nos níveis de mRNA de PEBP2αA e de OCIF, enquanto a exposição ao composto 2 (sugerindo-se fortemente como a metade desacetil do composto 1) teve quase nenhum efeito em sua expressão. O composto 3 (cucurbitacina B) apresentou a atividade mais potente. O relacionamento estrutura-atividade das cucurbitacinas será relatado algures. A reduzida expressão de PEBP2αA e de OCIF pode levar à inibição da formação do osso e aumento da reabsorção do osso, respectivamente, resultando consequentemente na perda da densidade óssea. Nós pretendemos identificar os alvos celulares das cucurbitacinas para compreender parte do mecanismo regulador do remodelamento do osso.
PMID: 15305007
http://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb/52/8/52_1018/_article
*602643 TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR SUPERFAMILY, MEMBER 11B; TNFRSF11B
Títulos Alternativos
OSTEOPROTEGERINA; OPG
FATOR INIBIDOR DE OSTEOCLASTOGENESE; OCIF
Lócus do Gene Mapeado 8q24
TEXTO
CLONAGEM
Simnonet e outros (1997) identificaram uma glicoproteína secretada que regula a reabsorção do osso. A proteína humana, chamada osteoprotegerina (OPG), é um membro da super-família de receptores de fator de necrose tumoral (TNF) e contém 401 aminoácidos. “In vivo”, a expressão hepática da OPG nos camundongos transgênicos resulta em uma profunda ainda que não letal osteopetrose [formação excessiva do osso e calcificação da cartilagem, especialmente em ossos longos, levando à obliteração de espaços medulares e à anemia com metastasia mielóide e hepatoesplenomegalia. Stedman], coincidente com um decréscimo nos últimos estágios da diferenciação dos osteoclastos. Esses mesmos efeitos são observados na adminstração de OPG em camundongos normais. ‘In vitro’, a diferenciação dos osteoclastos a partir de células precursoras é bloqueada de maneira dependente da dose por OPG recombinante. Além disso, a OPG bloqueia a perda óssea em ratos associada à ovariectomia. Simonet e outros (1997) concluíram que a OPG pode agir como um fator solúvel na regulação da massa óssea e especularam que a OPG pode ser útil no tratamento da osteoporose associada com atividade aumentada do osteoclasto.
Tsuda e outros (1997) identificaram a mesma glicoproteína, a qual eles chamaram fator inibitório de osteoclastogênese (OCIF). Yasuda e outros (1998) clonaram um cDNA humano para OCIF. A OPG/OCIF humana recombinante atua especificamente nos tecidos do osso e aumenta a densidade mineral do osso e o volume ósseo associado com um decréscimo do número de osteoclastos ativos e ratos normais.Os osteoclastos ou as células-tronco derivadas de medula óssea sustentam a osteoclastogênese através de interações de célula para célula. Uma única classe de sítios de ligação de alta afinidade para OPG/OCIF aparece na linha celular estromal do camundongo, st2, em resposta à 1.25-dihidroxivitamina D3. Um anicorpo anti-OPG/OCIF que bloqueia a ligação abole a atividade biológica de OPG/OCIF. Quando os sítios estão bloqueados com OPG/OCIF, as células st2 falham em sustentar a osteoclastogênese. Esses resultados sugeriram a Yasuda e outros (1998) que os sítios estão envolvidos na sinalização célula para célula entre as células do estroma e progenitoras dos osteoclastos e que OPG/OCIF inibe a osteoclastogênese pela interrupção da sinalização através dos sítios.
ESTRUTURA DO GENE
Morinaga e outros (1998) clonaram e caracterizaram o gene OPG/OCIF. Ele tem cinco éxons e se expande em 29 quilo-bases, e está presente em uma única cópia. O códon de terminação da tradução está localizado no éxon 5 e um sinal adicional típico de poli(A) reside a 173 nucleotídeos a jusante do códon de terminação da tradução. Um síttio de iniciação de transcrição principal está presente a 67 nucleotídeos a montante do códon ATG de iniciação. Um único íntron divide um alongamento que codifica quatro motivos ricos em cisteína, implicando na diversidade dos outros membros da família de receptores de TNF (fator de necrose tumoral). Duas regiões de domínios de morte homólogas presentes em seguida uma da outra no OPG/OCIT são codificadas separadamente pelos éxons 4 e 5. A conservação de sequências de aminoácidos sugere que o éxon 4 é produzido por uma duplicação e uma porção do éxon 5.
FUNÇÃO DO GENE
Kong e outros (1999) relataram que células T ativadas podem disparar diretamente a osteoclastogênese através de um ligante da osteoprotegerina (OPGL ou RANKL; omim 602642). A ativação sistêmica das células T ‘in vivo’ leva a um aumento da osteoclastogênese mediada pela OPGL e perda óssea. Em um modelo de adjuvante de artrite do rato dependente de célula T caracterizado por severa inflamação das juntas, destruição da cartilagem e do osso, e mutilação, o bloqueio da OPGL através do tratamento com osteoprotegerina no estabelecimento da doença preveniu a destruição do osso e da cartilagem mas não a inflamação. Esses resultados mostram que ambas a ativação sistêmica e local das células T podem levar à produção de OPGL e subseqüente perda óssea, e eles proporcionam um novo paradigma para as células T com reguladoras da fisiologia do osso.
Em um estudo prospective da aterosclerose baseada em populações com acompanhamento por dez anos, Kiechl e outros (2004) descobriram que a osteoprotegerina do soro mostrou uma forte associação com numerosos fatores de risco vascular. Análises multivariadas revelaram que a osteoprotegerina estava significativamente relacionada à severidade e progressão da aterosclerose da carótida em 10 anos. Um alto nível de osteoprotegerina foi um fator de risco independente para a incidente doença cardiovascular e mortalidade vascular mas não para mortalidade devida a causas não vasculares. Kiechl e outros (2004) concluíram que a osteoprotegerina é um fator de risco independente para a progressão da aterosclerose e estabelecimento da doença cardiovascular.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
Baixa densidade óssea (BMD) em adolescents com anorexia nervosa (omim606788) está associada com estado de baixa reciclagem do osso. A osteoprotegerina (TNFRSF11B), uma citocina que atua como um atraidor de receptor para o ativador de receptor do ligante do fator nuclear kappa-B (omim 164011), diminui a reabsorção do osso pela inibição da diferenciação dos precursores do osteoclasto e ativação dos osteoclastos maduros, e pela estimulação da apoptose dos osteoclastos. Misra e outros (2003) compararam os níveis de TNFRSF11B em 43 moças adolescentes com anorexia nervosa com 38 controles e examinaram a densidade óssea, reciclagem óssea e parâmetros hormonais. A Osteocalcina (omim112260), desoxipirolidina, estradiol, testosterona livre, IGF1 (147440) e leptina (164160) estavam mais baixos na anorexia nervosa do que nas adolescentes saudáveis. Os valores de TNFRSF11B correlacionaram-se negativamente com o índice de massa corporal, porcentual de massa gordurosa. Leptina e contagem z de baixa densidade mineral do osso lombar. Os autores concluíram que os valores de TNFRSF11B correlacionam-se negativamente com marcadores do estado nutricional e contagens z de baixa densidade óssea e podem ser uma resposta de compensação à perda óssea vista nesta população.
Viereck e outros (2003) demonstraram que o raloxifeno [modulador seletivo dos receptors de estrógenos que apresenta efeitos agonistas do estrógeno sobre ossos e o metabolismo dos lipídios e efeitos antagonistas do estrógeno sobre as mamas e o útero; é usado na profilaxia da osteoporose pós menopausa. Stedman] aumentou os níveis de mRNA de OPG e secreção da proteína por osteoblastos humanos de modo dependente da dose e do tempo por duas a quatro vezes, com um máximo efeito a concentração de 10(-7) M após 72 horas (P menor que 0,001). Em adição o raloxifeno inibiu a expressão da citocina IL6 de reabsorção do osso (omim 147620) por 25 a 45% (P menos que 0,001). Os autores sugeriram que porque a produção de OPG aumenta com a maturação dos osteoblastos, a intesificação da produção de OPG por raloxifeno poderia estar relacionada a seus efeitos estimulatórios na diferenciação dos osteoblastos.
MAPEAMENTO
Por análises de radiação de híbridos, Tan e outros (1997) mapearam o gene TNFRSF11B no cromossomo 8q24.
GENÉTICA MOLECULAR
A doença de Paget Juvenil (JPD), também conhecida como deformação cortical por hiperostose juvenil (239000), é uma osteopatia autossômica recessiva caracterizada pelo rápido remodelamento do entrelaçamento do osso, osteopenia, fraturas e progressiva deformidade do esqueleto. Whyte e outros (2002) raciocinaram que a deficiência em osteoprotegerina poderia explicar a doença de Paget juvenil porque a osteoprotegerina suprime a reciclagem óssea por funcionar como um atrativo do receptor para o fator de diferenciação dos osteoclastos, também conhecido como ligante de RANK (omim 602642). Eles avaliaram dois pacientes aparentemente não aparentados de Navajo com doença de Paget juvenil segundo defeitos no gene codificador da osteoprotegerina TNFRSF11B, usando amplificação por PCR seguida de seqüenciamento direto e pigmentação Southern do DNA genômico. Eles acharam que ambos os pacientes tinham uma deleção homozigota no gene de TNFRSF11B, com pontos de quebra idênticos em 8q24.2. O defeito expandia-se por aproximadamente 100 quilobases, mas os genes visinhos estavam intactos. Os níveis de osteoprotegerina no soro e fator de diferenciação de osteoclastos solúvel estavam indetectáveis mas marcadamente aumentados, respectivamente. Em outros dois pacientes, ambos os quais tinham uma forma relativamente moderada de doença de Paget juvenil, Whyte e outros (2002) não descobriram nenhum defeito no TNFRSF11B. Além disso, seus níveis de osteoprotegerina no soro e fator de diferenciação de osteocastos não eram observáveis. Krane (2002) reparou no conhecimento ganhado sobre o controle genético de remodeladores do osso a partir de estudos de doenças raras como a JPD.
Nos três irmãos com hiperfosfatasia idiopática (doença de Paget juvenil) [idiopático é relativo a uma doença de causa desconhecida. Stedman] em uma família consangüínea de origem iraquiana, Cundy e outros (2002) identificaram homozigosidade para a deleção de três pares de base uma faixa no éxon 3 do gene TNFRSF11B, resultando na perda de um resíduo de aspartato. Os cDNAs da OPG de tipo selvagem e mutante foram expressados em células epiteiais dos rins humanos, e a OPG secretada foi colhida do meio condicionado. Medidas de reabsorção óssea ‘in vitro’ mostraram que a OPG de tipo selvagem suprimiu a reabsorção óssea, enquanto a forma mutante não o fez, confirmando isso como uma mutação inativadora. Em dois desses parentes, Cundy e outros (2005) relataram o uso de osteoprotegerina recombinante.
Por análises de ligação e associação, Ohmori e outros (2002) não encontraram evidência para ligação significativa entre a OPG e a osteoporose (omim 166710); entretanto a possível associação de um SNP, localizado na região promotora do gene, foi identificada.
Arko e outros (2002) sondaram o promotor do gene TNFRSF11B para variações na sequência e examinaram suas associações com a densidade mineral óssea (BMD) em 103 mulheres com osteoporose pós-menopausa. Uma associação estatísitcamente significativa dos genótipos com BMD na espinha lombar (p=0.005) foi observada em dois polimorfismos: 209G –para A e 245 T para G. O haplótipo GATG estava associado com densidade mineral óssea mais baixa em comparação com o haplótipo GGTT. Arko e outros (2002) concluíram que esses polimorfismos no promotor do gene TNFRSF11B podem contribuir para a regulação genética da BMD.
Em 59 indivíduos saudáveis, Brandstron e outros (2002) analisaram a presença de uma transição de T para C localizada a 129 pares de bases a montante do box TATA do gene OPG e estudaram a grande quantidade no meio íntimo da artéria carótida comum e o afloramento sanguíneo máximo pós-isquêmico no ante-braço. Indivíduos com o genótipo CC mostratam aumentado afinamento do meio íntimo e um fluxo sanguíneo máximo reduzido do ante-braço. Brandstrom e outros (2002) concluíram que o polimorfismo T/C da região promotora está associado com ambas a morfologia e função vascular em indivíduos aparentemente saudáveis.
Soufi e outros (2004) examinaram polimorfismos do gene OPG em 468 homens caucasianos com ou sem doença arteriana coronária (CAD; veja 608320) ou doença de vaso único, duplo ou triplo na angiografia coronariana. Embora nenhum polimorfismo sozinho estivesse associado com a CAD, a ligação de dois polimorfismos foi sobre-apresentada em homens com CAD em comparação com homens sem CAD.
Em um estudo e associação do genoma amplo para encontrar sequências variantes comuns que influenciam a densidade mineral óssea e fraturas em traumas leves em três populações descendentes de europeus, Styrkarsdottir e outro (2008) identificaram dois polimorfismos de um só nucleotídeo em um bloco de desequilíbrio de ligação que incluía o gene OPG (veja BMND10, 612113).
CORRELAÇÕES GENÓTIPO/FENÓTIPO
Chong e outros (2003) estudaram oito pacientes com doença de Paget juvenile e identificaram homozigosidade para mutações no gene TNFRSF11B em cinco deles. Mutações de mudança de sentido nos resíduos de cisteína, previstas por causarem a principal ruptura à região de ligação do ligante, foram associadas com um fenótipo severo no qual a deformidade desenvolvia-se antes dos 18 meses de idade e causava a maior incapacidade. Mutações de mudança de sentina fora da cisteína no domínio de ligação do ligante estavam associadas com um fenótipo intermediário, com a defomidade sendo reconhecida por volta dos cinco anos de idade e uma taxa aumetada e fratura de ossos longos. Uma mutação de inserção/deleção no éxon 5 estava associada com o fenótipo mais moderado.
MODELO ANIMAL
Bucay e outros (1998) investigaram o papel fisiológico da OPG por geração de camundongos deficientes em OPG. Camundongos adolescentes e adultos com o gene rompido, OPG-/-, exibiram um decréscimo na densidade óssea total caracterizada por severa porosidade do osso trabecular (substância esponjosa do osso) e cortical, marcado afinamento dos ossos parietais (osso plano curvado de ambos os lados da calota do crânio) do crânio, e alta incidência de fraturas. Esses achados demonstraram que a OPG é um regulador crítico da massa óssea pós-natal. Inesperadamente, os camundongos deficientes em OPG também exibiram calcificação média das artérias aorta e renal, sugerindo que a regulação o OPG, sua via de sinalização, ou seu(s) ligante(s) podem atuar num papel na associação da longamente observada osteoporose e calcificação vascular.
Para elucidar a função do OCIF/OPG in vivo, Mizuno e outros (1998) também geraram camundongos carentes de OCIF/OPG por alvejamento do gene. O estudo mostrou que a falta de OCIF/OPG causou elevada osteoclastogênese e um fenótipo osteoporótico conseqüente. O possível mecanismo da elevada osteoclastogênese nos camundongos OCIf/OPG -/- é a falência na interferência da ligação entre o fator de diferenciação do osteoclasto (ODF), também conhecido como ligante de osteoprotegerina, nas células estromais e osteoblastos e num receptor de ODF nos progenitores de osteoclastos. O OCIF/OPG atua como um atraidor de receptor para o fator de diferenciação do osteoclasto que ocorre natualmente, e que media um sinal essencial para as progenitoras de osteoclasto para sua diferenciação em osteoclastos. Os resultados demonstraram que o OCIF/OPG é um fator chave atuando como um regulador negativo para a osteoclastogênese.
Croucher e outros (2001) demonstraram que células de mieloma expressam o crítico fator osteoclastogênico RANKL. A injeção de células de mieloma em linhagens C57BL de camundongos resultou no desenvolvimento de doença do osso caracterizada por decréscimo significativo no volume do osso esponjoso em metáfises da tíbia e femoral, um aumento da formação de osteoclastos, e evidência radiológica de lesões osteolíticas do osso. O tratamento dos camundongos com mieloma estabelecido com proteína OPG recombinante, o atraidor solúvel de receptor para RANKL, preveniu o desenvolvimento de lesões líticas do osso. O tratamento com OPG foi associado com a preservação do volume do osso esponjoso e a inibição de formação de osteoclastos. A OPG também promoveu um aumento na densidade mineral do osso vertebral, femoral e da tíbia. Os dados sugeriram que o sistema RANKL/RANK/OPG pode atuar num papel crítico no desenvolvimento de doença osteolítica do osso em múltiplos mielomas e que a mira nesse sistema deve ter potencial terapêutico.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=602643
Títulos Alternativos
OSTEOPROTEGERINA; OPG
FATOR INIBIDOR DE OSTEOCLASTOGENESE; OCIF
Lócus do Gene Mapeado 8q24
TEXTO
CLONAGEM
Simnonet e outros (1997) identificaram uma glicoproteína secretada que regula a reabsorção do osso. A proteína humana, chamada osteoprotegerina (OPG), é um membro da super-família de receptores de fator de necrose tumoral (TNF) e contém 401 aminoácidos. “In vivo”, a expressão hepática da OPG nos camundongos transgênicos resulta em uma profunda ainda que não letal osteopetrose [formação excessiva do osso e calcificação da cartilagem, especialmente em ossos longos, levando à obliteração de espaços medulares e à anemia com metastasia mielóide e hepatoesplenomegalia. Stedman], coincidente com um decréscimo nos últimos estágios da diferenciação dos osteoclastos. Esses mesmos efeitos são observados na adminstração de OPG em camundongos normais. ‘In vitro’, a diferenciação dos osteoclastos a partir de células precursoras é bloqueada de maneira dependente da dose por OPG recombinante. Além disso, a OPG bloqueia a perda óssea em ratos associada à ovariectomia. Simonet e outros (1997) concluíram que a OPG pode agir como um fator solúvel na regulação da massa óssea e especularam que a OPG pode ser útil no tratamento da osteoporose associada com atividade aumentada do osteoclasto.
Tsuda e outros (1997) identificaram a mesma glicoproteína, a qual eles chamaram fator inibitório de osteoclastogênese (OCIF). Yasuda e outros (1998) clonaram um cDNA humano para OCIF. A OPG/OCIF humana recombinante atua especificamente nos tecidos do osso e aumenta a densidade mineral do osso e o volume ósseo associado com um decréscimo do número de osteoclastos ativos e ratos normais.Os osteoclastos ou as células-tronco derivadas de medula óssea sustentam a osteoclastogênese através de interações de célula para célula. Uma única classe de sítios de ligação de alta afinidade para OPG/OCIF aparece na linha celular estromal do camundongo, st2, em resposta à 1.25-dihidroxivitamina D3. Um anicorpo anti-OPG/OCIF que bloqueia a ligação abole a atividade biológica de OPG/OCIF. Quando os sítios estão bloqueados com OPG/OCIF, as células st2 falham em sustentar a osteoclastogênese. Esses resultados sugeriram a Yasuda e outros (1998) que os sítios estão envolvidos na sinalização célula para célula entre as células do estroma e progenitoras dos osteoclastos e que OPG/OCIF inibe a osteoclastogênese pela interrupção da sinalização através dos sítios.
ESTRUTURA DO GENE
Morinaga e outros (1998) clonaram e caracterizaram o gene OPG/OCIF. Ele tem cinco éxons e se expande em 29 quilo-bases, e está presente em uma única cópia. O códon de terminação da tradução está localizado no éxon 5 e um sinal adicional típico de poli(A) reside a 173 nucleotídeos a jusante do códon de terminação da tradução. Um síttio de iniciação de transcrição principal está presente a 67 nucleotídeos a montante do códon ATG de iniciação. Um único íntron divide um alongamento que codifica quatro motivos ricos em cisteína, implicando na diversidade dos outros membros da família de receptores de TNF (fator de necrose tumoral). Duas regiões de domínios de morte homólogas presentes em seguida uma da outra no OPG/OCIT são codificadas separadamente pelos éxons 4 e 5. A conservação de sequências de aminoácidos sugere que o éxon 4 é produzido por uma duplicação e uma porção do éxon 5.
FUNÇÃO DO GENE
Kong e outros (1999) relataram que células T ativadas podem disparar diretamente a osteoclastogênese através de um ligante da osteoprotegerina (OPGL ou RANKL; omim 602642). A ativação sistêmica das células T ‘in vivo’ leva a um aumento da osteoclastogênese mediada pela OPGL e perda óssea. Em um modelo de adjuvante de artrite do rato dependente de célula T caracterizado por severa inflamação das juntas, destruição da cartilagem e do osso, e mutilação, o bloqueio da OPGL através do tratamento com osteoprotegerina no estabelecimento da doença preveniu a destruição do osso e da cartilagem mas não a inflamação. Esses resultados mostram que ambas a ativação sistêmica e local das células T podem levar à produção de OPGL e subseqüente perda óssea, e eles proporcionam um novo paradigma para as células T com reguladoras da fisiologia do osso.
Em um estudo prospective da aterosclerose baseada em populações com acompanhamento por dez anos, Kiechl e outros (2004) descobriram que a osteoprotegerina do soro mostrou uma forte associação com numerosos fatores de risco vascular. Análises multivariadas revelaram que a osteoprotegerina estava significativamente relacionada à severidade e progressão da aterosclerose da carótida em 10 anos. Um alto nível de osteoprotegerina foi um fator de risco independente para a incidente doença cardiovascular e mortalidade vascular mas não para mortalidade devida a causas não vasculares. Kiechl e outros (2004) concluíram que a osteoprotegerina é um fator de risco independente para a progressão da aterosclerose e estabelecimento da doença cardiovascular.
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
Baixa densidade óssea (BMD) em adolescents com anorexia nervosa (omim606788) está associada com estado de baixa reciclagem do osso. A osteoprotegerina (TNFRSF11B), uma citocina que atua como um atraidor de receptor para o ativador de receptor do ligante do fator nuclear kappa-B (omim 164011), diminui a reabsorção do osso pela inibição da diferenciação dos precursores do osteoclasto e ativação dos osteoclastos maduros, e pela estimulação da apoptose dos osteoclastos. Misra e outros (2003) compararam os níveis de TNFRSF11B em 43 moças adolescentes com anorexia nervosa com 38 controles e examinaram a densidade óssea, reciclagem óssea e parâmetros hormonais. A Osteocalcina (omim112260), desoxipirolidina, estradiol, testosterona livre, IGF1 (147440) e leptina (164160) estavam mais baixos na anorexia nervosa do que nas adolescentes saudáveis. Os valores de TNFRSF11B correlacionaram-se negativamente com o índice de massa corporal, porcentual de massa gordurosa. Leptina e contagem z de baixa densidade mineral do osso lombar. Os autores concluíram que os valores de TNFRSF11B correlacionam-se negativamente com marcadores do estado nutricional e contagens z de baixa densidade óssea e podem ser uma resposta de compensação à perda óssea vista nesta população.
Viereck e outros (2003) demonstraram que o raloxifeno [modulador seletivo dos receptors de estrógenos que apresenta efeitos agonistas do estrógeno sobre ossos e o metabolismo dos lipídios e efeitos antagonistas do estrógeno sobre as mamas e o útero; é usado na profilaxia da osteoporose pós menopausa. Stedman] aumentou os níveis de mRNA de OPG e secreção da proteína por osteoblastos humanos de modo dependente da dose e do tempo por duas a quatro vezes, com um máximo efeito a concentração de 10(-7) M após 72 horas (P menor que 0,001). Em adição o raloxifeno inibiu a expressão da citocina IL6 de reabsorção do osso (omim 147620) por 25 a 45% (P menos que 0,001). Os autores sugeriram que porque a produção de OPG aumenta com a maturação dos osteoblastos, a intesificação da produção de OPG por raloxifeno poderia estar relacionada a seus efeitos estimulatórios na diferenciação dos osteoblastos.
MAPEAMENTO
Por análises de radiação de híbridos, Tan e outros (1997) mapearam o gene TNFRSF11B no cromossomo 8q24.
GENÉTICA MOLECULAR
A doença de Paget Juvenil (JPD), também conhecida como deformação cortical por hiperostose juvenil (239000), é uma osteopatia autossômica recessiva caracterizada pelo rápido remodelamento do entrelaçamento do osso, osteopenia, fraturas e progressiva deformidade do esqueleto. Whyte e outros (2002) raciocinaram que a deficiência em osteoprotegerina poderia explicar a doença de Paget juvenil porque a osteoprotegerina suprime a reciclagem óssea por funcionar como um atrativo do receptor para o fator de diferenciação dos osteoclastos, também conhecido como ligante de RANK (omim 602642). Eles avaliaram dois pacientes aparentemente não aparentados de Navajo com doença de Paget juvenil segundo defeitos no gene codificador da osteoprotegerina TNFRSF11B, usando amplificação por PCR seguida de seqüenciamento direto e pigmentação Southern do DNA genômico. Eles acharam que ambos os pacientes tinham uma deleção homozigota no gene de TNFRSF11B, com pontos de quebra idênticos em 8q24.2. O defeito expandia-se por aproximadamente 100 quilobases, mas os genes visinhos estavam intactos. Os níveis de osteoprotegerina no soro e fator de diferenciação de osteoclastos solúvel estavam indetectáveis mas marcadamente aumentados, respectivamente. Em outros dois pacientes, ambos os quais tinham uma forma relativamente moderada de doença de Paget juvenil, Whyte e outros (2002) não descobriram nenhum defeito no TNFRSF11B. Além disso, seus níveis de osteoprotegerina no soro e fator de diferenciação de osteocastos não eram observáveis. Krane (2002) reparou no conhecimento ganhado sobre o controle genético de remodeladores do osso a partir de estudos de doenças raras como a JPD.
Nos três irmãos com hiperfosfatasia idiopática (doença de Paget juvenil) [idiopático é relativo a uma doença de causa desconhecida. Stedman] em uma família consangüínea de origem iraquiana, Cundy e outros (2002) identificaram homozigosidade para a deleção de três pares de base uma faixa no éxon 3 do gene TNFRSF11B, resultando na perda de um resíduo de aspartato. Os cDNAs da OPG de tipo selvagem e mutante foram expressados em células epiteiais dos rins humanos, e a OPG secretada foi colhida do meio condicionado. Medidas de reabsorção óssea ‘in vitro’ mostraram que a OPG de tipo selvagem suprimiu a reabsorção óssea, enquanto a forma mutante não o fez, confirmando isso como uma mutação inativadora. Em dois desses parentes, Cundy e outros (2005) relataram o uso de osteoprotegerina recombinante.
Por análises de ligação e associação, Ohmori e outros (2002) não encontraram evidência para ligação significativa entre a OPG e a osteoporose (omim 166710); entretanto a possível associação de um SNP, localizado na região promotora do gene, foi identificada.
Arko e outros (2002) sondaram o promotor do gene TNFRSF11B para variações na sequência e examinaram suas associações com a densidade mineral óssea (BMD) em 103 mulheres com osteoporose pós-menopausa. Uma associação estatísitcamente significativa dos genótipos com BMD na espinha lombar (p=0.005) foi observada em dois polimorfismos: 209G –para A e 245 T para G. O haplótipo GATG estava associado com densidade mineral óssea mais baixa em comparação com o haplótipo GGTT. Arko e outros (2002) concluíram que esses polimorfismos no promotor do gene TNFRSF11B podem contribuir para a regulação genética da BMD.
Em 59 indivíduos saudáveis, Brandstron e outros (2002) analisaram a presença de uma transição de T para C localizada a 129 pares de bases a montante do box TATA do gene OPG e estudaram a grande quantidade no meio íntimo da artéria carótida comum e o afloramento sanguíneo máximo pós-isquêmico no ante-braço. Indivíduos com o genótipo CC mostratam aumentado afinamento do meio íntimo e um fluxo sanguíneo máximo reduzido do ante-braço. Brandstrom e outros (2002) concluíram que o polimorfismo T/C da região promotora está associado com ambas a morfologia e função vascular em indivíduos aparentemente saudáveis.
Soufi e outros (2004) examinaram polimorfismos do gene OPG em 468 homens caucasianos com ou sem doença arteriana coronária (CAD; veja 608320) ou doença de vaso único, duplo ou triplo na angiografia coronariana. Embora nenhum polimorfismo sozinho estivesse associado com a CAD, a ligação de dois polimorfismos foi sobre-apresentada em homens com CAD em comparação com homens sem CAD.
Em um estudo e associação do genoma amplo para encontrar sequências variantes comuns que influenciam a densidade mineral óssea e fraturas em traumas leves em três populações descendentes de europeus, Styrkarsdottir e outro (2008) identificaram dois polimorfismos de um só nucleotídeo em um bloco de desequilíbrio de ligação que incluía o gene OPG (veja BMND10, 612113).
CORRELAÇÕES GENÓTIPO/FENÓTIPO
Chong e outros (2003) estudaram oito pacientes com doença de Paget juvenile e identificaram homozigosidade para mutações no gene TNFRSF11B em cinco deles. Mutações de mudança de sentido nos resíduos de cisteína, previstas por causarem a principal ruptura à região de ligação do ligante, foram associadas com um fenótipo severo no qual a deformidade desenvolvia-se antes dos 18 meses de idade e causava a maior incapacidade. Mutações de mudança de sentina fora da cisteína no domínio de ligação do ligante estavam associadas com um fenótipo intermediário, com a defomidade sendo reconhecida por volta dos cinco anos de idade e uma taxa aumetada e fratura de ossos longos. Uma mutação de inserção/deleção no éxon 5 estava associada com o fenótipo mais moderado.
MODELO ANIMAL
Bucay e outros (1998) investigaram o papel fisiológico da OPG por geração de camundongos deficientes em OPG. Camundongos adolescentes e adultos com o gene rompido, OPG-/-, exibiram um decréscimo na densidade óssea total caracterizada por severa porosidade do osso trabecular (substância esponjosa do osso) e cortical, marcado afinamento dos ossos parietais (osso plano curvado de ambos os lados da calota do crânio) do crânio, e alta incidência de fraturas. Esses achados demonstraram que a OPG é um regulador crítico da massa óssea pós-natal. Inesperadamente, os camundongos deficientes em OPG também exibiram calcificação média das artérias aorta e renal, sugerindo que a regulação o OPG, sua via de sinalização, ou seu(s) ligante(s) podem atuar num papel na associação da longamente observada osteoporose e calcificação vascular.
Para elucidar a função do OCIF/OPG in vivo, Mizuno e outros (1998) também geraram camundongos carentes de OCIF/OPG por alvejamento do gene. O estudo mostrou que a falta de OCIF/OPG causou elevada osteoclastogênese e um fenótipo osteoporótico conseqüente. O possível mecanismo da elevada osteoclastogênese nos camundongos OCIf/OPG -/- é a falência na interferência da ligação entre o fator de diferenciação do osteoclasto (ODF), também conhecido como ligante de osteoprotegerina, nas células estromais e osteoblastos e num receptor de ODF nos progenitores de osteoclastos. O OCIF/OPG atua como um atraidor de receptor para o fator de diferenciação do osteoclasto que ocorre natualmente, e que media um sinal essencial para as progenitoras de osteoclasto para sua diferenciação em osteoclastos. Os resultados demonstraram que o OCIF/OPG é um fator chave atuando como um regulador negativo para a osteoclastogênese.
Croucher e outros (2001) demonstraram que células de mieloma expressam o crítico fator osteoclastogênico RANKL. A injeção de células de mieloma em linhagens C57BL de camundongos resultou no desenvolvimento de doença do osso caracterizada por decréscimo significativo no volume do osso esponjoso em metáfises da tíbia e femoral, um aumento da formação de osteoclastos, e evidência radiológica de lesões osteolíticas do osso. O tratamento dos camundongos com mieloma estabelecido com proteína OPG recombinante, o atraidor solúvel de receptor para RANKL, preveniu o desenvolvimento de lesões líticas do osso. O tratamento com OPG foi associado com a preservação do volume do osso esponjoso e a inibição de formação de osteoclastos. A OPG também promoveu um aumento na densidade mineral do osso vertebral, femoral e da tíbia. Os dados sugeriram que o sistema RANKL/RANK/OPG pode atuar num papel crítico no desenvolvimento de doença osteolítica do osso em múltiplos mielomas e que a mira nesse sistema deve ter potencial terapêutico.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=602643
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