600375 X-RAY REPAIR, COMPLEMENTING DEFECTIVE, IN CHINESE HAMSTER, 2; XRCC2
Lócus do Gene Mapeado 7q36.1

TEXTO

CLONAGEM

Thacker e outros (1995) fundiram linhas celulares irs1 de ramster V79, que é um mutante deficiente em reparo que apresenta hipersensitividade à um número de diferentes agentes de dano em DNA (Jones e outros, 1987), à células humanas, resultando na complementação do defeito. Os híbridos resultantes foram analisados por PCR-Alu, pigmentação de cromossomo e marcadores de DNA para mapear o gene complementar, designado XRCC2, em uma região específica do cromossomo. As células híbridas mostraram correção de sensitividade a ambos raio X e mitomicina C e continham o cromossomo humano 7, frequentemente como seu único componente humano. Os híbridos mostrando instável retenção de cromossomos humanos foram sub-clonados para mostrar que a perda do cromossomo 7 e a perda da resistência à mitomicina C ocorreu concordantemente. Dois híbridos separados foram encontrados tendo um pedaço menor do cromossomo 7, e provas de DNA específic o marcadores de micro-satélite definiram este como uma região contígua em 7q35-q36. Métodos de fusão de irradiação híbrida foram usados para reduzir ainda mais o tamanho da região de complementação genômica e localizar o gene em uma região de aproximadamente 3 a 5 mega-bases em 7q36.1.

Jones e outros (1995) mapearam o gene XRCC2 em 7q36 estudando a complementação de um defeito na linha irs1 de células de ramster descrita por Jones e outros (1987). Jones e outros (1995) fomaram híbridos de células somáticas pela fusão das células irs1 com linfócitos humanos e selecionando por complementação em meio contendo concentrações de mitomicina C que são tóxicos para células irs1 mas não para suas parceiras humanas de fusão. A retenção do cromossomo 7 ou da região 7q36 resultou em células que eram resistentes à mitomicina C.

Tambini e outros (1997) trabalharam na redução de radiação dos híbridos humano/ramster para localizar o gene XRCC2 em uma região genômica ainda menor definida por um único micro-satélite marcador D7S483. Cromosomos artificiais de levedura (YACs) carregando esses marcadores foram então fundidos às células da linha irs1 de ramster e uma YAC portadora do gene complementar foi identificada. Essa YAC foi usada para experimentos de seleção de cDNA para identificar o gene XRCC2. O gene foi considerado por compartilhar homologia com o gene RAD51 e seu homólogo humano (omim 179617), os quais estão envolvidos no reparo recombinante do dano no DNA. Forte sustentação para a candidatura desse gene como sendo o XRCC2 foi obtida de sua posição refinada no mapa e pela total complementação da sensitividade da irs1 com um cosmídeo de 40 quilobases carregando o gene. Tambini e outros (1997) notaram que, embora o gene candidato XRCC2 no cromossomo 7 mostrasse homologia à RAD51 da levedura, ele deveria ser distinto da RAD51 humana homóloga, a qual está localizada no cromossomo 15.

FUNÇÃO DO GENE

Johnson e outros (1999) demonstraram que a XRCC2 é essencial para o reparo eficiente das quebras de dupla fita de DNA pela recombinação homóloga entre cromátides irmãs. Células de ramster deficientes em XRCC2 mostraram um decréscimo de mais de 100 vezes na recombinação homóloga induzida nas quebras de fita dupla em comparação com a linha celular parente. Esse efeito foi corrigido aos níveis próximos do tipo selvagem pela transfecção transitória com um plasmídeo expressando XRCC2. O defeito no reparo nas células mutantes em XRCC2 pareceu estar restrito a um reparo recombinante pois junções de finais (extremidades) não homólogas estavam normais. Johnson e outros (1999) concluíram que o XRCC2 está envolvido no reparo das quebras de dupla fita de DNA por recombinação homóloga.

Usando um ensaio de duas leveduras híbridas, Braybrooke e outros (2000) identificaram uma interação direta da XRCC2 com a RAD51L3 (omim 602954 – Os autores estabeleceram que se a mutação com ausência de registro for ignorada, a proteína de 289 aminoácidos na lente total compartilha 71% de identidade sequencial com a proteína prevista do camundongo, e que os genes do camundongo e humanos da RAD51D têm dois domínios conservados de ligação de ATP similares aos dos outros genes relacionados com RecA – 15q15.1 – omim 179617), e eles confirmaram a interação por ensaios de abatimento entre XRCC2 recombinante e RAD51L3 endógena em extratos de células HeLa. A cromatografia de exclusão de tamanho seguida por análises de pigmentação Western sugeriu que as duas proteínas existem como um heterodímero de 70 quilodáltons.

Masson e outros (2001) descobriram que anticorpos dirigidos contra a RAD51L3 imunoprecipitaram um complexo de um lisado de células HeLa que incluía XRCC2, RAD51B (RAD51L1; omim 602948), e RAD51C (omim 602774), juntamente com RAD51L3. Interações entre estas proteínas foram confirmadas em ensaios de abate usando-se proteínas recombinantes expressadas em células sf9 de inseto. A filtração dos complexos em gel indicou uma massa molecular aparente de aproximadamente 180 quilo-dáltons, sugerindo uma estoquiometria [determinação das quantidades relativas das substâncias envolvidas em qualquer reação química; Stedman] de 1:1:1:1 das quatro sub-unidades. Ensaios de ligação, confirmados por micoscopia eletrônica, indicaram que os complexos purificados ligaram-se a DNA de uma fita só ou DNA cortado. Essa ligação era dependente de magnésio (2+) mas independente de ATP. A atividade de ATPase do complexo estimulada pelo DNA foi extremamente baixa. Masson e outros (2001) também identificaram um segundo complexo protéico heterodimérico entre a RAD51C e a XRCC3 (omim 600675). Usando ensaios de co-precipitação e abate múltiplo, Liu e outros (2002) confirmaram a interação entre os mesmos parálogos de RAD51 nos mesmos dois complexos protéicos distintos.

Em uma peneira de levedura duplamente híbrida de uma biblioteca de cDNA do cérebro humano usando a XRCC2 como isca, Kurumizaka e outros (2002) também encontraram que a RAD51L3 interage diretamente com a XRCC2. Usando um ensaio de formação de laço D, eles encontraram que a RAD51L3 e a XRCC2, co-expressadas e purificadas de culturas bacterianas, catalisam o pareamento homólogo ente um oligonucleotídeo de uma fita só e um DNA de dupla fita super-helicoidal. Significativos DNA de uma fita só e de dupla fita foram ligados pelo complexo na ausência de ATP, mas o pareamento homólogo era dependente de ATP e de Mg(2+). Por microscopia eletrônica, eles descobriram que a RAD51L3 e a XRCC2 formam uma estrutura em anel multimérica na ausência do DNA, e elas formam estruturas filamentosas na presença do DNA de uma fita só.

MAPEAMENTO

Thacker e outros (1995) e Jones e outros (1995) mapearam o gene XRCC2 no cromossomo 7q36.1.

GENÉTICA MOLECULAR

Kuschel e outros (2002) desempenharam estudos de associação genética em um estudo de controle de caso de câncer de mama baseado em população analisando polimorfismos em sete genes envolvidos no reparo do DNA. A associação de uma variante rara no XRCC2 (R188H) foi marginalmente significativa. Em uma sub-classe comparável inglesa, Rafii e outros (2002) descobriram que o porte da R188H estava associado com o câncer de mama de um modo geral, e essa associação era aumentada quando casos estabelecidos em mais jóvens com um histórico familiar positivo eram comparados com controles mais idosos sem histórico familiar. Usando mutagênese direcionada ao sítio do XRCC2, Rafii e outros (2002) mostraram além que a substituição ou deleção não conservativa do aminoácido 188 da XRCC2 poderia afetar significativamente a sensibilidade celular ao dano no DNA. Os autores hipotetizaram que a variação sutil na capacidade de reparo do DNA pode influenciar a suscetbilidade ao câncer na população.

A perda do reparo de combinação (MMR) leva a um complexo fenótipo mutador que parece dirigir o desenvolvimento de um sub-conjunto de cânceres de cólon (veja Peltomaki, 2001). Mohindra e outros (2002) mostraram que linhas celulares de tumor defeituosas em MMR eram defeituosas no reparo de recombinação homóloga (HRR) induzido por quebras da fita dupla do DNA (DSBs). Uma mutação sem sentido (342delT) no XRCC2 encontrada em uma linha celular de tumor uterino deficiente em MMR, SKUT-1, conferia sensitividade à timidina quando intruduzida em uma linha proficiente em MMR. Como outras células com XRCC2 defeituosa, as células SKUT-1 eram sensíveis à mitomicina C, e as células proficientes em MMR expressando o alelo XRCC2 mutante também se tornaram mais sensíveis a este agente. Os autores sugeriram que a sensitividade à timidina das linhas celulares de tumor deficientes em MMR pode ser uma conseqüência dos defeitos na via de reparo de recombinação homóloga. Mohindra e outros (2004) intruduziram 342delT em células proficientes em HRR contendo um substrato repórter de recombinação. Em um conjunto de trasnfectantes, a expressão da 342delT conferiu senstividade à timidina e à mitomicina C e suprimiu a HRR induzida no repórter de recombinação pela timidina, mas não pelas DSBs somente. Em um segundo conjunto de transfectantes, a expressão de 342delT foi acompanhada por um decréscimo no nível da lente total da XRCC2, e essas células eram defeituosas na indução do HRR tanto por timidina quanto por DSBs. Mohindra e outros (2004) concluíram que a 342delT suprime a recombinação induzida pela timidina de maneira negativa dominante, enquanto a recombinação induzida pelas DSBs parece depender do nível de XRCC2, bem como da expressão do alelo XRCC2 mutante. Os autores sugeriram que as vias do HRR respondendo à forquilhas de replicação estragadas ou DSBs são geneticamente distinguíveis e que a XRCC2 tem um papel crítico no HRR nas forquilhas de replicação, possivelmente no transporte da RAD51 sobre a fenda no DNA.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=600375


Obs.: A mitomicina C é um potente ligador em cruzamento do DNA. Uma única ligação cruzada por genoma mostrou ser efetiva para matar uma bactéria. Isso é conseguido pela ativação redutora seguida por duas alquilações em N. Ambas as alquilações são sequências específicas par um nucleosídeo de guanina na sequência 5’-CpG-3’. Quinonas heterocíclicas duplamente alquilantes foram sintetizadas de acordo a explorar suas atividades anti-tumorais pela alquilação bio-redutora. http://en.wikipedia.org/wiki/Mitomycin {Alquilação é a substituição de um radical alquila (CnH2n+1) por um átomo de hidrogênio; Stedman}

A Timidina (mais precisamente chamada desoxitimidina; também pode ser cunhada de desoxirribosiltimina e timina desoxiribosídeo) é um composto químico, mais precisamente um desoxinucleotídeo pirimidina. A desoxitimidina é o nucleosídto T do DNA, a qual parelha com a desoxiadenosina (A) na fita dupla de DNA. Em biologia celular é usada para sincronizar as células na fase S.
http://en.wikipedia.org/wiki/Thymidine