UM DESENPENHO PARA MANOSILAÇÕES EXPOSTAS NA APRESENTAÇÃO DE PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS PRÓRIAS DO SER HUMANO AOS LINFÓCITOS TCD4+

Suryasarathi Dasgupta,abc Ana-Maria Navarrete,abc Jagadeesh Bayry,abc Sandrine Delignat,abc Bharath Wootla,abc Sébastien André,abc Olivier Christophe,de Michelina Nascimbeni,fg Marc Jacquemin,h Luisa Martinez-Pomares,i Teunis B. H. Geijtenbeek,j Arnaud Moris,k Jean-Marie Saint-Remy,h Michel D. Kazatchkine,abc Srinivas V. Kaveri,abc and Sébastien Lacroix-Desmazesabcl


Várias proteínas próprias do ser humano elicitam respostas imunes quando administradas aos pacientes. Essas respostas imunes adversas reduzem a eficácia da droga (do remédio). Para induzir uma resposta imune, uma proteína tem que interagir com diferentes células imunes, incluindo as células apresentadoras de antígenos, células T e células B. Cada tipo de célula reconhece padrões imunogênicos ou antígenos distintos. Glicanas com terminação em manose têm sido identificadas como padrões moleculares associados a patógenos que são essenciais para a internalização dos micróbios pelas células apresentadoras de antígenos, levando à apresentação. Aqui, nós investigamos a importância da manosilação exposta em uma proteína terapêutica própria do ser humano, o fator VIII humano pró-coagulante (FVIII). A administração do FVIII terapêutico aos pacientes de hemofilia A induz anticorpos inibitórios anti-FVIII em mais de 30% dos casos. Nós demonstramos que a entrada do FVIII nas células dendríticas (DC) levando à ativação da célula T, é mediada por glicanos com terminação e manose no FVIII. Além disso, nós identificamos o receptor de manose do macrófago (CD206) como um receptor endocítico candidato para o FVIII na DC. A saturação de receptores de manose nas DC com manana, e a remoção enzimática de glicanos manosilados a partir do FVIII levaram à ativação reduzida das células T. A interação entre o FVIII e a CD206 foi bloqueada pelo VWF, sugerindo que, sob condições fisiológicas, a imunogenicidade dependente de manose intrínseca ao FVIII é suprimida por imunochaperones endógenas. Esses dados proporcionam uma ligação entre a manosilação de proteínas próprias terapêuticas e sua imunogenicidade iatrogênica (referente a uma resposta a tratamento clínico ou cirúrgico induzida pelo próprio tratamento; termo habitualmente utilizado para indicar respostas desfavoráveis. Stedman). Tal ligação seria de especial relevância no contexto da terapia de reposição onde mecanismos de tolerância central e periférica não tenham sido estabelecidos durante a ontogenia (desenvolvimento do indivíduo independente da filogenia que é o desenvolvimento evolutivo da espécie) devido à ausência do antígeno.

Palavras-chave: dendritic cells, factor VIII, hemophilia, mannose receptor, mannosylated glycans.

INTRODUÇÃO

Várias proteínas próprias terapêuticas, incluindo produtos isolados do sangue humano, citocinas humanas recombinants, e fatores de crescimento recombinantes elicitam respostas imunes quando administrados aos pacientes. Essas respostas imunes adversas às moléculas próprias terapêuticas reduzem a eficácia e a potência da droga. Em particular, o tratamento dos episódios de sangramento nos pacientes de hemofilia A (HA) pela administração do fator VIII exógeno (FVIII) para restaurar a hemostasia normal resulta na emergência de aloanticorpos (aloanticorpo é um anticorpo específico para aloantígenos; aloantígeno é um antígeno que ocorre em alguns, mas não em todos os membros de uma espécie. Stedman) inibitórios anti-FVIII em mais de 30% dos casos. A ocorrência de inibidores do FVIII complica dia a dia a administração aos pacientes, embaraça o resultado clínico e representa um pesado fardo sócio-econômico.


O FVIII é uma glicoproteína heterodimérica composta de uma cadeia pesada com a estrutura A1-a1-A2-a2-B e uma cadeia leve com a estrutura a2-A3-C1-C2. Glicanos no FVIII terminam tanto com resíduos de galactose, fucose [uma metilpentose cuja configuração L é encontrada nos mucopolissacarídeos das substâncias dos grupos sanguíneos, no leite humano (como um polissacarídeo) e na composição de outras substâncias encontradas na natureza. A configuração D é encontrada em alguns antibióticos e em certos glicosídeos vegetais. Stedman] ou manose. A maioria das glicoformas terminando com resíduos de galactose é sialiada [ácido é um composto que libera um íon de hidrogênio em um solvente polar (ex. água); os ácidos formam sais substituindo todo o hidrogênio ionizável ou parte dele por um elemento ou radical eletropositivo. Stedman – ácidos siálicos são ésteres e outros derivados N-acil ou O-acil do ácido neuramínico; os radicais dos ácidos siálicos são sialoil, se o OH do COOH for removido, e sialosil, se o OH provém do carbono anomérico (C-2) da estrutura cíclica. – sialidase é uma enzima que cliva resíduos acetilneuramínicos terminais dos oliossacarídeos, glicoproteínas ou glicolipídios; presente no antígeno de superfície do mixovírus; utilizada em histoquímica para remoção seletiva de sialomucinas, como das glândulas mucosas brônquicas e do intestino delgado; a deficiência dessa enzima resulta em sialidose.] o que protege o FVIII da ligação ao receptor endocítico de asialoglicoproteínas [ASGR1 – omim 108360 – o gene ASGR1 codifica uma licoproteína que forma o receptor de asialolicoproteínas, também conhecido como receptor Ashwell, o qual é específico para glicoproteínas desialiadas (com terminal galactosil) e é expressado exclusivamente nas células do parênquima hepático.] As glicosilações terminando em manose não são, entretanto capturadas por sialização. Elas são encontradas na Asparagina 2118 e na Asparagina 239, e formam o segundo tipo de glicanos mais prevalentes no FVIII.
A natureza dos linfócitos T e B específicos para o FVIII envolvidos nas respostas imunes anti-FVIII tem sido elucidada. Pouco se sabe, entretanto, sobre a entrada do FVIII nas células profissionais apresentadoras de antígenos (APCs), um evento anterior à ativação dos efetores imunes e mandatório para a elicitação das respostas imunes primárias ao FVIII.


A presença de glicanos terminados em manose no FVIII é interessante com respeito a isso. A manosilação de antígenos não-próprios têm sido mostrada por aumentar sua endocitose pelas células dendríticas (DC) e subseqüente apresentação aos linfócitos T antígeno-específicos. Não obstante, as DC expressam vários receptores de lectina tipo C endocíticos (CLRs), incluindo o receptor de manose dos macrófagos (CD206), a ICAM3 específica de células dendríticas [omim – 146631 - Fawcett e outros (1992) clonaram um terceiro ligante para LFA1 (153370 integrina alfa L ;600065 itegrina beta 2) ; veja também ICAM1 e ICAM2. ICAM1 e ICAM2 são membros da superfamília das imunoglobulinas. A interação da LFA1 com a ICAM proporciona sinais de adesão acessórios esenciais em muitas interações imunes, incluindo aquelas entre os linfócitos T e B e as células T citotóxicas e seus alvos. Ambas as ICAMs são expressadas em pouca quantidad no endotélio vascular em descanso; a ICAM1 é fortemente sobre-regulada por estímulos de citocinas e atua num papel chave na detenção dos leucócitos nos vasos sanguíneos em sítios de inflamação e lesão. Os leucócitos em descanso foram mostrados por expressarem um terceiro ligante para LFA1, a ICAM3. A ICAM3 é potencialmente a mais importante ligante para LFA1 na iniciação da resposta imune porque a expressão da ICAM1 nos leucócitos em descanso é baixa. Fawcett e outros (1992) usaram a expressão de um clone para isolar um cDNA codificador da proteína que é constitutivamente expressada em todos os leucócitos e que se liga a LFA1. A ICAM3 é estritamente aparentada a ICAM1, consiste de 5 domínios de imunoglobulina e lia-se a LFA1 através de seus dois domínios no terminal N. Vazeux e outros (1992) clonaram a mesma molécula de adesão intercelular, à qual eles se referiram como ICAM-R. O cDNA tinha 1.781 pares de bases, com uma sequencia aberta de leitura de 1.640 pares de bases iniciando com um códon ATG na posição 16, sequido de um segundo ATG na posição 24. A identidade geral da estrutura da proteína com ICAM1 e ICAM2 era de 48% e 31%, respectivamente, com um grau de similaridade variando entre domínios individuais.] que se agarram a não-integrina (sinal DC) e dectina 2, as quais se ligam a residuos de manose expostos nas glicoproteínas através de seus domínios de reconhecimento de carbohidratos (CRDs).

Aqui nós investigamos a relevância da manosilação exposta no FVIII como um ligante para a entrada do FVIII na DC, o requerimento inicial para a indução de uma resposta imune específica. As DC foram usadas como APCs porque elas são indicadas como as mais críticas APCs profissionais para indução das respostas imunes primárias e são um modelo estabelecido para entender a imunogenicidade de ligantes manosilados. Para validar que a endocitose do FVIII pelas DCs leva à apresentação aos linfócitos TCD4+ nós pesquisamos a ativação de um clone celular da célula TCD4+ específica para o FVIII. Nossos resultados demonstram que os resíduos expostos de manose no FVIII atuam num papel significativo em sua captura pelas DC derivadas de monócitos e que a remoção dos resíduos expostos de manose leva a uma significativa reedução na apresentação aos linfócitos T.

RESULTADOS

Receptores sensíveis a manose mediam a endocitose do FVIII pelas DCs.

Primeiro nós estudamos a endocitose do FVIII pela DC derivada do monócito humano imaturo. A incubação das DC com FVIII conjugado a FITC (FVIII-FITC) resultou em um etiquetamento das células com FVIII dependente da dose e do tempo (dados não mostrados) e o etiquetamento dependente da dose das células com FVIII. Nós confirmamos que o FVIII é internalizado por uso de microscopia confocal. A alta porcentagem de células etiquetadas com FVIII-FITC após duas horas de incubação e o fato de que o excesso molar de 10 vezes do FVIII não conjugado inibiu a internalização do FVIII-FITC para mais de 60% (dados não mostrados) é sugestivo de uma endocitose do FVIII mediada por receptor. Para investigar a natureza do(s) recepor(es) envolvidos na endocitose do FVIII, nós incubamos as células por 30 min a 37oC com tanto 5mM EDTA, mannana (1mg/ml) ou galactose (1mg/ml) antes da adição do FVIII-FITC. A endocitose a 4oC foi usada como controle.

A endocitose do FVIII-FITC foi inibida para mais de 92+ 16,5% (P<0,01) no caso da EDTA. Estes dados implicam um papel para os receptores dependentes de íons bivalentes na endocitose do FVIII pelas DC. A EDTA também é conhecida por mediar a dissociação das subunidades do FVIII. O efeito inibitório da EDTA, entretanto, não foi devido à dissociação do FVIII induzida pela EDTA, porque a dissociação das subunidades do FVIII requer concentrações mais altas de EDTA e períodos mais longos de incubação do que os usados em nossos ensaios.


O policarbohidrato manana, um modelo de ligante competitive para a captura sensitivo à manose, reduziu a captura do FVIII-FITC para 60 + 19% (P<0,01), enquanto a galactose, um ligante competitivo para captura sensível a galactose, não teve efeito significativo. A especificidade da manana para CLRs (receptores de lectina tipo C) sensitivos a manose foi confirmada em nosso preparo experimental usando dextran etiquetado com FITIC, um típico ligante para CLRs sensíveis a manose, especialmente a CD20, e lúcifer amarelo (LY), a internalização dos quais procede exclusivamente pela macropinocitose independente de receptor. A internalização do dextran foi bloqueada em 89 + 9,3% na presença de manana, enquanto a da LY não foi afetada. Os resultados indicam que os receptores sensíveis a manose mediam uma parte significativa da endocitose do FVIII pela DC.



CD206 é uma candidata a receptor de manose para o FVIII.

Nós executamos ELISAs de lectina com contruções de Fc de receptores de manose candidatos a serem expressados pelas DC, CD206, e SINAL-DC. O FVIII ligou-se de maneira dependente da dose e sensitiva à manose à CD206, mas não ao SINAL-DC (dados não mostrados). A CD 206 contém vários domínios extracelulares: um domínio rico em cisteína (CR), um domínio de fibronectina tipo II (FNII), e oito domínios de reconhecimento de carbohidrato similares a lectina de tipo C (CTDL). Os ensaios de ligação direta foram executaodos usando a contrução CTLD4-7-Fc e a contrução CR-FNII-CTLD1-3-Fc não ligante de manose. O FVIII interagiu especificamente com os domínios CTLD4-7-Fc e não com o resto da molécula. A manana inibiu de modo dependente da dose a interação do FVIII com o CTLDA-4-7-Fc.


A endocitose do FVIII sensitiva à manose pelas DCs leva à apresentação dos peptídios derivados do FVIII aos linfócitos TCD4+.

Então nós exploramos se a endocitose do FVIII pela DC através da rota sensitiva a manose resulta no processamento do FVIII e na apresentação de peptídeos derivados do FVIII às células T. A incubação com o clone de células TCD4+ humanas específicas para o FVIII D9E9 e com a DC de doadores igualados em HLA, resultou numa ativação das D9E9 dependente da dose, como mensurado pela liberação de IFN-y, em uma cultura sobrenadante. O Fator IX, usado como um antígeno de controle negativo, falhou em ativar as D9E9, indicando que a DC ativa a D9E9 de modo antígeno-específico. O bloqueio dos receptores sensíveis a manose por pré-incubação de DCs com manana antes da adição do FVIII, resultou numa dramática redução dependente da dose (mais de 80%) da ativação das D9E9. O bloqueio dos receptores de manose com uma dose de saturação de IgG anti-CD206 (10μg/ml) resultou em uma significativa inibição da produção de IFN-y, confirmando que a CD206 participa na endocitose do FVIII. A inibição da endocitose do FVIII foi menor no caso da IgG anti-CD206 do que no caso da manana. Esta última diferença pode ser explicada pela multivalência da manana, o que pode conferir-lhe a hablidade de mascarar vários CRDs (domínios de reconhecimento de carbohidratos) na CD206 ao contrário do limitado obstáculo espacial proporcionado pelos anticorpos monoclonais. Alternativamente, outros receptores sensitivos a manose também podem estar envolvidos e sinergizar com a CD206 na captura do FVIII.

Para excluir um efeito inibitório direto da manana ou da IgG anti-CD206 na capacidade das DC para ativar as células T, nós usamos como um antígeno, o peptídeo de 18-mer (mer é um sufixo para indicar a menor unidade de uma estrutura repetitiva) não glicosilado derivado do FVIII I 2144-T2161 (Isoleucina 2144 – Treonina 2161), conhecido por ser um epítopo alvo para a D9E9. Não há evidência de que o peptídeo I2144-T2161 precise ser internalizado pelas DC para ativar a D9E9. Como retratado na figura 3B, as D0E9 foram ativadas pelas DC incubadas com o peptídeo I2144-T2161 independentemente da presença ou ausência de manana ou da IgG anti-CD206. Então nós investigamos se a manana tem um efeito inibitório direto na capacidade das células T serem ativadas. Com este fim, nós pesquisamos uma linha d célula B de HLA combnado humana não específica para FVIII e duas específicas para FVIII, LE56, LE2E9, e BO2C11. A LE2E9 e a BO2C11 internalizam o FVIII através de seus receptores de célula B (BCR). As três linhas celulares tem sido usadas como APCs para a ativação das D9E9. A manana na impediu a ativação da D9E9 por nenhuma das linhas de células B incubadas na presença do FVIII. Juntos, esses dados validam que os efeitos inibitórios da manana e da IgG anti-CD206 na ativação da D9E9 resultam do bloqueio da endocitose do FVIII sensitiva à manose pela DC.



Dos 23 glicanos do FVIII, 19 estão localizados no domínio B da molécula, dois na cadeia leve e dois na cadeia pesada. Primeiro nós confirmamos por análise de espectro de massa a presença de glicanas com terminação em manose nos sítios das Asn239 e na Asn2118 (asparagina 239 e 2118) do FVIII com domínio B deletado (BDD-FVIII) e sua ausência no domínio B do FVIII de lente completa (dados não mostrados). Depois nós comparamos a endocitose do FVIII de lente total e do FVIII com domínio B deletado pelas DCs. A inibição da captura de ambas as formas do FVIII foi saturada na mesma concentração de manana (100μg/ml), confirmando o envolvimento dos glicanos terminados em manose localizados fora do domínio B na captura do FVIII. A inibição da captura do dextran, um modelo de ligante para a CD206, foi saturada na mesma concentração de manana, enfatizando ainda mais o papel da CD206 na endocitose do FVIII sensitiva à manose.


Então nós submetemos o FVIII com domínio B deletado à desglicosilação enzimática suave com EndoF1. A EndoF1 cliva estruturas oligomanose e oligossacarídeos híbridos, mas não oligossacarídeos complexos. A remoção de estruturas de oligomanose no tratamento com a EndoF1 foi indicada por uma alteração no perfil de migração do BDD-FVIII. A desmanosilação do BDD-FVIII estava associada com menos ligação do FVIII aos domínios CRLD4-7 sensitivos à manose da CD206, como evidenciado pelo Western blot e pelo uso da abordagem ressonância de plasmônio (plasmônio é o total dos determinantes genéticos extracromossômicos do citoplasma da célula eucariótica. Stedman) de superfície (SPR). Consequentemente, as DC incubadas com o BDD-FVIII tratados com EndoF1 ativaram as D9E9 em menor extensão do que aquelas incubadas com o BDD-FVIII nativo (P< 0,0001 no caso das DC de três doadores diferentes). De nota, a desmanosilação do BDD-FVIII não foi tão eficiente na redução da ativação da célula T quanto a saturação dos receptores de manose na DC usando-se manana. A ligação residual do BDD-FVIII tratado com Endo-F1 ao domínio CTLD4-7 observada por uso de SPR e a habilidade residual do BDD-FVIII tratado com EndoF1 em ativar a D9E9 pode ser atribuída à presença de glucosaminas-N-acetil remanescentes no FVIII, as quais apresentam-se com moderada afinidade para a CD206.



A ligação do FVIII aos receptores sensitivos à manose é inibida pelo VWF.

O vWF é uma proteína chaperone (acompanhante) do FVIII. Recentemente nós demonstramos que o vWF protege o FVIII de ser endocitado pela DC. O vWF inibiu de modo dependente da dose e mais de 80% a ligação do FVIII ao CTLD4-7-Fc. Experimentos de controle validaram a ausência da ligação direta do VWF ao CTLD4-7-Fc e a ausência da inibição da ligação do FVIII ao CTLD4-7 pela albumina, usada como uma proteína irrelevante a concentrações equimolares às do VWF (dados não mostrados).

DISCUSSÃO

A entrada do antígeno nas APCs, e particularmente na DC, pode levar tanto à tolerância ao antígeno, ou, ao contrário, à ativação da resposta imune antígeno-específica. O fato da resposta, tanto tolerogênica quanto imunogênica, é governado por vários fatores: a natureza dos sinais proporcionados pelo antígeno para a DC, a quantidade de antígeno internalizado pela DC e apresentado às células T, o nível de maturação das células DC, a força e o tipo de sinais na sinapse das células DC e T, e o microenvolvimento das citocinas. De fato, “in vivo”, a endocitose do FVIII é seguida tanto pela iniciação da resposta imune anti-FVIII, como visto em 30% dos pacientes de hemofilia A, quanto pela indução de uma ativa tolerância própria, como recentemente descrito em indivíduos saudáveis. Entre os fatores mencionados acima, a entrada do antígeno na DC, ainda que não suficiente, é mandatório para a preparação das efetoras imunes específicas para o antígeno. Aqui, nós demonstramos que os resíduos de manose expostos no FVIII, usados como um modelo de proteína própria terapêutica que é imunogênica, contribui para sua entrada na DC. Nós demonstramos além que a captura sensitiva à manose do FVIII leva ao processamento e à apresentação de peptídeos derivados de FVIII aos linfócitos TCD4+. Nossas observações documentam um papel potencial para os receptores sensitivos à manose nas células profissionais apresentadoras de antígeno e para as metades (partes) de manose nas proteínas terapêuticas próprias humanas, tais como o FVIII, em sua imunogenicidade.


Nós demonstramos a relevância da manosilação exposta no FVIII para sua interação com as APCs e sua apresentação aos efetores imunes usando duas abordagens complementares: saturação de receptores de manose nas DC usando manana e leve desglicosilação do FVIII. A glicosilação em um antígeno deverá influenciar tanto a entrada do antígeno na DC, ou seu processamento intracelular, a entrada dos peptídeos derivados do antígeno no sulco das moléculas de MHC II, e/ou o reconhecimento dos complexos MHC II/peptídeo pelos TCR (receptor de célula T). Usando a endocitose do FVIII como uma excomunhão, nós mostramos claramente uma redução quantitativa da entrada do FVIII na DC quando a interação entre o FVIII e os receptores sensitivos à manose está perturbada. Assim, a manosilação conta para > 60% da captura do FVIII. A descoberta de uma captura residual do FVIII em 40% a despeito da ruptura da via sensitiva à manose indica o envolvimento de processo endocítico alternativo para o FVIII que resta a ser identificado. Nossos dados não publicados sugerem que membros da família dos receptores de lipoproteínas de baixa densidade e o receptore endocíticos sensitivos à manose Sinal DC nas DC derivadas de monócitos não estão implicados. A concentração do FVIII usada nos ensaios de endocitose foi muito mais alta do que a encontrada nos pacientes com hemofilia A em administração com o FVIII terapêutico. Por isso nós recorremos ao ensaio de ativação da célula T, no qual as DC foram encubadas com FVIII em concentrações próximas às alcançadas nos pacientes. O clone de célula T D9E9 então produziu 26+8 e 711+64 pg/ml de IFN-y (significa +SD) a 1 e 7 nM de FVIII, respectivamente. Esses dados confirmam que, em valores próximos aos níveis da terapia de reposição, a endocitose sensitiva à manose do FVIII pelas células DC leva à apresentação do FVIII a e à ativação dos linfócitos TCD4+.

O uso do ensaio de ativação das D9E9 não nos permite decifrar o papel direto dos glicanos manosilados no processamento, entrada, ou reconhecimento dos peptídios de FVIII. Entretanto, devido à D9E9 ser específica para epítopos não glicosilados do FVIII localizados entre os aminoácidos I2144 e T2161, esses dados indicam que a manosilação de toda a molécula de FVIII governa a apresentação de epítopos não glicosilados. Os três principais conjuntos de epítopos das células B para inibidores de FVIII estão localizados nos domínios A2, A3 e C2 do FVIII. Interessantemente, nenhum desses domínios é manosilado. É tentador especular que a alteração do padrão de manosilação do FVIII possa reduzir a apresentação de peptídeos epítopos derivados de regiões antigênicas do FVIII pelas DC aos linfócitos TCD4+. De fato, a remoção do açúcar manosilado na asparagina 2118 na cadeia leve do FVIII por mutagênese direcionada ao sítio aboliu completamente a ativação da D9E9 na incubação da cadeia leve mutada de Asn2118 para Ala (alanina) com as DC como APCs (S.Dasgupta, O.C., S.V.K., e S.L.-D, dados preliminares não publicados). Em contraste, a D9E9 foi ativada na apresentação da cadeia leve Asn2118Ala pelas BO2C11. O uso de produtos FVIII demanosilados mutados pode revelar uma estratégia previamente inusitada para reduzir o risco de inibidores em pacientes HA.


Nesse estudo, nós identificamos a CD206 como um candidato a receptor endocítico
sensitivo a manose para o FVIII nas DC. A CD206 tem sido implicada na homeostase de várias glicoproteínas manosiladas do soro pró-inflamatórias. Convergentemente, a CD206 tem sido mostrada por mediar a endocitose de um número de antígenos microbianos em virtude de sua manosilação exposta, estimulando assim as respostas de células T específicas para antígenos. Interessantemente, a interação de antígenos da tiróide com a CD206 nas APCs localizadas na glândula ou nos linfonodos drenantes tem sido implicada nas respostas auto-imunes patológicas aos antígenos da tireóide. A expressão exacerbada da CD206 tem sido associada com várias situações patológicas. Assim, as DC de pacientes com alergia ao ácaro da poeira caseira expressam mais CD206 do que as dos doadores saudáveis, e internalizam Derp 1, um antígeno principal do ácaro alérgeno, mais eficientemente. Similarmente, enquanto as células de Langerhans da pele humana normal não expressam CD206, as DC da epiderme inflamatória de pacientes com dermatite atópica e psoríase vulgaris expressam CD206 “in situ” e usam ela para a endocitose mediada por receptor. Presumivelmente, o baço é o principal órgão imunocompetente onde a resposta imune ao FVIII tem lugar. Nossos dados preliminares demonstram que a CD206 pode ser expressada pelas DC mielóides do baço e sugerem a funcionalidade da via endocítica dependente de CD206. (M. Nascimbeni, A. Hosmalin, L.Garderet, e B.Fabiani, observações não publicadas.)


Em adição às DC, as células B podem atuar como APCs eficientes e internalizar o antígeno para qual elas são específicas através de seus receptores de superfície de célula B. Assim, nos pacientes HÁ que já tenham sido tratados com FVIII, as células B específicas para o FVIII podem ser ativadas e participarem na endocitose do FVIII terapêutico a apresentá-lo às células T. Diferentemente das DC, entretanto, as células B carecem de outros receptores endocíticos tais como receptores sensitivos a manose. De acordo, a manana não bloqueou a ativação das células T quando as células B específicas para o FVIII (BO2C11 e LE2E9) e as células B não específicas para o FVIII (LE56) foram usadas como APCs. Juntos estes dados sugerem que, em uma situação onde as células B específicas para o FVIII não tenham sido disparadas (isto é, em pacientes que não receberam o FVIII exógeno ainda), os receptores de manose nas DC são a porta de entrada preferencial para o FVIII nas APCs. Em fisiologia, o FVIII circula complaxado com o vWF e é protegido da degradação por enzimas circulantes e anticorpos enzimáticos. O vWF tem sido proposto por reduzir a imunogenicidade do FVIII em pacientes com HA. Interessantemente, nós demonstramos recentemente que o VWF reduz a captura do FVIII pelas DC e a ativação das células T específicas para o FVIII. Nós noticiamos aqui que o VWF bloqueia a ligação do FVIII à CD206 de modo dependente da dose. Se o vWF pode reduzir a imunogenicidade do FVIII por esconder estereoquimicamente (em relação ao espaço tridimensional da molécula) a interação do FVIII com os receptores sensitivos à manose e assim prevenir sua captura pelas DC permanece por ser formalmente demonstrado.


Aqui nós propusemos uma ligação entre a manosilação de uma proteína terapêutica própria e sua imunogenicidade iatrogênica (resposta relativa ao tratamento). A associação das proteínas manosiladas com moléculas chaperones (acompanhantes) endógenas, tais como VWF, regula suas interações com receptores endocíticos, dessa forma restringindo a ativação de efetores imunes. Em algumas situações, entretanto, o equilíbrio ligante/receptor está perturbado, possivelmente levando ao disparo de reações imunes deletérias não desejadas. De fato, a expressão de receptores sensitivos à manose nas DC podem ser sobre-regulados como uma resposta a sinais inflamatórios. Alternativamente, a formação de complexos entre proteínas manosiladas e chaperones endógenas pode ser impedida, como é visto no caso do FVIII terapêutico recombinante que se associa incompletamente ao VWF. Esse equilíbrio perturbado representa um fator agravante no contexto da terapia de reposição onde um antígeno próprio está ausente e onde mecanismos de tolerância central e periférica não tenham sido estabelecidos durante a ontogenia (desenvolvimento do indivíduo aparte do desenvolvimento evolutivo).


FVIII
factor VIII
HA
hemophilia A
BDD-FVIII
B domain-deleted FVIII
DC
dendritic cells
VWF
von Willebrand factor
CLR
C-type lectin receptor
CTLD
C-type lectin-like domain


FONTE: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=17502612

*DISCERINA; DKC1
Gene map locus Xq28

CLONAGEM

Por clonagem posicionada, Heiss e outros (1998) identificaram um gene, simbolizado DKC1, na região Xq28 que é a causa da disceratose (queratinização prematura de células epiteliais individuais que não alcançavam a camada superficial queratinizante; as células disceratóticas geralmente se tornam arredondadas e podem separar-se das células adjacentes e desprender-se. Stedman) congênita recessiva ligada ao X (DKC; omim 305000). Heiss e outros (1998) descobriram que o gene DKC1 é altamente conservado cruzando as barreiras entre as espécies e é o ortólogo do NAP57 do rato e do Cbf5 da S.cerevisiae. O produto do gene, referido como discerina, contém dois motivos TruB de sintase de pseudouridina, múltiplos sítios de fosforilação, e um domínio rico em lisina no terminal carboxila. Por analogia de função aos ortólogos conhecidos da discerina, Heiss e outros (1998) previram que a discerina está envolvida no ciclo celular e na função nucleolar.

FUNÇÃO DO GENE

McGrath (1999) comentou sobre a função da discerina em relação à sua difundida distribuição no tecido, à variedade dos aspectos clínicos na DKC, e a necessidade de se explicar a causa da displasia e das anormalidades da medula óssea nessa desordem. A estimativa/avaliação de homologia da sequência prognosticou que a discerina é uma proteína nuclear que é responsável por algumas etapas iniciais no processamento do RNA ribossômico, embora não tenha sido esclarecido se as mutações na discerina atrasariam a síntese dos ribossomos ou faria ribossomos funcionalmente anormais (Heiss e outros; 1998; Luzzatto e Karadimitris, 1998). A distribuição ubíqua da discerina sugeriu a McGrath (1999) que poderia haver redundância funcional em alguns tecidos, mas que sua função pode ser mais crítica em células com uma alta rotatividade, tais como os ceratinócitos (ou queratinócitos: células da epiderme viva e determinado eptélio oral que produz queratina no processo de diferenciação em células mortas e totalmente queratinizadas do estrato córneo. Stedman), epitélio da mucosa e medula óssea. Talvez nesses tecidos o risco do desenvolvimento de tumores malignos refletisse as conseqüências da tradução defeituosa provocada através da discerina mutada. A discerina também parece ser uma proteína do centrômero ou uma proteína do microtúbulo e, se mutada, pode dar surgimento a anormalidades na segregação dos cromossomos e a uma predisposição maligna.

Mitchell e outros (1999) demonstraram que a discerina está associada não somente com pequenos RNAs nucleolares H/ACA mas também com o RNA da Telomerase (TERC; omim 602322), a qual contém um motivo de RNA H/ACA. A telomerase adiciona simples repetições seqüenciais aos finais do cromossomo usando uma região interna de seu RNA como um molde e é requerida para a proliferação das células primárias humanas. Mitchell e outros (1999) descobriram que os fibroblastos e linfoblastos primários de maços afetados por DKC não eram detectavelmente deficientes na acumulação ou função dos pequenos RNA nucleolares H/ACA. Entretanto, as células DKC tinham níveis mais baixos de RNA telomerase, produziam atividade de telomerase em menores índices do que as células normais equivalentes, e tinham telômeros mais curtos. Mitchell e outros (1999) concluíram que a patologia da DKC é consistente com a função comprometida da telomerase levando a um defeito na manutenção do telômero, o que pode limitar a capacidade proliferativa das células somáticas humanas no epitélio e no sangue.

A proteína discerina é um componente do box H+ACA dos pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) e também está funcionalmente associada com o componente de RNA da TERC. A maioria das mutações causando disceratose congênita são mutações sem sentido, embora mutações não codificadoras tenham sido descritas. Uma dessas é uma mutação pontual (-141C-G; omim: 300126.0008) em um suposto sítio de ligação da Sp1 na região da ponta 5 a montante do gene DKC1, a qual presumivelmente representa a região promotora do gene. Salowsky e outros (2002) compararam as sequências do promotor de ambos os genes humano e do camundongo e proporcionaram uma caracterização funcional do promotor da DKC1 que incluía a caracterização das implicações associadas à doença caudadas pela mutação -141C-G. Por análises de gene repórter, as regiões funcionais do promotor da DKC1 foram delineadas. A região do cerne do promotora crítica para níveis básicos de transcrição foi encontrada por situar-se em – 10 a 180. Experimentos de deslocamento de bandas e super-deslocamento demonstraram claramente uma mútua ligação dos fatores de transcrição Sp1 e Sp3 para os sítios de ligação GCbox/Sp1 localizados no cerne da região promotora. Um Box GC adiciona interage somente com o fator de transcrição Sp1. Salowsky e outros (2002) proporcionaram evidencia de que a mencionada mutação DKC1 em um dos sítios de ligação de Sp1 resulta na reduzida atividade do promotor.

Montanaro e outros (2002) observaram que as linhas de células linfoblastóides de pacientes com disceratose congênita, a transcrição do rRNA e a capacidade de maturação e proliferativa permaneciam não diminuídas. O aumento do número de ciclos celulares levou a um elevado surgimento de uma fração apoptótica das células com disceratose congênita. Esses achados demonstraram que uma vez que as linhas de células com disceratose congênita não apresentassem defeitos proliferativos, elas mostravam níveis progressivamente crescentes de apoptose em relação ao número de divisões celulares. Essa observação é consistente com o atrasado estabelecimento dos defeitos da disceratose congênita nos tecidos proliferativos, os quais não emergem durante o desenvolvimento embrionário como se era de esperar com as alterações na biogênese do ribossomo, e com a severidade crescente dos defeitos nos tecidos proliferativos ao longo do tempo.

Wong e Collins (2006) descobriram que os fibroblastos primários da derme cultivados a partir de um paciente com DKC, submeteram-se à senescência prematura, consistente com a presença dos telômeros curtos, comparados com os fibroblastos cultivados a partir de sua avó materna assintomátic. a A expressão da TERT (omim: 187270 – Domínio catalítico da telomerase, ou telomerase transcriptase reversa : Comparações seqüenciais puseram as proteínas telomerases na família das transcriptases reversas mas revelaram marcas comprovadas que as distinguem das enzimas relacionadas a retrovírus e transpossons. Assim, as sub-unidades catalíticas propostas da telomerase são filogeneticamente conservadas e representam uma misteriosa derivação na evolução das transcriptases reversas.) exógena a partir de um vetor retroviral aumentou a atividade da telomerase nas células dos pacientes DKC, resultando num aumento no nível do estado estável da TERC e na eliminação da senecência prematura, mas não conferiu a manutenção da lente telomérica. As células dos pacientes DKC expressando ambas a TERT e TERC a partir de um único vetor retroviral ganharam e mantiveram telômeros longos. Seguindo a recuperação da senecência prematura, as células dos pacientes DKC de duas famílias diferentes tinham níveis normais de modificação da pseudouridina no rRNA e nenhum atraso dramático no processamento dos precursores de rRNA, em contraste com os fenótipos noticiados para modelos de camundongo com DKC. Wong e Collins (2006) concluíram que defeitos nas células de pacientes com DKC emergem somente a partir da reduzida acumulação da TERC.

Cohen e outros (2007) purificaram a telomerase humana 10(8)- vezes, com a elução final dependente da habilidade da enzima para catalisar a adição do nucleotídeo dentro do oligonucleotídeo de DNA da sequência telomérica, proporcionando dessa forma especificidade para a telomerase ativa cataliticamente. O sequenciamento da espectrometria de massa dos componentes da proteína e a determinação do tamanho molecular indicou uma composição da enzima de duas moléculas cada de TERT, TERC e discerina.

Machado-Pinilla e outros (2008) mostraram que a expressão da SE24-2, um elemento genético supressor codificador do domínio de sintase de pseudouridina da DKC1, aumentou a sobrevivência contra a cisplatina e os inibidores de telomerase nas células humanas. A GSE24-2 ativou o promotor de MYC (omim 190080: O proto-oncogene MYC codifica um fator de ligação a DNA que pode ativar e reprimir a transcrição. Por via desse mecanismo, o MYC regula a expressão de numerosos genes alvo que controlam funções celulares chaves, incluindo o crescimento da célula e o progresso do ciclo celular.)

Venteicher e outros (2009) mostraram que a TCAB1 (omim 612661: Imunoprecipitações mostraram que a TACB1 interagiu especificamente com a discerina, TERT e TERC, todos os principais componentes da telomerase ativa, e com os pequenos RNAs corpo de Cajal (scaRNAs), os quais estão envolvidos na modificação dos splicings de RNAs. Experimentos de imunoprecipitação e imunofluorescência mostraram que a TCAB1 é a subunidade de uma holoenzima (uma enzima completa) que é notavelmente enriquecida com corpos de Cajal, sítios nucleares de processamento de RNP (fosforilação de ribonucleotídeo?) que são importantes para a função da telomerase.) associa-se com a enima telomerase (TERT; omim 187270), estabilizou os componentes da telomerase inclusive a discerina e a TERC (omim 602322), e os pequenos RNAs corpos de Cajal (scaRNAs), os quais estão
envolvidos na modificação do splicing dos RNAs. A depleção da TCAB1 por uso de RNA de interferência impediu a associação da TERC aos corpos de Cajal, rompeu a associação telomerase-telômero, e anulou a síntese do telômero na telomerase. Assim, Venteicher e outros (2009) concluíram que a TCAB1 controla o tráfego da telomerase e é requerida para a síntese do telômero nas células humanas do câncer.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS

Rashid e outros (2006) determinaram a estrutura cristalina da proteína homóloga à discerina do Pyrococcus furiosus, Cbf5, em complexo com Nop10 (NOLA3; omim 606471) a uma resolução de 2,1 angstrons. Baseados na estrutura cristalina da Cbf5 e no alinhamento seqüencial da Cbf5 com a discerina humana, Rashid e outros (2006) determinaram que a maioria das mutações causadoras da disceratose colocalizam-se no lado 1 da sintase de pseudouridina e no domínio da transglicosilase de Archaeosina (PUA) da discerina, o qual é previsto por atuar num papel específico na ligação da H/ACA e dos RNAs da telomerase. Rashid e outros (2006) sugeriram que as mutações no domínio PUA poderiam despertar interações entre a discerina e seus RNAs cognatos, levando ao decréscimo na acumulação de RNAs. Alternativamente, as mutações poderiam afetar o sítio de ligação de um fator não identificado.

ESTRUTURA DO GENE

Hassock e outros (1999) determinaram que o gene DKC1 compreende 15 éxons expandindo-se em ao menos 16 quilobases e é transcrito em um mensageiro de 2,6 quilobases vastamente expressado. A cópia singular do gene DKC1 é transcrita a partir de uma ilha CpG a 60 quilobases em direção ao centrômero à distância do gene do fator VIII (omim 306700) no distante lócus Xq28 e se coloca caule a caule com o gene da proteína-1 da membrana do eritrócito palmitoilado (ácido palmitoleico é um ácido monoinsaturado com 16 carbonos; um dos constituintes comuns dos triacilgliceróis do tecido adiposo humano. Stedman) [omim 305360: A proteína da membrane do eritrócito (EMP55) é o protótipo de uma família de proteínas associadas a membrana chamada MAGUKs (homólogas da cinase guanilada associada a membrana). As MAGUs interagem com o citoesqueleto e regulam a proliferação celular, vias de sinalização e junções intracelulares (Kim e outros 1996). Ruff e outros deduziram a sequência completa de aminoácidos de uma proteína da membrana do eritrócito com 55 quilo-dáltons a partir de clones isolados de uma biblioteca de reticulócitos humanos (reticulócito é a jovem hemácia, ou eritrócito). Esta proteína, a p55, foi co-purificada durante o isolamento da dematina, uma proteína atando a actina do cito-esqueleto da membrana do eritrócito. Sua firme associação com a membrana plasmática foi reminiscente de uma proteína integrante de membrana. A proteína p55 é a proteína mais extensivamente palmitolada na membrana do eritrócito.]

GENÉTICA MOLECULAR

Heiss e outros (1998) demonstraram mutações de sentido trocado no gene de DKC1 que correlacionavam-se com a disceratose congênita. A doença é caracterizada pela manifestação precoce de pigmentação reticulada na pele, distrofia das unhas e leucoplaquia (uma placa branca da mucosa oral ou genital feminina que não pode ser removida e não pode ser diagnosticada clinicamente como qualquer entidade mórbida específica; no uso corrente, um termo químico sem conotação histológica.Stedman). A falência progressiva da medula óssea ocorre em 80% dos casos e é a principal causa da mortalidade precoce. A variabilidade na idade de início, a falência da medula óssea, e a amplitude das anormalidades congênitas foram observadas. Um risco aumentado de desenvolvimento de diferentes tipos de malignidades também existe. A instabilidade cromossômica é indicada pela aberração cromossômica da queratina (ceratina) nas culturas celulares de fibroblastos da pele e da metáfase (estágio de mitose ou meiose no qual os cromossomos são alinhados na placa equatorial da célula, separando os centrômeros. Na mitose e na segunda divisão meiótica, os centrômeros de cada cromossoma dividem-se, e os dois centrômeros filhos estão voltados para os pólos opostos da célula; na primeira divisão da meiose os centrômeros não se dividem, mas os centrômeros de cada par de cromossomos homólogos estão direcionados para pólos opostos. Stedman) na medula óssea. Em contraste com os pacientes com anemia Fanconi [omim 227650: A anemia Fanconi é uma desordem autosômica recessiva que afeta elementos da medula óssea, e está associada com malformações cardíacas, renais e dos braços bem como alterações na pigmentação da derme. Hirschman e outros (1969) noticiaram dois irmãos com anemia aplásica {caracterizada por formação muito diminuída de eritrócitos e hemoglobina, usualmente associada a granulocitopenia e trombocitopenia pronunciadas, em consequência de medula óssea hipoplásica ou aplásica.Stedman} similar à anemia Fanconi mas sem anomalias congênitas associadas. Ambos responderam à terapia com androgênio (p.ex.androsterona e testosterona) e mostraram aumentada ruptura cromossômica como na anemia Fanconi. Um tinha uma translocação cromossômica estável nas células da medula óssea. Os fibroblastos da pele do outro mostraram aumentada suscetibilidade para a transformação maligna pelo vírus SV40 (um poliomavírus que afeta símios e humanos), como na anemia Fanconi. Os fibroblastos da pele da mãe e da irmã, ambos normais, também mostraram aumentada suscetibilidade à transformação maligna.] os linfócitos dos pacientes DKC não mostram uma sensitividade aumentada para clastógenos (um agente que causa quebras cromossomiais, por exemplo, raios X.) Mulheres heterozigotas para o gene mutante mostraram um padrão de inativação do cromossomo X consistente com o defeito no gene dando surgimento à proliferação e/ou sobrevivência desvantajosa nas células que o expressam.

Knight e outros (1999) detectaram mutações no gene DKC1 em 21 das 37 famílias com disceratose congênita. Essas mutações consistiam com 11 substituições de único nucleotídeo, as quais resultavam e 10 mutações de sentido trocado e uma suposta mutação de splicing dentro de um íntron. A mudança de sentido trocado de Alanina 353 para Valina foi observada e 11 famílias diferentes e foi mostrada como um evento “de novo” recorrente. Dois polimorfismos também foram detectados, um deles resultou na inserção de uma lisina adicional no domínio terminal poli-lisina. É espantoso que a disceratose congênita ligada ao X seja predominantemente causada por mutações de sentido trocado.

Knight e outros (2001) rastrearam pacientes do sexo masculino de 25 famílias com disceratose congênita por mutações no gene DKC1. As variações seqüenciais foram detectadas em 10 dessas famílias. Em 5 famílias, as mutações previamente identificadas foram detectadas. Das cinco novas mudanças seqüenciais, 3 eram mudanças no código. A quarta mudança de sequência foi detectada na região que flanqueia a extremidade 5 que rompe um suposto sítio de ligação do fator de transcrição Sp1. Uma alteração intrônica também foi detectada como a incorporação parcial de uma porção do íntron 1 no mRNA. Esse foi o primeiro relato das mutações na DKC1 que foram previstos por afetarem os níveis de expressão da taxa de discerina mais do que sua sequência de aminoácidos. Isso sugere que um decréscimo na quantidade normal da proteína pode causar esta desordem.

Knight e outros (1999) identificaram mutações no gene DKC1 em pacientes com a síndrome de Hoyeraal-Hreidarsson [omim 300240: A síndrome de Hoyeraal-Hreidarsson é uma desordem multissistêmica afetando homens e é caracterizada por anemia aplásica {caracterizada por formação muito diminuída de eritrócitos e hemoglobina, usualmente associada a granulocitopenia e trombocitopenia pronunciadas, em consequência de medula óssea hipoplásica ou aplásica.Stedman} , imunodeficiência, microcefalia, hipoplasia cerebelar e crescimento atrasado.
Em cinco pacientes Japoneses do sexo masculino com presumida disceratose congênita ligada ao X, Kanegane e outros (2005) identificaram 4 mutações no gene DKC1, incluindo duas novas mutações de sentido trocado, Q31K e T357A.

MODELO ANIMAL

He e outros (2002) usaram um sistema Cre/loxP indutível para produzir deleções no gene murino Dkc1 na embriogênese inicial. Uma grande deleção carecendo dos éxons 12-15 e uma pequena deleção carecendo somente do último éxon foram produzidas. Eles descobriram que as duas deleções mostraram um efeito de origem parental 100% letal para o embrião quando a mutação ocorria na Dkc1 materna. Análises embrionárias aos 7 dias e meio e aos 9 dias e meio de gestação mostraram que nenhum dos embriões machos carregava as duas deleções, enquanto as fêmeas com deleções derivadas maternalmente morreram por volta dos nove dias e meio de gestação, com degeneração do tecido embrionário extra, nas quais o cromossomo X paterno estava inativado. Os camundongos fêmea carregando a deleção no Dkc1 derivado paternalmente mostraram extrema inativação do X (preso no espeto?) com o cromossomo X de tipo selvagem ativo em todas as células. Já que os camundongos sem nenhuma telomerase são viáveis nas primeiras gerações, a letalidade observada por He e outros (2002) foi unicamente causada pelos efeitos da discerina mutada na atividade da telomerase.

Rugero e outros (2003) geraram um camundongo mutante em Dkc1 hipomórfico que recaptulava o fenótipo DKC [omim 305000: As características da disceratose congênita (DKC ou DC) são pigmentação cutânea, distrofia das unhas, leucoplaquia da mucosa oral, contínuo lacrimejamento devido à atresia (ausência congênita de uma abertura normal ou luz normalmente de passagem para outros elementos) dos dutos lacrimais, freqüente trombocitopenia, anemia, e na maioria dos casos, atrofia testicular. Consistente com o padrão da herança recessiva ligada ao X, somente homens são afetados.] nas primeira e segunda gerações. As células dos camundongos machos homozigotos e das fêmeas heterozigotas mostravam um nível diminuído de expressão da Dkc1 (quatro e duas vezes respectivamente). Células com Dkc1 hipomórficas (hipomórfico é o gene mutante que provoca uma redução parcial na atividade controlada por ele. Stedman) da primeira e da segunda geração estavam diminuídas na pseudouridilação do RNA ribossômico antes do estabelecimento da doença. A redução da lente do telômero nos camundongos hipomórficos tornou-se evidente somente nas gerações seguintes. Ruggero e outros (2003) concluíram que a função desregulada do ribossomo é importante na iniciação da disceratose congênita, enquanto o encurtamento do telômero pode modificar e/ou exacerbar a disceratose congênita.

A discerina é uma proteína nucleolar presente em pequenas partículas de ribonucleoproteínas nucleolares que modificam resíduos específicos de uridina do RNA ribossômico por os converter em pseudouridina. A discerina também é um componente do complexo telomerase. Para testar a extensão em que o rompimento da pseudouridilação ou da atividade da telomerase possa contribuir na patogênese da disceratose congênita, Mochizuki e outros (2004) introduziram duas mutações na discerina dentro de células tronco embrionárias murinas: ala353 para Val (A353V; omim 300126.0006), a qual é a mais freqüente mutação em pacientes com disceratose congênita ligada ao X, e gly402 para glu (G402E; omim 300126.0005), a qual foi identificada em um único paciente. A mutação A353V, mas não a G402E, levou à severa desestabilização do RNA da telomerase, redução na atividade da telomerase, e uma significativa perda da lente telomérica com número aumentado de divisões celulares duante a cultura “in vitro”. Ambas as mutações causaram um defeito na pseudouridilação geral e um pequeno, porém detectável, decréscimo na taxa de processamento de RNA pré-ribossômico. Em adição, ambas as linhas de células tronco embrionárias mutantes mostraram um decréscimo na acumulação de um sub-conjunto de pequenos RNAs nucleolares H/ACA, correlacionando-se com um significativo decréscimo na eficiência da pseudouridilação em sítios específicos. Mochizuki e outros (2004) concluíram que as mutações pontuais na discerina podem afetar ambas as vias da telomerase e da pseudouridilação e que a extensão em que essas funções são alteradas pode variar segundo diferentes mutações.

Usando uma estratégia proteômica não tendenciosa, Yoon e outros (2006) descobriram um defeito específico na tradução dependente de IRES (sítio interno de entrada no ribossomo) nos camundongos mutados em Dkc1 e nas células dos pacientes com disceratose congênita ligada ao X. Esse defeito resulta na diminuída tradução dos mRNAs contendo elementos IRES, incluindo aqueles codificadores do supressor de tumor p27(Kip1) (600778) e os fatores antiapoptóticos Bcl-xl (600039) e XIAP (300079). Além disso os ribossomos derivados de camundongos com a Dkc1 mutada eram incapazes de administrar a tradução a partir de elementos IRES presentes nos mRNAs virais. Yoon e outros (2006) concluíram que seus achados revelaram um mecanismo potencial pelo qual a atividade defeituosa do ribossomo leva à doença e ao câncer.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300126

FORMAÇÃO DA URINA

A formação da urina começa com o processo de filtração, o qual segue em continuamente nos corpúsculos renais. Como o sangue segue através do glomérulo, muito do seu fluido, contendo tanto matéria química e resíduos dissolvidos, infiltra do sangue através das membranas (por osmose e difusão), onde é filtrado e depois flui para dentro da cápsula de Bowman. Esse processo é chamado filtração glomerular. A água, produtos residuais, sal, glicose, e outros químicos que tenham sido filtrados para fora do sangue são coletivamente conhecidos como filtrado glomerular. O filtrado glomerular consiste primariamente de água, excesso de sais (primariamente Na+ e K+), glucose, e um produto residual do corpo chamado uréia. A uréia é formada no fígado a partir dos aminoácidos.


Já que os humanos não podem excretar amônia, esta convertida em uréia menos perigosa e então filtrada para for a do sangue. A uréia é o produto residual mais abundante que precisa ser excretado pelos rins. A taxa total de filtração glomerular (taxa de filtração glomerular ou GFR) para todo o sangue (isto é, para todos os nefrônios em ambos os rins) é normalmente de 125 ml por minuto. Isto é, aproximadamente 125 ml de água e substâncias dissolvidas são filtradas para for a do sangue por minute. Os calculus seguintes podem ajudar a visualizar como esse volume é enorme. O GRF por hora é:

125 ml/min X 60min/h= 7500 ml/h. A GFR por dia é: 7500 ml/h X 24 h/dia = 180,000 ml/dia ou 180 litros/dia.

Agora veja se você pode calcular de quantos galões de água nós estamos falando. Aqui estão alguns fatores de conversão a considerar: 1 quarto = 960ml, 1 litro = 1000ml; 4 quartos = 1 galão. Então 180 litros/4 = 45 galões – [40ml x 180= 9200ml] 9,2 litros =42,7 galões.

Agora, o que nós acabamos de calcular é a quantidade de água que é removida do sangue a cada dia – aproximadamente 180 litros por dia. (Atualmente outros químicos também são incluídos, mas a vasta maioria desse filtrado glomerular é a água.) Imagine o tamanho de uma garrafa de dois litros de soda limonada. Aproximadamente 90 dessas garrafas equivalem a 180 litros! Obviamente, ninguém nunca urinou em lugar nenhum perto de 180 litros por dia! Por quê? Porque aproximadamente todos os 43 galões de água (os quais estão em torno de 180 litros – Yes) que saem do sangue pela filtração glomerular, o primeiro processo da formação da urina, retorna ao sangue pelo segundo processo: a reabsorção.

REABSORÇÃO

Reabsorção, por definição, é o movimento de substâncias for a dos tubules renais de volta aos capilares sanguíneos localizaodos em volta dos tubules (chamados capilares peritubulares). As substâncias reabsorvidas são a água, glucose e outros nutrients, e sódio (Na+) e outros íons. A reabsorção começa nos túbulos enrolados próximos e continua no laço de Henle, distante dos tubules enrolados, e túblulos coletores. Discutamos, por um instante, as três principais substâncias que são reabsorvidas na circulação sanguínea.

Grandes quantidades de água – mais de 178 litros por dia – são reabsorvidas de volta à circulação a partir dos túbulos proximais pois as forças físicas atuando sobre a água nesses túbulos atuam puxando a maior parte da água para dentro dos capilares sanguíneos. Em outras palavras, aproximadamente 99% dos 180 litros de água que saem do sangue a cada dia pela filtração glomerular retornam ao sangue pelo túbulo proximal através do processo de reabsorção passiva.

O nutriente glucose (açúcar do sangue) é inteiramente reabsorvido de volta ao sangue a partir dos túbulos proximais. De fato, ele é ativamente transportado para fora dos túbulos e para dentro dos capilares sanguíneos peritubulares. Nenhum desses nutrientes válidos é desperdiçado por sua perda na urina. Entretanto, ainda que os rins estejam funcionando com sua máxima eficiência, os nefrônios só podem reabsorver um tanto de açúcar e água. Suas limitações são dramaticamente ilustradas nos casos de diabetes mellitus, uma doença que causa a quantidade de açúcar no sangue subir mais do que o normal. Como mencionado anteriormente, em casos ordinários toda a glucose que se infiltra para fora através dos glomérulos para dentro dos túbulos é reabsorvida no sangue. Mas se muita glucose estiver presente, os túbulos chegam ao limite de sua capacidade para passar o açúcar de volta à circulação sanguínea, e os túbulos retém alguma quantidade. Então ele é carregado junto na urina, frequentemente proporcionando a um médico com sua primeira pista de que um paciente tem diabetes melitus. O valor da urina como ajuda no diagnóstico é sabido no mundo da medicina desde os tempos de Hippocrates. Desde então, o exame da urina tem-se tornado um procedimento regular para médicos e cientistas.

Íons de sódio (Na+) e outros íons são só parcialmente reabsorvidos a partir dos túbulos renais de volta ao sangue. Para a maior parte, entretanto, os íons de sódio são transportados ativamente de volta ao sangue a partir do fluido tubular. A quantidade de sódio reabsorvida varia de tempo em tempo; ela depende grandemente de quanto sal nós ingerimos na comida. (Como explicado anteriormente, o sódio é o principal componente do sal, conhecido quimicamente como cloreto de sódio.) Desde que uma pessoa aumente a quantidade de sal no corpo, os rins dessa pessoa diminuem a quantidade de reabsorção do sal de volta ao sangue. Isso é, mais sódio é retido nos túbulos. Por isso, a quantidade de sal excretada na urina aumenta. O processo trabalha de modo inverso. A falta de entrada de sal, aumenta a quantidade de sal reabsorvido de volta ao sangue e a quantidade de sal excretado na urina diminui.


SECREÇÃO

Agora, vamos descrever o terceiro processo da formação da urina. A Secreção é o processo pelo qual as substâncias movem-se dentro dos tubos distantes e coletores a partir dos capilares sanguíneos em volta desses tubos. A esse respeito, a secreção é o reverso da reabsorção. Enquanto a reabsorção remove substâncias para fora dos túbulos e para dentro do sangue, a secreção move as substâncias para fora do sangue e para dentro dos túbulos onde elas se misturam com a água e outros resíduos e são convertidas em urina. Essas substâncias são secretadas tanto através de um transporte ativo quanto uma resultado da difusão através da membrana. As substâncias secretadas são íons de hidrogênio (H+), íons de potássio (K+), amônia (NH3), e certas drogas. A secreção do túbulo renal atua num papel crucial na manutenção do balanço de ácidos e bases do corpo, outro exemplo de uma função importante da qual os rins participam.

http://bioisolutions.blogspot.com/2009/06/urine-formation.html

606862 RECEPTOR ASSOCIADO AO OSTEOCLASTO

OSCAR

Gene map lócus 19q13.4

DESCRIÇÃO

Os osteoclastos (OCs) são células multinucleadas que se desenvolvem a partir das células mielomonocíticas (monócitos da medula com um núcleo só) na interação com fatores de osteoblastos tais como MCSF (CSF; omim 120420) e TRANCE (TNFSF11; omim 602642). Os osteoclastos são essenciais para a reabsorção do osso e para a homeostase (equilíbrio na geração das células) do osso. A OSCAR é expressada especificamente nas células da linhagem dos osteoclastos e regulam a osteoclastogênese (Kim e outros , 2002).

CLONAGEM

Por subtração da PCR de bibliotecas de cDNA de osteoclastos e macrófagos do camundongo, seguida pela triagem da biblioteca de cDNA de osteoclasto humano, Kim e outros (2002) obtiveram cDNAs codificadores da OSCAR humana e do camundongo. A proteína transmembrana humana de tipo I deduzida em 263 aminoácidos é 73% idêntica à do camundongo. Ela contém dois domínios extracelulares similares a imunoglobulina, os quais são homólogos as proteínas do complexo receptor dos leucócitos (e.g. NKp46; 604530), um resíduo de ARG carregado na região transmembrana e um caule citoplasmático curto. Análises de Northern Blot detectaram a expressão dos transcritos de 1,8 e 1,0 quilobases nos osteoclastos e no osso do camundongo. Nenhuma expressão foi detectada nos macrófagos, células dendríticas, ou tecidos moles, sugerindo expressão específica nos osteoclastos. Citometria de fluxo e análises imuno-histoquímicas demonstraram a expressão da Oscar do camundongo predominantemente nos osteoclastos maduros, com nenhuma expressão nos macrófagos, células dendríticas, células matadoras naturais ou linfócitos.

FUNÇÃO DO GENE

Kim e outros (2002) demonstraram que a Oscar solúvel inibe a formação de osteoclastos a partir das células precursoras da medula óssea estimuladas pelos osteoblastos, mas não inibe a formação de osteoclastos a partir das linhas de células mielóides estimuladas com a TRANCE solúvel. Análises de citometria de fluxo dos osteoblastos sugeriram a presença de um ligante de OSCAR nessas células.

MAPEAMENTO

Usando analises de clone BAC, Kim e outros (2002) mapearam o gene da OSCAR no cromossomo 19q13, dentro de um complexo receptor dos leucócitos. Eles mapearam o gene do camundongo no cromossomo 7 na região PIR por análises de radiação híbrida.

FONTE: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=606862

*153618 MANNOSE RECEPTOR, C-TYPE, 1; MRC1

RECEPTOR DE MANOSE DOS MACRÓFAGOS; MMR
CD206

Gene map locus 10P13

DESCRIÇÃO

O reconhecimento de estruturas complexas de carbohidratos desempenha um papel importante nos processos biológicos, incluindo o reconhecimento célula-célula, volume de glicoproteínas no soro, e neutralização de patógenos (Kim e outros, 1992). Muitas das lectinas animais endógenas que mediam esses eventos de reconheciento compartilham um motivo estrutural comum dependente de Ca(2+) que tem sido designado como um domínio de reconhecimento de carbohidrato tipo C (CRD). O receptor de manose encontrado nos macrófagos e nas céllulas endoteliais do fígado é o único exemplo conhecido de lectina de tipo C que contém múltiplos CRDs de tipo C. Uma função do receptor é ligar-se a grandes estruturas de manose na superfície de viroses potencialmente patogênicas, bactérias, fungos, tanto que elas podem ser neutralizadas pela absorção fagocítica.

FUNÇÃO DO GENE

Nguyen e Hildreth (2003) mostraram que o MMR mediou a associação inicial do vírus da imunodeficiência humana (HIV, veja omim 609423) com os macrófagos carentes do sinal DC (CD209, omim 604672). A captura do vírus e a transmissão dos macrófagos para as células T pode ser bloqueada por manosana (polissacarídeo da manose encontrado em vários legumes e na jarina. Stedman), manose, e lectina ligante de manose, mas não pela galactose. Células carentes de MMR não foram inibidas por esses agentes. Nguyen and Hildrech (2003) concluíram que o MMR tem um papel substancial na ligação e transmissão do HIV-1 por macrófagos.

ESTRUTURA DO GENE

Kim e outros (1992) caracterizaram o gene para o receptor de manose dos macrófagos (MRC1) pelo isolamento de clones cobrindo a região codificadora inteira. O MRC1 foi demonstrado por ser dividido em 30 éxons. Os primeiros três éxons codificam uma sequência sinal, o domínio rico em cisteína no terminal NH2, e a repetição de fibronectina tipo II, enquanto o éxon final codifica a âncora transmembrana e o caule citoplasmático. Os 26 éxons intervenientes codificam oito domínios de reconhecimento de carbohidratos e elementos espaçadores intervenientes.

MAPEAMENTO

Por hibridização de fluorescência em sítio e mapeamento híbrido de células somáticas baseado em PCR, Eichbaum e outros (1994) assinaram o gene MRC1 em 10p13. Harris e outros (1994) mapearam o homólogo do camundongo, Mrc1, no cromossomo2. Essa região do genoma do camundongo contém ao menos 5 lócus que são conhecidos por estarem em 10p11-q15 nos humanos.

MODELO ANIMAL

Lee e outros (2002) geraram camundongos geneticamente deficientes no receptor de manose, Camundongos MR -/- eram defeituosos na remoção de proteínas carregando resíduos acessíveis de manose e de N-acetilglucosamina e tinham níveis elevados de oito hidrolases lisossômicas. Análises proteômicas dos soros do camundongo MR-/- e do controle mostraram que uma quatro proteínas adicionais fora das 52 proteínas identificadas estavam elevadas no soro MR-/-. Cada uma dessas proteínas esta sobre-regulada durante a inflamação e na cicatrização das feridas. Assim, Lee e outros (2002) concluíram que a MR parece operar como um regulador essencial as homeostase das glicoproteínas no soro. As proteínas sobre-reguladas durante a inflamação incluíam domínios pró-peptídios no terminal C das cadeias 1 e 2 pró-alfa do pró-colágeno de tipo I (omim - 120150 e 120160, respectivamente) e a cadeia pró-alfa 1 do pró-colágeno de tipo III (omim 120180), bem como a fetuína B (fetuína é uma globina de baixo peso molecular que consiste quase na totalidade da globulina do sangue fetal. Stedman) (omim 605954). Lee e outros (2002) demonstraram que o receptor de manose é requerido para a rápida remoção de um sub-conjunto de glicoproteínas do soro carregando manose que estão normalmente elevadas durante a inflamação, mas que não parecem regular o início da inflamação.

Usando camundongos deficientes em Mr, Burgdorf e outros (2007) mostraram que as células dendríticas e os macrófagos usaram somente a endocitose mediada por Mr para obter antígeno para ativação das células T positivas em Cd8 (veja 186910), enquanto a pinocitose e, no caso dos macrófagos, os receptores de cadáveres (veja MSR1; omim 153622) foram usados para ativação das células T positivas em Cd4 (omim 186940). Microscopia fluorescente demonstrou que a endocitose mediada por Mr supriu um compartimento endossômico precoce contendo Rab5 (omim 179512) e Eea1 (omim 605070) que era distinto dos lisossomos supridos por receptores de cadáveres e pinocitose. Burgdorf e outros (2007) propuseram que o alvejamento do antígeno para o MR pode ser uma avenida para o melhorameto de vacinas objetivadas em induzir a imunidade mediada por células T Cd8 positivas contra viroses e tumores.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=153618

OBS.:
"A role for exposed mannosylations in presentation of human therapeutic self-proteins to CD4+ T lymphocytes."

Várias proteínas próprias elicitam respostas imunes quando administradas aos pacientes. Estas respostas imunes adversas reduzem a eficácia da droga. Para induzir uma resposta imune, uma proteína deve interagir com diferentes células imunes, incluindo as células apresentadoras de antígenos, as células T e B. Cada tipo de célula reconhece distintos padrões imunogênicos nos antígenos. As glicanas (polissacarídeo) com terminação em mannose (um epímero da glicose, uma aldoexose obtida de vegetais) têm sido identificadas como padrões moleculares associados a patógenos que são essenciais para internalização de micróbios por células apresentadoras de antígenos, levando à apresentação. Aqui nós investigamos a importância da manosilação em uma proteína self terapêutica imunogênica, o fator VIII humano pró-coagulante. A administração do FVIII terapêutico a pacientes de hemofilia A induz anticorpos anti-FVIII em mais de 30% dos casos. Nós demonstramos que a entrada do FVIII em células dendríticas humanas (DC) levando à ativação de células T, é mediado por glicanas terminando em manose no FVIII. Além disso, nós identificamos o receptor de manose nos macrófagos (CD206) como um candidato a receptor endocítico para FVIII em células dendríticas. A saturação de receptores de manose nas células dendríticas com mananas (ou manosanas, polissacarídeos da manose), e a remoção enzimática de glicanas manosiladas do FVIII levaram à redução da ativação das células T. A interação entre FVIII e CD206 foi bloqueada por VWF, sugerindo que, sob condições fisiológicas, a imunogeniciade de FVIII dependente de manose é satisfeita por peptídeos imuno-acompanhantes (imuno-chaperones) endógenos (neste caso não seria o vWF?). Estes dados proporcionam uma ligação entre a manosilação de proteínas próprias terapêuticas e suas imunogenicidades iatrogênicas (relativas a uma resposta a tratamento clínico). Tal ligação seria de relevância especial no contexto da terapia de reposição onde mecanismos de tolerância central e periférica não têm sido estabelecidos durante a ontogenia (o desenvolvimento do indivíduo conforme é diferente da espécie) devido à presença do antígeno.

PMID: 17502612

Receptor de insulina (segunda parte)

MODELO ANIMAL

Em camundonos geneticamente obesos com resistência à insulina, Le Marchand-Brustel e outros (1985) encontraram um defeito na atividade de tirosina cinase do receptor de insulina.
A completa falta de receptores de insulina devida a mutações no gene do receptor de insulina resulta em severo retardamento do crescimento e moderado diabetes. Nos camundongos, o alvejamento do substrato-1 do receptor de insulina (147545) leva à inibição do crescimento e a média resistência às ações metabólicas da insulina. Para tratar da questão de se ambas as ações da insulina, a metabólica e de promoção do crescimento, são mediadas pelo receptor de insulina, Accili e outros (1996) geraram camundongos carentes em receptores de insulina pela mutagênese alvejada em células-tronco derivadas de embrião (ES). Diferente dos pacientes humanos carentes de receptores de insulina, com camundongos homozigotos para um alelo nulo do gene do receptor de insulina nasceram no prazo com crescimento e desenvolvimento intra-uterino aparentemente normais. Dentro de alguma horas do nascimento, entretanto, os camundongos homozigotos nulos desenvolveram severa hiperglicemia e hipercinemia (aumento da velocidade da circulação, aumento do volume do fluxo do sangue, débito cardíaco supernormal), e morreram como um resultado da cetoacidose diabética (cetoacidose é o aumento de produção de corpos cetônicos) entre 48 e 72 horas. Os autores consideraram os dados consistentes com um modelo no qual o receptor de insulina funciona primariamente para mediar as ações metabólicas da insulina.

Para determinar a contribuição da resistência à insulina no músculo para o fenótipo metabólico do diabetes, Bruning e outros (1998) usaram o sistema Cre-loxP para romper o gene INSR no músculo esquelético do camundongo. Os camundongos nocauteados para o Insr específico do músculo exibiram uma redução no conteúdo de receptores no músculo específico maior que 95% e precoces eventos de sinalização. Os camundonos apresentaram elevada massa de gordura, triglicerídeos no soro, e ácidos graxos livres, porém, a glucose no sangue, a insulina do soro e a tolerância à gluclose normais. Assim, a resistência à insulina no músculo contribui para o metabolismo alterado de gordura associado com o diabetes de tipo II, mas outros tecidos além do músculo parecem estar mais envolvidos na disposição da glicose regulada pela insulina do que previamente se reconhecia.

Para determinar se a sinalização da insulina tem um papel funcional na célula beta pancreática, Kulkarni e outros (1999) usaram o sistema Cre-loxP para inativar especificamente o gene do Insr do camundongo nas células beta. A expressão de Cre usando um promotor da insulina do rato específica da célula beta pancreática resultou na eficiente recombinação do gene Insr contendo loxP nas cálulas beta. Camundongos carentes de receptores de insulina nas células beta mostraram uma perda da primeira fase de secreção da insulina em resposta à glucose, mas não em resposta à arginina, similar ao observado na diabetes de tipo II humana. Esses camundongos também mostraram uma redução progressiva na tolerância à glucose por seis meses. Os dados indicaram um importante papel funcional para o receptor de insulina na sensibilidade à glucose pelas células beta pancreáticas e sugeriram que defeitos na sinalização da insulina ao nível da célula beta pode contribuir para as alterações observadas na secreção de insulina no diabetes de tipo II.

Para investigar o efeito da perda da ação direta da insulina no fígado, Michael e outros (2000) usaram o sistema Cre-loxP para inatvar o gene Insr nos hepatócitos. Camundongos nocauteados para o receptor de insulina específico do fígado (LIRKO) exibiram dramática resistência à insulina, severa intolerância à glucose, e falência da insulina em suprimir a produção da glucose hepática e em regular a expressão gênica hepática. Essas alterações foram paralelizadas por marcada hiperinsulinemia devida à combinação de aumento na secreção de insulina e decréscimo na remoção da insulina. Com a idade, os fígados dos camundongos nocauteados exibiram mudança morfológicas e funcionais, e o fenótipo metabólico tornou-se menos severo. Assim, os autores concluíram que a sinalização da insulina no fígado é crítico na regulação da homeostase da glucose e na manutenção da função normal hepática.

Bruning e outros (2000) criaram camundongos com uma ruptura específica nos neurônios do gene Insr (NIRKO). A inativação do receptor de insulina não teve impacto no desenvolvimento do cérebro ou na sobrevivência do neurônio. Entretanto camundongos fêmea IRKO apresentaram aumentado consumo de alimento, e ambos os camundongos macho e fêmea desenvolveram obesidade sensível à dieta com aumento da gordura corporal e níveis de leptina no plasma [Leptina omim – 164160: A leptina é uma proteína de 16 quilo-dáltons que atua num papel crítico na regulação do peso corporal inibindo a ingestão de alimento e estimulando o dispêndio de energia. Defeitos na produção da leptina causam obesidade hereditária severa em roedores e humanos. Em adição a esses efeitos no peso corporal, a leptina tem uma variedade de outras funções, incluindo a regulação da hematopoiese, aniogênese, curativo das feridas, e resposta imune e inflamatória. ... He e outros (1995) descobriram que a co-transfecção do promotor do gene do camundongo obeso com C/EBP-alfa, um fator de transcrição importante na diferenciação da célula adiposa, causou sua ativação 23 vezes. He e outros (1995) sugeriram que o promotor do “obeso” é uma mira natural da C/EBP-alfa.]

Belke e outros (2002) geraram camundongos com Insr nocauteado específicamente no cardiomiócito (CIRKO), usando recombinação cre/losP. Os corações dos camundongos CIRKO eram de 20 a 30% menores devido à reduzida hipertrofia pós-natal dos cardiomiócios ; eles tinham expressão persistente da isoforma da beta-miosina de cadeia pesada, aproximadamente metade da expressão normal do transportador 1 de glucose (GLUT1; 138140), e aumento de duas vezes na expressão da GLUT4. A captura da glucose cardíaca estava aumentada “in vivo”, a glicólise estava aumentada em corações isolados trabalhando, e havia expressão reduzida de enzimas que catalisam a oxidação beta mitocondrial, levando ao decréscimo das taxas de oxidação dos ácidos graxos.

Em camundongos nocauteados para o INSR específico no tecido adiposo marrom, Guerra e outros (2001) observaram profunda atrofia da gordura marrom dependente da idade concomitante com o desenvolvimento de hiperglicemia em jejum e diminuída tolerância à glucose. Guerra e outros (2001) concluíram que o receptor de insulina atua num papel direto na adipogênese da gordura marrom e sugeriram que o tecido adiposo marrom está envolvido na regulação da secreção de insulina e homeostase da glucose.

Usando o sistema Cre-loxP, Bluher e outros (2002) geraram camundongos nocauteados para Inrs específico do tecido gorduroso os quais eles acharam ter reduzida massa gordurosa e perda do relacionamento normal entre a leptina do plasma e o peso corporal. Os camundongos também estavam protegidos contra a obesidade induzida por lesão hipotalâmica (hipotálamo é a região ventral e medial do diencéfalo; o hipotálamo está envolvido nas funções do sistema nervoso autônomo (visceral) e, através de sua ligação vascular, com o lobo anterior da hipófise, nos mecanismos endócrinos. Stedman) e relacionada à idade e intolerância à glucose relacionada à obesidade. Usando estudos histlógicos e de expressão de genes, Bluher e outros (2002) observaram que os camudongos condicionalmente nocauteados exibiram polarização de adipócitos dentro da população de células grandes e pequenas, as quais diferiam no padrão de expressão de proteína. Bluher e outros (2002) concluíram que a sinalização da insulina nos adipócitos é crítica para o desenvolvimento da obesidade e suas anormalidades metabólicas associadas.

Bluher e outros (2003) geraram camundongos com FIRKO. O crescimento das curvas era normal nos camundongos FIRKO machos e fêmeas a partir do nascimento até 8 semanas de idade. Iniciando os 3 meses de idade, os camundongos FIRKO mantiveram de 15 a 25% do peso corporal mais baixo e uma redução de 50 a 70% na massa gordurosa durante a vida. Os camundongos FIRKO eram saudáveis, careciam de qualquer anormalidade associada com lipodistrofia, e estavam protegidos contra a deterioração da tolerância à glucose relacionada à idade, o que era observado em todas as linhagens de controle. Camundongos FIRKO mantiveram baixa gordura corporal, a despeito da ingestão normal de alimento. De fato, porque os camundongos FIRKO eram mais magros, a ingestão de alimento dos camundongos FIRKO expressada por grama de peso corporal geralmente excedia à dos controles numa proporção de 55%. Ambos os camundongos FIRKO macho e fêmea foram mostraram um aumento na média de vida de aproximadamente 134 dias (18%) (Em cativeiro os camundongos podem viver mais de dois anos e meio, porém os camundongos selvagens conseguem chegar no máximo a aproximadamente 4 meses de vida.) , com aumento paralelo do período de vida médio e máximo. Assim, Bluher e outros (2003) concluíram que a redução da massa gordurosa sem restrição calórica pode estar associada com a longevidade aumentada no camundongo, possivelmente através dos efeitos de sinalização da insulina.

Song e outros (2003) descobriram que na Drosophila, o receptor de insulina funciona na orientação do axônio e é requerido pelos axônios das células fotoreceptoras para enconrarem seu caminho da retina ao cérebro durante o desenvolvimento do sistema visual. O receptor de insulina da Drosofila funciona como um receptor orientador da proteína adaptadora Cock/Nck (veja omim: 600508 – A NCK1 pertence à família das proteínas adaptadoras compostas exclusivamente pelos domínios 2 (SH2) e 3 (SH3) homólogos aos da proteína Src. Essas proteínas funcionam casando a fosforilação da tirosina via domínios SH2 aos efetores seguintes através dos domínios SH3 (Chen e outros, 1988). (OBS.: omim 190090 – O gene SRC tem sequência homóloga ao gene v-src do vírus do sarcoma Rous (também chamado vírus do sarcoma aviário, ASV) (Le Beau e outros, 1984)... TRANCE (omim 602642) um membro da família do fatores de necrose tumoral, e seu receptor RANK (omim 603499), são críticos reguladores das funções das células dendríticas e dos osteoclastos. Wong e outros (1999) demonstraram que a TRANCE ativa a cinase anti-apoptótica serina/treonina PKB (AKT1; omim 164730) através de uma sinalização complexa que envolve a Src e e a TRAF6 (omim 602355). Uma deficiência na SRC ou a adição de inibidores de cinases da família Src bloquearam a ativação da PKB mediada pela TRANCE nos osteoclastos.)

Nef e outros (2003) demonstraram que a família de tirosina cinase receptora de insulina, compreendendo o INSR, IGF1R (omim 147370) e o IRR (omim 147671), é requerida para o aparecimento das gônadas masculinas e assim para a diferenciação sexual do sexo masculino. Camundongos XY que eram mutantes para todos os 3 receptores desenvolveram ovários e mostraram um fenótipo completamente feminino.

Kondo e outros (2003) observaram que, seguindo-se a uma hipoxia relativa (diminuição do oxigênio abaixo dos níveis normais nos gases inspirados, no sangue ou no tecido, sem ser anoxia que é a ausência total do oxigênio), os camundongos nocauteados para o receptor de insulina específicamente das células do endotélio vascular (VENIRKO) mostraram um decréscimo de 57% na neovascularização da retina comparados aos controles, os quais foram associados com uma ascenção errada dos mediadores vasculares VEGF (omim 192240), eNOS (NOS3; omim 163729), e endotelina 1 (EDN1; omim 131240). Camundongos com nocaute específico do receptor de Igf1 em células do endotélio vascular (VENIFARKO) mostraram somente uma redução de 34% na neovascularização e uma redução muito modesta na geração dos mediadores. Kondo e outros (2003) concluíram que ambas as sinalizações da insulina e do IGF1 no endotélio desempenham um papel na neovascularização da retina através da expressão de mediadores vasculares, com a insulina tendo o maior efeito.

Através de análises de mosaicos da função do receptor de insulina no camundongo, Kitamura e outros (2004) demonstraram que a insulina regula o crescimento independentemente do metabolismo e que o número de receptores de insulina é um importante determinante para a especificidade da ação da insulina. Eles geraram camundongos com mosaicismos celulares variáveis para alelos nulos do Insr. A remoção (do Insr) em aproximadamente 80% das células causou extremo retardo do crescimento, lipoatrofia, e hipoglicemia, uma constelação clínica que relembra a síndrome de Donohue em humanos. (omim 246200 – Donohue e Uchida (1954) observaram duas irmãs com as seguintes características: aparente cessação do crescimento próxima ao sétimo mês de gestação, faces peculiares gerando uma aparência de gnomo (nanismo?) e levando à designação, e severa interrupção endócrina indicada pelo emagrecimento, aumento dos seios e dos clitóris e alterações histológicas nos ovários, pâncreas e seios. Três abortos (uma criança aos 4 meses, e as outras mais cedo) foram experimentados por essa mãe. As pacientes faleceram aos 46 e 66 anos de idade respectivamente.) A remoção do Insr em 98% das células, embora resultasse em similar retardo no crescimento e lipoatrofia, causou diabetes sem hiperplasia das células beta. O retardo no crescimento foi associado com um aumento maior que 60 vezes na expressão da proteína 1 de ligação ao fator de crescimento de tipo insulina (IGFBP1; omim 146730).

Nos camundongos, a remoção genética dos receptores de insulina causam morte pós-natal precoce a partir da ketoacidose diabética (Accili e outros, 196). Okamoto e outros (2004) mostraram que a restauração combinada da função do receptor de insulina no cérebro, fígado e nas células beta pancreáticas resgatou o camundongo nocauteado para Insr da morte neonatal, preveniu o diabetes na maioria dos animais, e normalizou o conteúdo de tecido adiposo, a extensão de vida, e a função reprodutiva. Em contraste, camundongos com expressão limitada do receptor de insulina no cérebro ou no fígado e nas células beta do pâncreas foram resgatados da morte neonatal, mas desenvolveram o diabetes lipoatrófico e morreram prematuramente. Okamoto e outros (2004) concluíram que a sinalização do receptor de insulina em tecidos alvo não canônico da insulina é suficiente para manter a homeostase de combustível e impedir o diabetes.

Corl e outros (2005) descobriram que a inibição específica do receptor de insulina ou de sua via de sinalização no sistema nervoso levou ao aumento da sensitividade ao etanol na Drosófila.
Ueki e outros (2006) criaram camundongos carentes de ambos o Insr e do receptor de fator 1 de crescimento de tipo insulina somente nas células beta pancreáticas. Esses camundongos nasceram com o complemento norma de ilhas de células, mas três semanas após o nascimento, eles desenvolveram o diabetes, em contraste com os fenótipos medianos observados em mutantes singulares (camundongos mutados em só um dos receptores). Às duas semanas de idade, os camundongos duplamente nocauteados especificamente para as células beta normoglicêmicas apresentaram reduzida expressão de Akt (omim 164730 – As cinases 3 fosfoinositídeo (fosfatidilinositol, fosfolipídio que contém inositol), ou PI3Ks (veja PIK3CA, omim 171834), geram lipídios, que contém inositol, específicos e implicados na regulação do crescimento celular, proliferação, sobrevivência, diferenciação e mudanças no citoesqueleto. Um dos alvos melhor caracterizados como produtos lipídicos de PI3K é a proteína cinase AKT, ou proteína cinase B (PKB). Em células quiescentes, as PKB residem no citosol numa conformação de baixa atividade. Na estimulação celular, a PKB é ativada através do recrutamento para a membrana celular pelos produtos lipídicos da PI3K e pela fosforilação pela cinase 1 dependente de fosfoinositídeo na ponta 3 (PDPK1; omim 605213).)

Biddinger e outros (2008) geraram camundongos nocauteados para o Insr específico do fígado (LIRKO) e observaram uma marcada predisposição para a formação de cálculos biliares (colélito) de colesterol (Os cálculos biliares são formados de uma mistura de colesterol, bilirrubinato de cálcio e carbonato de cálcio, e ocasionalmente, como um cálculo puro composto apenas de uma dessas substâncias.), com todos os camundongos LIPKO desenvolvendo cálculos biliares após 12 semanas de dieta litogênica. Essa predisposição foi devida a ao menos dois mecanismos distintos: desinibição do gene Foxo 1 (omim 136533), o qual aumentou a expressão dos transportadores do colesterol biliar Abcg5 (omim 605459) e Abcg8 (omim 605460), resultando num aumento da secreção do colesterol biliar e diminuição da expressão de enzimas sintetizadoras de ácidos biliares, particularmente a Cyp7b1 (omim 603711), a qual produziu parcial resistência ao receptor de farnesoide X (NR1H4, omim 603826, obs.: o farnesol é um grupamento presente na cadeia lateral da vitamina K2 e no esqualeno [http://pt.wikipedia.org/wiki/Esqualeno]), levando a um perfil de sais biliares litogênico. Biddinger e outros (2008) concluíram que a resistência à insulina hepática proporciona a ligação entre a síndrome metabólica (605552) e a aumentada suscetibilidade ao cálculo biliar de colesterol.



Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=147670