179835 PROTEÍNA DE REPLICAÇÃO A1, 70-KD; RPA1

Símbolos

RPA70
REPA1

Lócus do Gene Mapeado 17p13.3

TEXTO

CLONAGEM

A proteína de replicação A (RPA) é uma proteína de ligação da DNA de uma fita só (ssDNA) de três unidades que foi isolada das células humanas e considerada essencial para replicação ‘in vitro’ do papovavírus SV40. Erdile e outros (1991) relataram a sequencia de um cDNA codificando a sub-unidade de 70 quilobases. O cDNA humano direcionou a produção na E.coli de uma proteína de 70 quilobases que reagiu com um anticorpo monoclonal direcionado contra a sub-unidade de 70 quilobases da proteína humana. A sub-unidade recombinante, purificada da bactéria, exibia uma atividade de ligação a DNA de fita singular comparável à do complexo RPA completo. Ela pôde substituir o complexo completo estimulando a atividade da primase alfa da DNA polimerase, mas não pôde substituir o complexo por completo na replicação do DNA do SV40 in vitro, sugerindo um papel funcional importante para outras sub-unidades.

[Omim 174761 – Lydeard e outros (2007) mostraram que em leveduras haplóides em germinação, a replicação induzida pela endonuclease HO induzida pela quebra dependente de Rad51 requer o escoramento do complexo primase da DNA polimerase alfa bem como da polimerase delta para iniciar nova síntese de DNA.]

[A Primase catalisa a síntese de um curto segmento de RNA (chamado primer) complementar a um modelo de fita singular de DNA. A primase é de importância chave na replicação do DNA porque nenhuma DNA polimerase conhecida pode iniciar a síntese de uma fita de DNA sem um primer de RNA ou de DNA. http://en.wikipedia.org/wiki/Primase]


FUNÇÃO DO GENE

Gomes e Wold (1996) construíram uma série de deleções do terminal N da RPA70 para explorar a função da proteína. Seus dados indicaram que a RPA70 é composta de três domínios funcionais: um domínio terminal N que não é requerido para a ligação a DNA de fita singular ou replicação do SV40, um domínio de ligação a DNA central, e um domínio terminal C que é essencial para as interações das sub-unidades.
O dobramento do mRNA influencia uma extensão de diversos eventos biológicos tais como splicing de mRNA e processamento e controle e regulação da tradução. Devido à estrutura do mRNA ser determinada por sua sequência de nucleotídeos e seu meio ambiente, Shen e outros (1999) examinaram se o dobramento do mRNA poderia ser influenciado pela presença de polimorfismos de um só nucleotídeo (SNPs). Eles relataram marcadas diferenças na estrutura secundária do mRNA associadas com SNPs na região codificadora de dois mRNAs humanos: a sintetase de tRNA alanil (601065) e a sub-unidade de 70 quilo-dáltons da proteína de replicação A. A prova enzimática dos fragmentos contendo SNP dos mRNAs revelou pronunciadas diferenças alélicas no padrão de clivagem nos sítios dos nucleotídeos 14 e 18 fora do SNP, sugerindo que uma única variação do nucleotídeo pode dar lugar a diferentes dobramentos do mRNA. Usando oligo-desóxirribonucleotídeos complementares à região das estruturas alélicas no mRNA da RPA70, mas não extendendo ao SNP em si, eles encontraram que o SNP exercia um efeito alelo-específico na acessibilidade ao seu sítio flanqueador no mRNA da RPA70 humana endógeno. Os resultados demonstraram a contribuição da variação genética comum através da diversidade estrutural do mRNA e sugeriu um papel mais amplo do que os previamente pensados para os efeitos dos SNPs na estrutura do mRNA e, no final das contas, na função biológica.

Nakayama e outros (1999) relataram que uma mutação de T para C na posição 786 na região promotora do gene da eNOS (sintase de óxido nítrico) reduzia a transcrição do gene e estava fortemente associada com a angina coronária espástica (relativo a espasmo) e infarto do miocárdio. Para elucidar o mecanismo molecular para a reduzida transcrição do gene de eNOS, Miyamoto e outros (2000) purificaram uma proteína que se liga especificamente ao alelo mutante nos extratos nucleares das células HeLa. A proteína purificada era idêntica à RPA1, conhecida como uma proteína de ligação à DNA de uma fita só essencial para o reparo do DNA, replicação, e recombinação. Nas células endoteliais da veia umbilical humana, a inibição da expressão da RPA1 usando-se oligo-nucleotídeos restaurou a transcrição dirigida pela sequência do promotor mutada, enquanto a sobre-expressão da RPA1 a reduzia ainda mais. Os níveis de nitrito/nitrato no soro entre indivíduos carregando a mutação de T para C na posição 786 estavam significativamente mais baixos do que entre aqueles sem a mutação. Os autores concluíram que a RPA1 funciona aparentemente como uma proteína repressora na redução da transcrição do gene eNOS relacionada com a mutação de T para C na posição 786 associada com o desenvolvimento da doença da artéria coronária.

A função do complexo de proteína cinase ATR (601215)-ATRIP(606605) é crucial para a resposta celular ao estresse de replicação e dano no DNA. Zou e Elledge (2003) demonstraram que o complexo RPA, o qual está associado com uma fita singular de DNA, é requerido para o recrutamento da ATR aos sítios de dano noDNA e para a ativação da CHK1 (603078) mediada pela ATR nas células humanas. “In vitro”, a RPA estimula a ligação da ATRIP ao DNA de uma fita só. A ligação da ATRIP à RPA coberta com a fita singular do DNA habilita o complexo ATR-ATRIP em associar-se com o DNA e estimula a fosforilação da proteína RAD17 (603139) que está ligada ao DNA. Além disso, a Ddc2, a homóloga da ATRIP nas leveduras, é recrutada especificamente às quebras de fita dupla de DNA de modo dependente de RPA. Uma mutante da RPA deficiente no ponto de controle, rfa1-t11, é defeituosa para o recrutamento da Ddc2 às fitas de DNA singulares tanto ‘in vivo’ quanto ‘in vitro’. Zou e Elledge (2003) concluíram que o DNA de fita singular coberto pela RPA é a estrutura crítica nos sítios de dano de DNA que recruta o complexo ATR-ATRIP e facilita seu reconhecimento de substratos para fosforilação e a iniciação da sinalização no ponto de controle.

A desaminase de citidina induzida por ativação (AID; 605257) é uma desaminase de pequena fita singular de DNA requerida para a hipermutação somática e recombinação de troca de classe dos genes das imunoglobulinas. A recombinação de troca de classes envolve a transcrição através de regiões de troca, as quais geram pequenos DNAs singulares dentro do laços com formato de R. Chaudhuri e outros (2004) caracterizaram o mecanismo de alvejamento da AID em substratos transcritos ‘in vitro’ abrigando motivos de hipermutação somática. Eles mostraram que a atividade de alvejamento da AID é devida à RPA, uma proteína heteroquímica de ligação a pequeno DNA singular envolvida na replicação, recombinação, e reparo. A sub-unidade de 32 quilo-dáltons da RPA (179836) interage especificamente com a AID de células B ativadas de uma maneira que parece ser dependente da modificação pós-tradução da AID. Chaudhuri e outros (2004) concluíram que a RPA está implicada enquanto um novo fator envolvido na diversificação da imunoglobulina, e propuseram que os complexos AID-RPA específicos das células B se ligam preferencialmente aos pequenos DNA singulares de pequenas bolhas de replicação nos pontos quentes de hipermutação somática, levando à desaminação mediada pela AID e recrutamento mediado pela RPA das proteínas de reparo do DNA.

Maga e outros (2007) analisaram os efeitos dos antígenos nucleares de células humanas em proliferação (PCNA; 176740) e da RPA em seis polimerases de DNA humanas diferentes pertencentes às classes B, Y e X durante o desvio ‘in vitro’ de lesões diferentes. A lesão mutagênica da guanina-oxo-8 tem alto potencial para codificação errada. O efeito principal e específico foi encontrado para o desvio 8-oxo-G com a polimerase de DNA lamda (606343) e eta (603968). A PCNA e a RPA permitiram a correta incorporação de desóxi CTP em oposição a um molde de 8-oxo-G 1.200 vezes mais eficientemente do que o dATP incorreto pela polimerase de DNA lamba, e 68 vezes do que pela polimerase de DNA eta, respectivamente. Por outro lado, a polimerase de DNA iota junto com a polimerase de DNA alfa, delta e beta, mostrou uma eficiência de desvio de correção muito mais baixa. Maga e outros (2007) concluíram que seus achados mostraram a existência de um mecanismo acurado para reduzir conseqüências prejudiciais do dano oxidativo e, em adição, apontaram um papel importante para a PCNA e aRPA na determinação de uma hierarquia funcional entre as diferentes polimerases de DNA no desvio lesional.

Gupta e outros (2007) descobriram que a FANCJ (BRIP1;605882) imunoprecipitou com a RPA. FANCJ e RPA co-localizaram-se em focos nucleares após o dano no DNA ou o estresse da replicação. A FANCJ e a RPA ligaram-se com alta afinidade por via da sub-unidade 70 da RPA. Embora a FANCJ mostrasse limitada capacidade para desprender-se até mesmo de um duplex em forca de 47 pares de base, a presença da RPA capacitou a FANCJ a agir como uma helicase muito mais processante.

MAPEAMENTO

Usando amplificação de DNA genômico por PCR de linhas celulares de roedores e humanas, Umbricht e outros (1993) mapearam o gene para a sub-unidade de 70 quilodáltos no cromossomo 17. Pelo mesmo método, eles mapearam os genes das sub-unidades de 32 e de 14 quilo-dáltons (179837) nos cromossomos 1 e 7, respectivamente. Usando uma combinação de amplificação por PCR de células somáticas híbridas e radiação híbrida contendo fragmentos do cromossomo 17, Umbricht e outros (1994) mapearam a RPA1 em 17p13.3. A perda da região cromossômica 17p13.3 tem estado repetidamente implicada em várias malignidades incluindo cânceres colo-retais, cânceres de mama, linfomas e leucemias (Wang e outros, 2005).

MODELO ANIMAL

Wang e outros (2005) demonstraram que camundongos heterozigotos para uma mutação de sentido trocado em um dos domínios de ligação ao DNA da Rpa1 desenvolveram tumores linfóides e que seus irmãos de barriga homozigotos sucumbiram à letalidade embrionária precoce. Uma série comparativa de hibridização genômica dos tumores identificou mudanças em grande escala no cromossomo bem como ganhos e perdas em segmentos. A mutação na RPA1 resultou em defeitos no reparo da quebra da dupla fita de DNA e precipitou as quebras cromossômicas bem como a aneuploidia em fibroblastos de camundongos mutantes heterozigotos embrionários. A mutação equivalente nas leveduras é hipomórfica e semi-dominante e aumentou a formação de rearranjos grosseiros no cromossomo em múltiplas bases genéticas de segundo plano.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=179835