*DISCERINA; DKC1
Gene map locus Xq28

CLONAGEM

Por clonagem posicionada, Heiss e outros (1998) identificaram um gene, simbolizado DKC1, na região Xq28 que é a causa da disceratose (queratinização prematura de células epiteliais individuais que não alcançavam a camada superficial queratinizante; as células disceratóticas geralmente se tornam arredondadas e podem separar-se das células adjacentes e desprender-se. Stedman) congênita recessiva ligada ao X (DKC; omim 305000). Heiss e outros (1998) descobriram que o gene DKC1 é altamente conservado cruzando as barreiras entre as espécies e é o ortólogo do NAP57 do rato e do Cbf5 da S.cerevisiae. O produto do gene, referido como discerina, contém dois motivos TruB de sintase de pseudouridina, múltiplos sítios de fosforilação, e um domínio rico em lisina no terminal carboxila. Por analogia de função aos ortólogos conhecidos da discerina, Heiss e outros (1998) previram que a discerina está envolvida no ciclo celular e na função nucleolar.

FUNÇÃO DO GENE

McGrath (1999) comentou sobre a função da discerina em relação à sua difundida distribuição no tecido, à variedade dos aspectos clínicos na DKC, e a necessidade de se explicar a causa da displasia e das anormalidades da medula óssea nessa desordem. A estimativa/avaliação de homologia da sequência prognosticou que a discerina é uma proteína nuclear que é responsável por algumas etapas iniciais no processamento do RNA ribossômico, embora não tenha sido esclarecido se as mutações na discerina atrasariam a síntese dos ribossomos ou faria ribossomos funcionalmente anormais (Heiss e outros; 1998; Luzzatto e Karadimitris, 1998). A distribuição ubíqua da discerina sugeriu a McGrath (1999) que poderia haver redundância funcional em alguns tecidos, mas que sua função pode ser mais crítica em células com uma alta rotatividade, tais como os ceratinócitos (ou queratinócitos: células da epiderme viva e determinado eptélio oral que produz queratina no processo de diferenciação em células mortas e totalmente queratinizadas do estrato córneo. Stedman), epitélio da mucosa e medula óssea. Talvez nesses tecidos o risco do desenvolvimento de tumores malignos refletisse as conseqüências da tradução defeituosa provocada através da discerina mutada. A discerina também parece ser uma proteína do centrômero ou uma proteína do microtúbulo e, se mutada, pode dar surgimento a anormalidades na segregação dos cromossomos e a uma predisposição maligna.

Mitchell e outros (1999) demonstraram que a discerina está associada não somente com pequenos RNAs nucleolares H/ACA mas também com o RNA da Telomerase (TERC; omim 602322), a qual contém um motivo de RNA H/ACA. A telomerase adiciona simples repetições seqüenciais aos finais do cromossomo usando uma região interna de seu RNA como um molde e é requerida para a proliferação das células primárias humanas. Mitchell e outros (1999) descobriram que os fibroblastos e linfoblastos primários de maços afetados por DKC não eram detectavelmente deficientes na acumulação ou função dos pequenos RNA nucleolares H/ACA. Entretanto, as células DKC tinham níveis mais baixos de RNA telomerase, produziam atividade de telomerase em menores índices do que as células normais equivalentes, e tinham telômeros mais curtos. Mitchell e outros (1999) concluíram que a patologia da DKC é consistente com a função comprometida da telomerase levando a um defeito na manutenção do telômero, o que pode limitar a capacidade proliferativa das células somáticas humanas no epitélio e no sangue.

A proteína discerina é um componente do box H+ACA dos pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) e também está funcionalmente associada com o componente de RNA da TERC. A maioria das mutações causando disceratose congênita são mutações sem sentido, embora mutações não codificadoras tenham sido descritas. Uma dessas é uma mutação pontual (-141C-G; omim: 300126.0008) em um suposto sítio de ligação da Sp1 na região da ponta 5 a montante do gene DKC1, a qual presumivelmente representa a região promotora do gene. Salowsky e outros (2002) compararam as sequências do promotor de ambos os genes humano e do camundongo e proporcionaram uma caracterização funcional do promotor da DKC1 que incluía a caracterização das implicações associadas à doença caudadas pela mutação -141C-G. Por análises de gene repórter, as regiões funcionais do promotor da DKC1 foram delineadas. A região do cerne do promotora crítica para níveis básicos de transcrição foi encontrada por situar-se em – 10 a 180. Experimentos de deslocamento de bandas e super-deslocamento demonstraram claramente uma mútua ligação dos fatores de transcrição Sp1 e Sp3 para os sítios de ligação GCbox/Sp1 localizados no cerne da região promotora. Um Box GC adiciona interage somente com o fator de transcrição Sp1. Salowsky e outros (2002) proporcionaram evidencia de que a mencionada mutação DKC1 em um dos sítios de ligação de Sp1 resulta na reduzida atividade do promotor.

Montanaro e outros (2002) observaram que as linhas de células linfoblastóides de pacientes com disceratose congênita, a transcrição do rRNA e a capacidade de maturação e proliferativa permaneciam não diminuídas. O aumento do número de ciclos celulares levou a um elevado surgimento de uma fração apoptótica das células com disceratose congênita. Esses achados demonstraram que uma vez que as linhas de células com disceratose congênita não apresentassem defeitos proliferativos, elas mostravam níveis progressivamente crescentes de apoptose em relação ao número de divisões celulares. Essa observação é consistente com o atrasado estabelecimento dos defeitos da disceratose congênita nos tecidos proliferativos, os quais não emergem durante o desenvolvimento embrionário como se era de esperar com as alterações na biogênese do ribossomo, e com a severidade crescente dos defeitos nos tecidos proliferativos ao longo do tempo.

Wong e Collins (2006) descobriram que os fibroblastos primários da derme cultivados a partir de um paciente com DKC, submeteram-se à senescência prematura, consistente com a presença dos telômeros curtos, comparados com os fibroblastos cultivados a partir de sua avó materna assintomátic. a A expressão da TERT (omim: 187270 – Domínio catalítico da telomerase, ou telomerase transcriptase reversa : Comparações seqüenciais puseram as proteínas telomerases na família das transcriptases reversas mas revelaram marcas comprovadas que as distinguem das enzimas relacionadas a retrovírus e transpossons. Assim, as sub-unidades catalíticas propostas da telomerase são filogeneticamente conservadas e representam uma misteriosa derivação na evolução das transcriptases reversas.) exógena a partir de um vetor retroviral aumentou a atividade da telomerase nas células dos pacientes DKC, resultando num aumento no nível do estado estável da TERC e na eliminação da senecência prematura, mas não conferiu a manutenção da lente telomérica. As células dos pacientes DKC expressando ambas a TERT e TERC a partir de um único vetor retroviral ganharam e mantiveram telômeros longos. Seguindo a recuperação da senecência prematura, as células dos pacientes DKC de duas famílias diferentes tinham níveis normais de modificação da pseudouridina no rRNA e nenhum atraso dramático no processamento dos precursores de rRNA, em contraste com os fenótipos noticiados para modelos de camundongo com DKC. Wong e Collins (2006) concluíram que defeitos nas células de pacientes com DKC emergem somente a partir da reduzida acumulação da TERC.

Cohen e outros (2007) purificaram a telomerase humana 10(8)- vezes, com a elução final dependente da habilidade da enzima para catalisar a adição do nucleotídeo dentro do oligonucleotídeo de DNA da sequência telomérica, proporcionando dessa forma especificidade para a telomerase ativa cataliticamente. O sequenciamento da espectrometria de massa dos componentes da proteína e a determinação do tamanho molecular indicou uma composição da enzima de duas moléculas cada de TERT, TERC e discerina.

Machado-Pinilla e outros (2008) mostraram que a expressão da SE24-2, um elemento genético supressor codificador do domínio de sintase de pseudouridina da DKC1, aumentou a sobrevivência contra a cisplatina e os inibidores de telomerase nas células humanas. A GSE24-2 ativou o promotor de MYC (omim 190080: O proto-oncogene MYC codifica um fator de ligação a DNA que pode ativar e reprimir a transcrição. Por via desse mecanismo, o MYC regula a expressão de numerosos genes alvo que controlam funções celulares chaves, incluindo o crescimento da célula e o progresso do ciclo celular.)

Venteicher e outros (2009) mostraram que a TCAB1 (omim 612661: Imunoprecipitações mostraram que a TACB1 interagiu especificamente com a discerina, TERT e TERC, todos os principais componentes da telomerase ativa, e com os pequenos RNAs corpo de Cajal (scaRNAs), os quais estão envolvidos na modificação dos splicings de RNAs. Experimentos de imunoprecipitação e imunofluorescência mostraram que a TCAB1 é a subunidade de uma holoenzima (uma enzima completa) que é notavelmente enriquecida com corpos de Cajal, sítios nucleares de processamento de RNP (fosforilação de ribonucleotídeo?) que são importantes para a função da telomerase.) associa-se com a enima telomerase (TERT; omim 187270), estabilizou os componentes da telomerase inclusive a discerina e a TERC (omim 602322), e os pequenos RNAs corpos de Cajal (scaRNAs), os quais estão
envolvidos na modificação do splicing dos RNAs. A depleção da TCAB1 por uso de RNA de interferência impediu a associação da TERC aos corpos de Cajal, rompeu a associação telomerase-telômero, e anulou a síntese do telômero na telomerase. Assim, Venteicher e outros (2009) concluíram que a TCAB1 controla o tráfego da telomerase e é requerida para a síntese do telômero nas células humanas do câncer.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Rashid e outros (2006) determinaram a estrutura cristalina da proteína homóloga à discerina do Pyrococcus furiosus, Cbf5, em complexo com Nop10 (NOLA3; omim 606471) a uma resolução de 2,1 angstrons. Baseados na estrutura cristalina da Cbf5 e no alinhamento seqüencial da Cbf5 com a discerina humana, Rashid e outros (2006) determinaram que a maioria das mutações causadoras da disceratose colocalizam-se no lado 1 da sintase de pseudouridina e no domínio da transglicosilase de Archaeosina (PUA) da discerina, o qual é previsto por atuar num papel específico na ligação da H/ACA e dos RNAs da telomerase. Rashid e outros (2006) sugeriram que as mutações no domínio PUA poderiam despertar interações entre a discerina e seus RNAs cognatos, levando ao decréscimo na acumulação de RNAs. Alternativamente, as mutações poderiam afetar o sítio de ligação de um fator não identificado.

ESTRUTURA DO GENE

Hassock e outros (1999) determinaram que o gene DKC1 compreende 15 éxons expandindo-se em ao menos 16 quilobases e é transcrito em um mensageiro de 2,6 quilobases vastamente expressado. A cópia singular do gene DKC1 é transcrita a partir de uma ilha CpG a 60 quilobases em direção ao centrômero à distância do gene do fator VIII (omim 306700) no distante lócus Xq28 e se coloca caule a caule com o gene da proteína-1 da membrana do eritrócito palmitoilado (ácido palmitoleico é um ácido monoinsaturado com 16 carbonos; um dos constituintes comuns dos triacilgliceróis do tecido adiposo humano. Stedman) [omim 305360: A proteína da membrane do eritrócito (EMP55) é o protótipo de uma família de proteínas associadas a membrana chamada MAGUKs (homólogas da cinase guanilada associada a membrana). As MAGUs interagem com o citoesqueleto e regulam a proliferação celular, vias de sinalização e junções intracelulares (Kim e outros 1996). Ruff e outros deduziram a sequência completa de aminoácidos de uma proteína da membrana do eritrócito com 55 quilo-dáltons a partir de clones isolados de uma biblioteca de reticulócitos humanos (reticulócito é a jovem hemácia, ou eritrócito). Esta proteína, a p55, foi co-purificada durante o isolamento da dematina, uma proteína atando a actina do cito-esqueleto da membrana do eritrócito. Sua firme associação com a membrana plasmática foi reminiscente de uma proteína integrante de membrana. A proteína p55 é a proteína mais extensivamente palmitolada na membrana do eritrócito.]

GENÉTICA MOLECULAR

Heiss e outros (1998) demonstraram mutações de sentido trocado no gene de DKC1 que correlacionavam-se com a disceratose congênita. A doença é caracterizada pela manifestação precoce de pigmentação reticulada na pele, distrofia das unhas e leucoplaquia (uma placa branca da mucosa oral ou genital feminina que não pode ser removida e não pode ser diagnosticada clinicamente como qualquer entidade mórbida específica; no uso corrente, um termo químico sem conotação histológica.Stedman). A falência progressiva da medula óssea ocorre em 80% dos casos e é a principal causa da mortalidade precoce. A variabilidade na idade de início, a falência da medula óssea, e a amplitude das anormalidades congênitas foram observadas. Um risco aumentado de desenvolvimento de diferentes tipos de malignidades também existe. A instabilidade cromossômica é indicada pela aberração cromossômica da queratina (ceratina) nas culturas celulares de fibroblastos da pele e da metáfase (estágio de mitose ou meiose no qual os cromossomos são alinhados na placa equatorial da célula, separando os centrômeros. Na mitose e na segunda divisão meiótica, os centrômeros de cada cromossoma dividem-se, e os dois centrômeros filhos estão voltados para os pólos opostos da célula; na primeira divisão da meiose os centrômeros não se dividem, mas os centrômeros de cada par de cromossomos homólogos estão direcionados para pólos opostos. Stedman) na medula óssea. Em contraste com os pacientes com anemia Fanconi [omim 227650: A anemia Fanconi é uma desordem autosômica recessiva que afeta elementos da medula óssea, e está associada com malformações cardíacas, renais e dos braços bem como alterações na pigmentação da derme. Hirschman e outros (1969) noticiaram dois irmãos com anemia aplásica {caracterizada por formação muito diminuída de eritrócitos e hemoglobina, usualmente associada a granulocitopenia e trombocitopenia pronunciadas, em consequência de medula óssea hipoplásica ou aplásica.Stedman} similar à anemia Fanconi mas sem anomalias congênitas associadas. Ambos responderam à terapia com androgênio (p.ex.androsterona e testosterona) e mostraram aumentada ruptura cromossômica como na anemia Fanconi. Um tinha uma translocação cromossômica estável nas células da medula óssea. Os fibroblastos da pele do outro mostraram aumentada suscetibilidade para a transformação maligna pelo vírus SV40 (um poliomavírus que afeta símios e humanos), como na anemia Fanconi. Os fibroblastos da pele da mãe e da irmã, ambos normais, também mostraram aumentada suscetibilidade à transformação maligna.] os linfócitos dos pacientes DKC não mostram uma sensitividade aumentada para clastógenos (um agente que causa quebras cromossomiais, por exemplo, raios X.) Mulheres heterozigotas para o gene mutante mostraram um padrão de inativação do cromossomo X consistente com o defeito no gene dando surgimento à proliferação e/ou sobrevivência desvantajosa nas células que o expressam.

Knight e outros (1999) detectaram mutações no gene DKC1 em 21 das 37 famílias com disceratose congênita. Essas mutações consistiam com 11 substituições de único nucleotídeo, as quais resultavam e 10 mutações de sentido trocado e uma suposta mutação de splicing dentro de um íntron. A mudança de sentido trocado de Alanina 353 para Valina foi observada e 11 famílias diferentes e foi mostrada como um evento “de novo” recorrente. Dois polimorfismos também foram detectados, um deles resultou na inserção de uma lisina adicional no domínio terminal poli-lisina. É espantoso que a disceratose congênita ligada ao X seja predominantemente causada por mutações de sentido trocado.

Knight e outros (2001) rastrearam pacientes do sexo masculino de 25 famílias com disceratose congênita por mutações no gene DKC1. As variações seqüenciais foram detectadas em 10 dessas famílias. Em 5 famílias, as mutações previamente identificadas foram detectadas. Das cinco novas mudanças seqüenciais, 3 eram mudanças no código. A quarta mudança de sequência foi detectada na região que flanqueia a extremidade 5 que rompe um suposto sítio de ligação do fator de transcrição Sp1. Uma alteração intrônica também foi detectada como a incorporação parcial de uma porção do íntron 1 no mRNA. Esse foi o primeiro relato das mutações na DKC1 que foram previstos por afetarem os níveis de expressão da taxa de discerina mais do que sua sequência de aminoácidos. Isso sugere que um decréscimo na quantidade normal da proteína pode causar esta desordem.

Knight e outros (1999) identificaram mutações no gene DKC1 em pacientes com a síndrome de Hoyeraal-Hreidarsson [omim 300240: A síndrome de Hoyeraal-Hreidarsson é uma desordem multissistêmica afetando homens e é caracterizada por anemia aplásica {caracterizada por formação muito diminuída de eritrócitos e hemoglobina, usualmente associada a granulocitopenia e trombocitopenia pronunciadas, em consequência de medula óssea hipoplásica ou aplásica.Stedman} , imunodeficiência, microcefalia, hipoplasia cerebelar e crescimento atrasado.
Em cinco pacientes Japoneses do sexo masculino com presumida disceratose congênita ligada ao X, Kanegane e outros (2005) identificaram 4 mutações no gene DKC1, incluindo duas novas mutações de sentido trocado, Q31K e T357A.

MODELO ANIMAL

He e outros (2002) usaram um sistema Cre/loxP indutível para produzir deleções no gene murino Dkc1 na embriogênese inicial. Uma grande deleção carecendo dos éxons 12-15 e uma pequena deleção carecendo somente do último éxon foram produzidas. Eles descobriram que as duas deleções mostraram um efeito de origem parental 100% letal para o embrião quando a mutação ocorria na Dkc1 materna. Análises embrionárias aos 7 dias e meio e aos 9 dias e meio de gestação mostraram que nenhum dos embriões machos carregava as duas deleções, enquanto as fêmeas com deleções derivadas maternalmente morreram por volta dos nove dias e meio de gestação, com degeneração do tecido embrionário extra, nas quais o cromossomo X paterno estava inativado. Os camundongos fêmea carregando a deleção no Dkc1 derivado paternalmente mostraram extrema inativação do X (preso no espeto?) com o cromossomo X de tipo selvagem ativo em todas as células. Já que os camundongos sem nenhuma telomerase são viáveis nas primeiras gerações, a letalidade observada por He e outros (2002) foi unicamente causada pelos efeitos da discerina mutada na atividade da telomerase.

Rugero e outros (2003) geraram um camundongo mutante em Dkc1 hipomórfico que recaptulava o fenótipo DKC [omim 305000: As características da disceratose congênita (DKC ou DC) são pigmentação cutânea, distrofia das unhas, leucoplaquia da mucosa oral, contínuo lacrimejamento devido à atresia (ausência congênita de uma abertura normal ou luz normalmente de passagem para outros elementos) dos dutos lacrimais, freqüente trombocitopenia, anemia, e na maioria dos casos, atrofia testicular. Consistente com o padrão da herança recessiva ligada ao X, somente homens são afetados.] nas primeira e segunda gerações. As células dos camundongos machos homozigotos e das fêmeas heterozigotas mostravam um nível diminuído de expressão da Dkc1 (quatro e duas vezes respectivamente). Células com Dkc1 hipomórficas (hipomórfico é o gene mutante que provoca uma redução parcial na atividade controlada por ele. Stedman) da primeira e da segunda geração estavam diminuídas na pseudouridilação do RNA ribossômico antes do estabelecimento da doença. A redução da lente do telômero nos camundongos hipomórficos tornou-se evidente somente nas gerações seguintes. Ruggero e outros (2003) concluíram que a função desregulada do ribossomo é importante na iniciação da disceratose congênita, enquanto o encurtamento do telômero pode modificar e/ou exacerbar a disceratose congênita.

A discerina é uma proteína nucleolar presente em pequenas partículas de ribonucleoproteínas nucleolares que modificam resíduos específicos de uridina do RNA ribossômico por os converter em pseudouridina. A discerina também é um componente do complexo telomerase. Para testar a extensão em que o rompimento da pseudouridilação ou da atividade da telomerase possa contribuir na patogênese da disceratose congênita, Mochizuki e outros (2004) introduziram duas mutações na discerina dentro de células tronco embrionárias murinas: ala353 para Val (A353V; omim 300126.0006), a qual é a mais freqüente mutação em pacientes com disceratose congênita ligada ao X, e gly402 para glu (G402E; omim 300126.0005), a qual foi identificada em um único paciente. A mutação A353V, mas não a G402E, levou à severa desestabilização do RNA da telomerase, redução na atividade da telomerase, e uma significativa perda da lente telomérica com número aumentado de divisões celulares duante a cultura “in vitro”. Ambas as mutações causaram um defeito na pseudouridilação geral e um pequeno, porém detectável, decréscimo na taxa de processamento de RNA pré-ribossômico. Em adição, ambas as linhas de células tronco embrionárias mutantes mostraram um decréscimo na acumulação de um sub-conjunto de pequenos RNAs nucleolares H/ACA, correlacionando-se com um significativo decréscimo na eficiência da pseudouridilação em sítios específicos. Mochizuki e outros (2004) concluíram que as mutações pontuais na discerina podem afetar ambas as vias da telomerase e da pseudouridilação e que a extensão em que essas funções são alteradas pode variar segundo diferentes mutações.

Usando uma estratégia proteômica não tendenciosa, Yoon e outros (2006) descobriram um defeito específico na tradução dependente de IRES (sítio interno de entrada no ribossomo) nos camundongos mutados em Dkc1 e nas células dos pacientes com disceratose congênita ligada ao X. Esse defeito resulta na diminuída tradução dos mRNAs contendo elementos IRES, incluindo aqueles codificadores do supressor de tumor p27(Kip1) (600778) e os fatores antiapoptóticos Bcl-xl (600039) e XIAP (300079). Além disso os ribossomos derivados de camundongos com a Dkc1 mutada eram incapazes de administrar a tradução a partir de elementos IRES presentes nos mRNAs virais. Yoon e outros (2006) concluíram que seus achados revelaram um mecanismo potencial pelo qual a atividade defeituosa do ribossomo leva à doença e ao câncer.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300126