*190010 RECEPTOR DE TRANSFERRINA; TFRC
RECEPTOR DE TRANSFERRINA 1; TFR1TFRTRFRCD71

Lócus do gene mapeado 3q29

CLONAGEM

Um anticorpo monoclonal, OKT-9, reconhece um antígeno ubiquamente distribuído na superfície celular de células humanas em ativo crescimento. Ele é uma glicoproteína composta de cadeias polipeptídicas ligadas por dissulfeto, cada uma com 90.000 daltons de peso molecular.

A imunoprecipitação do antígeno de OKT-9 na presença de transferrina etiquetada resulta na precipitação específica da transferrina (Sutherland e outros, 1981), assim, o antígeno de OKT-9 é presumivelmente o receptor de transferrina. Nikinmaa e Schroder (1987) concluíram que a p90 e a TFRC são a mesma proteína: estudos usando anticorpos monoclonais indicaram que a precipitação exaustiva de lisados radioativamente etiquetados com um anticorpo removeu toda a atividade dos lisados com o outro (anticorpo). Mapas de peptídeos de antígenos reconhecidos com ambos os anticorpos mostraram grande similaridade e indicaram que ambos os anticorpos reagem com o mesmo antígeno, o receptor de transferrina humana, mas com diferentes sítios antigênicos da molécula.

FUNÇÃO DO GENE

Casey e outros (1988) analisaram a regulação pelo ferro do gene TFRC por exame de células do camundongo transformadas com construções quiméricas contendo o promotor do gene do receptor da transferrina humana e tanto o gene estrutural para a acetiltransferase cloranfenicol bacteriana quanto o cDNA do TFRC humano. Eles concluíram que ao menos dois elementos genéticos, um na extremidade 5 e outro na extremidade 3 do gene, estavam envolvidos na regulação do gene do receptor de transferrina pelo ferro.

Radoshitzky e outros (2007) demonstraram uma associação de alta afinidade entre o TFR1 e a glicoproteína de entrada do vírus Machupo (um arenavírus do Novo Mundo). [Obs.: Arenavírus é um gênero de vírus. As espécies do tipo são vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV); também estão incluídas as espécies responsáveis pela febre Lassa (febre hemorrágica viral). Vistos em secção transversal, eles mostram partículas granulosas que são ribossomos adquiridos de suas células hospedeiras. É por essa característica que ganharam seu nome, Arena vêm do latim significando areia. Wikipédia.] A expressão do TRF1 humano, mas não a do TFR2 humano (omim 604720), em linhagens de células de ramster, aumentou marcadamente a infecção de viroses pseudotipadas com a glicoproteína dos vírus Machupo, Guanarito e Junin, mas não as da febre Lassa ou das viroses de coriomeningite linfocítica. Um anticorpo anti-TFR1 inibiu eficientemente a replicação das viroses Machupo, Guanarito, Junin e Sabiá, mas não a do vírus Lassa. A depleção (falta) de ferro no meio de cultura aumentou, e a suplementação de ferro diminuiu, a eficiência da infecção pelos pseudovírus Junin e Machupo, mas não pelos pseudovírus Lassa. Radoshitzky e outros (2007) concluíram que o TFR1 é um receptor para as arenaviroses da febre hemorrágica do Novo Mundo.

Ishii e outros (2009) descobriram que a redução de Ppargc1b (omim 608886) [ 5q33

Por busca genômica em bancos de dados com a sequencia da Pcg1 do camundongo (PPARGC1A; omim 604517) como uma pergunta, Lin e outros (2002) identificaram um gene homólogo do camundongo, chamado Ppargc1b. O Ppargc1b codifica uma proteína prevista em 1.014 aminoácidos, e o homem e o camundongo compartilham 70% de identidade na sequência de aminoácidos da PPAGC1B. A Pargc1b contém três motivos LXXLL (Leu-Xaa-Xaa-Leu-Leu , uma sequencia de ligação multifuncional na regulação da transcrição, dois domínios acídicos ricos em ácido glutâmico/aspártico, um sítio de ligação para o fator de célula hospedeira (HCF1; omim 300019)


[OBS.: HCF1 - Frattini e outros (1996) descobriram que o gene mapeia na região sintênica (correspondente à humana) Xq28 em como nos humanos, está em estreita proximidade com o gene da proteína de ligação à renina, em uma região de 100 quilobases que também inclui os genes da L1cam e do receptor de vasopressina de tipo 2.

Wilson e outros (1995) descobriram que os transcritos de HCF e a proteína são mais abundantes em tecidos fetais e da placenta e linhagens celulares, sugerindo um papel na proliferação celular. Em adultos, a proteína HCF é abundante nos rins, mas não no cérebro, um sítio de infecção latente do vírus herpes simples (HSV) e um sítio onde os níveis de HCF podem influenciar na progressão da infecção por HSV.]

,e um motivo de reconhecimento de RNA no terminal C. Análises de Northern blot mostraram expressão abundante dos transcritos de Ppargc1b de 9 e 5 quilobases no tecido adiposo marrom e no coração, e moderada expressão no músculo esquelético, fígado e tecido adiposo branco.
Kressler e outros (2002) usaram PCR-RT para amplificar a lente total do PPARGC1B, ao qual eles se referiram como PERC (coativador do receptor de estrogênio relacionado a PGC-1), em células HeLa. O PPARGC1B codifica uma proteína de 1.023 aminoácidos com as mesmas características estruturais da Ppargc1b (do camundongo fica com letra minúscula porque não é humana), relatada por Lin e outros (2002), e uma isoforma menor carecendo de 39 aminoácidos (os resíduos de 156 a 194). Análises de imunofluorescência mostraram que a PPARGC1B localiza-se no núcleo. Análises de PCR-RT da Ppargc1b do camundongo mostraram expressão abundante da isoforma maior no coração, no músculo esquelético, níveis intermediários no cérebro, rins, fígado e glândulas adrenais, e níveis baixos no ovário, intestino, e tecido adiposo branco.]

em osteoclastos primários do camundongo diminuiu sua diferenciação e biogênese mitocondrial. A expressão do receptor de transferrina foi induzida nos osteoclastos por via da proteína 2 regulatória do ferro (IREB2; omim 147582), e a captura do ferro por meio do Tfrc promoveu a diferenciação do osteoclasto e a atividade de reabsorção do osso, a qual está associada com a indução da respiração mitocondrial, produção de espécies reativas de oxigênio, e transcrição acelerada da Ppargc1b. A quelação (despolarização? – quelação é a formação de um complexo envolvendo um íon metálico e dois ou mais grupamentos polares de uma única molécula, assim, no heme, o íon Fe2+ é quelado pelo anel de porfirina) do ferro inibiu a reabsorção osteoclástica do osso e protegeu os camundongos fêmea contra a perda óssea seguida de deficiência de estrogênio resultante da ovariectomia. Ishi e outros (2009) concluíram que a biogênese mitocôndria, a qual é induzida pela PPARGC1B e suportada pela captura de ferro por meio do TFRC para utilização pelas proteínas respiratórias da mitocôndria, é fundamental para a ativação do osteoclasto e metabolismo do osso. [Obs. O osteoclasto remove o tecido do osso e o osteoblasto forma o osso.]


MAPEAMENTO

Por estudos de células somáticas híbridas, Goodfellow e outros (1982) assinaram o lócus do TFR no cromossomo 3. Miller e outros (1983) confirmaram a assinatura no cromossomo 3, especificamente em 3q22-qter. Por hibridização em sítio, Rabin e outros (1985) restringiram a assinatura a 3q26.2-qter. Adriaansen e outros (1990) confirmaram a assinatura no cromossomo 3 por estudo em células somáticas híbridas. Usando análises de ligação, células somáticas híbridas e painéis de mapeamento de radiação híbrida, e fluorescência em sítio de hibridização, Kashuba e outros (1997) refinaram a localização do gene TFRC em 3q29.

Valenzuela e outros (1991) descobriram associação altamente significativa entre fenótipos de Rh (omim 111700) e a capacidade total de ligação do ferro, isto é, da transferrina. Criancas com a especificidade RhC tinham valores mais altos do que indivíduos não C ou c. Valenzuela e outros (1991) sugeriram que esse achado pode ser significativo em relação à manutenção do polimorfismo do Rh e incompatibilidade fetomaternal.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Os atletas, tais como cliclistas, algumas vezes usam a eritropoietina, que foi oficialmente incluída na lista de substâncias banidas do Comitê Olímpico Internacional desde 1990, como uma droga estimulante. Gareau e outros (1994) apresentaram evidência de que o nível de receptores de transferrina no sangue pode ser usado como meio de detecção de uso inapropriado de Epo.

MODELO ANIMAL

Levy e outros (1999) romperam o gene do receptor de transferrina, o qual eles chamaram Trfr, nos camundongos. Os camundongos mutantes homozigotos não foram viáveis além dos 12 dias e meio de vida e tiveram anemia severa com hidropsia (acúmulo de líquido aquoso e claro em qualquer um dos tecidos ou cavidades do corpo) bem como anomalias neurológicas difusas. Havia alguma variação no estabelecimento da anemia severa, e nos embriões não anêmicos sem edema e necrose tecidual (E9,5), ambos o estresse da eritropoese e anormalidades neurológicas eram aparentes. Os autores concluíram que o ferro inadequado levava à apoptose dos neurônios, mas que os tecidos outros que não os eritrócitos e os neurônios podem obter ferro suficiente para crescer e desenvolver através de mecanismos independentes do ciclo da transferrina. A haploinsuficiência (insuficiência única) do receptor de transferrina resultou em eritrócitos microcíticos e hipocrômicos; os valores normais de hemoglobina (proteína respiratória vermelha das hemáceas que é liberada no sangue quando ocorre hemólise, morte, rompimento das hemáceas) e hematócrito (fração de hemáceas por volume de sangue) eram devidos ao aumento compensatório no número de células. Embora a saturação do ferro da transferina no soro fosse indistinguível da dos camundongos de tipo selvagem, os heterozigotos tinham significativamente menos ferro nos tecidos.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=190010

*117700 CERULOPLASMINA; CP

Título Alternativo; símbolo

FERROXIDASE

Lócus do gene mapeado 3q23-24

TEXTO

DESCRIÇÃO

A ceruloplasmina (também conhecida como ferroxidase; ferro (II):oxigênio oxido-redutase, é uma glicoproteína alfa 2 azul que se liga a 90 a 95% do cobre do plasma e tem de 6 a 7 íons cúpricos (cobre bivalente) por molécula. Ela está envolvida na peroxidação da ferro (II) transferrina para formar a ferro (III) transferrina, Como a transferrina (TF omim 190000) [a transferrina é uma globulina beta 1 não hêmica do plasma que tem a capacidade de associar-se de modo reversível com até 1,25 nanogramas de ferro por grama e que atua como proteína de transporte de ferro. Stedman], a ceruloplasmina é uma metaloproteína do plasma.

CLONAGEM

A ceruloplasmina humana é composta de uma única cadeia polipeptídica de 1.046 aminoácidos com uma massa molecular de 132 quilo-dáltons (Takahashi e outros, 1984). Koschinsky e outros (1986) relataram a sequência nucleotídica do cDNA da pré-cerulopasmina humana. O mRNA do fígado humano foi achado com o tamanho de 3.700 nucleotídeos. A homologia seqüencial com o fator VIII foi demonstrada. A proteína é sintetizada nos hepatócitos e secretada no soro com cobre incorporado durante a biossíntese. A falência em incorporar cobre durante a síntese resulta na secreção de uma apoproteína desprovida de cobre, chamada apoceruloplasmina (Culotta e Gitlin, 2001).

Yang e outros (1990) demonstraram duas formas de CP que diferenciavam-se pela presence ou ausência de 12 bases de nucleotídeos codificadoras de uma sequencia deduzida em gli-glu-tyr-pro (glicina, ácido glutâmico, tirosina e prolina) na região terminal em carboxila da molécula. O splicing alternativo foi a explicação aparente, e a expressão diferenciada dos dois transcritos em tecidos diferentes com a produção de isoformas a partir de um único gene foi demonstrada.
Klomp e Gitlin (1996) analisaram a expressão do gene da ceruloplasmina no cérebro. A hibridização em sítio usando clones de DNA de ceruloplasmina revelou a expressão abundante em populações específicas de células da glia dentro da microvasculatura do cérebro, envolvendo neurônios dopaminérgicos (que produzem dopamina) melanizados na substância negra (uma região dentro do mesencéfalo), e dentro da camada nuclear da retina.

ESTRUTURA DO GENE

Daimon e outros (1995) determinaram que o gene da ceruloplasmina contém 19 éxons e se expande por aproximadamente 50 quilobases.

FUNÇÃO DO GENE

Klomp e Gitlin (1996) concluíram que a expressão do gene específico das células gliais é essencial para a homeostase do ferro e a sobrevivência do neurônio no sistema nervoso central.
Indivíduos com deficiência hereditária de ceruloplasmina tem profunda acumulação de ferro na maioria dos tecidos, sugerindo que a ceruloplasmina é importante para a liberação normal do ferro celular (Mukhopadhyay e outros, 1998).

MAPEAMENTO

Weitkamp (1983) descobriu um lod score (logaritmo decádico das chances a favor da ligação genética) de pico de 3,5 no ângulo aproximado de 0,15 para ligação da ceruloplasmina à transferrina, a qual está localizada em 3q21. A homologia argúi sobre essa ligação; A transferrina e a ceruloplasmina são ligadas, no gado, num lod score de 11,3 em freqüência de 20% de recombinação em progenitores (Larsen, 1977 – Sobre Relações de Conexão do Polimorfismo da ceruloplasmina no Gado.)

Riddell e outros (1987) identificaram um pseudogene da ceruloplasmina no cromossomo 8. Koschinsky e outros (1987) isolaram um gene processado para a ceruloplasmina humana e o mapearam no cromossomo 8 por hibridização de células somáticas. Wang e outros (1988) além disso localizaram o pseudogene processado em 8q21,13q23 por hibridização em sítio. Eles ressaltaram que, como todos os outros pseudogenes descritos até então, o gene está localizado num cromossomo diferente do gene parentado.

GENÉTICA MOLECULAR

Shreffler e outros, 1967, identificaram ao menos três variantes determiadas por alelos co-dominantes por eletroforese de gel de amido. Mohrenweiser e Decker (1982) identificaram mais várias variantes eletroforéticas da ceruloplasmina.

Em um paciente japonês relatado por Miyajima e outros (1987) como um caso de deficiência familiar de apoceruloplasmina, Harris e outros (1995) identificaram uma mutação no gene da ceruloplasmina. A análise de Southern blot do DNA do paciente foi normal, mas a amplificação por PCR de 18 dos 19 éxons que compõem o gene da ceruloplasmina mostraram uma diferença de tamanho no éxon 7. O seqüenciamento desse éxon revelou uma inserção de 5 pares de base a no aminoácido 410, resultando em uma mudança de sequencia de leitura e uma sequência aberta de leitura truncada após o aminoácido 445. A filha do paciente era heterozigota para a inserção dos cinco pares de base.

Em uma família japonesa relatada por Morita e outros (1992), Yoshida e outros (1995) demonstraram uma mutação homozigota no gene da ceruloplasmina em quatro irmãs com aceruloplasminemia, três delas apresentavam desordens extrapiramidais, ataxia [incapacidade de coordenar a atividade muscular durante o movimento voluntário; causada com mais freqüência por distúrbios do cerebelo ou das colunas posteriores da medula espinhal. Stedman] cerebelar, demência progressiva e diabetis melitus.

Em um paciente com deficiência hereditária de ceruloplasmina caracterizada por hemossiderose sistêmica [acúmulo de hemossiderina (proteína insolúvel amarelo-ouro produzida pela digestão fagocítica da hematina; encontrada na maioria dos tecidos, especialmente no fígado, baço e medula óssea, sob a forma de grânulos muito maiores do que as moléculas de ferritina {das quais se acredita sejam agregados}, porém com teor mais elevado de ferro)], diabetes mellitus, degeneração do pigmento da retina, e anomalias neurológicas, Okamoto e outros (1996) relataram uma nova mutação homozigota, uma inserção da base adenina na posição 184, que produziu um códon finalizador prematuro.

Nos parentes relatados por Takahashi e outros (1996), uma substituição de G para A foi identificada no éxon 15 do gene da ceruloplasmina, resultando em uma mutação sem sentido no aminoácido 858 (triptofano 858 para ter [terminal?]). A mutação homozigota foi encontrada no probando sintomático de 45 anos de idade bem como em seus irmãos mais jovens assintomáticos. Assim, os autores acharam que a aceruloplasminemia parece ser uma causa genérica do diabetis e de doenças neurológicas.

Nos dois irmãos relatados por Logan e outros (1994), Harris e outros (1996) encontraram homozgosidade para a deleção de um único par de bases (guanina 2389) no éxon 13 do gene da ceruloplasmina. A sequencia de nucleotídeos que envolve o sítio dessa deleção (TGGAGA) correspondia à sequencia consenso ‘ponto quente’ para deleções de nucleotídeo (Krawczak e Cooper, 1991). A deleção do nucleotídeos resultou em uma mutação sem sentido com a alteração de 11 aminoácidos e um códon finalizador prematuro no códon 789.

Os dados das freqüências de variantes alélicas do gene foram tabulados por Rovchoudhury e Nei (1988).

EVOLUÇÃO

Aduplicação interna é um método de evolução do genoma ilustrado pela ceruloplasmina (Dwulet e Putnam, 19881). A partir da homologia interna da estrutura dos aminoácidos, Takahashi e outros (1983) concluíram que a molécula ceruloplasmina evoluiu por triplicação em tandem (repetida uma atrás da outra na fita) de genes ancestrais. A partir de uma busca computadorizada da sequência de aminoácidos da proteína em bancos de dados da Fundação Nacional de Pesquisas Biomédicas, Church e outros (1984) descobriram a evidência de que o fator V (omim 612309), o fator VIII (306700) e a ceruloplasmina podem ter tido uma origem evolutiva comum.

MODELO ANIMAL

Para elucidar o papel da ceruloplasmina na homeostase do ferro, Harris e outros (1999) criaram um modelo animar de aceruloplasminemia por rompimento do gene murino Cp (ceruloplasmina do camundongo). Embora normais no nascimento, os camundongos Cp-/- demonstraram progressiva acumulação de ferro tal que por um ano de idade todos os animais tinham uma elevação proeminente de ceratina no soro e conteúdo de ferro aumentado de três a seis vezes no fígado e no baço. Análises histológicas de tecidos afetados nesses camundongos mostraram abundante estoque de ferro dentro das células reticuloendoteliais e nos hepatócitos. Estudos de ferro-cinética em camundongos Cp+/+ e Cp -/- revelaram taxas equivalentes de absorção de ferro e retorno/volume de ferro ao/no plasma, sugerindo que a acumulação do ferro resulta da compartimentalização alterada dentro do ciclo do ferro. Consistentemente com este conceito, os camundongos Cp-/- não mostraram anormalidades na captura celular do ferro mas uma impressionante diminuição no movimento do ferro fora das células reticuloendotelias e dos hepatócitos. Os achados demonstraram um papel fisiológico essencial para a ceruloplasmina na determinação da taxa de efluxo do ferro com estoques de ferro mobilizáveis.

Os mecanismos da homeostase do ferro na retina e no cérebro tornaram-se sujeitos de grande interesse após a descoberta dos elevados níveis de ferro nos cérebros de pacientes com Alzheimer (omim 104300) e nas retinas de pacientes com degeneração da mácula relacionada com a idade (omim 603167). Para determinar se a ceruloplasmina e sua homóloga hephestina (HEPH, omim 300167) são importantes para a homeostase do ferro na retina, Hahn e outros (2004) estudaram retinas de camundongos deficientes em ceruloplasmina e/ou hefestina. Em camundongos normais, a Cp e a Heph loccalizaram-se no epitélio pigmentado retinal e na glia de Muller, uma barreira cerebral do sangue. Camundongos deficientes em ambas a Cp e a Heph, mas não cada uma individualmente, tinham um impressionante aumento de ferro no epitélio pigmentado retinal dependente da idade e na retina. A proteína de estocagem de ferro Ferritina (veja 134790) também foi aumentada nas duas retinas nulas. Após os níveis de ferro na retina terem aumentado, os camundongos nulos para Ep e Heph tiveram hipertrofia do epitélio pigmentado retinal dependente da idade, hipoplasia, e morte, degeneração do foto-receptor, e neovascularização sub-retinal, proporcionando um modelo de algumas características das doenças aceruloplasmênicas retinais humanas, e degeneração macular relacionada com a idade. Essas mudanças patológicas indicaram que a ceruloplasmina e a hefestina são críticas para a homeostase do ferro no sistema nervoso central e que a perda de ambas no camundongo leva à neurodegeneração da retina dependente da idade, proporcionando um modelo que pode ser usado para testar a eficácia terapêutica de quelantes do ferro e agentes anti-angiogênicos.

Stasi e outros (2007) descobriram que o mRNA da Cp e a proteína Cp eram sobre-reguladas nas retinas com glaucoma em camundongos DBA/2. A sobre-regulação da Cp ocorreu aproximadamente no tempo de morte extensiva das células dos gânglios retinais )RGC) e aumentou com o aumento da idade nas retinas mas não nos cérebros dos animais. Nenhuma sobre-regulação da Cp relacionada com a idade foi detectada com referência às linhagens normais de camundongos (C57BL/6), as quais puderam desenvolver significativa perda de RGC (célula do gânglio retinal) não glaucomatosa no final do mesmo estado de tempo. A sobre-regulação da Cp também foi detectada na maioria dos olhos de pacientes com glaucoma. A sobre-regulaçao da Cp foi localizada nas células de Muller dentro das retinas e na área de limite interno da membrana. Stasi e outros (2007) concluíram que o tempo dessa sobre-regulação sugeria que ela possa representar uma mudança reativa da retina em resposta à estímulos nocivos ou à morte das células dos gânglios retinais. Stasi e outros (2007) hipotetizaram que tal sobre-regulação da ceruloplasmina deve representar um mecanismo de proteção dentro da retina.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=117700

Mucopolissacaridose VII Felina devida à deficiência em beta-glucuronidase.

Um gato macho de 12 a 14 semanas de idade tinha dificuldade de andar e o abdômen alargado. A deformação facial, patas roliças, córnea sombria, granulação dos neurófilos, linfócitos vacuolados, e um teste positivo para glicosaminoglicanos na urina sugeriram mucopolissacaridose. Fibroblastos cultivados incorporaram 35SO4 nos mucopolissacarídeos mais ativamente do que os fibroblastos de um felino de controle, e a degradação foi de longe inferior. A atividade da beta-glucuronidase estava ausente nos leucócitos e marcadamente reduzida nos fibroblastos, estabelecendo assim o diagnóstico da mucopolissacaridose VII (deficiência em beta-glucuronidase) esfingolipídeos (qualquer lipídeo contendo uma base de cadeia longa semelhante à da esfingosina – por exemplo, ceramidas, cerebrosídeos, gangliosídeos, esfingomielinas. Stedman) estocadas na forma de corpos “zebra” foram vistos nas células dos gânglios do sistema nervoso central e nas células da musculatura lisa dos vasos sanguíneos. Este caso representa outro modelo animal de mucopolissacaridose VII com as características completas da doença conhecida em pacientes humanos.

PMID: 7941232
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7941232?ordinalpos=102&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_Default
ReportPanel.Pubmed_RVDocSum

Células Plasmáticas Vacuoladas: Ultra Distribuição da Acido Fosfatase e Imunoglobulinas Intracelulares.

Em dois casos de células plasmáticas vacuoladas, um dos quais foi associado com macroglobulinemia primária e o outro com mieloma múltiplo da cadeia kappa Bence Jones, nós examinamos as características imunopatológicas dos vacúolos no intuito de saber se o sistema secretor de Ig ou o sistema do lisossomo é de importância no processo de formação do vacúolo. Estudos com imunofluorescência não detectaram Igs nos vacúolos. A detecção de Ig intracelular através da técnica de microscopia imunoeletrônica revelou que as Ig estavam localizadas somente numa pequena porção dos vacúolos mas não na maioria deles. Ainda quando as Igs estavam incluídas nos vacúolos, somente o conteúdo dos vacúolos eram positivos para Igs mas suas membranas demarcadas eram negativas para Ig. Em contraste, estudos de microscopia eletrônica da atividade da ácido fosfatase revelou a presença de sua atividade em todos os vacúolos. Esses achados sugerem que o sistema lisossômico, mas não o sistema secretório de Ig pode atuar num papel principal na vacuolação dessas células de mieloma.
PMID: 2502893
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2502893?ordinalpos=132&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum

*602702 MANNOSE 6-PHOSPHATE RECEPTOR-BINDING PROTEIN 1; M6PRBP1

Símbolos alternativos
MPR-BINDING PROTEIN, 47-KDMPR TAIL-INTERACTING PROTEIN, 47-KD; TIP47

Gene mapeado no loculs 19p13.3

CLONAGEM

Os receptores de manose com fosfato no carbono 6 (MPRs) transportam hidrolases do lisossomo recém sintetizadas do Golgi para os pré-lisossomos e então retornam ao Golgi por outra rota de transporte. Usando análises de leveduras duplamente híbridas para identificar proteínas que interagem com domínios citoplasmáticos de MPR independente de cátion [ (IGF2R; 147280; 6q26– O fator 2 de crescimento similar a insulina (147470) é um hormônio polipeptídico com homologia estrutural com a insulina e o fator I de crescimento de tipo insulina. Embora o Fator II de crescimento de tipo insulina possa estimular uma grande escala de respostas biológicas em células isoladas, essas respostas parecem ser mediadas pelos receptores de insulina e de Fator I de crescimento de tipo insulina (147670 e 47370). O receptor para o Fator II de crescimento tipo insulina foi apanhado também como receptor de manose com fosfato no carbono 6 (manose 6-fosfato), o qual está implicado em mirar enzimas do lisossomo (Mac Donald e outros, 1988; Roth, 1988; Tong e outros, 1988). Receptores de Fator 2 de crescimento tipo insulina (IGF2R) purificados, humanos e de rato, interagem com anticorpos para o receptor de manose 6-fosfato e com a manose 6-fosfato.
Em comparação com a estrutura relatada do IGF2R (Morgan e outros, 1987), o MPRI (receptor de manose 6-fosfato independente de cátion) mostrou 99,8% de identidade ao nível de nucleotídeo e 99,4% de identidade ao nível de aminoácido. Por seqüenciamento de cDNA, Laureys e outros (1988) mostraram que o receptor de manose 6-fosfato e o receptor de Fator II de crescimento de tipo(similar a)insulina são idênticos. ] e do receptor de manose 6-fosfato dependente de cátion (12p13), MPR (M6PR; omim 154450), Diaz e Pfeffer (1998) clonaram a TIP47. A proteína deduzida contém 434 aminoácidos. Análises de Imunomanchas mostraram que ela (MIP47) tem uma massa molecular aparente de 47 quilo-dáltons.

FUNÇÃO DO GENE

Dias e Pfeffer (1998) mostraram que a TIP47 ligou-se seletivamente aos domínios citoplasmáticos de ambos os MPRs independente e dependente de cátion. A TIP47 estava presente no citosol e nos endossomos e foi requerida para o transporte pelos MPR a partir dos endossomos à rede do Golgi que opera em trans in vitro e in vivo. A TIP47 reconheceu um sinal de fenilalanina/triptofanp no caule do MPR dependente de cátion essencial para seu próprio destinamento dentro da via endossômica. Esses dados sugerem que a TIP47 liga-se aos domínios citoplasmáticos dos MPR e facilita sua coleta para dentro das vesículas de transporte destinadas para o Golgi.

A TIP47 reconhece os domínios citoplasmátics dos MPRs e é requerida para o transporte do endossomo ao Golgi. Carrol e outros (2001) demonstraram que a TIP47 liga-se diretamente à RAB9 GTPase [omim 300284- Xp22.2 – As proteínas RAB são GTPases que regulam o tráfego de vesículas e residem em compartimentos intracelulares específicos. A RAB9 tem sido localizada em componentes da via endocítica/exocítica e tem sido implicada na reciclagem dos receperores de membrana, tais como o receptor de manose 6-fosfato, dos endossomos primários à rede trans do Golgi] em sua conformação ativa e ligada a GTP. Além disso, a RAB9 aumenta da afinidade da TIP47 para sua carga (o que ela carrega). Um sítio funcional de ligação a RAB9 foi requerid para a estimulação do transporte do MRP pela TIP47 in vivo. Assim, Carroll e outros (2001) concluíram que a seleção citosólica da entrega da carga pode ser o recrutamento seletivamente em uma organela específica, e uma voluntariedade da vesícula deve estar acoplada à presença de uma RAB GTPase ativa.

Aivazian e outros (2006) geraram uma quimera de RAB5(omim179512)/RAB9, a qual pode ligar-se a ambos os efetores RAB5 e RAB9, e uma quimera de RAB1 (omim179508/RAB9, a qual pode ligar-se a amos os efetores RAB1 e RAB9, e examinaram o papel da ligação dos efetores na localização da RAB. Em ambos os casos, a alteração da concentração celular do efetor de RAB9, TIP47, moveu uma fração das proteínas de sua localização parental enquanto RAB para a de RAB9. Eles concluíram que as proteínas efetoras e as RABs dependem umas nas outras para atingir o correto estado estável de suas localizações.

Por análises de mutação e de imuno-manchas, Lopez-Verges e outros (2006) descobriram que a TIP 47 atuou como um indexador entre as proteínas Gag e Env do vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1 pela ligação ao domínio de matriz de Gag e ao caule citoplasmático da sub-unidade transmembrana pg41 da proteína Env. O silenciamento da TIP47 diminuiu a incorporação da Env em partículas da Gag bem como a infectividade do HIV-1, e aboliu a co-imunoprecipotação de Gag e Env. Em contraste, a expressão de TIP47 para mais aumentou a incorporação da Env para dentro dos vírions.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=602702

RECEPTOR DE VITAMINA D

O receptor de Calcitriol, também conhecido como receptor de Vitamina D (VDR) e NR1I1 (membro 1, grupo 1, da sub-família 1 de receptores nucleares), é um membro da família de receptores de hormônios esteróides entre os receptores nucleares. Na ativação pela vitamina D, o VDR forma um heterodímero com o receptor X de retinóide e liga-se aos elementos responsivos ao hormônio no DNA resultando na expressão ou trans-repressão de produtos gênicos específicos.

Os glucocorticóides são conhecidos por diminuir a expressão de VDR, o qual é expressado na maioria dos tecidos do corpo. Sua função melhor conhecida é a regulação do transporte intestinal de cálcio.

Esse gene (VDR) codifica o receptor de hormônio nuclear para a vitamina D3. Este receptor também funciona como um receptor para o ácido litocólico, um ácido secundário da bile. O receptor pertence à família dos fatores regulatórios transcricionais de ação trans e apresenta similaridade de sequência com os receptores de hormônios esteróides e da tiróide. Alvos (sequencias) desses receptores nucleares de hormônios a jusante estão envolvidas principalmente no metabolismo mineral, embora o receptor regule uma variedade e outras vias metabólicas, tais como aquelas envolvidas na resposta imune e no câncer. Mutações neste gene estão associadas com o raquitismo de resistência à vitamina D. Um polimorfismo de um só nucleotídeo no códon de iniciação resulta em uma um sítio de iniciação de tradução alternado em três códons abaixo. O splicing alternativo resulta em múltiplas variantes do transcrito codificando a mesma proteína.

http://bioisolutions.blogspot.com/2009/02/vitamin-d-receptor-molecular-surface.html

RECEPTOR DE VITAMINA D
VDR

Gene mapeado em 12q12-q14

Usando análises de micro-rede de DNA e PCR quantitativo, Liu e outros (2006) descobriram que a ativação do TLR2 (omim 603028) e do TLR1 (omim 601194) por um ligante de micobactéria regulou para mais a expressão do VDR e de CYP27B1 [citocromo p450; omim 609506], a vitamina D hidroxilase 1 que catalisa a conversão da vitamina D em sua forma ativa, em monócitos e macrófagos, mas não nas células dendríticas. Análises de citometria de fluxo e PCR quantitativo mostraram que o tratamento dos monócitos com vitamina D regulou para mais a expressão do CYP24 [citocromo P450 (CYP24A1; omim 126065)], a vitamina D hidroxilase 24 e da catelicidina (CAMP; omim 600474 – A proteína animicrobiana catelicidina é uma proteína antimicrobiana encontrada em grânulos específicos de leucócitos polimorfonucleares (PMNs).), um peptídeo antimicrobiano, mas não a DEFB4 [omim 602215 – Defensina – As defensinas são uma família de pequenos (3 a 4 quilodáltons) de peptídeos catiônicos exibindo amplo espectro de atividade antimicrobiana contra bactérias e fungos. As defensinas são divididas em alfa e beta defensinas baseado no relacionamento da sequência de seis resíduos de cisteína conservados. As defensinas alfa humanas de HNP1 (omim 125220) a HNP4 são estocadas nos grânulos azurofil dos leucócitos fagocíticos atuando no papel da ingestão de micro-organismos, enquanto as defensinas alfa HD5 e HD6 são expressadas nas células epiteliais do intestino delgado. As defensinas beta 1 (DEFB1; omim 602056) aparecem a partir do padrão de expressão do gene estar envolvido na defesa antimicrobiana do epitélio de superfície tais como o do trato respiratório, trato urnário e vagina. A DEFB1 tem sido implicada na patogênese da fibrose cística.] A microscopia confocal demonstrou a colocalização da CAMP com vacúolos contendo bactérias de monócitos tratados com vitamina D, e o tratamento de macrófagos infectadaos com M. tuberculosis com vitamina D reduziu o número de bacilos vivedouros. A estimulação dos TLR2 e TLR1 com ligantes regulou o CYP24 e a CAMP para mais na presença de soro humano, mas não de soro bovino, e a regulação da CAMP para mais foi mais eficiente em soro de Caucasianos do que no de Afro-americanos, no qual os níveis de vitamina D eram significativamente mais baixos. A suplementação de vitamina D no soro dos Afro-americanos reverteu o defeito na indução de CAMP. Liu e outros (2006) propuseram que a suplementação da vitamina D nas populações africana e asiática, as quais podem ter uma capacidade reduzida de sintetizar a vitamina D a partir dos raios ultra-violeta e da luz solar, deverá ser uma intervenção efetiva e de baixo custo para aumentar a imunidade inata contra a infecção microbiana e a doença neoplásica.
…

O metabólito ativo da vitamina D, 1,25(OH)2D3, modula a resposta immune nas doenças relacionadas com a célula T helper. Usando um modelo experimental de asma alérgica, Wittke e outros (2004) descobriram que, aparte da regulação de dois genes relacionados com a célula T helper 2 (Th2) para mais, a 1,25(OH)2D3 não afetou a severidade da asma em camundongos selvagens. Camundongos deficientes em Vdr induzidos à asma, entretanto, falharam em desenvolver a inflamação aérea, hiper-sensitividade aérea, ou eosinofilia [eosinofilia pulmonar simples são infiltrados pulmonares acompanhados de eosinofilia sanguínea; frequentemente assintomática; a maioria dos casos é devida a helmintíases, e alguns casos ocorrem por administração de drogas. Stedman], a despeito da alta concentração de IgE e elevadas citocinas de Th2 (linfócito que gera os linfócitos B). Wittke e outros (2004) sugeriram que o sistema endócrino da vitamina D tem um papel importante no desenvolvimento da inflamação dirigida por Th2 nos pulmões.
…

Yu e Cantorna (2008) mostraram que camundongos carentes do Vdr têm células T matadoras naturais invariantes (iNKT) intrinsecamente defeituosas e em número reduzido com respostas diminuídas para as galactosilceramidas alfa apresentadas no contexto da CD1d [(omim 188410 - A CD1D é o único membro do grupo 2 da família CD1 de glicoproteínas semelhantes a complexo maior de histocompatiilidade (MHC).

Balk e outros (1994) descobriram que a CD1D, a qual é um ligante para as células T CD8+, está expressada na superfície das células epiteliais intestinais (IECs) como uma proteína de 37 quilo-dáltons que é independente da microglobulina beta 2 (B2M; omim 109700), com nenhum carbohidrato ligado na ponta N.

Em uma revisão da apresentação de antígeno lipídico pela CD1, Park e Bendelac (2000) estabeleceram que o principal sub-grupo de células T associado com a CD1D é a célula T matadora natural (NK), a qual expressa um receptor de célula T (TCR) feito de um TCRA (omim 186880 – sub-unidade alfa do receptor de antígeno de célula T) invariante associado com diversas cadeias V-beta-11 (veja TCRB, omim 186930). Esse TCR reconhece uma família conservada de glicolipídeos, alfa-galactosilceramida, uma forma da qual é prognosticada por existir em hospedeiros mamíferos. Essas células NKT são ativas no diabetes auto-imune (veja omim 605026 e 2221000), rejeição tumoral, e algumas infecções microbianas.]. Essas células iNKT também apresentam maturação defeituosa e reduzida expressão no timo de CD1d, e carecem da expressão de Tbet [ omim 604895 – As células T auxiliares novas (Th naive) diferenciam-se e dois sub-grupos, Th1 e Th2, cada um com distintas funções e perfil de citocinas. A TBX21 é um fator de transcrição de Box T que controla a expressão da principal citocina da Th1, o interferon gama (IFNG; omim 147570) (Szabo e outros, 2000)] , mas não da CD122 (IL2RB; omim 146710 – receptor beta de interleucina 2).

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=601769

Desafios no Desenvolvimento de uma Vacina para o HIV-1

Dan H. Barouch
2 October 2008

RESUMO

O desevolvimento de uma vacina segura e efetiva para o HIV-1 é uma prioridade criticamente importante para a saúde global. A despeito dos avanços recentes em nosso entendimento da patogênese e imunidade do HIV-1, entretanto, os principais obstáculos científicos permanecem. O modelo de vacinas anti-HIV-1 candidatas visando a elicitação das respostas humoral e imune falharam até agora em proteger contra a infecção por HIV-1 ou reduzir a carga viral após a infecção em estudos de eficácia clínica. Um compromisso renovado e coordenado com as pesquisas de descobrimento básico, estudos pré-clínicos e testes clínicos serão, por isso, necessários para suplantar as barreiras faceando correntemente este campo. Aqui, eu revisei os desafios chave e prospecções futuras na questão do desenvolvimento de uma vacina profilática para o HIV-1.

INTRODUÇÃO

Já faz 25 anos desde que o HIV-1 foi identificado como o agente causador da AIDS. Mais de sessenta milhões de pessoas em todo o mundo foram infectadas com o HIV-1, a maioria no mundo em desenvolvimento, e perto da metade desses indivíduos faleceram. O desenvolvimento de uma vacina segura e efetiva seria indubitavelmente a melhor solução para o controle final da pandemia de AIDS no mundo inteiro, porém, desafortunadamente, os esforços para o desenvolvimento de uma vacina para o HIV-1 ainda não se provaram prósperos. A extraordinária diversidade do HIV-1, a capacidade do vírus de evadir-se às respostas imunes adaptativas, a incapacidade de induzir completamente/amplamente a resposta de anticorpos reativos, o precoce estabelecimento de reservatórios virais latentes, e a falta de correlatos imunes claros de proteção representam desafios não precedentes para o desenvolvimento de uma vacina.

O objetivo de uma vacina para o HIV-1 seria tanto prevenir a infecção ou reduzir a carga viral e a progressão clínica da doença após a infecção. Uma vacina ideal bloquearia completamente a infecção e proporcionaria a imunidade esterilizante. Embora tal vacina fosse ótima, essa grau de proteção não foi alcançado ainda com as a maioria das vacinas clinicamente licenciadas. Em contraste, a maioria das vacinas virais licenciadas parecem funcionar por controle da replicação viral sub-clínica e por prevenir contra a doença clínica. Pode ser por isso mais sensato desenvolver-se uma vacina sub-ótima para o HIV-1 do que falhar em prevenir a infecção mas proporcionar um controle imune parcial da replicação viral após a infecção. Este controle parcial, como exemplificado por uma redução no pico e no ponto de estabelecimento da carga viral após a infecção, tem sido demonstrado em certos estudos pré-clínicos por vacinas que elicitam as respostas dos linfócitos T. Além disso, porque a carga viral representa um determinante principal da transmissão do HIV-1, é concebível que uma vacina parcialmente protetora deva ter um impacto substancial no nível de população.

A despeito da necessidade urgente de uma vacina para o HIV-1, somente dois conceitos vacinais completaram os estudos clínicos de sua eficácia, até o momento. O primeiro conceito de vacina usou a proteína gp120 monomérica da ENV (gp120 + gp41) do HIV-1 , e o objetivo dessa estratégia foi induzir respostas imunes humorais específicas para ENV. Na fase inicial dos testes clínicos, os imunógenos de gp120 elicitaram anticorpos de ligação específica ao tipo, mas falharam em induzir anticorpos neutralizantes amplamente reativos. Em dois testes de eficácia de fase 3 pela companhia de biotecnologia VaxGen, essas vacinas candidatas não forneceram eficácia protetora detectável, indicando que essas respostas de anticorpos específicas para o tipo eram insuficientes para proteger contra a infecção por HIV-1 em humanos. Outro estudo de fase 3 avaliando a eficácia de um regime vacinal de estímulo com vetor de canaripox recombinante com a proteína gp120 está correntemente a caminho. O segundo conceito de vacina que completou os estudos de eficácia clínica envolveu vetores recombinantes do adenovírus de sorotipo 5 (rAd5) incompetentes para replicação expressando Gag, Pol e Nef do HIV-1. O objetivo dessa estratégia era elicitar as respostas imunes celulares específicas para o HIV-1. Os testes clínicos de fases iniciais demonstraram que vacinas baseadas no vetor rAd5 elicitaram as respostas imunes celulares na maioria dos sujeitados, embora essas respostas fossem parcialmente suprimidas em indivíduos com anticorpos neutralizantes específicos para o Ad5 pré-existentes. Os testes de eficácia de fase 2b subvencionados pela Merck e pelos Instituto Nacional de Saúde (NIH) foram finalizados desafortunadamente quando as primeiras análises interinas planejadas mostraram que essa vacina falhava em proteger contra a infecção ou em reduzir a carga viral após a infecção, e que os vacinados que tinham previamente anticorpos neutralizantes específicos para Adr5 exibiram uma taxa aumentada de aquisição de HIV-1. Esses resultados têm ilustrado novos desafios e tem levado ao debate substancial com relação ao caminho optimal a seguir no campo da vacina contra o HIV-1.

DESAFIOS VIROLÓGICOS E IMUNOLÓGICOS

Os desafios para o desenvolvimento de uma vacina profilática contra o HIV-1 não têm precedentes. A extraordinária diversidade do HIV-1 no mundo representa talvez a maior barreira. Guiados pela propensão ao erro da transcriptase reversa, o grupo M do HIV-1 tem-se diversificado em nove clados divergentes , bem como em múltiplas formas recombinantes em circulação. As sequencias de aminoácidos de Env podem divergir em mais de 20% dentro de uma classe particular e mais de 35% entre classes diferentes. Um imunógeno vacinal precisará, por isso, combater extraordinariamente um alto grau de diversidade viral, e a proteção vacinal será necessariamente dependente da capacidade das respostas imunes em reagir em cruzamento com viroses altamente heterogêneas. Embora as respostas imunes humoral e celular de reação cruzada contra regiões conservadas do vírus tenham sido relatadas, é razoável assumir que a eficácia protetora diminuirá substancialmente com o aumento da divergência entre antígenos vacinais e viroses infectantes.

Outro desafio chave é a falta de correlatos de eliminação imune de proteção em humanos, pois os pacientes infectados por HIV-1 são incapazes de erradicar o vírus. Uma evidência sugestiva com relação a correlatos imunes de proteção deverão ser obtidos a partir dos estudos de desafio viral em primatas não-humanos e a partir de estudos de indivíduos infectados com HIV-1 que controlam a replicação viral em níveis muito baixos espontaneamente. Entretant, um correlato imune definitivo de proteção emergirá provavelmente somente no contexto de estudos exitosos de eficácia vacinal em humanos.


A Resposta Humoral Específica para o HIV-1

Títulos (padrão de concentração)de anticorpos neutralizantes específicos para o vírus representam um correlato imune chave de proteção para a maioria das vacinas virais licenciadas, e assim s primeiros estudos focalizaram o desenvolvimento de sub-unidades imunogênicas da Env do HIV-1. Os avanços em nosso entendimento sobre a estrutura e função da Env começaram a elucidar o por quê da geração de anticorpos amplamente neutralizantes reativos ao HIV-1 por vacinação pode ser tão difícil. A glicoproteína Env do HIV-1 é um trímero na superfície do vírion com extensiva glicosilação ligada na ponta N que age efetivamente como um escudo para muitos epítopos conservados contra o reconhecimento pelos anticorpos. Alças altamente imunogênicas variáveis também elicitam anticorpos específicos para cada tipo que podem redirecionar as respostas humorais para fora das regiões conservadas. Em adição, regiões chave conservadas, tas como o sítio de ligação do co-receptor de quimiocina, são formados somente após a ligação da Env ao receptor celular CD4 e submetem-se a uma extensa mudança em sua conformação. O desenvolvimento de mutações nos glicanos ligados ao N (amina terminal) também têm sido mostradas por levar à rápida evasão das respostas de anticorpos neutralizantes do hospedeiro.

Todavia, a atividade de anticorpos neutralizantes amplamente reativa têm sido identificada em um pequeno número de sujeitos infectados com o HIV-1, e essa reatividade parece estar largamente direcionada contra regiões conservadas da glicoproteína Env tais como o sítio de ligação a CD4. O anticorpo monoclonal amplamente reativo b12 também se liga ao sítio de ligação à CD4, sugerindo que essa região da glicoproteína Env pode representar um ponto crítico de vulnerabilidade que é potencialmente acessível à neutralização. Entretanto, o sítio de ligação à CD4 é recuado e só parcialmente acessível à ligação pelo anticorpo. Outra região conservada é a região externa próxima à membrana da gp41 (MPER), a qual representa o alvo dos anticorpos monoclonais amplamente reativos 2F5 e 4E10. Entretanto, anticorpos neutralizantes específicos para MPER podem ser dificilmente elicicitados por vacinação por múltiplas razões, incluindo o controle de tolerância e imuno-regulação, seqüestro do epítopo na membrana lipídica, exposição do epítopo só transitoriamente durante a entrada do vírus, ou possivelmente uma combinação de múltiplos fatores.

O desenvolvimento de imonógenos que induzem anticorpos neutralizantes amplamente reativos é talvez a mais importante prioridade para o campo da vacina para o HIV-1. Estudos de prova do conceito de transferência passiva em primatas não humanos têm mostrado que a administração de altas doses de anticorpos monoclonais altamente reativos pode fornecer proteção esterilizante da infecção, demonstrando assim o potencial da imunidade humoral específica para o vírus. Entretanto, não foi possível induzir estes anticorpos neutralizantes amplamente reativos por vacinação, até o momento. Embora tenha havido um progresso substancial em nosso entendimento sobre a estrutura e função de Env, não existem correntemente vacinas candidatas que estejam visando a elicitar anticorpos neutralizantes amplamente reativos especificamente para Env nos testes clínicos. É plausível que a próxima geração de imunógenos para Env sejam antígenos que precisam ser engenheirados. Estratégias que estão sendo perseguidas incluem a geração de trímeros bioquimicamente estabilizados de Env, restringindo os imunógenos de Env em conformações estruturalmente definidas, fornecendo epítopos de neutralização conservada em proteínas que não são produzidas pelo organismo do hospedeiro, desenvolvendo métodos para envolver a imunorregulação, e desenhando imunógenos para regiões alvo específicas como o sítio de ligação a CD4, a região MPER e elementos estruturalmente conservados do laço V3. A relevância de anticorpos não neutralizantes que mediam outras funções efetoras tais como inibição viral mediada pela célula e dependente de anticorpos, ativação do complemento e fagocitose também está sendo investigada.


Imunidade Celular Específica para o HIV-1

Acredita-se que as respostas do linfócito T específicas para o vírus tenham um papel crítico no controle da replicação do HIV-1 e estão sendo, por isso, ativamente exploradas no desenvolvimento de estratégias vacinais. Os primeiros estudos mostraram que as respostas específicas para o vírus do linfócito T CD8+ emergem durante a infecção aguda coincidentemente com o controle primário da viremia. Respostas imunes celulares potentes também tem sido relatadas em não progressores de longo prazo, e alelos específicos de HLA e a liberação das respostas do linfócito T específicas para Gag tem estado correlacionadas com o controle da replicação viral em indivíduos infectados por HIV-1. De acordo com essas observações, a depleção experimental dos linfócitos CD8+ tem mostrado abolir o controle imune da replicação do vírus da imunodeficiência símia (SIV) em macacos Rhesus.

Uma limitação de respostas de linfócitos T específicos para o vírus é a propensão do vírus acumular mutações nos epítopos para o linfócito T e evadir ao controle imune celular. Por isso é plausível que as respostas do linfócito T específicas ao epítopo de tolerância provar-se-ão críticas para uma vacina para o HIV-1, não somente para maximizar a cobertura imunológica da diversidade do HIV-1, mas também para minimizar o potencial de escape viral do reconhecimento pelos linfócitos T. Entretanto, a amplitude das respostas imunes celulares elicitadas pela vacina pode ser limitada pela restrição imunodominante e pela tendência herdade das respostas do linfócito T CD8+ em ser altamente focado para um número limitado de epítopos.

Avanços recentes na caracterização das respostas do linfócito T por citometria de fluxo de múltiplos parâmetros têm iluminado a diversidade funcional dos linfócitos T específicos para o vírus, em termos de secreção de citocinas, degranulação, proliferação e outras funções efetoras em várias sub-populações de linfócitos T efetores e de memória. É plausível que a funcionalidade complexa dos linfócitos T possa, em última instância, provar-se mais relevante do que a secreção do interferom gama como mensurado por ensaios de imuno-manchas (ELISPOT) ligados a enzimas para a contabilização das respostas imunes celulares elicitadas por vacina. Linfócitos T poli-funcionais capazes de desempenhar múltiplas funções têm sido relatados em não progressores de longo prazo, em recebedores de vacinas efetivas como da vacínia, e em certos estudos de desafio pré-clínico. Essas considerações sugerem que a amplitude e a qualidade das respostas do linfócito T pode provar-se crítica em adição à magnitude dessas respostas.

Talvez a mais significativa limitação das respostas imunes celulares elicitadas por vacina seja que elas provavelmente não protegem contra a aquisição da infecção por HIV-1. Como resultado, as respostas do linfócito T induzidas por vacina presumivelmente serão incapazes de prevenir a infecção por toda a vida, pois o vírus rapidamente estabelece reservatórios latentes. Além disso, não está claro se os linfócitos T elicitados por vacina estarão aptos a funcionar rápido o suficiente dada a importância de que importantes eventos imunopatológicos ocorrem dentro de poucos dias na infecção aguda por HIV-1. O HIV-1 infecta preferencialmente linfócitos T CD4+ específicos do HIV-1 e rapidamente depleta a maioria dos linfócitos TCD4+ de memória no tecido linfóide associado ao intestino dentro dos primeiros 4 a 10 dias de infecção. Isso estabelece o estágio de imunodeficiência progressiva bem como a ativação imune crônica, o que provavelmente resulta enfim em parte da transmigração microbiana através da mucosa intestinal danificada. Dado o tempo requerido para as respostas dos linfócitos T CD8+ induzidos por vacinação expandirem-se após a infecção, pode ser difícil para os linfócitos T elicitados por vacinação impedirem esses primeiros eventos imunopatológicos completamente.


AS ATUAIS ESTRATÉGIAS VACINAIS PARA O HIV-1.

Estratégias Tradicionais

As estratégias vacinais para o HIV-1 podem ser divididas em tradicionais e novas abordagens vacinais. As tecnologias da vacina tradicional incluem viroses atenuadas vivas, viroses totalmente mortas e sub-unidades protéicas. Embora essas abordagens tenham-se provado de enorme sucesso para o desenvolvimento de vacinas contra outras viroses, todas elas têm limitações substanciais em termos de sua utilidade para o HIV-1. Viroses atenuadas vivas têm proporcionado eficácia protetora considerável contra o SIV em macacos rhesus desafiados, mas elas são impróprias para o uso em humanos no que concerne à segurança. Em contraste, viroses completamente mortas e sub-unidades de proteínas são limitadas por sua incapacidade para elicitar respostas de anticorpos neutralizantes amplamente reativos bem como por sua incapacidade de elicitar as respostas do linfócito TCD8+. Dados recentes, entretanto, sugerem que os receptores Toll-like como adjuvantes podem aumentar a utilidade dos imunógenos de sub-unidades protéicas.

Novas Estratégias

Novas estratégias vacinais incluem tecnologias de entrega de genes tais como vacinas de plasmídio de DNA e vetores recombinantes vivos que são engenheirados para expressar antígenos do HIV-1. Vacinas de plasmídio de DNA frequentemente oferecem promessas consideráveis em termos de simplicidade e versatilidade, porém múltiplas injeções de altas doses de vacinas de DNA são requeridas para elicitar respostas imunes tipicamente detectáveis em primatas humanos e não humanos. Uma pesquisa substancial está, por isso, focada no desenvolvimento de adjuvantes para vacinas de DNA e em tecnologias melhoradas de entrega do DNA tais como eletroporação [técnica pela qual se aplica um breve choque elétrico às células fazendo com que orifícios momentâneos se abram para a entrada de macromoléculas; p.ex. uma forma de introduzir DNA novo em uma célula. Stedman]. Vetores recombinantes incluem viroses atenuadas ou incompetentes para a replicação, mais notadamente adenoviroses e poxviroses [viroses que promovem pequenas feridas na pele]. Vetores virais, administrados tanto sozinhos ou no contexto de regimes de estímulo de DNA de origem e vetor heterólogos representam as principais vacinas para o HIV-1 candidatas que estão em testes clínicos atualmente. Outros vetores virais que estão sendo avaliados incluem o vírus da estomatite vesicular, vírus associados à glândulas, vírus da encefalite eqüina venezuelana, citomegalovírus, vírus do herpes simples e vírus measles. Vetores bacterianos e micobacterianos (fungos?) também estão sendo explorados, incluindo a Salmonella, Listéria e o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG).


O Estudo de Etapas

Conhecimento Pré-clínico

Vetores recombinantes de Ad5 foram selecionados para o desenvolvimento pela Merck com base em estudos pré-clínicos de comparação de vetor que mostraram que vetores rAd5 (r de recombinante) eram mais imunogênicos que outras múltiplas modalidades de vetores em macacos rhesus. Além disso, vetores Ad5 expressando a Gag do SIV concederam marcadas reduções nas cargas virais após o desafio de macacos reshus com o vírus da imunodeficiência humana/símia quimérico (SHIV)- 89.6P. Entretanto, também foi observado que a mesma vacina concedeu de mínimo a nenhum controle de pico ou do ponto de estabelecimento da carga viral após o desafio com SIVMAC239 , indicando que os desafios com SIV foram consideravelmente mais rigorosos do que os desafios com SHIV-89.6P.

O regime de estímulo com molde de DNA/Ad5 expressando a Gag SIV forneceu uma redução breve (90 dias) e marginal (0,8 log) do pico da carga viral após o desafio com SIVMAC239 , mas esse efeito só foi observado em macacos rhesus que foram selecionados para expressar a molécula Mamu-A*01 do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I, a qual está associada com o controle virológico eficiente. O regime de molde de DNA/rAd5 expressando múltiplos antígenos de SIV forneceram eficácia protetora aumentada nos macacos Mamu-A*01 positivos, indicando que expandir a amplitude das respostas imunes celulares melhora a proteção. Entretanto, nem o regime de rAd5 sozinho ou de estímulo com molde de DNA/rAd5 foram capazes de reduzir o ponto estabelecido da carga viral após o desafio de SIV em macacos rhesus negativos em Mamu-A*01, até o momento.



Estudos Clínicos

A vacina candidata da Merck foi formulada como uma mistura trivalente de vetores de rAd5 expressando as proteínas Gag, Pol e Nef do HIV-1 de classe B. Os testes clínicos de fase 1 sugeriram que essa vacina foi, em geral, bem tolerada e imungênica na maioria dos voluntários. Entretanto, como previsto por estudos pré-clínicos, as respostas a esta vacina foram parcialmente suprimidas em indivíduos com anticorpos neutralizantes pré-existentes contra o vetor da vacina. Devido a 30 a 40% da população dos Estados Unidos e da Europa Ocidental e 80 a 90% das pessoas na África sub-Sahariana terem anticorpos neutralizantes específicos para o Ad5 pré-existentes, o impacto da imunidade contra o vetor foi previsto como uma limitação dos vetores rAd5.

Duas fases 2b de estudos de eficácia de “prova de conceito” foram iniciadas pela Merck e o Instituto Nacional de Saúde para determinar se as respostas imunes celulares específicas para o HIV-1 induzidas por esse regime vacinal preveniriam a infecção por HIV-1 ou reduziriam a carga viral após a infecção. A Rede de Trabalho de Testes da Vacina para o HIV-1 (HVTN) no 502, também conhecida como estudo de Etapa, foi um estudo com 3.000 pessoas nas Américas, Caribe e Austrália. A HVTN 503, também chamada “Phambili” (o que significa ‘mover para frente’ em Xhosa – língua Bantu no Sul da África), foi designada como um estudo paralelo de 3.000 pessoas na África do Sul.

Em 18 de setembro de 2007, a HVTN 502 foi inesperadamente terminada no ínterim do primeiro plano de análises quando o Conselho de Monitoramento de Dados e Segurança declarou a futilidade do estudo para atingir seus objetivos primários. Além disso, em pessoas com títulos de anticorpos neutralizantes específicos para o Ad5 pré-existentes, ocorreu um grande número de infecções por HIV-1 em vacinados mais que em recebedores de placebo. Embora as bases biológicas para essa observação permaneçam obscurecidas, esses dados sugerem que a vacinação com vetores rAd5 pode estar associada com um aumento no risco de aquisição do HI-1 neste sub-grupo. Análises posteriores multivariadas a partir desses dados, sugeriram suplementarmente que o risco mais acrescido estava em homens que tinham anticorpos neutralizantes específicos para o Ad5 pré-existentes e que eram circuncisados.

Não está claro, correntemente, se a falta de eficácia no estudo de Etapa simplesmente representa a falência da vacina de rAd5-Gag/Pol/Nef da Merck ou se isso deverá ser arbitrado à falência do conceito da vacina com a célula T em geral. É aceitável que dados substanciais venham emergir a partir de análises imunológicas detalhadas dos vacinados que subsequentemente tornaram-se infectados, e é possível que a vacina com rAd5-Gag/Pol/Nef tenha falhado em induzir suficiente magnitude, amplitude ou qualidade das resposta imunes celulares. No presente momento, por este motivo, pareceria prematuro considerar a falência desse estudo singular com a falência de vacinas baseadas em célula T em geral.

O risco aparentemente aumentado de aquisição do HIV-1 em vacinados que tinham anticorpos neutralizantes específicos para Ad5 pré-existentes foi inesperado, e esse achado ilumina nossa falta de entendimento dos parâmetros que determinam a suscetibilidade à infecção por HIV-1. As bases biológicas para essa observação permanecem sem esclarecimento. Uma hipótese é que a vacinação com rAd5 de indivíduos com anticorpos neutralizantes específicos para Ad5 pré-existentes poderia ter resultado em linfócitos T CD4+ de memória específicos para o Ad5 que eram alvos aumentados para a infecção por HIV-1. Entretanto, os primeiros dados sugeriram que as respostas específicas para Ad5 de linfócitos T após a vacinação com rAd5 são atualmente mais baixas em indivíduos que têm anticorpos neutralizantes específicos para o Ad5 pré-existentes do que aqueles sem os anticorpos pré-existentes neutralizantes específicos para o Ad5 (J. McElrath, observações não publicadas). Uma hipótese alternativa é que os anticorpos neutralizantes específicos para o Ad5 tenham opsonizado (se ligado a)os vetores de rAd5 após a imunização, resultando na alteração do tropismo ou das respostas inflamatórias. Também é possível que os anticorpos neutralizantes específicos para Ad5 pré-existentes tenham sido um marcador para outras variáveis misturadas que não tenham sido identificadas ainda.

Uma ETAPA adiante?

A despeito dos resultados desapontadores do estudo e ETAPA, várias lições chave tem sido aprendidas agora. Primeiro, está claro que o caminho na direção de uma vacina para o HIV-1 não será nem simples nem fácil. Segundo, a importância do entendimento de ambas as respostas imunes sistêmicas e da mucosa para vetores vacinais é primordial. Terceiro, os determinantes biológicos da aquisição do HIV-1 e o impacto que as respostas imunes da mucosa a antígenos específicos e a vetores específicos podem ter nesse processo hão de requerer investigação intensiva. Quarto, estudos vacinais clínicos serão necessários para adaptar ao que concerne à segurança relevada no estudo de ETAPA, tal como a possibilidade de exclusão de pessoas que tenham anticorpos neutralizantes pré-existentes para o vetor da vacina que estará sendo usado até este fenômeno ser compreendido mais completamente. Quinto, futuras vacinas candidatas baseadas em células T deverão ser priorizadas para estudos de eficácia clínica somente se forem convincentemente superiores ao regime homólogo de rAd5-Gag/Pol/Nef que falhou. Sexto, modelos de primatas não humanos devem ser recalibrados (avaliados com precisão) com base no estudo de ETAPA para guiar o desenvolvimento de uma futura vacina para o HIV-1.

A proteção proporcionada pelo regime homólogo de rAd5 contra SHIV-89.6P indica que este modelo carece de austeridade para a avaliação de vacinas candidatas baseadas em células T. Embora o modelo mais rigoroso de desafio com SIV não possa ser considerado com validamente útil existe um estudo de eficácia clínica de sucesso em humanos, parece razoável usar SIVMAC239 ou SIVMAC251 como viroses de desafio para avaliar vacinas candidatas de próxima geração. Estudos de desafio pré-clinico precisam ser adequadamente capacitados com tempo suficiente de acompanhamento, e o agendamento e dose da vacina deverá servir de modelo para o regime clínico proposto. Para um rigor otimizado, os estudos deverão excluir macacos rhesus que expressam alelos de MHC de classe I que estão especificamente associados com o controle virológico eficiente, tais como Mamu-A*01, Mamu-B*17 e Mamu-B*08. O uso de antígenos homólogos de Env que possam superestimar inapropriadamente a eficácia protetora também devem ser evitados. Os desafios na mucosa podem oferecer certas vantagens fisiológicas sobre os desafios intravenosos, e esses modelos de desafio deverão ser desenvolvidos. Finalmente, uma ênfase aumentada deve ser colocada na estimativa da capacidade das promissoras vacinas candidatas em proteger contra desafios com SIV altamente heterogêneos, pois as viroses infectantes em humanos serão certamente heterólogas à qualquer sequência da vacina. Devido a poucos estudos de desafio com SIV heterólogos terem sido completados até agora, uma abordagem prática pode ser a determinação da eficácia protetora de vacinas promitentes candidatas contra ambos os desafios com SIV homóloga e heteróloga. Atualmente há um debate sobre se os estudos de desafio em primatas não humanos poderiam ser usados como um ‘guarda’ formal para vacinas candidatas avançadas em estudos de eficácia clínica, pois a capacidade desse modelo para prever os resultados dos estudos de eficácia clínica permanecem obscurecidos. Todavia, pareceria razoável dar uma prioridade relativa ao desenvolvimento de vacinas candidatas que levaram a um controle duradouro da carga viral estabelecida após o desafio com SIVMAC239 ou com SIVMAC251.

O estudo de ETAPA também teve um impacto principal em outros programas de vacina para o HV-1 em campo. O HVTN 503 terminou porque usava a mesma vacina candidata baseada em rAd5 que foi usada no HVTN 502. O Centro de Pesquisa de Vacinas NIH desenvolveu um regime vacinal estimulador com molde/rAd5 expressando antígenos da Gag e da Pol de classe B e a Env de múltiplas classes de HIV. Essa vacina candidate tem sido mostrada como imunogênica na maioria dos indivíduos nos estudos de fase 1, particularmente para os antígenos de Env. Em estudos pré-clínicos, um regime de estímulo vacinal com molde/rAd5 expressando os antígenos de Gag, Pol, Nef e Env do SIV forneceram uma redução de 1,1 log no pico da carga viral por 112 dias após o desafio com SIVMAC251 homólogo. Entretanto, nenhum controle duradouro do ponto de estabelecimento da carga viral foi observado com esta vacina, embora a procrastinação na progressão para a mortalidade relacionada com a AIDS fosse evidente. O NIH anunciou recentemente que não procederá no estudo de eficácia de fase 2b ampla conhecido como PAVE 100, embora um estudo de eficácia menor, mais focado na vacina candidata já esteja sob consideração. Regimes de estimulação com molde de DNA/poxvírus (vírus da grande família Poxviridae incluindo os gêneros Orthopoxvírus, Avipoxvírus, Capripoxvírus, Leporipoxvírus e Parapoxvírus - Stedman) também estão sendo avaliados usando-se vetores modificados de vacínia Ankara (MVA) e de NYVAC, e testes clínicos de fase 1 tem demonstrado imunogenicidade na maioria dos voluntários. Entretanto, é central para esses programas, a hipótese de que o molde de DNA, antes do estímulo do vetor, melhorará a eficácia da proteção. Isso tem sido observado em alguns, mas não todos os estudos de desafio com SIV, e assim isso ainda permanece uma questão em aberto que requer investigação adicional e será considerada de alta prioridade.

Novos vetores de rAd derivados de sorotipos de Ad que são raros na população humana também estão sendo explorados como uma estratégia para evadir aos anticorpos neutralizantes específicos para Ad5 pré-existentes. Espera-se que tais vetores possam oferecer vantagens imunológicas bem como segurança em comparação aos vetores de rAd5 nas circustâncias de anticorpos pré-existentes neutralizantes específicos para o vetor. Entretanto, essas possibilidades não foram confirmadas ainda em testes clínicos. Estratégias correntes incluem o desenvolvimento de vetores de raros sorotipos rAd26, rAd35 e rAd48 ; vetores quiméricos rAd5HVR48 nos quais os epítopos dominantes para os anticorpos neutralizantes específicos para Ad5 tenham sido trocados; e vetores de rAd não humano. Vetores de rAd de sorotipo raro são biologicamente diferentes dos vetores de rAd5 em termos de seus receptores celulares, tropismo, vias de tráfego intracelular e perfis imunes inatos. Além disso, os vetores rAd26 e rAd48 têm sido mostrados por elicitar respostas do linfócito T de um fenótipo substancialmente diverso em comparação com vetores rAd5, e potnetes regimes de estímulo com molde rAd heterólogos podem ser construídos usando-se vetores rAd sorologicamente distintos. Nós demonstramos recentemente que um regime de estimulação com molde rAD26/Ad5 heterólogos expressando a Gag do SIV forneceu uma duradoura redução de 2,4 log do ponto de estabelecimento da carga viral após o desafio com SIVMAC251 dos macacos rhesus negativos para o Mamu-A*01, enquanto um regime de rAd5 homólogo não proporcionou proteção nesse rigoroso modelo de desafio. Nossos dados sugerem que vacinas candidatas que elicitam melhorada magnitude, amplitude e qualidade de respostas de linfócito T podem proporcionar eficácia protetora superior em comparação com regimes de rAd5 homólogos.

PERSPECTIVAS E DIREÇÕES FUTURAS

Para uma grande dimensão, a ciência da vacina do HIV-1 ainda está na infância. Os principais problemas permanecem não resolvidos, e um renovado compromisso com a pesquisa de descobrimento básico em adição aos estudos pré-clínicos e testes clínicos serão requeridos para mover o campo adiante. Testes clínicos que estão focados em responder hipóteses científicas específicas mais do que exclusivamente voltados para o desenvolvimento do produto podem ser mais úteis ao campo no presente momento. Certos regimes vacinais, tais como regimes de estímulo com modelos de rAd heterólogos, podem oferecer a possibilidade de aumento da magnitude, amplitude e qualidade das respostas de linfócitos T em comparação com os regimes de rAd5 homólogo. Novos conceitos, tais como consenso centralizado e imunógenos em mosaico, também podem resultar em aumento na amplitude das respostas imunes celulares e melhoramento na cobertura da diversidade viral.

Talvez o foco mais importante da pesquise devesse ser o desenvolvimento de imunógenos melhorados de Env para elicitar anticorpos neutralizantes amplamente reativos. Dado o objetivo desse problema, pesquisas básicas incrementadas em direção à estrutura, função e imunogenicidade da glicoproteína Env serão requeridas. Idéias inovadoras e de alto risco serão perseguidas, e abordagens promissoras serão testadas o mais rapidamente possível em estudos pré-clínicos e eventualmente em testes clínicos. Enfim, é aceitável que uma vacina em combinação consistindo de componentes vacinais separados que elicitam linfócitos T e anticorpos neutralizantes provar-se-á ótima. Em resultado, o desenvolvimento de estratégias vacinais baseadas em anticorpos e baseadas em célula T deverá ser perseguido em paralelo.

Para atingir esses objetivos, será de sumária importância atrair e reter novos e talentosos investigadores para este campo. Os programas de fundos deverão ser, por isso, expandidos para encorajar investigadores juniores a explorar idéias inovadoras que relacionem problemas críticos neste campo Dados os desafios científicos que faceiam o campo do HIV-1 atualmente, um suporte e incentivo aumentados de capacitação de docentes e estudantes será visto no topo da prioridade por ambos os investigadores experientes e organizações de fomento. Também será importante para a indústria continuar a participar no campo da vacina para o HIV-1, já que as companhias de biotecnologia e farmacêuticas têm conhecimento e capacidade críticos que não estão disponibilizados nas academias, governo e organizações não-profissionais.

Há um debate atual sobre a possibilidade do campo da vacina para o HIV-1 resistir a outra falência no estudo de eficácia. Para o HIV-1, os desafios científicos são enormes, e assim então são os riscos nos testes de qualquer novo conceito vacinal. Claramente, a decisão para avançar uma vacina candidata em testes de eficácia deverá ser altamente seletiva e baseada em uma análise transparente e rigorosa dos dados clínicos e pré-clínicos. Entretanto, não há outro caminho para determinar se uma promissora vacina candidata oferecerá proteção em humanos senão pela condução de estudos de eficácia clínica. Testes de eficácia múltipla podem ser requeridos, e muitos conceitos falharão indubitavelmente. Nós devemos por isso estar preparados para aceitar múltiplas falhas nos estudos de eficácia como parte do caminho ao longo do esperado desenvolvimento terminado com o sucesso de uma vacina segura e efetiva contra o HIV-1.

Fonte - http://www.nature.com/nature/journal/v455/n7213/full/nature07352.html

126449 DOPAMINE RECEPTOR D1; DRD1

Títulos alternativos; símbolos

DOPAMINE RECEPTOR D1A; DRD1A
Lócus do gene mapeado 5q35.1

TEXTO

As diversas ações fisiológicas da dopamina são mediadas por sua interação com dois tipos de receptores casados com proteína G, D1 e D2 (omim 126450), os quais estimulam e inibem respectivamente, a enzima adenilato ciclase (enzimas responsáveis pela síntese de AMP cíclico).

CLONAGEM

Três grupos relataram a clonagem do gene do receptor de dopamina D1 (Dearry e outros, 1990; Zhou e outros , 1990; Sunahara e outros, 1990). O gene codifica uma proteína de 446 aminoácidos tendo uma massa molecular relativa prevista em 49.300 e uma topologia transmembrana similar à de outros receptores casados com proteína G. Análises de Northern blot e hibridização em sítio mostraram que o mRNA para esse receptor é mais abundante no nucleus accumbens, uma região de fusão entre a cabeça do núcleo caudado e o putame, no tubérculo olfatório, bem como no núcleo caudado e no tubérculo olfatório, com pouco ou nenhum mRNA detectável na substância negra, fígado, rins, ou coração (Dearry e outros). (Explicação: http://www.icb.ufmg.br/mor/neurovia/aulas/nucbase.htm.Visualização: http://www.icb.ufmg.br/mor/neurovia/modelos_visceral.htm)


FUNÇÃO DO GENE

Uma etapa crítica no transporte de proteínas de membrana do retículo endoplasmático (ER) para a superfície celular envolve mecanismos de volume de fluxo ou a presença de sequências de exportação do ER específicas. Bermak e outros (2001) notaram a presença de quatro aminoácidos conservados no espaço dos resíduos hidrofóbicos, FxxxFxxxF, dentro ao próximo terminal C dos GPCRs (receptores casados com proteína G), incluindo o DRD1. Análises de microscopia fluorescente da Drd1 do rato com seus resíduos de fenilanlanina no terminal C mutados para alanina demonstraram que os resíduos de fenilalanina são críticos para a localização na superfície da célula. Análises funcionais mostraram reduzida ligação ao ligante e a produção de cAMP cortada em resposta à dopamina nas células que expressam a proteína Drd1 mutada. A expressão de uma proteína quimérica com CD8 (omim186910) no terminal N e com o terminal C da Drd1 de tipo selvagem, mas não com a proteína Drd1 mutante em fenilalanina, conferiu a expressão na superfície celular. Bermark e outros (2001) concluíram que o motivo FxxxFxxxF e todos os seus resíduos de fenilalanina são essenciais para o transporte normal por receptor (de transporte).

Usando um teste com duas leveduras híbridas, Bermark e outros (2001) identificaram a DRIP78 [omim 606092- 12q-13.1-q13.2: O receptor de dopamina D1 é um receptor casado a proteína G expressado na superfície da célula. Usando um teste de biblioteca de cDNA do cérebro com leveduras duplamente híbridas com o terminal C da Drd1 do rato como isca, Bermak e outros (2001) isolaram um cDNA humano parcial codificando a DRIP78. Eles isolaram a lente toda do cDNA do rato por sondagem de uma biblioteca de cDNA. As análises de sequência predisseram que a proteína de 701 aminoácidos do rato carece de um peptídio sinal mas contém dois segmentos de expansão na membrana. Ambos os terminais N e C da Drip78 estão localizados no citosol. Análises de Northern blot revelaram a expressão ubíqua de um transcrito de 3,0 quilobases, com expressão relativamente alta no coração, cérebro, pulmões e rins. Análises de ligação mostraram que a sequência hidrofóbica da Drd1 é crítica para sua interação com a Drip78, e que os resíduos de 488 a 673 da Drip78 contém dois domínios com potencial de dedos de zinco que são cruciais para sua associação à Drd1. A microscopia confocal demostrou que a Drip78 está localizada no retículo endoplasmático (ER).

Os membros da família de moléculas chaperones com domínio J contêm um domínio de interação proteína-proteína com aproximadamente 70 aminoácidos, o domínio J, como sua única característica em comum. Por verificação de uma biblioteca de cDNA de cérebro fetal, Chen e outros (2003) isolaram um cDNA codificando a HDJ3, uma nova proteína com domínio J. A proteína HDJ3, de 702 aminoácidos, é altamente homóloga à Drip78 do rato, sugerindo que esta seja um novo membro da família das chaperones moleculares e funcionalmente relacionada à transdução de sinal de dopamina. A HDJ3 tem um domínio transmembrana a partir do resíduo 326 até o resíduo 342 e um domínio J a partir do resíduo 443 até o 507. A PCR de Transcriptase Reversa detectou alta expressão no pâncreas e uma expressão seletiva no cérebro, pulmões, fígado, músculo esquelético e rins. Nenhuma expressão foi detectada no coração nem na placenta. Um segundo transcrito foi detectado no pâncreas, sugerindo que deve haver uma variante de Splice no HDJ3. ] como uma proteína que interage com DRD1. A co-expressão da Drd1 e da Drip78 resultou na inibição da expressão da Drd1 na superfície e em sua contenção intracelular. Bermark e outros (2001) concluíram que a DRIP78, similarmente à calnexina (CANX; omim114217) e a GRP78 (HSPA5; omim 138120), é uma proteína residente no retículo endoplasmático que impede o transporte prematuro das proteínas de carga para o Golgi por mascarar o motivo FxxxFxxxF da DRD1.

Através de análises imuno-histoquímicas, Mayerhofer e outros (1999) mostraram que a DRD1 é expressada no tecido ovariano humano dentro da células granulosas dos folícuos grandes e nas células luteínicas dos corpos lúteos [o hormônio luteínico é a progesterona, a luteína é o pigmento amarelo da gema do ovo, luteinização é a transformação do folículo ovariano maduro e sua teca interna em um corpo lúteo após a ovulação ou a formação do tecido lúteo, que se mostra amarelo em algumas espécies; as células granulosas são células da membrana do folículo pré-ovulatório que dão origem às células luteínicas que são células do corpo lúteo do ovário; estas células luteínicas secretam progesterona e estrogênio]. Nas células luteínicas da granulosa, a imuno-reatividade da DRD1 foi associada com a membrana celular e/ou com o citoplasma da maioria das células. A DRD1 nas culturas de células da granulosa (GC) foi biologicamente ativa. O tratamento de células luteinizadas da granulosa com SKF38393, um agonista seletivo do receptor de dopamina, aumentou os níveis de cAMP de duas a três vezes num prazo de 3 a 6 horas. O tratamento com SKF38393 também aumentou significativamente a fosforilação da treonina da proteína DARPP32 [omim 604399 - Bibb e outros (1999) sugeriram que a DARPP32, dependendo do resíduo de aminoácido que é fosforilado, pode funcionar tanto como um inibidor de cinase quanto de fosfatase. Hemmings e outros (1984) e Greengard e outros (1999) demonstraram que a DARPP32 é convertida em um inibidor da proteína fosfatase 1 quando ela é fosforilada pela proteína cinase A (PKA; veja imim 176911) na treonina 34. Bibb e outros (1999) descobriram que a DARPP32 é convertida em um inibidor da PKA quando fosforilada na treonina 75 pelas CDK5 (omim 123831). A CDK5 fosforilou a DARPP32 in vitro e em células intactas do cérebro. A DARPP32 fosforilada na treonia 75 nas células do corpo estriado tanto por uma inibidor específico da CDK5 ou por uso de camundongos alterados geneticamente resultou no aumento da fosforilação induzida por CDK5 dos substratos da PKA e aumentou o pico da passagem da voltagem da corrente de cálcio. Assim, a DARPP32 é uma molécula de transdução de sinal bifuncional que, por distintos mecanismos, controla uma cinase serina/treonina e uma fosfatase serina/treonina.

Stipanovich e outros (2008) demonstraram que o abuso de drogas, bem como o hábito de comer demais, promovem uma acumulação nuclear de DARPP32. Essa acumulação é mediada através de uma cascata de sinalização envolvendo os receptores de dopamina D1 (veja omim 126449), a ativação da proteína fosfatase 2A dependente de cAMP (veja omim 176915), e a desfosforilação da DARPP32 na serina 97 com a inibição de sua exportação nuclear. A acumulação nuclear da DARPP32, um potente inibidor da proteína fosfatase 1, aumentou a fosforilação da histona 3 (H3, veja 602812), um importante componente da resposta nuleossômica (nucleossoma é o conjunto de histona e DNA que pode ser identificado quando a cromatina não está condensada.) A mutação da serina 97 alterou profundamente os efeitos comportamentais no abuso de drogas e diminuiu a motivação para comer, relevando a importância funcional desta cascata de sinalização.]

Lee e outros (2002) relataram que os receptores de dopamina modulam funções mediadas pelo receptor de glutamato NMDA através de interações diretas proteína-proteína. Duas regiões no caule de carboxila do receptor D1 puderam casar com sub-unidades NR1-1A (omim 138249) e NR2A (omim 138253) do receptor de glutamato NMDA direta e seletivamente. Enquanto uma interação estava envolvida na inibição das correntes de entrada do receptor NMDA, a outra estava implicada na atenuação da excitotoxidade [excitóxico é o que possui a propriedade de excitar; excitotoxinas são toxinas que se ligam a determinados receptores (p.ex alguns receptores de glutamato) e podem causar morte neuronal; as excitotoxinas podem estar envolvidas na lesão cerebral associada a acidentes vasculares cerebrais.] mediada pelo receptor NMDA através de uma via dependente cinase-3 fosfatidilinositol (veja omim 171833)

Stipanovich e outros (2008) demonstraram que o abuso de drogas, bem como o hábito de comer demais, promovem uma acumulação nuclear de DARPP32. Essa acumulação é mediada através de uma cascata de sinalização envolvendo os receptores de dopamina D1 (veja omim 126449), a ativação da proteína fosfatase 2A dependente de cAMP (veja omim 176915), e a desfosforilação da DARPP32 na serina 97 com a inibição de sua exportação nuclear. A acumulação nuclear da DARPP32, um potente inibidor da proteína fosfatase 1, aumentou a fosforilação da histona 3 (H3, veja 602812), um importante componente da resposta nuleossômica (nucleossoma é o conjunto de histona e DNA que pode ser identificado quando a cromatina não está condensada.) A mutação da serina 97 alterou profundamente os efeitos comportamentais no abuso de drogas e diminuiu a motivação para comer, relevando a importância funcional desta cascata de sinalização.

O trabalho da memória é uma função chave para a cognição humana, dependendo da adequada neurotransmissão de dopamina. McNab e outros (2009) mostraram que o treinamento da memória, o que melhora a capacidade de trabalho da memória, está associado com mudanças na densidade dos receptores de dopamina D1 corticais. Quatorze horas de treinamento durante cinco semanas em 13 voluntários, homens saudáveis entre 20 e 28 anos, foram associadas com mudanças no potencial de ligação do D1 pré-frontal e parietal [relativo à parede de qualquer cavidade ou ao osso parietal que fica na calota (porção superior da caixa craniana) do crânio.Stedman], como determinado por tomografia de emissão de positrão [tomografia com raios gama] enquanto os participantes estavam descansando e após o treinamento. McNab e outros (2009) concluíram que esta plasticidade do sistema do receptor D1 de dopamina demonstra uma interação recíproca entre a atividade mental e a bioquímica do cérebro in vivo.

ESTRUTURA DO GENE

Sunahara e outros (1990) relataram que o gene DRD1 é sem íntrons.

MAPEAMENTO

Por hibridização de Southern blot de DNAs de um painel de células híbridas, Sunahara e outros (1990) mapearam o gene DRD1 no cromossomo 5. Estudos de ligação familiar confirmaram essa assinatura e sugeriram que esta é a mesma região geral do gene do receptor de glucocorticóide (omim 138040) e do D5S22, um marcador de aproximadamente 12 cM a partir do GRL (receptor de glucocorticóide). Isso fica na região 5q31-q34 perto dos genes estruturalmente homólogos para o receptor adrenérgico beta 2 (omim 109690) e o receptor adrenérgico alfa 1 (omim 104220) [Obs. adrenérgico é relativo às células nervosas.]. Usando eletroforese com pulsação no campo de gel em uma gama de diferentes enzimas de restrição digestivas, Boultwood e outros (1991) estabeleceram que o GRL e o DRD1 estão no mesmo fragmento de DNA genômico de 300 quilo-bases. Grandy e outros (1990) usaram um gene do DRD1 recentemente clonado para mapear o lócus no cromossomo 5 em células híbridas de camundongos e humanas. A hibridização de fluorescência em sítio refinou a localização em 5q35.1 Uma EcoRi RFLP com dois alelos associados com o DRD1 permitiu a confirmação da localização por análises de ligação em famílias CEPH. O gene homólogo no camundongo está localizado no cromossomo 13 (Wilkie e outros, 1993).


GENÉTICA MOLECULAR

Associação com Níveis de Pressão Sanguínea Sistólica [sístole é a contração do coração através da qual o sangue é expulso da aorta e da artéria pulmonar para atravessar a circulação sistêmica e pulmonar. Stedman].

O distante final do 5q, 5q31.1-qter, contém os genes para dois receptores adrenérgicos, ADRB2 (omim 109690) e ADRA1B (omim 104220), e o gene para o receptor de dopamina de tipo 1A. Krushkal e outros (1998) usaram um esquema de investigação de um par de parentes eficientes discordantes para investigar o impacto dessa região do genoma na variação da pressão sanguínea sistólica em caucasianos jovens. Eles mediram oito marcadores altamente polimórficos expandindo a posição dessa região rica em genes candidatos em 427 indivíduos de 553 descendências contendo 69 pares de parentes discordantes, e calcularam a identidade de múltiplos pontos por probabilidade de descendência. Os resultados da ligação genética e dos testes de associação indicaram que a região entre os marcadores D5S2093 e D5S462 estava significativamente ligada a um ou mais genes polimórficos influenciando a variação inter-individual nos níveis da pressão sistólica do sangue. Já que os genes ADRA1B e DRD1A estão localizados na proximidade desses marcadores, os dados sugerem que a variação genética em uma ou em ambos receptores casados com proteína G, os quais participam no controle da entoação (tonalidade) vascular, atuam num importante papel influenciando a variação inter-individual nos níveis da pressão sanguínea sistólica.

Associação com Dependência de Nicotina.

Huang e outros (2008) descobriram uma associação significativa entre a dependência de nicotina (omim 188890) e um SNP (rs686) no gene DRD1 entre 1.366 afro-americanos. Em um farto exemplo de 1.366 afro-americanos e 671 euro-americanos, o rs686 e o rs4532 estavam ambos significativamente associados com a dependência de nicotina. Vários haplótipos [haplótipo é característica de um indivíduo em relação a um membro de um par de genes alelos; os indivíduos são do mesmo haplótipo (mas de genótipos diferentes) quando semelhantes em relação a um alelo de um par, porém diferente em relação ao outro alelo de um par.; em imuno-genética, a porção do fenótipo determinada por um conjunto de genes estreitamente ligados e herdados de um dos genitores. Stedman] relacionados a esses SNPs também sugeriram uma associação. Estudos de expressão funcional in vitro indicaram que o rs686, o qual está localizado na região não traduzida da extremidade 3, está funcionalmente envolvido na regulação da expressão do DRD1.

Associação com Esquizofrenia

Allen e outros (2008) desempenharam uma meta-análise comparando 725 pacientes com Esquizofrenia (veja omim 181500) com 1.075 controles e descobriram que o alelo DRD1-48ª-G (rs4532) estava associado com a suscetibilidade à esquizofrenia. De acordo com as diretrizes de Venice para a avaliação de evidências em estudos de associação genética (Ioannidis e outros, 2008), a associação do DRD1 mostrou um forte grau de credibilidade epidemiológica.

MODELO ANIMAL

O sistema dopaminérgico do cérebro é um modulador crítico da função basal e da plasticidade do gânglio. Para investigar a contribuição do receptor de dopamina D1 para essa modulação, Xu e outros (1994) usaram a tecnologia de alvejamento (mira) do gene para gerar camundongos mutantes no receptor D1. Embora as análises histológicas não sugerissem nenhuma mudança principal na anatomia dos cérebros dos camundongos mutantes, a expressão de dinorfina (ligante opióide endógeno que atua como agonista em receptores opiáceos. Neuropeptídeo extremamente potente, amplamente distribuído que contém leu5-encefalina como sua sequência terminal em NH2. Stedman) (omim 131340) estava muito reduzido no estriado e regiões relacionadas aos gânglios de base. Os camundongos mutantes não respondiam aos efeitos estimulantes e supressores dos agonistas (competidores) e antagonistas do receptor D1, respectivamente, e exibiram hiperatividade locomotora.

Já que a dopamina produzida pelos rins é um regulador intra-renal do transporte de sódio, Albrecht e outros (1996) investigaram a possibilidade de que uma anormalidade do sistema dopaminérgico possa ser importante na patogênese da hipertensão.No rato espontaneamente hipertenso (SHR), apesar da produção normal de dopamina e desidade normal do receptor, existe uma transdução defeituosa do sinal do receptor D1 nos túbulos renais próximos, resultando numa inibição diminuída do transporte de sódio pela dopamina. Dois genes similares ao receptor D1 foram clonados em mamíferos, o DRD1A e o DRD1B (omim 126453). Embora ambos os genes de receptores sejam expressados nos rins, o DRD1A é mais abundante que o DRD1B nos túbulos renais próximos. Por isso, Albrecht e outros (1996) estudaram o efeito da deleção dos receptores D1A em camundongos gerados por recombinação homóloga. Eles descobriram que a pressão sanguínea sistólica era maior em camundongos homozigotos e em heterozigotos do que nos controles de uma ninhada de ambos os sexos gerada sexualmente; além disso, camundongos carente de um ou dos dois alelos do Drd1 desenvolveram hipertensão diastólica (diástole é a dilatação pós-sistólica normal das cavidades cardíacas, durante a qual estas se enchem de sangue; a diástole atrial precede a diástole ventricular. Stedman)

O bloqueio crônico dos receptores de dopamina D2, um mecanismo comum de ação para drogas anti-psicóticas, regula para menos os receptores D1 no córtex pré-frontal, como mostrado por Castner e outros (2000), e produz severas reduções no trabalho de memória. Esses déficits foram revertidos em macacos pela co-administração de um agonista de curto prazo do D1, o ABT431, e essa melhora foi mantida por mais de um ano após a cessação do tratamento do D1. Castner e outros (2000) concluíram que a modulação farmacológica da via de sinalização do D1 produz mudanças de longa duração nos circuitos funcionais subjacentes ao trabalho de memória. A restauração dessa via por breve exposição ao agonista pode proporcionar uma estratégia valorosa para a intervenção terapêutica na esquizofrenia e outros estados de disfunção da dopamina.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=126449