Engenheirando Proteína Permeável à Célula

Bernhard Münst, Christoph Patsch, Frank Edenhofer
Stem Cell Engineering Group, Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn - Life & Brain Center and Hertie Foundation

28/12/2009

RESUMO

A técnica de transdução de proteína permite a entrega direta de material biologicamente ativo para dentro de células de mamíferos. Para isso pode-se fazer uso da habilidade de translocação dos peptídeos assim chamados de penetração celular (CPPs), também designados como proteínas de domínios de transdução (PTDs). A TAT-CPP derivada da proteína Tat (transativadora de transcrição) do vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (HIV-1) tem sido amplamente usada. A TAT positivamente carregada promove a permeabilidade celular deste modo superando as barreiras da membrana celular por endocitose ou/e penetração direta da membrana. Em combinação com um sinal de localização nuclear (NLS) proteínas em fusão são capazes de entrar no núcleo exibindo funcionalidade. Nosso vídeo demonstra, como uma exemplificação da engenharia de proteínas permeáveis às células, a construção, produção e aplicação de uma versão de enzima Cre de modificação do DNA permeável à célula.

A Cre é uma recombinase de sítio específico que é capaz de reconhecer e recombinar sítios loxP de 34 pares de bases nas células dos mamíferos in vitro e in vivo. Por isso o sistema Cre/loxP é amplamente usado para induzir condicionalmente mutações no genoma de células vivas. A entrega de uma recombinase Cre ativa às células, entretanto, representa uma limitação.

Nós descrevemos o sistema do vetor pSESAME, o qual permite uma inserção direta de um gene de interesse e proporciona uma plataforma para rapidamente clonar domínios diferentes e etiquetas usados dentro de um vetor de maneira conveniente e padronizada. O rearranjo de diferentes etiquetas tem sido mostrado como um modificador das propriedades bioquímicas de proteínas fundidas proporcionando uma possibilidade para atingirem-se produção mais alta e melhores solubilidades. Nós demonstramos como expressar e purificar proteínas recombinantes permeáveis à células na e da E.coli. A funcionalidade da proteína recombinante Cre é finalmente validade em cultura celular pela disponibilização de sua atividade de recombinase intracelular.

RESULTADOS REPRESENTATIVOS

No dia seguinte a solução de coloração X-Gal foi aspirada e as células foram cobertas com uma camada de PBS para análises microscópicas. 80 a 100% das células recombinadas puderam ser observados dentro das células ES murinas a julgar pela atividade da β-galactosidase.

DISCUSSÃO

Durante o processo de purificação da proteína de fusão com Cre é importante não omitir a adição de gelo ao buffer TBS antes de centrifugar. De outra forma a recombinase Cre tende a precipitar dentro do buffer de glicerol.

Se a fração de eluato (que emerge da solução) parecer tornar-se turva/densa devido à alta concentração de proteínas fundidas, um bufer de eluição adicional deverá ser adicionado antes da solução ter clareado de novo.

A aplicação de 10μM de proteína de fusão com Cre resulta tipicamente em uma recombinação com eficiência de 80 a 100%. O Soro de Feto de Vitelo (FCS) sendo um componente principal do meio de células ES inibe fortemente a transdução de proteínas. Por isso altas concentrações de recombinase Cre tiveram que ser usadas. Ao trabalhar com condições livres de soro menos proteína (0.5 - 2 μM) pode ser usada para alcançar similar eficiência de recombinação.

Com o sistema de vetor pSESAME na mão pode-se aplicar a técnica de transdução de proteína para outras proteínas incluindo fatores de transcrição tais como Oct4 e Sox2 e Scl/Tal1.
FONTE: http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1627