Caracterização de Metacaspases com Atividade Típica de Tripsina e Seu Suposto Papel na Morte Celular Programada no Protozoário Parasita Leishmania.

Nancy Lee, Sreenivas Gannavaram, Angamuthu Selvapandiyan, and Alain Debrabant*

RESUMO

Nessa matéria, nós caracterizamos duas metacaspases da Leishmania donovani, a metacaspase -1 (LdMC1) da L. donovani e a LdMC2. Essas duas proteínas mostram 98% de homologia entre si, e ambas contém um domínio rico em prolina no terminal carboxina. Ambos os genes são transcritos em promastigotos e amastigotos axênicos (livres de contaminação ou estéreis) de L. donovani; entretanto, a LdMC1 apresenta níveis aumentados de mRNA nos amastigotos axênicos. Um anticorpo anti LdMC foi obtido e mostrou reatividade com uma única banda de aproximadamente 42 quilo-dáltons da proteína em todas as células lisadas de ambos parasitas promastigotos e amastigotos axênicos por coloração Western. Experimentos de dilatação de fenda sugerem que as LdMCs não são sintetizadas como pró-enzimas, e estudos de imunofluorescênca mostram que as LdMCs estão associadas com os compartimentos acidocalcissomos [Acidocalcisomes são organelas ácidas redondas densas em elétrons, ricas em cálcio e polifosfato e com 100 nanometros a 200 nanômetros de diâmetro. Elas foram descobertas nos tripanossomas mas já foram encontradas no Toxoplasma gondi (toxoplasmose), Plasmódium (malária), Chlamydomonas reinhardtii (uma alga móvel com cloroplasto e flagelo), Dictyostelium discoideum (fungo), bactérias e plaquetas humanas. Wikipédia] da L. donovani. Ensaios enzimáticos de LdMCs imuno-precipitadas mostram que as LdMCs nativas clivam substratos de tripsina eficientemente e são incapazes de clivar substrataos específicos de caspases. Consistentemente, a atividade da LdMC é insensível aos inibidores de caspase e é eficientemente inibida por inibidores de tripsina, tais como leupeptina, antipaína, e TLCK. Em adição, nossos resultados mostram que a atividade da LdMC foi induzida nos parasitas tratados com peróxido de hidrogênio, um conhecido disparador da morte celular programada na Leishmania e que os parasitas que expressavam muitas metacaspases são mais sensíveis à morte celular programada induzida por peróxido de hidrogênio. Esses achados sugerem que as metacaspases da Leishmania não são responsáveis pela atividade típica de caspase relatadas neste organismo e sugere um possível papel das LdMCs como moléculas efetoras na morte celular programada das Leishmanias.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2043384/?tool=pubmed

*608444 MYELOID/LYMPHOID OR MIXED-LINEAGE LEUKEMIA 5; MLL5

Lócus do gene mapeado 7q22

TEXTO

Numa busca por genes candidatos dentro de um segmento costumeiramente deletado do cromossomo 7q22, seguida de análises de bases de dados e RT-PCR de RNA de medula óssea, Emerling e outros (2002) clonaram o MLL5. A proteína deduzida em 1.858 aminoácidos contém um dedo PHD no terminal N e um domínio SET central. A proteína MLL5 compartilha 38% de identidade de aminoácidos com a MLL (omim 159555), mas carece de ganchos A-T e de homologia de domínios MT encontrados na MLL. Análises de Northern blot detectaram um transcrito de 6,5 quilo-bases em todos os tecidos hematopoiéticos examinados. A expressão do MLL5 também foi detectada em todos os tecidos analisados em série de RNA de tecido, com altos níveis no timo fetal e nos rins e nos tecidos hematopoiéticos adultos, jejuno e cerebelo.

Deng e outros (2004) identificaram numerosos sinais de localização nuclear distribuídos através da sequência do MLL5. Ambos MLL5 transfectados etiquetados por epítopo e o MLL5 endógeno exibiam uma distribuição nuclear salpicada e exclusão a partir dos nucléolos.

FUNÇÃO DO GENE

Deng e outros (2004) descobriram que a sobre-expressão ectópica (fora do lugar) do MLL5 induzia o refreamento do ciclo celular na fase G1. Eles hipotetisaram que o MLL5pode formar complexos protéicos intranucleares que podem estar envolvidos no remodelamento da cromatina e supressão do crescimento (divisão) celular.
Fujiki e outros relataram que a acilação (remoção de um grupo hidroxila carboxílico que gera radical acil) de uma metil-transferase de lisina de histona (HKMT) com beta-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc), MLL5, pela O-GLcNAc transferase (OGT, omim 300255) facilita a granulopoiese induzida por ácido retinóico nos pró-mielócitos humanos HL60 através da metilação da lisina 4 da histona 3. O MLL5 foi identificado bioquimicamente em um complexo de multi-sub-unidades dependentes de acilação da GlcNac associando-se com o receptor nuclear de ácido retinóico RAR-alfa (RARA, omim 180240 [obs.: A sinalização dos retinóides é transduzida por duas famílias de receptores nucleares, o receptor de ácido retinóico (RAR) e o receptor de retinóide X (RXR), os quais formam heterodímerod RXR/RAR. Na ausência do ligante, o RXR/RAR ligado a DNA reprime a transcrição pelo recrutamento de co-repressores NCOR1, SMRT, e desacetilase de histona. Quando o ligante se une ao complexo, ele induz uma mudança na conformação permitindo o recrutamento de co-ativadores, acetil-transferases de histona, e maquinaria básica de transcrição.]), servindo como uma transferase monometil ou dimetil para a lisina 4 da histona 3. A acilação do triptofano 440 com a GlcNAc no domínio SET da MLL5 evocou a atividade da metil-transferase de lisina de histona (HKMT) na lisina 4 da histona 3 (H3K4) e co-ativou o receptor alfa de ácido retinóico nos promotores dos genes alvo. A acilação com GlcNAc nuclear aumentada por meio da transferase de O-GlcNAc (OGT) potencializou a granulopoiese das HL60 induzida por ácido retinóico e restaurou a resposta a ácido retinóico nas células de linha HL60-R2 resistentes a ácido retinóico. Assim, a acilação do MLL5 com GlcNAc dispara a diferenciação da linhagem celular de HL60 através da ativação de sua atividade de HKMT.

ESTRUTURA DO GENE

Emerling e outros (2002) determinaram que o gene MLL5 contém 25 éxons e se expande por 73 quilobases.
Fujiki e outros (2009) relataram que o gene MLL5 contém 27 éxons.

MAPEAMENTO

Por análise de sequência genômica Emerling e outros (2002) mapearam o gene MLL5 no cromossomo 7q22.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=608444

RNA Polimerase II

A RNA polymerase II (também chamada RNAP II e Pol II) é uma enzima encontrada nas células eucarióticas. Ela catalisa a transcrição do DNA para sintetizar precusores de mRNA e a maioria dos snRNA (pequeno RNA nuclear) e micro RNA. Um complexo de doze subunidades com 550 quilo-dáltons, a RNAP II é o tipo de RNA polimerase mais estudada. Uma extensa amplitude de fatores de transcrição é requerida para ela se ligar a seus promotores de começar a transcrição.

Estágios de Transcrição

No processo da transcrição (por qualquer polimerase) existem três estágios principais:

1. Iniciação: a construção do complexo RNA polimerase no promotor do gene com a ajuda de fatores de transcrição.

2. Alongamento: o ato da transcrição da maioria dos genes em uma sequência de RNA correspondente, altamente equilibrada por vários métodos.

3. Terminação: a cessação da transcrição do RNA e a dispersão do complexo da RNA polimerase.


Devido à amplitude de genes que a Pol II transcreve esta é a polimerase que sofre a maior regulação, por uma gama de fatores, em cada estágio da transcrição. Ela também é uma das mais complexas em termos de co-fatores de polimerase envolvidos.


Iniciação

O complexo de pré-iniciação (PIC): a construção do complexo da polimerase no promotor. O box TATA é um exemplo bem estudado de um elemento promotor. Ele está conservado em muitos (embora não todos) os modelos eucariotos e é encontrado em uma fração dos promotores nesses organismos. A sequência TATA está localizada em aproximadamente 25 nucleotídeos antes do Ponto de Iniciação da Transcrição (TSP). Em adição, existem também algumas características fracamente conservadas incluindo o Elemento de reconhecimento por TFIIB (BRE), aproximadamente cinco nucleotídeos anteriores e cinco nucleotídos posteriores ao box TATA.

Ordem de Fixação dos GTFs

A seguir está a ordem na qual os GTFs (fatores gerais de transcrição) se fixam:

1. A TBP (proteína de ligação a TATA) e um complexo de TAFs (fatores associados a TBP) fixados, coletivamente conhecidos como TFIID (fator de transcrição para polimerase II D), ligam-se ao box TATA.

2. O TFIIA (três sub-unidades) liga-se a TFIID e AP DNA, estabilizando as primeiras interações.

3. O TFIIB liga-se entre o TFIID e ao local da ligação da Pol II no futuro próximo. O TFIIB liga-se com parcial especificidade à sequência, com alguma preferência por BRE.

4. O TFIIF (duas sub-unidades, RAP30 e RAP74, mostrando alguma similaridade com os fatores sigma das bactérias) e a Pol II entram juntos no complexo. O TFIIF ajuda a acelerar o processo de polimerização.

5. O TFIIE entra no complexo, e ajuda a abrir e fechar a estrutura de tipo ‘Jaw’ da Pol II, a qual permite o movimento fita de DNA abaixo. Os TFIIE e TFIIH entram concomitantemente.

6. Finalmente TFIIH e TFIIJ estão juntos no complexo. O TFIIH é um grande complexo protéico que contém entre outros o complexo CDK7/cinase ciclina H e uma helicase de DNA. O TFIIH tem três funções: ele se liga especificamente à fita molde para assegurar que a fita correta de DNA seja transcrita e funde-se ou se solta do DNA (dependentemente de ATP) para separar as duas fitas usando sua atividade de Helicase. Ele tem uma atividade de cinase que fosforila o domínio C terminal (CTD) da Pol II no aminoácido serina. Isso estimula a RNA polimerase a começar a produção de RNA, o que marca o final da iniciação e o início do alongamento. Finalmente, isso é essencial para o Reparo de Excisão de Nucleotído (NER) no DNA danificado. Os TFIIH e TFIIE interagem fortemente um com o outro. O TFIIE afeta a atividade catalítica do TFIIH. Sem TFIIE, o TFIIH não se solta do promotor.

7. O mediador então envolve todos os fatores de transcrição e a Pol II. O mediador interage com intensificadores, áreas muito distantes (acima ou abaixo) que ajudam a regular a transcrição.


Regulação da Iniciação

A iniciação é regulada por muitos mecanismos. Esses podem ser separados em duas categorias principais:

1. Interferência protéica;
2.Regulação por fosforilação.

Regulação por Interferência Protéica

A interferência protéica é o processo em que algumas proteínas sinalizadoras interagem, tanto com o promotor ou algum estágio do complexo parcialmente construído, para impedir a continuação da construção do complexo da polimerase, então impedindo a iniciação. Essa é geralmente uma resposta muito rápida e é usada par o nível final, controle individual de genes e para processos em ‘cascata’ para um grupo de genes úteis sob condições específicas (por exemplo os genes de reparo DNA ou genes de choque de calor).


A inibição da estrutura da cromatina é o processo em que o promotor está escondido pela estrutura da cromatina. A estrutura da cromatina é controlada pela modificação pós-tradução das histonas envolvidas e conduz a níveis volumosos de altos ou baixos níveis de transcrição.

Esses métodos de controle podem estar combinados em um método modular, permitindo especificidade muito alta no controle da iniciação da transcrição.

http://www.biosolutions.info/2010/01/rna-polymerase-ii.html

*107830 ARGINASE II; ARG2

Lócus do gene mapeado 14q24.1-q24.3

TEXTO

Spector e outros (1980) apresentaram evidência da existência de duas arginases. Uma delas encontrada nas células do fígado e nas células vermelhas (ARG1; omim608313) está severamente deficitária na argininemia (omim207800). [Arginase é uma enzima do fígado que catalisa a hidrólise da arginina L em ornitina L e uréia; é a enzima principal do ciclo da uréia. Stedman] Em pacientes com essa desordem, alguma uréia é produzida, presumivelmente porque a arginase dos rinas, cérebro e trato gastrointestinal é menos afetada; enzimas típicas do fígado constituem só aproximadamente metade das enzimas nesses tecidos. Na argininemia, a enzima dos rins está a aproximadamente três vezes o normal. Spector e outros (1980, 1983) demonstraram diferenças imunológicas entre as enzimas do fígado e dos rins por meio de anti-arginase do fígado humano de coelhos. Em adição às diferenças imunológicas e diferenças na localização tecidual, a seunda enzima difere na mobilidade eletroforética em gel de policrilamida, em sua demanda quantitativa diferente para ativação de manganésio divalente, e em sua inibição diferencial pela prolina e isoleucina; ela está localizada na matriz mitocondrial, enquanto a arginase I é citoplasmática.

Vockley e outros (1996) estabeleceram que a ARG2 pode ser indutível e pode ser essencial na regulação da síntese do óxido nítrico pela modulação das concentrações de arginina local. Gotoh e outros (1996) mostraram que o mRNA da ARG2 e o mRNA da sintase de óxido nítrico (NOS) eram co-induzidas por lipopolissacarídeo em uma linhagm celular do tipo macrófago. Essa co-indução foi aumentada por dexametasona e dibutiril cAMP, e foi impedida por interferon gama (omim 147570).

Vockley e outros (1996) descobriram várias sequencias de bancos de dados EST com 40 a 60% de homologia com ARG1 e usaram essas sequências para clonar o gene da ARG2 humana a partir de uma biblioteca de cDNA de células Jurkat. O gene da ARG2 codifica um poli-peptídeos de 355 aminoácidos. Comparando as sequências de aminoácidos das ARG1 e ARG2, Vockley e outros (1996) notaram seis pequenas regiões de 92% de identidade em regiões conservadas e aproximadamente 42% de identidade através do restante das sequencias. Usando Northern blott e RT-PCR, Vockley e outros (1996) descobriram que a ARG2 é expressada como um mRNa de 15 quilo-bases em uma ampla variedade de tecidos, com níveis mais altos de expressão na próstrata, cérebro e rins. Os autores também observaram doius outros transcritos de 2,0 e 4,0 quilo-bases expressados no tecido da próstrata. Gotoh e outros (1996) clonaram o gene da ARG2 humana. Eles notaram que ele continha uma sequência de importação pela mitocôndria, e mostraram que em células COS7 transfectadas a proteína é importada para dentro da mitocôndria com proteólise apropriada.

Morris e outros (1997) descobriram que uma sequência prevista da arginase humana de tipo II é 58% idêntica à arginase humana de tipo I mas é 71% idêntica Pa sequência da arignase de tipo II do Xenopus (peixe), sugerindo que a duplicação do gene da arginase ocorreu antes dos mamíferos e anfíbios divergirem. Sete resíduos conhecidos por serem essenciais para a atividade são conservados em todas as arginases. O mRNA da arginase de tipo II foi detectado virtualmente em todas as amostras de RNA testadas do homem e do camundongo, enquanto o mRNA da arginase de tipo I foi encontrado somente no fígado. Morris e outros (1997) especularam que múltiplos tipos de mRNAs de arginase de tipo II nos humanos dever emergir de processamento diferenciado do RNA ou uso de promotores alternativos.

Por análise de PCR de paineis de células somáticas híbridas, fluorescência em sítio de hibridização e análises de radiação híbrida, Gotoh e outros (1997) mapearam o gene da ARG2 em 14q24.1-q24.3.

Em uma revisão e discussão sobre as arginases humanas e deficiência de arginase, Iyer e outros (1998) proporcionaram um breve histórico introdutório à clonagem do gene da ARG2. Eles ressaltaram que a localização mitocondrial da ARG2 e sua co-indução com a aminotransferase de ornitina e envolvimento com a biossíntese de prolina na glândula mamária do rato lactante levou à inferência de que a ARG2 está envolvida em funções biossintétivas, em oposição às funções metabólcas do ciclo da uréia. Os vários destinos metabólicaos da arginina e seu produto imediato ornitina foram diagramados em sua figura 4. Eles apresentaram evidência para o papel da ARG2 no metabolismo do óxido nítrico e da poli-amina.

Deignan e outros (2006) criaram camundongos com Arg1 e Arg2 apagadas individualmente ou combinadamente. Os animais com Arg1 apagada morreram de hiper-amonenemia aos 14 dias de idade, enquanto os camundongos com Arg2 apagada não tinham fenótipo óbvio. Os camundongos com Arg1 e Arg2 duplamente apagadas exibiram o fenótipo dos camundongos com a Arg1 apagada, com a ausência adicional da Arg2 não exacerbando o fenótipo. Medidas do aminoácido no plasma dos camundongos duplamente deletados mostraram níveis aumentados de arginina aproximadamente 100 vezes e decréscimo de ornitina em aproximadamente 10 vezes em comparação com os tipos selvagens. Os níveis de arginina e ornitina também estavam alterados no fígado, rins, cérebro e intestino delgado nos camundongos duplamente apagados.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=107830

O QUÊ É ARGININA

A arginina (abreviada como Arg u R) é um aminoácido alfa. A forma L é um dos vinte aminoácidos mais comuns. Seus códons são CGU. CGC, CGA, CGG, AGA, e AGG. Nos mamíferos, a arginina é classificada como um aminoácido semi-essencial ou condicionalmente essencial, dependendo do estágio de desenvolvimento e o estatus de saúde do indivítuo. Crianças são incapazes de encontrar sua demanda e assim a arginina é nucicionalmente essencial para elas. A arginina foi isolada inicialmente a partir de um extrato de semente de tremoço em 1886 pelo químico suíço Ernst Schultze.


A arginina consiste de uma cadeia simples alifática de quatro carbonos, o final mais distante dela é encapuzado por um grupo de guanidínio em complexo. [Obs.: Guanidina é um composto altamente alcalino geralmente encontrado em algumas plantas e animais inferiores na forma de cloridrato; ela é um dos constituintes da creatina e da arginina. Stedman] Com um pKa de 12,48, o grupo guanidínio é positivamente carregado em ambientes neutros, ácidos e ainda na maioria dos ambientes básicos, e assim transmite as propriedades químicas básicas para a arginina. Devido à conjugação entre ligações duplas e pares de nitogênio isolados, a carga positiva é deslocada, permitindo a formação de múltiplas ligações com H.



Função

A arginina atua num importante papel na divisão celular, cicatrização de feridas, removedor da amônia do corpo, função imune, e liberação de hormônios.

Os benefícios e funções atribuídos à ingestão oral da arginina L incluem:

1) Precursor da síntese de óxido nítrico (NO);
2) Estimulação de liberação de hormônio de crescimento;
3) Melhora da função imune;
4) Reduz o tempo de cicatrização de lesões (particularmente no osso);
5) Acelera o tempo de reparo de tecido danificado;
6) Reduz o risco de doença cardíaca;
7) Aumenta a massa muscular;
8) Reduz o tecido adiposo corporal;
9) Ajuda na sensibilidade à insulina;
10)Ajuda a diminuir a pressão sanguínea;
11)Reduz a infertilidade masculina, melhorando a produção de espermatozóides e a mobilidade;
12) Aumenta a circulação do sangue inclusive nos órgãos sexuais.

Nas Proteínas

A geometria, distribuição de carga e habilidade da arginina em formar múltiplas ligações de hidrogênio a tornam ideal para ligação a grupos negativamente carregados. Por esta razão a arginina prefere estar do lado externo das proteínas onde ela pode interagir com o ambiente polar. Incorporada às proteínas, a arginina também pode ser convertida em citrulina pelas enzimas PAD. Em adição, a arginina pode ser metilada por proteínas metiltransferases.


Como um Precursor

A arginina é o precursor imediato do óxido nítrico, urea, ornitina [aminoácido formado quando a arginina é hidrolisada pela arginase que não é constituinte das proteínas mas participa do ciclo da uréia. Stedman] e agmatina [é o produto da descarboxilação da arginina. Wikipédia] ; é necessária para a síntese de creatina e também pode ser usada para a síntese de poli-aminas (principalmente através da ornitina e em menor grau através da agmatina), citrulina e glutamato. Por ser um precursor do óxido nítrico, o qual relaxa os vasos sanguíneos, a arginina é usada em muitas condições onde a vasodilatação é necessária. A presença de dimetil-arginina assimétrica (ADMA), um parente próximo, inibe a reação do óxido nítrico; dessa forma, a ADMA é considerada um marcador para doenças vasculares, da mesma forma que a arginina L é considerada um sinal de saúde endotelial.

http://www.biosolutions.info/2008/12/arginin.html

*300255 TRANSFERASE DE N-ACETILGLUCOSAMINA LIGADA EM OXIGÊNIO; OGT

GlcNAc TRANSFERASE
Lócus do Gene Mapeado Xq13

TEXTO

DESCRIÇÃO

A transferase de N-acetilglucosamina (GlcNAc) ligada a oxigênio (OGT) catalisa a adição de uma única N-acetilglucosamina no oxigênio glicosídico ligado a resíduos de serina ou treonina. Já que a fosforilação e a glicosilação competem por resíduos similares de treonina ou serina, os dois processos podem competir por sítios, ou eles podem alterar a especificidade do substrato ou sítios vizinhos por efeitos estéricos ou eletrostáticos (Lubas e outros, 1997).

CLONAGEM

Haltiwanger e outros (1992) purificaram a OGT do fígado do rato e determinaram que ela tem uma massa molecular de 340 quilo-dáltons. Elespropuseram que a OGT existe como um complexo heterotrimérico com duas sub-unidades de 110 quilo-dáltons e uma de 78 quilo-dáltons. Entretanto, usando a OGT do coelho, Lubas e outros (1997) analisaram a impressão proteolítica de ambos os peptídeos e acharam que os dois estão relacionados. Eles sugeriram que a banda de 78 quilo-dáltons é um produto proteolítico do polipeptídeo de 110 quilo-dáltons ou o produto de um sítio alternativo da iniciação da transcrição. Kreppel e outros (1997) clonaram cDNAs de rato codificadores da sub-unidade de 110 quilo-dáltons. A imunofluorescência das células humanas expressando a OGT do rato indicou que a OGT está presente em ambos o núcleo e o citosol.

Por busca em um banco de dados com a sequência parcial da proteína OGT do coelho, Lubas e outros (1997) identificaram os cDNAs da OGT humana e de C.elegans. A proteína humana prevista em 920 amioácidos contém nove repetições tetratricopeptídicas e um suposto sinal de localização nuclear bipartido. Células HeLa [as primeiras células malígnas humanas cultivadas continuamente, derivadas do carcinoma cervical. Stedman] que expressam OGT não sobrevivem bem durante incubações prolongadas, sugerindo que essa proteína deve ser tóxica para as células. Análises de Soutern blot indicaram que um único gene de OGT está presente nos humanos. Análises de Northern blot revelaram que a OGT é expressada como múltiplos transcritos que estão presentes em diferentes quantidades em vários tecidos humanos, com os níveis mais altos de expressão no pâncreas.

FUNÇÃO DO GENE

A glicosilação protéica nuclear e citoplasmática é uma modificação pós-tradução difundida e reversível nas células eucarióticas. A glicosilação intra-celular pela adição de N-acetilglucosamina à serina e treonina é catalisada pela OGT. Essa GlcNAcilação no oxigênio de proteínas intracelulares pode ocorrer em sítios de fosforilação, e tem sido implicada no controle da transcrição de genes, reunião dos neurofilamentos, e na emergência do diabetes e doenças neurológicas. Para estudar a função da OGT ‘in vivo’, Shafi e outros (2000) usaram abordagens de alvejamento de genes em células-tronco embrionárias masculinas. Eles descobriram que a mutagênese da OGT requer uma estratégia que retenha um gene da OGT intacto como é realizado pelo uso da recombinação Cre-loxP porque a deleção do gene OGT resulta na perda da viabilidade da célula-tronco embrionária. A expressão do RNA da OGT nos camundongos foi comparativamente alta entre a maioria dos tipos de células, com níveis mais baixos no pâncreas. A segregação dos alelos da OGT em linhas germinativas do camundongo revelaram que alelos intactos da OGT são requeridos para completar a embriogênese. Esses estudos ilustraram a necessidade de abordagens de alvo a genes condicionadores na mutagênese e de estudo dos genes essenciais ligados ao X, e indicaram que a participação da OGT na glicosilação intracelular é essencial para a viabilidade da célula-tronco e ontogenia do camundongo.

Fatores de transcrição e a RNA polimerase II podem ser modificados por monossacarídeos GlcNAc no oxigênio dos resíduos de serina e treonina, ainda que os precisos papéis funcionais dessa modificação sejam largamente desconhecidos. Yang e outros (2002) mostraram que a OGT, a enzima que catalisa essa modificação pós-transcricional, interage com um complexo de desacetilase de histona pela ligação ao co-repressor Sin3A (omim 607776). Funcionalmente, a OGT e a Sin3A reprimem cooperativamente a transcrição em paralelo à desacetilação da histona. Os autores propusema que a Sin3A alveja a OGT aos promotores para inativar fatores de transcrição e a RNA polimerase II por modificação do O-GlcNAc, o qual atua em concerto com a desacetilação da histona para promover o silenciamento de genes de um modo eficiente e específico.

Zhang e outros (2003) demonstraram que o proteossomo 26S dos mamíferos pôde ser inibido pela modificação mediada pela Ogt, resultando em uma proteólise inibida do fator de transcrição Sp1 (omim 189906) e num peptídeo de prova hidrofóbico. A ATPase Rpt2 na sub-unidade 19 do capuz do proteossomo foi modificada por O-GlcNAc in vitro e in vivo, e como sua modificação aumentou, a função do proteossomo decaiu.

[OBS.: Proteossomo

Antes da descoberta do sistema de ubiquitina do proteossomo, pensava-se que a degradação protéica nas células dependia principalmente dos lisossomos, organelas ligadas à membrana com interiores cheios de ácidos e proteases que podem degradar e depois reciclar proteínas exógenas e organelas envelhecidas ou danificadas. Entretanto, o trabalho de Alfred Goldberg em 1977 sobre a degradação de proteínas dependente de ATP nos reticulócitos, os quais carecem de lisossomos, sugeriu a presença de um segundo mecanismo intra-celular de degradação. Em 1978 mostrou-se que este era composto de várias cadeias distintas de proteínas, uma novidade sobre as proteases naquele momento. Trabalhos posteriores sobre a modificação das histonas levaram à identificação de uma insuspeita modificação covalente da proteína histona por uma ligação bifurcada entre o resíduo de lisina na histona e o resíduo de glicina no terminal C da proteína ubiquitina, a qual não tinha função conhecida. Então descobriu-se que uma proteína préviamente identificada associada com a degradação proteolítica, conhecida com fator 1 de proteólise dependente de ATP (APF-1), era a mesma proteína que a ubiquitina. Depois, o complexo proteolítico dependente de ATP que era responsável pela degradação protéica dependente de ubiquitina foi descoberto e foi chamado de proteossomo 26S.

Os sub-componentes do proteossomo são frequentemente mencionados por seus coeficientes de sedimentação Svedberg (unidade de sedimentação denotada S). A forma mais comum de proteossomo é conhecida como proteossomo 26S, o qual tem aproximadamente 2000 quilo-dáltons (kDA) de massa molecular e contém uma estrutura com uma partícula cerne 20S e dois capuzes regulatórios 19S. O cerne é oco e proporciona uma cavidade envolvida na qual proteínas são degradadas; aberturas nos dois finais do cerne permitem a proteína alvo entrar. Cada final da partícula cerne associa-se com uma sub-unidade regulatória 19S que contém múltiplos sítios ativos ATPase e sítios de ligação a ubiquitina; essa é a estrutura que reconhece proteínas poliubiquitinizadas e as transfere para o cerne catalítico. Uma forma alternativa da sub-unidade regulatória, chamada partícuka 11S pode se associar com o cerne essencialmente da mesma maneira que a partícula 19S; a 11S pode atuar num papel na degradação de peptídeos estranhos tais como aqueles produzidos após a infecção por um vírus.

O mecanismo de proteólise pelas sub-unidades beta da partícula cerne 20S é através de uma ataque nucleofílico dependente de treonina. ... Embora as três sub-unidades catalíticas beta tenham um mecanismo comum, elas tem ligeiras diferenças na especificidade para o substrato, as quais são consideradas de tipo quimiotripsina, de tipo tripsina e de tipo hidrólise de peptídeo glutamil por peptidil. Essas variações em especificidade são o resultado de contatos inter-atômicos com resíduos em locais próximos de sítios ativos de cada sub-unidade. Cada sub-unidade catalítica beta também possui um resíduo de lisina conservado requerido para proteólise.
http://en.wikipedia.org/wiki/Proteasome]

Yang e outros (2008) mostraram que a OGT esconde um tipo de domínio de ligação a fosfoinositídeo previamente não reconhecido. Após a indução com insulina, o fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato recruta a OGT do núcleo para a membrana plasmática onde a enzima cataliza a modificação dinâmica da via de sinalização da insulina pela O-GlcNAc. Isso resulta em uma alteração na fosforilação de moléculas de sinalização chave e na atenuação da transdução de sinal da insulina. A sobre-expressão hepática da OGT diminui a expressão de genes responsivos à insulina e causa resistência a insulina e dislipidemia. Yang e outros (2008) concluíram que seus achados identificaram um mecanismo molecular pelo qual estímulos nutricionais regulam a sinalização da insulina através da O-GlcNAc, e sub-classificaram a contribuição dessa modificação para a etiologia da resistência à insulina e o diabetes de tipo dois (omim 125853).

Aumentos na concentração de glucose circulante ativam a via biossintética da hexosamina e promove a glicosilação no oxigênio de proteínas pela OGT. Dentin e outros (2008) mostraram que a OGT dispara a glucogênese hepática através da glicosilação do oxigêncio do transdutor (conversor) 2 da proteína de ligação a elementos de resposta a cAMP (CREB) regulada (TORC2 ou CRTC2; omim 608972). A CRTC2 foi glicosilada em O nos sítios que normalmente sequestram a CRTC2 no citoplasma através de um mecanismo dependente de fosforilação. O decréscimo na quantidade de CRTC2 glicosilada no oxigênio pela expressão da enzima O-GlcNAcase desglicosiladora (omim 604039) bloqueou os efeitos da glucose na gluconeogênese, demonstrando a importância da via biossintética da hexosamina no desenvolvimento da intolerância à glucose.

MAPEAMENTO

Shafi e outros (2000) determinaram que uma única cópia do gene OGT está presente no genoma masculino. Por FISH, eles mapearam o gne OGT humano em Xq13, uma região associada com doenças neurológicas. Por análises de radiação híbrida, eles mapearam o homólogo do camundongo no cromossomo X perto do centrômero, na região D.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=300255

Como os Cromossomos São Protegidos pelos Telômeros e a Enzima Telomerase (Prêmio Nobel de Medicina 2009)

O Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina 2009 foi concedido a três cientistas que resolveram um problema maior na biologia: como os cromossomos podem ser copiados de modo completo durante as divisões celulares e como são protegidos da degradação. Os laureados pelo Nobel mostraram que a solução pode ser encontrada no final dos cromossomos: nos telômeros, e em uma enzima que os forma: a telomerase.

As longas e enroscadas moléculas de DNA que carregam nossos genes são empacotadas em cromossomos, sendo os telômeros o capuz (selo) em seus finais. Elizabeth Blackburn e Jack Szostak descobriram que uma única sequência de DNA nos telômeros protege os cromossomos da degradação. Carol Greider e Elizabeth Blackburn identificaram a telomerase, a enzima que produz o telômero no DNA. Essas descobertas explicaram como os finais dos cromossomos são protegidos pelos telômeros e que eles são construídos pela telomerase.


Se os telômeros forem encurtados, as células envelhecem. Ao invés disso, se a atividade da telomerase estiver alta, o comprimento do telômero é mantido, e a senescência celular é procrastinada.


O Misterioso Telômero

Os cromossomos contêm nosso genoma em suas moléculas de DNA. Ainda no início dos anos 30, Hermann Muller (Prêmio Nobel de 1946) e Barbara McClintock (Prêmio Nobel de 1983) tinham observado que as estruturas nos finais dos cromossomos, os então chamados telômeros, pareciam impedir os cromossomos de fixarem-se uns nos outros. Eles suspeitaram de que os telômeros pudessem ter um papel protetor, mas como eles operavam permanecia um enigma.

Quando os cientistas começaram a entender como os genes são copiados, nos anos 50, outro problema se apresentou. Quando uma célula está próxima de dividir-se, as moléculas de DNA, as quais cotem quatro bases que formam o código genético, são copiadas, base por base, pelas enzimas DNA polimerases. Entretanto para uma das duas fitas de DNA, existe um problema no qual o verdadeiro final da fita não pode ser copiado. Por isso, os cromossomos deveriam estar mais curtos a cada vez que uma célula se divide; porém, de fato, esse não é normalmente o caso.

Esses dois problemas foram solucionados quando os Laureados pelo Nobel deste ano (2009) descobriram como os telômeros funcionam e acharam a enzima que os copia.


O Telômero de DNA Protege os Cromossomos

Na fase inicial de sua carreira de pesquisadora, Elizabeth Blackburn mapeou sequências de DNA. Quando estudava os cromossomos da Tetrahymena, um organismo ciliado unicelular, ela identificou uma sequência de DNA que era repetida várias vezes no final dos cromossomos. A função dessa sequência, CCCCAA, restava obscurecida. Na mesma época, Jack Szostak tinha feito a observação de que uma molécula linear de DNA, como um mini-cromossomo, é rapidamente degradada quando introduzida dentro de células de levedura.


Blackburn apresentou seus resultados em uma conferência em 1980. Eles captaram o interesse de Jack Szostak e ele e Blackburn decidiram desempenhar um experimento que cruzaria as fronteiras entre espécies muito diferentes. A partir do DNA da Tetrahymena, Blackburn isolou a sequência CCCCAA. Szostak a acoplou dentro dos mini-cromossomos e colocou-os de volta nas células de levedura. Os resultados, que oram publicados em 1982, eram surpreendentes: a sequência de DNA do telômero protegeu os mini-cromossomos da degradação. Como o DNA telomérico de um organismo, Tetrahymena, protegeu cromossomos em uma levedura inteiramente diferente, isso demonstrou a existência de um mecanismo fundamental até então desconhecido. Depois disso, tornou-se evidente que o DNA do telômero com sua sequência característica está presente na maioria das plantas e animais, da ameba ao homem.



A Enzima que Constrói os Telômeros

Carol Greider, então uma estudante graduada, e sua supervisora Blackburn começaram a investigar se a formação do DNA do telômero poderia ser devida à uma enzima desconhecida. No dia de Natal, em 1984, Greider descobriu sinais de atividade enzimática num extrato celular. Greider e Blackburn chamaram a enzima de telomerase, a purificaram, e mostraram que ela consiste tanto de RNA quanto de proteína. O componente de RNA revelou-se conter a sequência CCCCAA. Ela serve de modelo quando o telômero é construído, enquanto o componente protéico é requerido para o ofício da construção, isto é, a atividade enzimática. A telomerase extende o DNA telomérico, proporcionando uma plataforma que capacita as DNA polimerases copiarem a lente inteira do cromossomo sem perder a verdadeira porção final.


Os Telômeros Adiam o Envelhecimento da Célula

Agora os cientistas começam a investigar que papéis o telômero deverá desempenhar na célula. O grupo de Szostak identificou células de levedura com mutações que levaram a um encurtamento gradual dos telômeros. Tais células cresciam pobremente e eventualmente paravam de se divider. Blackburn e suas cooperadoras fizeram mutações no RNA da telomerase e observaram efeitos similares na Tetrahymena. Em ambos os casos, isso levou ao envelhecimento cellular premature: a senescência. Em contraste, telômeros funcionais no lugar disso impedem a danificação do cromossomo e retardam a senescência celular. Mais tarde, o grupo de Greider mostrou que a senescência das células humanas também é procrastinada pela telomerase. Pesquisas nessa área têm sido intensas e agora sabe-se que a sequência de DNA no telômero atrai proteínas que formam um capuz protetor em volta dos frágeis finais das fitas de DNA.


Um Parte Importante do Mistério: Envelhecimento Humano, Câncer e Células-Tronco

Essas descobertas tiveram um impacto maior dentro da comunidade científica. Muitos cientistas especularam que o encurtamento do telômero poderia ser a razão do envelhecimento, não somente das células individualmente, mas também do organismo como um todo. Porém, o processo de envelhecimento deixou de ser proposto por ser complexo e agora se pensa que depende de vários fatores diferentes, sendo o telômero um deles. As pesquisas nessa área permanecem intensas.

A maioria das células normais não se divide frequentemente, por isso seus cromossomos não estão em risco de encurtar e elas não requerem alta atividade de telomerase. Em contraste, as células de câncer têm a habilidade de dividir-se infinitamente e ainda preservar seus telômeros. Como elas escapam da senescência celular? Uma explicação tornou-se aparente com o achado de que as células de câncer frequentemente têm a atividade de telomerase aumentada. Foi sugerido, por isso, que o câncer deveria ser tratado pela erradicação da telomerase. Vários estudos são subsidiados nesta área, inclusive testes clínicos avaliando vacinas direcionadas contra células com elevada atividade de telomerase.

Sabe-se que algumas doenças herdadas são causadas por defeitos da telomerase, inclusive certas formas de anemia aplásica (poucos eritrócitos e hemoglobina, granulocitopenia e trombocitopenia em conseqüência da medula óssea hipoplásica ou aplásica), na qual a insuficiente divisão celular nas células-tronco da medula óssea levam à anemia severa. Certas doenças herdadas da pele e dos pulmões também são causadas por defeitos da telomerase.

Em conclusão, as descobertas de Blackburn, Greider e Szostak adicionaram uma nova dimensão ao nosso entendimento da célula, lançara luz nos mecanismos das enfermidades, e estimularam o desenvolvimento de novas terapias em potencial.


Fonte : http://www.biosolutions.info/

+305900 GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE; G6PD
Alternative titles; symbols
ANEMIA, NONSPHEROCYTIC HEMOLYTIC, DUE TO G6PD DEFICIENCY, INCLUDED
Lócus do Gene Mapeado Xq28

TEXTO

Desde a identificação da G6PD (Carson e outros, 1956), sua determinação cromossômica no X (Childs e outros , 1958) nos anos cinquenta e a demonstração de variantes eletroforéticas dessa enzima no início dos anos sessenta (Boyer e outros, 1962), a significância genética, clínica e bioquímica desse polimorfismo tem sido encontrada fartamente. A G6PD está na rota da hexose monofosfato, o único processo de geração de NADPH em células vermelhas maduras que carece do ciclo do ácido cítrico. Por esta razão, a deficiência de G6PD tem efeitos fisiológicos adversos. A deficiência da enzima das células vermelhas, em várias formas, é a base do favismo (uma condição aguda que ocorre após a ingestão de certas favas, principalmente na Itália. Stedman), sensitividade à primaquina (agente anti-malárico contra o Plasmodium vivax); e algumas outras anemias hemolíticas sensitivas a drogas (Beutler e outros, 1968). Beaconsfield e outros (1965) avançaram na hipótese de que a incidência de câncer está inversamente relacionada à frequência da deficiência da G6PD em pessoas de pele escura. Já que o metabolismo do xilitol (álcool de açúcar frequentemente usado como substituto do açúcar em dietas para diabéticos. Stedamn) permanece intacto em células vermelhas deficientes em G6PD, Wang e outros (1971) sugeriram o uso do xilitol no tratamento da crise hemolítica. Diferentes variantes da enzima são encontradas em alta frequência em populações africanas, mediterrâneas e asiáticas (Porter e outros, 1964), e a vantagem do heterozigoto em relação à malária (Luzzatto e outros, 1969) tem sido invocada para quantificar a alta frequência de alelos particulares em populações particulares. A variedade de formas da enzima é grande, como ilustrado pelas tabelas publicadas (Yoshida e outros; Beutler e Yoshida, 1973; Yoshida e Beutler. 1978) e pela listagem de variantes alélicas nessa entrada. A Organização Mundial de Saúde deu sua atenção a problemas de nomenclatura e padronização de procedimentos para estudo. O polimorfismo demonstrado no lócus ligado ao X rivaliza aquele do lócus autossômico para as cadeias polipeptídicas da hemoglobina. Num momento posterior, a substituição de um único aminoácido foi demonstrada como a base da alteração na molécula G6PD resultando de mutação (Yoshida e outros, 1967).

O polimorfismo no lócus da G6PD a tem tornado um útil marcador do cromossomo X, como os lócus da dautonia do verde e do grupo sanguíneo Xg; foi mostrada ligação estreita entre os lócus do dautonismo do verde, da G6PD e da hemofilia A (Adam e outros; Boyer e Graham, 1965). Também, como um fenótipo bioquímico identificável ao nível celular, variantes da G6PD têm sido úteis na genética de células somáticas, permitindo, por exemplo, uma das provas críticas no homem sobre a hipótese de Lyon (Davidson e outros, 1963).

[OBS.:

Em 1932, Muller cunhou o termo “compensação de dosagem” para explicar a igualdade da expressão fenotípica em machos e fêmeas para a maioria dos genes localizados no cromossomo X. Ao longo dos anos, várias teorias explicativas para esse fenômeno foram consideradas, e foram revisadas recentemente por Stern e McKusick.
Em 1961, uma única hipótese foi desenvolvida por Lyon e Russell. A hipoótese, frequentemente mencionada como “Hipótese de Lyon”, propõe que em cada célula somática (não sexual) da fêmea, um dos cromossomos X está geneticamente inativo. A inativação deve ocorrer no início do desenvolvimento e é uma questão de sorte se o X paterno ou o materno estará inativado. Uma vez que um cromossomo X seja inativado numa célula em desenvolvimento, toda a descendência dessa célula provavelmente mantêm o mesmo X inativo.

O exame de células singulares em uma fêmea, que é heterozigota para os genes ligados ao X, com efeito mensurável proporcionaria evidência direta para autentificar a hipótese. Nesse caso, esperar-se-ia que a fêmea produzisse uma atividade do comossomo X em mosaico. Em algumas de suas células, um alelo poderia ser ativo; nas outras, o outro alelo poderia funcionar.

A enzima, glucose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PD), proporciona uma ferramenta quantitativa e qualitativa para testar esta hipótese. Mostrou-se que em um homem caucasiano cujos eritrócitos têm atividade deficiente da G6PD células da pele cultivadas também são claramente deficientes. Nossos próprios estudos têm confirmado isso e mostrado a amplitude da atividade para células da pele de vários genótipos. Se a “Hipótese de Lyon” sustenta-se, a heterozigozidade de uma mulher caucasiana deverá produzir duas populações de células quantitativamente diferentes, uma com atividade G6PD do ramo mutante, e outra com atividade do ramo normal.


A eletroforese em gel Starch demonstrou variantes qualitativas da G6PD em eritrócitos e leucócitos na população negra africana, mas não entre caucasianos. Oitenta e nove homens negros podem ter uma rápida banda de G6PD A, ou uma mais lenta, B. Mulheres podem ter A, B ou ambas A e B. Esses estudos provaram que as variantes eletroforéticas são herdadas, e que o lócus genético responsável está no cromossomo X. Assim, se a “Hipótese de Lyon” se aplica, a mulher que for heterozigota para duas variantes eletroforéticas deverá ser também um mosaico, algumas de suas células produzindo G6PD de tipo A, outras de tipo B, mas nenhuma produzindo as duas.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC221205/?tool=pubmed]

A relativa estabilidade do cromossomo X durante a evolução tem sido mostrada pelo fato de que o lócus do gene G6PD nasce no X em um grande número de outras espécies (Ohno, 1967). A ligação do G6PD ao X no camudongo é defendida pelos achados de Epstein (1969) pois os oócitos (ovócitos fecundados?) de fêmeas XO (monossomia do X) têm a metade do G6PD dos oócitos das camundongas fêmeas XX. O nível de desidrogenase láctica [nome para inúmeras enzimas, incluindo L-1 desidrogenase (citocromo), D-1 desidrogenase (citocromo), L-1 desidrogenase e D-1 desidrogenase. As duas primeiras transferem hidrogênio para o ferricitocromo c ou para o citocromo b; as duas últimas enzimas transferem-no para o NAD+, ao catalisar a oxidação do lactato em piruvato; a distribuição da isoenzima da 1.desidrogenase cardíaca e muscular é de uso significativo nos casos de enfarto do miocárdio. Stedman] foi o mesmo. A conclusão de Epstein foi que o G6PD é ligado ao X no camundongo, que a síntese ocorre no oócito e é dependente da dose, e que a inativação do X não ocorre nos oócitos. Os genes G6PD e o HPRT [omim-308000 - A HPRT1 tem um papel central na geração dos nucleotídeos púricos através da via de resgate de purina (purina é a substância original da adenina, guanina e outras bases purinas que ocorem naturalmente. Stedman). A HPRT cataliza a conversão da hipoxantina em inosina monofosfato e da guanina em guanosina monofosfato pela transferência do grupo 5-fosforribosil do 5-fosforribosil 1-pirofosfato.] estão ligados no ramster chinês (Rosnenstraus e Chasin,1975) e presumivelmente estão no cromossomo X como no homem. Por estudo de células híbridas, Shows e outros (1976) descobriram que os genes HPRT e G6PD estão intimamente ligados no cervo Muntjac. Smith e outros (1976) acharam deficiência de G6PD em um cachorro Weimaraner macho, mas não foram capazes de fazer estudos genéticos. Alpha-GAL, HPRT, PGK e G6PD são ligados ao X no coelho, de acordo com estudos de células híbridas de camundongo com coelho (Cianfriglia e outros, 1979; Echard e Gillois, 1979). Por métodos comparáveis, Hors-Cayla e outros (1979) os descobriram ligados ao X no gado. De acordo com estudos de hibridização celular, o HPRT, G6PD, e PGK estão ligados ao X no porco (Gelin e outros, 1979) e no carneiro/ovelha (Saidi e outros, 1979). Pretsch e outros (1988) reestabeleceram um camundongo com deficiência de G6PD ligada ao X de descendência de um camundongo macho tratado com 1-etil-1-nitrosouréia (um agente para tratar neoplasia. Stedman). Usando eletroforese de campo eletrico em gel, Faust e outros (1992) demonstraram que, no camundongo, o Gdx (omim 312070), o P3 (omim 312090) e o G6pd estão fisicamente ligados ao lócus do pigmento visual ligado ao X (Rsvp) dentro de uma distância máxia de 340 quilo-bases, enquanto o G6pd e o Cf-8 (O gene do FVIII no camundongo – omim 306700) estão apartados por 900 quilo-bases.

Cooper e outros (1972) e Gray e outros (1973) descobriram que a completa deficiência da G6PD produz não somente a anemia hemolítica não esferocítica mas também a doença granulomatosa crônica devido à disfunção do neutrófilo. O paciente de Cooper e outros (1972) foi uma mulher com completa deficiência de G6PD nos leucócitos, deficiência parcial nas células vermelhas, e nenhuma história de deficiência de G6Pd na família. Das várias explicações possíveis adiantadas pelos autores, eles preferiam a sugestão de que a inativação do X tinha afetado as séries de células vermelhas e de células brancas diferencialmente e que a paciente de fato tinha deficiência em G6PD. Gray e outros (1973) descreveram três irmãos afetados. A mãe mostrou um defeito intermediário na atividade metabólica e microbicida dos leucócitos, bem como um mosaicismo nas células vermelhas e brancas. Beutler (1990) ergueu a questão sobre se o defeito nesses casos deveria ser um rearranjo, deleção ou mutação sem sentido levando à real ausência do produto do gene. Ele estava pronto para levantar a possibilidade porque todas as mutações analisadas na G6PD até aquela data tinham sido substituições de nucleotídeo de sentido trocado. Na Arábia Saudita, Mallouh e Abu-Osba (1987) revisaram o status da G6PD de todas as crianças com um mês de idade a quatorze anos que eram tratadas para meningite, septissemia, osteomielite, ou febre tifóide durante um período de nove anos. A freqüência da deficiência de G6PD observada era significativamente mais alta do que o esperado para o grupo inteiro, para mulheres com infecção positivas em catalase e negativas em catalase, e para homens com infecções positivos em catalase [uma enzima que converte peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Stedman].

A partir do estudo de segregantes induzidos por radiação (células humanas irradiadas ‘recuperadas’ por fusão com células de ramster) Goss e Harris (1977) mostraram que a ordem dos quatro lócus é PGK: alfa-GAL: HPRT: G6PD e que os três intervalos entre esses quatro lócus são, em termos relativos, 0,33, 0,30 e 0,23. Entre crianças nigerianas com convulsões e pesada parasitemia de malária falciparum, Martin e outros (1979) notaram uma reduzida frequência na deficiência em G6PD. Eles realçaram que a única sustentação para um papel da malária na seleção de genes deficientes seria a associação geográfica. O mecanismo de proteção das células deficientes em G6PD contra a malária falciparum foi engendrado por Friedman a Trager (1981). A G6PD é crítica para a regeneração da NADPH, uma co-enzima que é essencial para o reparo ao e a proteção contra dano oxidativo. As células vermelhas deficientes em G6PD são mais sensitivas a peróxido de hidrogênio gerado pelo parasita da malária. A perda do potássio da célula e do parasita é grandemente responsável pela morte do parasita. O feijão de fava contém uma variedade de substâncias que aumenta a sensibilidade das células vermelhas aos oxidantes. Ainda não se identificou se haveria expectativa em comer feijão de fava e talvez outros alimentos para o aumeto no nível de proteção contra a malária em pessoas que são heterozigotas para a deficiência em G6PD e para a talassemia. Células vermelhas fetais têm igualmente uma sensitividade aumentada para oxidantes e uma resultante resistência à malária. É verdade a respeito de células adultas que têm uma alta concentração incomum de hemoglobina fetal. Roth e outros (1983) descobriram que células vermelhas deficientes em G6PD de Sardenhos hemizigotos e heterozigotos suportaram o crescimento do parasita Plasmodium falciparum in vitro em torno de somente um terço das células vermelhas normais. Nenhuma anormalidade do crescimento pôde ser demonstrada nas células vermelhas dos Sardenhos com o traço de talassemia beta-zero. Os autores sugeriram que os dados sustentam uma vantagem seletiva da deficiência em G6PD em áreas de malária; a vantagem para mulheres heterozigotas pode ser particularmente forte se a resistência à malária foi igual à dos homens hemizigotos, sem o risco da hemólise fatal.

Que a resistência à malária severa é a base da alta frequência da deficiência de G6PD e que ambos os hemizigotos e heterozigotos gozam de uma vantagem foi estabelecido por Ruwando e outros (1995) em dois grandes estudos de controle de casos com mais de duas mil crianças africanas. Eles descobriram que a forma africana comum da deficiência em G6PD (G6PD A) estava associada com uma redução de 46 a 58% no risco de malária severa para ambos as mulheres heterozigotas e homens homozigotos. Um modelo matemático incorporando a vantagem seletiva mensurada contra a malária sugeriu que uma desvantagem seletiva contrabalançando, associada com a deficiência dessa enzima, tinha atrasado a frequência de seu surgimento nas regiões com malária endêmica.

É notável que embora os lócus HPRT [omim 308000 – Xq26-q27.2 -A HPRT1 tem um papel central na geração de nucleotídeos de purina através da via de recuperação de purina. A HPRT’ cataliza a conversão de hipoxantina em inosina monofosfato e de guanina em guanosina monofosfato por meio da transferência de um grupo 5-fosforribosil de um pirofosfato 5-fosforribosil 1.] e G6PD pareçam estar estritamente situados no mapeamento físico, estudos de famílias indicam uma considerável recombinação. Já que o lócus do G6PD está assinado na banda terminal do braço longo do cromossomo X (Xq28) e o HPRT no Xq27 e já que o ‘sítio frágil’ está localizado na interface entre essas duas bandas, pode haver um ‘ponto quente’ para crossing-over no segmento do cromossomo X entre os lócus HPRT e G6PD? Estudando translocações autossômicas do X (do cromossomo X para cromossomos não sexuais) em células somáticas híbridas, Pai e outros (1980) mostraram que um ponto de interrupção na junção Xq27-Xq28 separa o HPRT do G6PD. O G6PD é situado distalmente (na extremidade) em Xq28. Eles localizaram o HPRT nos segmentos entre Xq26 e Xq27. Sansone e outros (1981) descreveram seis novas variantes do G6PD em homens italianos, todas associadas com deficiência da enzima e duas com sinais de hemólise. Eles proporcionaram um mapa útil de 19 variantes esporádicas da G6PD encontradas na Itália. Eles mapearam duas regiões onde as formas comuns da deficiência em G6PD são frequentes. Hitzeroth e Bender (1981) encontraram uma crescente frequencia de homozigotos aparentemente BB com aumento de idade nos grupos de negros Sul-Africanos estudados. Eles sugeriram que isso representa uma seleção contra linhas de células A em heterozigotos e especularam suplementarmente que a malária é o agente seletivo subjacente. Mohrenweiser e Neel (1981) identificaram variantes temolábeis (sujeitas a destruição pelo calor) da lactato desidrogenase B, isomerase do glucosefosfato, e desidrogenase da glucose-6-fosfato. Nenhuma foi detectável como uma variante por técnicas eletroforéticas estandardizadas. Todas foram herdadas. Beutler (1983) hipotetizaram que diferenças marcadas na extensão em que vários tecidos manifestam o estado de deficiência em várias enzimopatias incluindo a deficiência em G6PD podem estar relacionadas a diferenças em proteases de tecido para tecido. A mutação pode produzir mudanças na suscetibilidade da enzima às proteases.

O promotor do G6PD tem um peso molecular de 50.000 e consiste de 531 aminoácidos (Takizawa e outros, 1986). Martini e outros (1986) determinaram que o gene humano G6PD tem 18 kilobases de comprimento com 13 éxons. A região codificadora da proteína é dividida em 12 segmentos, alternando em tamanho de 12 a 236 pares de base, e um íntron está presente na região não traduzida da extremidade 5. O final da ponta 5 inicial do mRNA da G6PD em várias linhas celulares está localizado a 177 pares de base acima do códon de iniciação da tradução [então esses 177 não são traduzidos no ribossomo]. A comparação da região promotora da G6PD e 10 outros genes de enzimas de manutenção [genes de manutenção estão envolvidos no metabolismo celular de rotina são geralmente expressados. Stedman] confirmou a presença de características comuns. Em particular, em oito casos nos quais um box ‘TATA’ estava presente, uma sequência conservada de 25 pares de base foi vista imediatamente a jusante.

Zinkham (1961) descobriram que indivíduos com eritrócitos sensitivos à primaquina tinham deficiência de atividade de G6PD no cristalino. Orzalesi e outros (1981) descobriram que a deficiência G6PD era significativamente mais frequente entre 210 pacientes masculinos de catarata na Sardenha do que em 672 sujeitos de controle. Esse era particularmente o caso de catarata pré-senil. Também na Sardenha, entretanto, Meloni e outros (1990) descobriram que pacientes com catarata tinham frequências de deficiência de G6PD não diferente da população em geral. Ferraris e outros (1988) examinaram a hipótese de existir uma correlação negativa entre a deficiência de G6PD e malignidade hematológica. A frequência da deficiência em G6PD em 481 homens sardenhos com malignidade hematológica não era significativamente diferente no grupo de controle com 16.219 indivíduos. Similarmente, nenhuma diferença foi encontrada na frequência da expressão do gene Gd(B) em mulheres com desordens hematológicas clonais e heterozigotos saudáveis. Não havia evidência de que a G6PD proporciona um efeito protetor contra o desenvolvimento de malignidade hematológica.

Por uso de provas de quatorze sequências únicas e 18 enzimas de restrição, D’Urso e outros (1988) descobriram uma mutação de silenciamento polimórfica no gene G6PD. Um sítio PstI que mapeia no éxon 10 era monomórfico em todos os sujeitos britânicos e italianos estudados, mas era polimórfico em pessoas do leste da Africa. Especificamente, estava ausente de 22% dos cromossomos X nigerianos. Por análises de sequência, D’Urso e outros (1988) mostraram que a ausência desse sítio PstI resultou de uma substituição de G para A na posição 1116, correspondento à terceira base do códon da glutamina. Nenhuma mudança no aminoácido foi gerada na proteína. Yoshida e outros (1988) relataram dois RFLPs (polimorfismos na lente do fragmento de restrição PMID: 20027468) no lócus da G6PD com alta frequência em negros e mostraram um desequilíbrio estatísticamente significativo de ligação entre os tipos A(+)/B(+) e um dos dos RFLPs no lócus da G6PD.

[Obs.: RFLPs são os polimorfismos encontrados nos fragmentos de DNA cortados pelas enzimas de restrição.
Os RFLPs referem-se a diferenças entre duas ou mais amostras de moléculas de DNA homólogas que emergem de sítios de restrição em diferentes locais, sendo uma técnica laboratorial pela qual os segmentos podem ser distinguidos. Na análise de RFLP a amostra de DNA é quebrada em pedaços (digerida) por enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são separados de acordo com suas lentes (superfícies) por eletroforese de gel. Embora obsoleto atualmente, as análises de RFLP foram a primeira técnica de sondagem de DNA suficientemente não dispendiosa para ter difundida aplicação.
Exemplo:
Existem dois mecanismos comuns pelos quais o tamanho de um fragmento de restrição particular pode variar. Um pequeno segmento do genoma pode ser detectado por uma prova de DNA. No alelo “A” o genoma é clivado por uma enzima de restrição em três sítios vizinhos, mas somente o fragmento mais correspondente será detectado pela prova. Em um alelo “a”, o sítio de restrição 2 pode ter sido perdido por uma mutação, então a prova agora detectará um fragmento mais comprido entre os sítios de restrição de 1 a 3 correspondente aos dois fragmentos fundidos.
http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_fragment_length_polymorphism]

Vulliamy e outros (1988) descobriram um predomínio notório de transições de C para T entre as mutações no gene G6PD, com duplas GC envolvidas em quatro dos sete casos. Encontrou-se que, ainda na mesma população, mais de uma variante da G6PD está presente. Por exemplo, na Ilha da Sardenha, estudos clínicos e bioquímicos extensivos identificaram quatro variantes diferentes da G6PD. De Vita e outros (1989) clonaram e sequenciaram as quatro variantes da G6PD e descobriram que somente duas mutações haviam ao nível molecular. A primeira mutação tinha uma mudança de ácido aspártico para histidina na posição 282, resultado de uma alteração de GAT para CAT no éxon oito. Essa mutação causava o fenótipo de tipo G6PD Seattle (http://en.wikipedia.org/wiki/Seattle), uma forma relativamente branda de deficiência da G6PD. As outras três variantes eram acompanhadas de deficiência muito severa da G6PD. Todas as três tinham uma mudança de serina para fenilalanina no aminoácido 188, resultante de uma transição de TCC para TTC. Essa é a mesma alteração da G6PD no Mediterrâneo.Essas três variantes Sardenhas também tinham uma mutação silenciosa no éxon 11 com uma mudança de TAC para TAT, ambas das quais codificam tirosina no aminoácido 437. Esses achados indicam que algumas variantes da deficiência em G6PD identificadas somente com base em suas características bioquímicas podem não corresponder a mutações diferenciais no gene G6PD. As variações podem ser devidas a modificações pós-transcrição ou modificações pós-tradução da enzima; se as modificações forem devidas a mutações em um gene rigorosamente ligado ou a mudanças fisiológicas não herdadas poderiam não ser distinguidas com os dados disponíveis. Estudos de famílias nas quais formas diferentes de G6PD do Mediterrâneo segregam sugeriram que as características bioquímicas são transmitidas na família junto com a deficiência da enzima, favorecendo assim a primeira hipótese. Em um estudo de amostra não selecionada de 1.524 meninos em idade escolar da província de Matera (Lucânia) no sul da Itália, Calabro e outros (1990) descobriram que embora a forma mais freqüente da deficiência em G6PD fosse a da G6PD do Mediterrâneo, um numero extraordinário de outras formas existe.A taxa total da deficiência em G6PD era de 2,6%. A frequência alternava de 7,2% na costa Ioniana (http://en.wikipedia.org/wiki/Ionian_sea) para zero no lado leste dos Apeninos Lucanianos (sul da Itália). Chiu e outros (1993) relataram a caracterização molecular de defeitos em 43 homens chineses deficientes em G6PD cujas G6PDs foram bem caracterizadas bioquímicamente. Entre as 43 amostras, eles identificaram cinco diferentes substituições de nucleotídos: no cDNA a posição 1388 mudou de G para A (de arg para his); no cDNA a posição 1376 mudou de G para T (de arg para leu); no cDNA a posição 1024 mudou de C para T (de leu para phe); no cDNA a posição 392 mudou de G para T (gly para Val); e no cDNA a posição 95 mudou de A para G (de his para arg). As cinco substituições causaram 36 das 43 amostras; nenhuma dessas substituições tinha sido relatada em não asiáticos. As substituições no cDNA 392 e no cDNA 1024 eram novos achados. As substituições no cDNA 1376 e 1388 ocorriam em para mais da metade das amostras.

Chen e outros (1991) determinaram a sequência de 20.114 pares de bases do DNA humano incluindo o gene G6PD. A região incluía uma proeminente ilha CpG, iniciando a 680 nucleotídeos a montante do sítio de iniciação da transcrição, extendendo-se por 1.050 nucleotídeos abaixo do sítio de iniciação e terminando no início do primeiro íntron. A região transcrita a partir do sítio de iniciação até o sítio de adição do caule de poli-adenina cobria 15.860 pares de bases. A sequência dos 13 éxons coincide com a sequência editada do cDNA e, para os onze éxons testados, com a sequencia correspondente em um cromossomo artificial de levedura (YAC). Dezesseis sequências Alu faziam parte de 24% do total da sequência. Quatro estavam fora das bordas do transcrito do gene em mRNA ; todas as outras foram encontradas em um grande íntron de 9.858 pares de base entre os exons 2 e 3.

Dados das frequências de variantes alélicas do gene foram tabelados por Roychoudhury e Nei (1988).

As variantes da G6PD tem sido divididas em cinco classes de acordo com o nível de atividade da enzima. Elas são: classe 1) deficiência da enzima com anemia hemolítica não esferocítica; classe 2) severa deficiência da enzima (menos de 10%); classe 3) moderada a branda deficiência da enzima (de 10% a 60%); classe 4) deficiência muito branda ou nenhuma (60%); classe 5) aumento da atividade da enzima. As substituições de nucleotídeos conhecidas são dadas a seguir. Mutações que causam anemia hemolítica não esferocíticas estão agrupadas perto do final carboxila da enzima, na região entre os aminoácidos de 362 a 446, enquanto a maioria das mutações clinicamente brandas estão localizadas no final amina da molécula. Como defeitos intragênicos foram identificados, muitas variantes que foram pensadas como únicas tem sido encontradas como idênticas em análises sequenciais. Esses achados não seriam surpreendedores, visto que como os métodos de caracterização bioquímica não são muito precisos particularmente quando tratam de enzimas mutantes que são instáveis. Por exemplo, embora os pacientes não fossem parentes, a G6PD Marion, a G6PD Gastonia, e a G6PD Minnesota tinham a mesma substituição da valina 213 para leucina; e a G6PD Nashville e a G6PD de Anaheim foram achadas com a mesma substituição da arginina 393 para histidina (Beutler e outros, 1991).

Costa e outros (2000) ressaltaram que mutantes G6PD causando variantes de classe 1 (a mais severa forma da doença) agrupa-se dentro do éxon 10, em uma região que, ao nível da proteína, acredita-se estar envolvido na dimerização. Eles identificaram uma variante de classe I mapeada no éxon 8.

Kay e outros (1992) analisaram a evolução do gene G6PD pelo exame de amostras de DNA de 54 homens afro-americanos quanto a polimorfismos no íntron 5 (PvuII), no nucleotídeo 1311, e no nucleotídeo 116 para G6PD A+, G6PD A- e G6PD B. Eles concluíram a partir delas (amostras) e de seus estudos prévios que a G6PD B é o genótipo mais antígo. A mutação no nucleotídeo 1211, com sua distribuição espalhada no mundo, provavelmente ocorreu depois. A mutação PstI, limitada aos africanos, provavelmente surgiu depois e é mais antiga do que as mutações no alelo A+, o qual ocorreu em um gene sem as mutações PstI e 1311. A G6PD A- (da alanina 202 à glicina 376) é a mutação mais recente e ainda está em desequilíbrio de ligação (relação entre sítios próximos herdados) com todos os outos sítios. Provavelmente ela ocorreu em um indivíduo com ambas as mutações A+ e PvuII.

Vulliamy e outros (1993) tabelaram 58 mutações diferentes no gene G6PD que contabilizam para 97 variantes nomeadas da G6PD. As mutações eram quase exclusivamente mutações de sentido trocado, causando substituições de um único aminoácido. Eles eram espalhadas através da região codificadora do gene, embora parecessem ser um conjunto de mutações que causavam o fenótipo clínico mais severo junto à ponta 3 do final do gene. A ausência de grandes deleções, mutações na sequencia de leitura, e mutações sem sentido foi considerada consistente com a noção de que a falta total da atividade da G6PD seria letal.

Beutler (1994) ressaltaram que 35 anos antes, William Demshek, o primeiro editor do jornal emergente ‘Blood”, o havia convidado para escrever uma revisão sobre ‘O Efeito Hemolítico da Primaquina e Componentes Relacionados’ (Beutler, 1959). Nesta revisão, Beutler tentou colocar em perspectiva o que foi aprendido no intervalo de 35 anos e ensinar sobre o que ainda precisava ser apredido. Ele proporcionou uma tabulação compreensiva daquelas variantes G6PD que foram caracterizadas no nível do DNA bem como informação sobre a distribuição populacional das mutações comuns da G6PD. Ele ressaltou que a mais perigosa consequência da deficiência da G6PD é a icterícia neonatal. Icterícia nuclear [icterícia associada a altos níveis de bilirrubina não-conjugada. Stedman] tem sido registrada repetidamente em populações nas quais as variantes de classe 2 são comuns e é uma forma importante de evitar o retardo mental. A Fototerapia [terapia com raios luminosos. Stedman] tem sido usada para reduzir os níveis da bilirrubina e o fenobarbitol tem sido usado profilaticamente com algum sucesso.

Ninfali e outros (1995) estudou a expressão da G6PD nos músculos em indivíduos normais e em pessoas com deficiência em G6PD de três tipos. Eles estavam dispostos a experimentar esses estudos por causa de pacientes com sintomas tais como mialgia (dor muscular), câimbra, fraqueza muscular sob condições de estresse, particularmente esforço físico. Todas as variantes: Mediterrânica, tipo Seattle, e G6PD A-, mostraram defeito da enzima no músculo. Uma relação estatisticamente significativa foi encontrada na atividade da G6PD nos eritrócitos e músculos de pessoas do sexo masculino. Os resultados sugeriram aos autores que, para uma dada variante, a extensão do defeito da enzima no músculo pode ser determinada a partir da atividade da G6PD dos eritrócitos, usando uma equação da qual elas derivaram.

O peixe-bola Fugu rubripes (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/25/Fugu_in_Tank.jpg) é um modelo útil para estudo comparativo de genomas de vertebrados devido à natureza compacta de seu genoma. Sendo o genoma do Fugu aproximadamente 8 vezes menor do que o dos mamíferos, a maioria dos genes deveria ser mais compacta. Para testar esta hipótese, Mason e outros (1995) clonaram e sequenciaram o gene G6PD do Fugu e o compararam com o gene correspondente humano. A estrutura intron/exon dos dois genes era idêntica através das regiões codificadoras da proteína. O íntron 2 também é o íntron mais largo em ambas as espécies. Entretanto, eles encontraram que o gene do Fugu é quatro vezes menor do que o gene humano; a diferença foi explicada pelo fato de o gene do peixe-bola ter íntrons menores. Mason e outros (1995) construíram uma filogenia molecular para sequências de dez proteínas G6PD. As sequências caíram no arranjo esperado baseado no relacionamento filogenético estabelecido, com a sequência do Plasmódium falciparum divergindo mais amplamente. (PMID: 7607684)

A G6PD Hektoen (outra variante) é caracterizada pelo aumento da atividade da enzima nas células vermelhas. Ela é, por isso, a variante G6PD da classe cinco. Ela foi descrita primeiro por Dern e outros (1969). Yoshida (1970) pensou que o peptídeo variante tivesse substituição de histidina por tirosina. Mais tarde, Yoshida (1996) estava incerto sobre sua conclusão e estabelecou os defeitos básicos que restavam a ser identificados.

Miwa e Fujii (1996) listaram as mutações responsáveis por aproximadamente 78 variantes da G6PD. Eles estabeleceram que estimadamente 400 milhões de pessoas em todo o mundo tenham deficiência de G6PD associada com anemía hemolítica crônica e/ou ataque hemolítico agudo induzido por droga ou infecção. Estudos moleculares desvendaram que a maioria das variantes da G6PD de classe um com hemólise crônica tem mutações rodeando tanto o substrato ou o sítio de ligação a NADP.

Filosa e outros (1996) analisaram células do sangue fracionadas em quatro heterozigotos para mutações de classe um da G6PD, G6PD Portici e G6PD Bari. Nas linhagens celulares eritróides, mielóides e linfóides havia um significativo excesso de células normais em G6PD, sugerindo que um mecanismo seletivo opera ao nível das células-tronco pluripotentes do sangue. Eles concluíram que seus estudos proporcionam evidência de que a deficiência severa da G6PD afeta adversamente a proliferação ou sobrevivência das células nucleadas do sangue.

Mason (1996) revisou informações recentes sobre a enzima G6PD e sobre mutações no gene. Um mapa de 515 aminoácidos mostrando a localização das mutações, incluindo duplas mutações, foi elaborado.

Liu e outros (1997) relatou um método de determinação da clonalidade usando PCR específico do alelo (ASPCR) para detectar polimorfismos exônicos na p55 [omim 305360, Xq28 – Ela tem um domínio SH3 e está localizado numa ilha CpG de 30 quilobases na extremidade 3 do gene do fator VIII da coagulação. A proteína é expressada em grande quantidade nas células eritróides durante seu desenvolvimento de células tronco até se tornarem plenamente em reticulócitos e isso sugere que a p55 tenha funções de gene de manutenção. (Obs.: reticulócito é a hemácia jovem mais abundante durante o processo de regeneração ativa do sangue. Stedman)] e na G6PD. Eles demonstraram uma significativa diferença sexual na frequência dos alelos em afro-americanos mas não em caucasianos, e um desequilíbrio de ligação (relação entre lócus sintênicos próximos o suficiente para que os respectivos alelos não sejam herdados de maneira independente pela prole. Stedman) para os alelos p55 e G6PD em caucasianos mas não em afro-americanos.

Cocco e outros (1998) relataram um estudo de mortalidade de um grupo de 1.756 homens com deficiência da G6PD identiicados durante a sondagem de uma população de 1981 na Sardenha e acompanhados durante o período de primeiro de janeiro de 1982 até 31 de dezembro de 1992. Medidas dos resultados foram padronizadas segundo a causa específica na razão da mortalidade (SMRs), as quais foram computadas como 100 vezes a razão observada sobre a esperada, com a população geral de homens da Sardenha como referência. Mortes de toda natureza estavam significativamente menos presentes do que o esperado devido ao decréscimo das SMRs (Padronização da Taxa de Mortalidade) para para doença isquêmica do coração, doença cerebrovascular, e cirrose hepática, a qual explicou 95,6% do déficit na mortalidade total. Toda a mortalidade por câncer estava próxima da expectativa, com um aumento significativo do SMR para linfoma não Hodgkin. O aumento da mortalidade de linfoma não Hodgkin e decréscimo na mortalidade por cirrose hepática eram novas observações. O decréscimo na mortalidade por doença cardiovascular pode estar baseado na seleção tendenciosa pois a sondagem da população não foi aleatória mas baseada em voluntários, os quais podiam ser mais preocupados do que o comum a respeito de sua saúde.

Puck e Willard (1998) revisaram o mecanismo para o padrão distorcido de inativação do cromossomo X em fêmeas heterozigotas para características ligadas ao X. Sua figura 1 diagramou três diferentes mecanismos para um padrão extremamente desbalanceado do mosaicismo das células somáticos em mulheres após a inativação do X. Luzzatto e Martini (1998) notaram que ao menos um possível exemplo de cada um dos três mecanismos que trabalham em diferentes mulheres com deficiência da G6PD pode ser indicado. O primeiro mecanismo (o extremo fina de uma distribuição normal curva após a inativação inadvertida do X) foi considerada a mais simples para os valores da G6PD na amplitude completa da deficiência relatada por Rinaldi e outros (1976) em aproximadamente 1% das heterozigotas confirmadas geneticamente para a defciêcia de G6PD da variante do Mediterrâneo.O segundo mecanismo poderia ser chamado ‘seleção somática após a inativação do X’. Luzzatto e Martini (1998) preferiam esse termo à ‘inativação do X não aleatória’ porque, de fato, a inativação do X por si mesmo é contudo aleatória. Esse mecanismo foi bem caracterizado (Filosa e outros, 1996) em muitas mães heterozigotas de pacientes com anemia hemolítica não esferocítica crônica devido à deficiênca da G6PD. Aqui, a seleção afeta células hematopoiéticas de modo que é análogo ao que acontece com as células linfóides em síndromes de imunodeficiência. Como para o terceiro mecanismo, a G6PD Ilesha (outra variante) foi observada por Luzzatto e outros (1979) em uma família na qual todas as mulheres heterozigotas tinha uma padrão de inativação do X extremamente desbalanceado, o qual poderia não ter resultado da seleção contra as células com o G6Pd Ilesha, pois em alguns membros da família, o desbalanceamento favorecia o cromossomo X como o alelo G6PD normal, enquanto em outros membros, ele favorecia o cromossomo X como alelo 6PD Ilesha. Embora ao tempo da reportagem a explicação favorecida fosse a seleção de células que expressavam um alelo secretável de outros genes ligados ao X, poderia ter havido um defeito no processo de inativação do X nessa família. Já que o transcrito específico do gene da inativação do X (XIST, omim 314670) mapeia em Xq13 e a G6PD em Xq28, poder-se-ia predizer uma chance eventual de recombinação, em conformidade com o que foi observado na família com a mutação G6PD Ilesha.

Vulliamy e outros (1998) determinaram a mutação causativa em 12 casos de deficiência em G6PD associada com anemia hemolítica não esferocítica. Em 11 casos, a mutação que eles acharam tinha sido previamente relatada em indivíduos não aparentados. Essas mutações compreendiam sete diferentes mutações de sentido trocado e uma deleção de 24 pares de base, G6PD Nara, previamente encontrada em um menino japonês. Achados repetidos das mesmas mutações sugerem que um número limitado de troca de aminoácidos pode produzir o fenótipo da anemia hemolítica não esferocítica e ser compatível com o desenvolvimento normal. Eles encontraram uma nova mutação, a G6PD Serres.

Cappadoro e outros (1998) descobriram que com cinco linhagens diferentes de Plasmodium falciparum, não havia diferença significativa em sua invasão ou amadurecimento quando os parasitas estivessem crescendo em seus eritrócitos normais ou deficientes em G6PD (variante mediterrânea). Com todas essas linhagens e em diferentes estágios de maturação, eles não foram capazes de detectar nenhuma diferença na quantidade de mRNA de G6PD específico com relação ao P.falciparum em eritrócitos normais versus eritrócitos deficientes parasitados. Em contraste, em estudos sobre a fagocitose de eritrócitos com parasita por monócitos aderentes humanos, eles encontraram que quando os parasitas estavam no estágio circular (anel), eritrócitos deficientes parasitados no estágio circular eram fagocitados 2,3 vezes mais intensamente do que os eritrócitos normais parasitados no estágio circular, enquanto não havia diferença quando o parasita estivesse no estágio mais maduro trofozoíta [forma amebóide, vegetativa e assexuada de determinados Sporozoea, como o esquinozonte dos plasmódios da malária e parasitas relacionados. Stedman], isto é, eritrócitos parasitados no estágio trofozoíta. O nível de glutationa reduzida [que atua como doadora de hidrogênio. A deficiência de glutationa pode causar hemólise com estresse oxidativo. Stedman] era notavelmente mais baixo em eritrócitos deficienntes no estágio circular em comparação com os eritrócitos normais no mesmo estágio. Cappadoro e outros (1998) concluíram que a redução da defesa anti-oxidante nos eritrócitos deficientes parasitados no estágio circular poderia ser responsável pelo dano na membrana seguido da fagocitose. Porque os eritrócitos parasitados no estágio circular, ao contrário dos parasitados no estágio trofozoíta, não são tóxicos para os fagócitos, o aumento da remoção dos eritrócitos parasitados no estágio circular por fagocitose reduziria a maturação dos eritrócitos parasitados no estágio trofozoíta e para esquizonte [trofozoíta de esporozoário que se reproduz por esquizogonia (fissão múltipla em que o núcleo se divide em primeiro lugar, e, a seguir, a célula se divide em tantas partes quantos forem os núcleos) formando um número variado de trofozoítas ou merozoítas. Stedman] e pode ser um mecanismo altamente eficiente da resistência à malária em sujeitos deficientes.

Notaro e outros (2000) mostraram que uma análise evolucionária é a chave para o entendimento da biologia de um gene de manutenção como o G6PD. A partir do alinhamento da sequência de aminoácidos de 52 espécies de G6PD de 42 organismos diferentes, eles encontraram uma notória correlação entre as substituições de aminoácidos que causam a deficiência da G6PD em humanos e a conservação da sequência do G6PD. Dois terços dessas substituições foram encontradas em aminoácidos altamente e moderadamente conservados (de 50 a 99%); relativamente poucas foram localizadas em aminoácidos completamente conservados (onde seria letal) ou em aminoácidos pobremente conservados (onde provavelmente eles simplesmente não causariam deficiência em G6PD). Os achados foram considerados consistentes com a noção de que todos os mutantes humanos tinham uma atividade enzimática residual e que as mutações nulas são letais am algum estágio do desenvolvimento. A comparação da distribuição de mutações em genes humanos de manutenção com a conservação evolutica é uma ferramente útil para localizar aminoácidos residuais importantes para a estabilidade ou função da proteína correspondente.

As frequências de alelos com baixa atividade de G6PD em humanos estão altamente correlacionadas com a prevalência da malária. Esses alelos são considerados por proporcionar um risco reduzido para a infecção pelo parasita Plasmódium e são mantidos em alta frequência a despeito da doença que causam. A análise do haplótipo (constituição genética em relação a um dos dois alelos; os indivíduos são do mesmo haplótipo se trazem um alelo igual e são do mesmo genótipo se têm os dois alelos iguais. Stedman) das mutações A e Mediterrânica (Med) nesse lócus indica que eles evoluíram independentemente e tem aumentado em frequência em uma taxa que é muito rápida para ser explicada por deriva genética aleatória. Tishkoff e outros (2001) usaram modelo estatístico para demonstrar que o alelo A emergiu entre 3.840 a 11.760 anos atrás e que o alelo Med surgiu dentro de 1600 a 6640 anos atrás. Tishkoff e outros (2001) concluíu que seus resultados sustentam a hipótese de que a malária tenha sido o maior impacto nos humanos somente a partir da introdução da agricultura nos últimos 10.000 anos e proporciona um extraordinário exemplo da assinatura da seleção sobre o genoma humano.

Em comparação com neonatos normais, neonates deficientes em G6PD experimentam um aumento de duas vezes na prevalência de uma significativa hiperbilirrubinemia requerendo fototerapia. Kappas e outros (2001) testaram a eficácia de uma única dose de SN-mesoporfirina intramuscular, um potente inibidor da atividade da heme oxigenase, na melhora da icterícia em recém-nascidos deficientes em G6PD na Grécia. Quando comparados com controles não tratados e um grupo de recém-nascidos com G6PD normal, uma única dose de SN-mesoporfirina alterou a concentração de bilirrubina no plasma do pico para valores mais baixos, mesmo em relação aos neonatos normais, e eliminou inteiramente a necessidade da fototerapia.

Kwok e outros (2002) descreveram um banco de dados de mutações da G6PD disponível na Web. As bases de dados relacionadas integram até o presente dados mutacionais e estruturais de vários bancos de dados com variantes caracterizadas bioquimicamente e suas associações a fenótipos obtidas de literatura pulicada e de um site sobre Favismo na Web.

Barisic e outros (2005) identificaram cinco mutações diferentes no gene G6PD em vinte e quatro homens não aparentados com deficiência em G6PD da região da Dalmácia no sul da Croácia. As variantes incluíam Cosenza (37,5% dos pacientes), Mediterrânea (16,6%), Seattle (12,5%), Union (12,5%), Cassano (4,2%) e uma variante nova, chamada G6PD Split (4,2%). As variantes em três pacientes (12,5%) não tinham caracterização.

Ninokata e outros (2006) identificaram a deficiência em G6PD em 9,8% dos homens e 10,4% das mulheres entre 345 adultos saudáveis na ilha de Phuket no sul da Tailândia. Embora nenhum dos indivíduos tivesse evidência molecular de infecção por malária, os achados sugerem que a malária endêmica tenha ocorrido no passado e que a deficiência em G6PD foi mantida como um traço geneticamente vantajoso nessa população. Ao menos cinco variantes da G6PD foram identificadas, sugerindo que vários grupos étnicos Asiáticos, tais como Birmaneses, Laosianos, Cambojanos, Taitianos, e Chineses, participaram no estabelecimento de uma identidade étnica corrente na população de Phuket (na Tailândia).

Jiang e outros (2006) identificaram 14 mutações diferentes no gene G6PD entre 1.004 indivíduos chineses deficientes em G6PD compreendendo 11 grupos étnicos. As variantes variavam em frequência através dos grupos étnicos e correlacionava-se geograficamente com padrões históricos da malária. As variantes eram diferentes daquelas relatadas nas populações Africana, Européia e Índia. As variantes mais comuns na população chinese eram a G6PD Kaiping, e G6PD Canton, compreendendo mais de 60% dos indivíduos deficientes em G6PD, e a G6PD Gaohe. Estudos de expressão funciona in vitro em E.coli mostraram significativa redução da atividade enzimática em todas as três proteínas mutantes. Todas as três variantes mostraram Km diminuído para G6P, mas enquanto as variantes Canton e Kaiping tinham Km aumentado para HADP+, a variante Gaohe mostrou Km diminuído para NADP+, provavelmente refletindo a compensasão na última variante. Jiang e outros (2006) concluíram que os resíduos afg459 e arg463 atuam num papel importante no ancoramento da NADP+ ao domínio catalítico da enzima.

Em estudos em células endoteliais da artéria coronariana humana e na aorta bovina, Leopold e outros (2007) demonstraram que a aldosterona diminuía a expressão e atividade da G6PD, resultando num aumento do estresse oxidativo e diminuídos níveis de óxido nítrico, similar ao que é observado nas células endoteliais deficientes em G6PD. A aldosterona diminuía a expressão da G6PD pelo aumento da expressão do elemento modulador da resposta de cAMP (CREM; omim 123812) , dessa forma inibindo a transcrição da G6PD mediada pela proteína de ligação ao elemento de resposta a cAMP (CREB; omim 123810). A infusão de aldosterona in vivo em camundongos diminuiu a expressão da G6PD vascular e enfraqueceu a reatividade vascular, esses efeitos foram abolidos por espironolactona [diurético que bloqueia as ações tubulares da aldosterona. Stedman] ou transferência genética vascular de G6pd. Leopold e outros (2007) concluíram que a aldosterona induz o fenótipo deficiente em G6PD a debilitar a função endotelial.

Cappellini e Fioreli (2008) proporcionaram uma revisão da deficiência em G6PD.

[OBS.: CREM: 10p12.1-p11. CREM é um gene multi-exônico que codifica ambos os ativadores e antagonistas da transcrição indutível por cAMP por splicing diferenciado. As variantes de Splice com função antagonista carecem de dois domínios ricos em glutamina e bloqueiam a transcrição induzida por cAMP, enquanto uma isoforma que inclui esses domínios ricos em glutamina é o ativador transcricional (Molina e outros, 1993).
CREM is a multiexonic gene that encodes both activators and antagonists of cAMP-inducible transcription by differential splicing. Splice variants with antagonistic function lack 2 glutamine-rich domains and block cAMP-induced transcription, whereas an isoform that includes these glutamine-rich domains is a transcriptional activator (Molina et al., 1993).
From a mouse pituitary cDNA library, Foulkes et al. (1991) isolated a protein highly homologous to nuclear factor CREB (123810), an activator of cAMP-responsive promoter elements (CREs). Unlike CREB, which is expressed uniformly in several cell types, the CREM gene showed cell-specific expression. Downstream of the stop codon was a second out-of-frame DNA-binding domain. Foulkes et al. (1991) identified 3 mRNA isoforms that appeared to be formed through differential cell-specific splicing. In contrast to CREB, CREM acts as a down-regulator of cAMP-induced transcription.
Foulkes e outros (1991) isolaram uma proteína altamente homóloga ao fator nuclear CREB (omim 123810), um ativador dos elementos promotores responsivos a cAMP, de uma biblioteca de cDNA pituritário de camundongo. [Obs.: CREBBP – 600140 – Quando os níveis celulares de cAMP aumentam, uma cascata de eventos leva à indução de genes que contém elementos regulatórios em cis chamados elementos de resposta a cAMP (CREs). Níveis elevados de cAMP causam a estimulação e a translocação nuclear da proteína cinase A (PKA, veja omim 176911), a qual ativa o fator de transcrição CREB (proteína de ligação a CRE; veja 123810) pela fosforilação em seu resíduo de serina 133 (Gonzalez e Montminy, 1989)] Diferentemente de CREB, a qual é expressada uniformemente em vários tipos de células, o gene CREM mostrou expressão específica nas células. Abaixo (a jusante) dp códom de finalização estava um segundo domínio de ligação a DNA fora da sequencia. Foulkes e outros (1991) identificaram três isoformas de mRNA que pareciam ser formadas através de splicing específico em diferentes células. Em contraste com a CREB, a CREM atua como um regulador negativo da transcrição induzida por cAMP.

Usando análises EMSA, Solomou e outros (2001) mostraram que enquanto as células T estimuladas de indivíduos normais tinham ligação de CREB fosforilada aumentada para o sítio 180 do promotor na interleucina 2 (IL-2), quase todas as células T estimuladas de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico tinham ligação aumentada primariamente da CREM fosforilada neste sítio e no sítio de co-ativadores transcricionais CREBBP (omim 600140) e EP300 (omim 602700). A expressão aumentada da CREM fosforilada correlacionava-se com a produção diminuída da IL2. Solomou e outros (2001) concluíram que a repressão transcricional é responsável pela produção diminuída de IL2 e anergia nas células T no lúpus eritematoso sistêmico. ]

MODELO ANIMAL

Lee e outros (1981) observaram a heterozigosidade da G6PD em lebres fêmeas. Stockam e outros (1994) observaram a deficiência da G6PD causandora da anemia heemolítica persistente e hiperbilirrubinemia em um cavalo americano Saddlebred (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/9b/American_Saddlebred3.jpg). A fêmea tinha anomalias consistentes com a heterozigosidade.

Longo e outros (2002) cruzaram camundongos quiméricos de células tronco embrionárias nas quais o gene G6PD tinha sido alvejado com fêmeas normais. A primeira geração de heterozigotos em G6PD nascida desse cruzamento era essencialmente normal; seus tecidos demonstraram forte seleção para células com o gene G6pd alvejado no cormossomo X inativo. Quando essa primeira geração de fêmeas heterozigotas foi acasalada com machos normais, somente os camundongos G6pd normais nasceram. Havia três razões para isso: o desenvolvimento dos embriões machos homozigotos para G6pd foi embargado a partir do sétimo dia embrionário e meio, o momento do estabelecimento da circulação sanguínea, e eles morreram no décimo dia embrionário e meio; fêmeas heterozigotas G6pd mostraram anomalias a partir do oitavo dia e meio e faleceram pelo décimo primeiro dia e meio; a severas mudanças patológicas estavam presentes na placenta de duas homozigotas G6pd e nos embriões heterozigotos. Assim, a G6PD não é indispensável para o desenvolvimento embrionário inicial, entretanto, a severa deficiência na G6PD em tecidos extra-embrionários (consequencia da inativação seletiva do alelo G6PD paternal normal) debilita o desenvolvimento da placenta e causa a morte do embrião. Mais importante, a G6PD é indispensável para a sobrevivência quando o embrião está exposto ao oxigênio através de seu suprimento de sangue.

Em experimentos de reperfusão na isquemia [obs.: deve ser o retorno do sangue pelo vaso entupido que provocou a isquemia] em corações de camundongos isolados, Jain e outros (2004) demonstraram que a G6pd é rapidamente ativada sem uma mudança nos níveis da proteína G6pd. Corações G6pd -/- tinham grandiosa debilidade no desenpenho do relaxamento e contração cardíacos, associados com a depleção dos estoques totais de glutationa e geração menor de glutationa reduzida, comparados com corações de tipo selvagem. O aumento da injúria de reperfusão isquêmica for revertido pelo tratamento com antioxidantes mas não foi afetado pela suplementação de estoques de ribose. Jain e outros (2004) concluíram que a G6PD é uma enzima anti-oxidante essencial para o miocárdio, requerida para a manutenção dos níveis celulares de glutationa e proteção contra disfunção cardíaca induzida por estresse oxidativo durante a reperfusão isquêmica.

Fonte:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=305900