OBS.: DNA Ligase é uma enzima que completa as ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos da fita dupla de DNA, tanto as ligações entre os pares de base quanto entre dois nucleotídeos ladeados um pelo outro na mesma fita. Isso acontece após a inserção de um segmento de nucleotídeos cujas pontas são coesivas. O ponto de inserção cego é aquele que apresenta na extremidade um par de nucleotídeos derivado de um corte lateral, vertical, na dupla fita. O ponto de inserção coesivo é quando uma das duas fitas do segmento a ser inserido apresenta um corte longitudinal, horizontal em relação às fitas (uma fita fica maior que a outra) e neste local de corte encontra correspondência para o pareamento de bases com a fita dupla m que será inserido. A DNA ligase completa ligações entre estes nucleotídeos do ponto de união das partículas de DNA. No momento da transcrição do vírus do HIV ela funciona da mesma forma, completando as ligações/selando a fita dupla contínua. (Livro consultado : “Clonagem Gênica e Análise de DNA, uma Introdução.” T.A.Brown, Ed. Artmed.)

CAPÍTULO DO LIVRO : HIV-1 MOLECULAR BIOLOGY AND PATHOGENESIS. VIRAL MECHANISMS,2ND EDITION – 2000/2007
KUAN-TEH JEANG
COLEÇÃO ADVANCES IN PHARMACOLOGY – VOLUME 55
EDITORA ELSEVIER

ATRANSCRIÇÃO REVERSA DO HIV-1: ENCONTRO ÍTIMO ENTRE O GENOMA VIRAL E O TRNA CELULAR

OU

A TRANSCRIÇÃO REVERSA DO HIV-1: A BATALHA TRAVADA ENTRE O GENOMA VIRAL E O RNA TRANSPORTADOR CELULAR

Truus E.M. Abbink and Bem Berkhout

I – RESUMO DO CAPÍTULO

Retroviroses diferem de outras viroses de RNA no processo da transcrição reversa. Este processo é um degrau/ ponto essencial no ciclo vital do vírus para converter o genoma retroviral de RNA em um complexo DNA proviral que se desenvolve em múltiplas etapas. Neste capítulo, nós descreveremos em detalhes a etapa inicial da transcrição reversa. Ao longo desta fase, um tRNA celular iniciador (primer) OBS1 é colocado em contato com a seqüência completamentar no genoma viral chamada sítio de ligação do primer ou PBS. A enzima viral transcriptase reversa (RT) reconhece esses complexo RNA-RNA e cataliza a extensão do final 3’ do iniciador tRNA, com o RNA viral (ou vRNA) atuando como molde. Essa fase inicial é regulada e a maioria dos vírus é restringida no uso deste conato(o mesmo) iniciador tRNA. Muitos anos atrás, nós tentamos levar o vírus da imunodeficiência humana do tipo1 (HIV-1) a usar outro primer de tRNA por alteração do PBS. Nós nos baseamos em que esta abordagem revelaria importantes determinantes adicionais sobre a especificidade do primer. As tentativas iniciais falharam no nosso e em todos os outros laboratórios. Novidades recentes sobre contatos adicionais entre o tRNA e o genoma de RNA viral (vRNA) nos levaram a renovar a investigação para a alteração na especificidade do prímer (iniciador) do HIV-1. Nós obtivemos a variante de HIV-1 em réplica que usa um outro primer (non-self), diferente do seu próprio. Análises dessa variante confirmam o papel de múltiplos determinantes na utilização do prímer de tRNA.


II – Introdução

Neste capítulo nós focaremos a etapa de iniciação da transcrição reversa como é projetada pelo HIV-1/ou na performance do HIV-1. É um processo altamente organizado, a molécula celular de tRNALys3 (Lys é o aminoácido lisina AAG ou AAA- e o tRnaLYS3 é o RNA transportador deste aminoácido) atua como um primer. Nenhuma mudança/ mutação espontânea no uso do tRNA pelo HIV-1 ou outras retroviroses foram descritas, e tentativas de alteração de identidade do iniciador (obs.:primer é a proteína que sinaliza o sítio de iniciação da transcrição e promotor é o sítio de ligação dessa proteína no DNA ou RNA; sendo o promotor uma ou mais seqüencias de nucleotídeos) de tRNA não tiveram sucesso no passado. Essas observações indicam que o vírus prefere intensamente o primer que se identifica com ele, sugerindo que existe um mecanismo verdadeiramente específico para a seleção do primer de RNA. Na realidade, os tRNA iniciadores são seletivamente empacotados, encaixados ou copiados em pequenas partículas virais especificamente reconhecidos pela enzima Transcriptase Reversa (RT) e colocados em contato com o genoma viral via pares de base com o PBS (PRMER BINDING SITE = SÍTIO DE LIGAÇÃO DO PRIMER), oferecendo dessa forma um específico complexo de iniciação. Este capítulo focalizará primeiramente a interação entre o iniciador de tRNA celular e o genoma viral em RNA. Outros aspectos que determinam a especificidade do primer (iniciador) estarão presentes genericamente. Novos achados têm promovido novos clarões nas múltiplas interações entre o iniciador de RNA transportador e o genoma viral em RNA. Seus resultados dispararam a revisão das tentativas para alterar o uso do tRNA para o HIV-1, assim proporcionando um método para estudar em profundidade os determinantes de especificidade do uso de tRNA. Nossos resultados confirmam a ativação do modelo de iniciador de tRNA por um molde contido no genoma viral em RNA. Nós discutiremos especificamente a pesquisa no nosso laboratório que nos conduziu à identificação deste sinal de ativação do iniciador (PAS – PRIMER ATIVADOR SIGNAL), que nos permitiu desviar com sucesso o uso do tRNA do HIV-1.

III – Transcrição Reversa

A transcrição reversa é a etapa de replicação que converte um genoma de RNA em uma cópia de pró-vírus em DNA, um mecanismo que é compartilhado pelas retroviroses, retrotransposons e vírus da hepatite (obs. Hepatite B). O processo de transcrição reversa é composto de várias etapas.

OBS. A figura 1 do capítulo apresenta as fases da transcrição em várias linhas. A primeira linha representa o RNA viral sendo abordado pelo tRNALys3e está reproduzida abaixo:


R U5 PBS cppt ppt U3 R
vRNA:
tRNA

Onde:
R = seqüencias de repetição, que neste caso são iguais;

U5 = Unidade da extremidade do carbono 5’.Este é o carbono que apresenta um grupo fosfato que poderá se ligar ao grupo OH livre do carbono 3 do nucleotídeo.
OBS.: O nucleotídeo é composto da base nitrogenada (pririmídicas: citosina, tirosina ou uracila; ou púricas: guanina e adenina), um açúcar (ribose ou desoxirribose) que se liga à base , formando o conjunto nucleosídio, e, finalmente, o grupamento fosfato que se liga ao carbono 5 do açúcar, para formar conjunto denominado nucleotídeo.

U3 = Unidade da extremidade do carbono 3’. Este carbono 3 é que apresenta um grupo OH, onde o grupamento fosfato do carbono 5 de outro nucleotídeo é ligado formando a trilha de nucleotídeos (primeira fita, fita minus). Por isso a fita só cresce no sentido 5’ para 3’. Mas na fita de origem, a leitura segue de 3’ para 5’.

Cppt = central ppt (trato de polipurina). Não é degradado pela RNaseH, após a transcrição do (‑) ssDNA.

Ppt= trato de polipurina. Não é degradado pela RNaseH, após a transcrição do (-)ssDNA.

Texto da figura:
O genoma de RNA contém terminações repetidas na ponta 5’ e na ponta 3’ que são fundamentais para a reação da transcrição reversa. O lado do carbono 5’ é seguido pelo elemento U5 que é alocado imediatamente a montante do sítio de ligação ao primer (promotor/iniciador) e contém várias seqüências-molde que regulam a transcriptase reversa. A seqüência de tRNA de Lisina (tRNALis3 ), que é complementar ao PBS no genoma viral está ressaltada com o círculo cinza com a alça do tRNA. Essa seqüência (Lis3) é copiada durante a transcrição reversa. O PBS do pró-gene viral é então codificado pelo promotor (primer) celular e também é marcado por um círculo cinzento. O capítulo focará a etapa inicial da transcrição reversa, indicada pelo Box da esquerda acima na figura.

OBS. O BOX é o sítio onde a enzima de transcrição se liga na fita codificadora, que é a fita anti‑senso. É o complexo de iniciação da transcrição, que, neste caso, compreende o conjunto:
R U5 PBS
tRNALys3


OBS. A segunda linha da figura demonstra o sítio de interação do tRNA com o PBS copiado em DNA, como reproduzido abaixo:
R U5 cppt ppt U3 R
RNA
-DNA

Este primeiro trecho de cópia em DNA é denominado (-)ssDNA. O trecho original composto de RNA com os sítios R, U5 e PBS, serão degradados. O (-)ssDNA vai se deslocar até a outra extremidade da fita de RNA, emparelhando o sítio R (em DNA) com o sítio correspondente R (em RNA), que fica ao lado de U3. A partir deste ponto ocorre o alongamento da fita de –DNA , ou seja, a cópia do RNA em DNA de uma fita somente. A fita de RNA original é degradada (exceto o cppt e o ppt) e na fase posterior a nova fita de DNA é duplicada através da formação de outro complexo de iniciação similar ao primeiro.

OBS. A pergunta do capítulo é:
Se na constituição das proteínas pode haver mais de um tRNA para cada aminoácido, já que apenas a correspondência no pareamento das duas primeiras bases do anticódon do tRNA com as segunda e terceira bases do códon do mRNA são o suficiente para a interação com o aminoácido, por que o vírus do HIV-1 não aceita no complexo de iniciação da transcrição reversa outro primer que não o tRNA específico para Lisina?

OBS. Trecho do livro “Genética um Enfoque Molecular”, de T.A.Brown, capítulo 9, pg. 98:
“De acordo com o que se tem dito até agora, é possível imaginar que há 6 tipos de moléculas de tRNA em cada célula, uma para cada um dos códons que especificam um aminoácido. Na verdade, sabe-se desde o início da década de 60 que há substancialmente menos de 61 moléculas de tRNA diferentes, geralmente entre 31 e 40, dependendo do organismo. A explicação para tal é dada pela hipótese de oscilação, que foi primeiramente exposta por Crick em 1966.
Esta hipótese baseia-se no fato de que uma alça anticódon é apenas isto, uma alça, e que o próprio anticódon não é um trinucleotídeo perfeitamente linear. A pequena dupla hélice formada por pareamento de bases entre o códon e o anticódon não tem, portanto, a configuração precisa de uma hélice de RNA padrão: em vez disso, suas dimensões estão ligeiramente alteradas. Como resultado podem se formar pares de bases fora do padrão na posição de oscilação (entre o prmeiro nucleotídeo do anticódon e o terceiro nucleotídeo do códon). Por tanto, um único anticódon pode ser capaz de formar pares de bases com mais de um códon, e um único tRNA pode decodificar mais de um membro da família de códons. Entretanto, as regras de pareamento de bases não são completamente flexíveis na posição de oscilação, e somente alguns poucos tipos de pares de bases incomuns são permitidos. Os exemplos mais comuns são os seguintes:
1. Pares de bases G-U
2. Inosina pode formar pares de bases com C, A e U. A inosina é uma forma desaminada de G (guanina). Em alguns tRNAs o nucleotídeo de oscilação do anticódon é a inosina.”

OBS. Se o tRna para Lisina traz o anticódon que, por pareamento, se liga ao códon em mRNA para este aminoácido, o mRNA (ou o RNA do HIV-1 no PBS) teria que ser, contando com as possíveis oscilações, AAG, AAA, ou AAC, enquanto o tRNA poderia ser UUC, UUU ou UUG, podendo aceitar o tRNA para AAU (aspargina)?

OBS. Aminoacilação do tRNA:
Cada molécula de tRNA forma uma ligação covalente com seu aminoácido específico por meio de um processo chamado aminoacilação ou associação. O aminoácido se torna ligado à extremidade do braço aceptor do trevo de tRNA. A ligação se forma entre o grupamento carboxila do aminoácido e o grupamento 3’-OH do nucleotídeo terminal do tRNA. Este nucleotídeo terminal é sempre A (adenina) pois todos os tRNAs possuem a seqüência : 5’ –CCA-3’ nas suas extremidades. ( In, Genética um Enfoque Molecular, de T.A.Brown.)

OBS. OMIM 590060 tRna Lys, Mitochondrial

Kinetoplastid protozoa, including Leishmania, have evolved specialized systems for importing nucleus-encoded tRNAs into mitochondria. Mahata et al. (2006) found that the Leishmania RNA import complex could enter human cells by a caveolin-1 (601047)-dependent pathway, where it induced import of endogenous cytosolic tRNAs, including tRNA-lys, and restored mitochondrial function in a cybrid harboring a mutant mitochondrial MTTK gene. Mahata et al. (2006) suggested that the use of protein complexes to modulate mitochondrial function may help in the management of mitochondrial tRNA-associated neuromyopathies.

OMIM 590060 tRna Lys, Mitochondrial
Segundo parágrafo
Tradução de Isabela Matheus

O protozoário kinetoplastidio, incluindo a Leishmania, tem envolvido sistemas especializados para importação de tRNAs codificados do núcleo para dentro das mitocôndrias. Mahata et al (2006) descobriu que o complexo de RNA da Leishmania pode entrar nas células humanas através de um caminho dependente da proteína caveolina-1, onde esta induziu a importação de tRNAs citosólicos endogenos, incluindo o tRNA lys, e restaurou a função mitocondrial num híbrido gene mitocondrial MTTK. Mahata et al. sugeriram que o uso do complexo proteico para modular as funções mitocondriais pode ajudar no gerenciamento das neuromiopatias associadas ao tRNA mitocondrial.

OMIM
189918 TRANSFER RNA LYSINE 1; TRK1
Alternative titles; symbols
tRNA LYSINE 1
Gene map locus 17p13.1

0023 HEMOPHILIA A [F8C, EX15DEL]
In a patient (JH29) with severe hemophilia A and a translocation t(X;17), Antonarakis et al. (1995) found deletion of exon 15.
O exon 15 foi translocado para o cromossomo 17.

(VOLTANDO AO TEXTO DO CAPÍTULO DE Truus E.M. Abbink and Bem Berkhout)

O molde é o genoma viral de RNA estabilizado/fortificado por uma seqüência de repetição nos terminais 5’ e 3’ (obs.: por poliadenilação ou AACAACAAC?). A reação enzimática é catalizada pela associação entre o vírus e a RT (transcriptase reversa) codificada pelo gene “pol” (obs.: de polimerase?). A RT é sintetizada como parte da proteína precursora de Gag-Pol, a qual é clivada pela protease (PR) codificada do vírus em proteínas estruturais e enzimas de replicação RT, PR e IN (integrase). Processamentos do precursor das proteínas ocorrem no momento ou logo após a recepção do vírus e sua potencialização.

OBS.: A figura 2 do livro demonstra claramente o sítio AAAA onde a seqüência complementar UUU do tRNA é ligada e as subseqüentes seqüências do PBS viral e sua correspondente de interação no tRNA, sendo o PBS : UGGCGCCCGAACAGGGAC e o anti-PBS no tRNA: ACCGCGGGUUGUCCCUG. Além destes sítios correspondentes, a figura realça o sítio PAS (Primer Activation Signal : sinal de ativação do promotor), no vírus é GGUCUCAG e no tRNA é CCAGGGTψ, demonstrando que existe um pareamento imperfeito sendo:

Vírus GGUCUCAG
Anti-Pas CCAGGGTψ.

Sendo assim, o vírus admite uma complementaridade imperfeita do tipo UG.

(OBS.: “Genética um Enfoque Molecular”, de T.A.Brown, capítulo 6, pg. 62/63
Todos os tRNA apresentam o característico trevo de tRNA, que traz as seguintes estruturas:
1. O braço aceptor, onde é ligado o aminoácido durante a síntese protéica;
2. O braço D ou DHU, que apresenta invariavelmente uma pirimidina modificada chamada diidrouracila;
3. O braço anticódon, que decodifica a informação trazida no mRNA;
4. O braço extra, opcional ou variável, que pode ser apenas uma alça de três a cinco nucleotídeos ou uma alça muito maior, de treze a vinte e um nucleotídeos com até cinco pares de bases na haste;
5. O braço TψC, que sempre traz esta seqüência de nucleotídeos, sendo o ψ uma pseudouracila, uma base modificada de pirimidina. Esse ψ também é chamado Pseudouridina )

O processamento de proteínas precursoras ocorre no momento ou brevemente após o momento da montagem do vírus e de sua potencialização. Isso sugere que a iniciação da transcrição reversa está restrita até que as partículas do vírus tenham se reunido. O mecanismo responsável por esta restrição é desconhecido, mas motivos seqüenciais e estruturas no padrão viral tem sido implicadas, assim como baixa concentração de dNTP dentro das partículas virais.

OBS.: ( dNTP é desoxinucleotídeo primer trifosfato.)

A Transcriptase Reversa do HIV-1 funciona como um heterodímero de 66 e 55 kDa subunidades.

(Quilodaltons. Obs. Dalton é unidade de massa atômica equivalente a 1/12 da massa de um átomo do nuclídeo de carbono 12 = 1,657x10-24g, aproximadamente igual à massa de um átomo de hidrogênio. Então, massa do quilodalton deve ser igual à massa do hidrogênio vezes 103. Mas a utilização dessas medidas é para contar bases ntrogenadas por computador.)

OBS.:. Heterodímero é um par de diferentes seqüências peptídicas, de aminoácidos ou de nucleotídeios, que parece um pregador de roupa. No caso das polimerases, esta estrutura se liga na dupla hélice de DNA ou de RNA nos processos de separação das duplas hélices para controle da trascrição, etc. As polimerases nos eucariotos são muito complexas e cada uma transcreve um tipo de gene. Existem três RNA polimerases nos eucariotos. A RNA polimerase I transcreve os genes do RNA ribossômico, a II, transcreve genes de proteínas e a maioria dos genes de pequeno RNA nuclear (snRNA) e a RNA polimerase III transcreve genes para snRNA (small nuclear RNA), tRNAs e alguns RNAs ribossômicos. Outro exemplo é a proteína Cro que regula a expressão de genes do bacteriófago λ (lambda). “Cro é um dímero de polipeptídeos idênticos, cada um com três hélices α e de uma região de folha β. Na forma ativa da proteína, as duas hélices α (uma de cada polipeptídeo no dímero) estão separadas exatamente em 34 Å e, portanto, se encaixam em duas seções adjacentes do sulco maior da molécula do DNA.” ... “A ligação ao DNA depende, portanto, de a proteína assumir a estrutura secundária, terciária ou quaternária dorreta, que, por sua vez, depende da seqüência de aminoácidos.” (O texto em negrito foi copiado do livro “Genética um enfoque Molecular”, de T.A.Brown, capítulo 8, pg 87.) Quando as duas partes do pregador apresentam seqüências iguais, então há um homodímero. Outro exemplo é o zíper de leucina, uma proteína que apresenta no lado interno de sua estrutura helicoidal resíduos de leucina que unem as hélices desta proteína como se fosse um zíper. Quando o zíper dentro da proteína, se abre, ele forma um dímero. Introduzindo-se no sulco maior das hélices de DNA, os braços do zíper abrem a estrutura do DNA. Os zíperes de leucina não se ligam diretamente ao DNA, mas, em vez disso, mantêm unidas as duas unidades da proteína dimérica para que os aminoácidos das hastes diméricas possam interagir com a dupla hélice de DNA. (Livros consultados: Genética, Texto e Atlas, 2ª edição, Eberhard Passage, Ed. Artmed e Genética um enfoque Molecular”, de T.A.Brown , cap 10. Ed Guanabara Koogan)

O primeiro dímero da Transcriptase Reversa do HIV-1 é composto por um domínio de polimerase da Transcriptase Reversa e um domínio da enzima RNaseH (Ribonuclease H, que cliva o RNA viral após a transcrição da primeira fita de vDNA (a fita minus), e o segundo dímero contém apenas o domínio da polimerase. A subunidade p51 (de 51 pares de bases) resulta da clivagem da unidade p66 pela protease viral. A atividade de polimerização (transcrição do vírus de RNA para DNA) tem sido atribuída ao dímero p66 que compõe o heterodímero. Como toda polimerase de DNA, a Transcrptase Reversa precisa de um promotor com o grupo 3’-OH livre para iniciar a síntese de cDNA (clone de DNA). Embora uma variedade de moléculas de prímer (sinalizador do promotor) possam ser usadas para iniciar a transcrião reversa in vitro, todo retrovírus utiliza uma só molécula de RNA transportador (tRNA) celular como primer. A análise da seqüência de DNA do genoma pró-viral responsabiliza o tRNAlys3 como incador da replicação para o HIV-1 E HIV-2. Um pré-requisito para a iniciação da transcrição reversa é a formação do complexo de iniciação externamente vincado entre o genoma viral e o tRNA. Os dezoito nucleotídeos finais do terminal 3’ (18nts) dos pares de base do iniciador de tRNA com o complementar em PBS (nas posições +182 para 199) (Obs.: + indica a fita anti-senso, a segunda fita transcrita) no genoma viral, e o terminal 3’-OH do tRNA servem como padrão de dependência para primer de síntese de DNA. O PBS está localizado próximo ao final 5’ do genoma de RNA na região da guia não traduzida. (Obs. O RNA viral não é em fita dupla.) A seqüência de tRNA que se anela ao PBS é referida como anti-PBS (no tRNA). No anelamento, o iniciador está estendido e um cDNA do 5’R (do sítio R na ponta 5’) é sintetizada pela transcriptase reversa. Ela imediatamente reproduz a fita filha (minus-strand) até o ponto de finalização do DNA (-)ssDNA (strong-stop DNA). O domínio RNase H do dímero da RT degrada o modelo de RNA que restou unido ao produto (-)ssDNA. Conseqüentemente, o strong-stop DNA (o ponto de finalização da transcrição da fita filha em DNA) está livre para unir-se à região 3’R (seqüência de repetição no lado 3’ da fita de RNA viral, a outra extremidade) localizada no final do genoma. Esta etapa é referida como a primeira reação de transferência de fita.
O (-)ssDNA subseqüentemente serve como um primer para a síntese do resto do DNA. A transcrição reversa produz / gera uma grande extensão de fita de cDNA(-) que serve como modelo para a síntese da fita de DNA(+). A RNaseH degrada o molde de RNA, exceto dois fragmentos que resistem à clivagem: a polipurina seguinte à região 3’ (3’-ppt) e o centro do modelo inicial (ppt central, ou cppt). A seqüência de RNA resistente prepara a síntese da fita de DNA(+), a qual pára na primeira base modificada da molécula de tRNAlys3. Então, os dezoito nucleotídeos do terminal 3’-OH do tRNA acabam (saem do) no progene viral, um fenômeno único na virologia. O tRNA primer é subseqüentemente removido da fita (+)ssDNA pela RNaseH. (Obs. Esses dezoito nucleotídeos são a cópia da seqüencia de tRNA que serve como primer). Uma segunda reação de transferência de fita resulta num anelamento da fita (+)ssDNA ao final 3’ da fita (-)DNA de grande extensão. A transcrição reversa prossegue sobre a fita (-)DNA até encontrar a extensão cppt da fita (+). Enlongamentos (prosseguimento da transcrição) ocorrem através do cppt por meio de um mecanismo chamado deslocamento até a transcriptase reversa alcançar um sítio vizinho (80 a 100 nucleotídeos a jusante) que é a seqüência de terminação central. Este modelo é muito eficiente na terminação do alongamento de DNA catalizado pela Transcriptase Reversa do HIV-1. Conseqüentemente, o produto da fita dupla de DNA pró-viral é sintetizado de tal forma que é flanqueado (ladeado) por dois LTRs (longos terminais de repetição) e contêm uma fita descontínua de DNA(+) com aproximadamente 99 nucleotídeos de DNA oscilatório no centro. Esta seqüência oscilante como uma aba é específica para lentiviroses e é importante para a importação nuclear e conseqüentemente replicação em células que não estão em divisão. Uma endonuclease (proteína que atua no núcleo da célula) celular remove a aba e uma DNA ligase completa a continuação da fita dupla. (Qual DNA ligase? A DNA ligase não atua após a inserção do DNA viral no DNA da célula hospedeira?) O DNA pró-viral é eventualmente integrado no genoma da célula hospedeira pela proteína viral integrase.
Existe uma ocasião especial em que o HIV-1 usa uma diversidade de moléculas de tRNA como promotores de reinicialização da transcrição reversa. Quando uma estrutura de excessivos ganchos (alças) em conjunto é introduzida no genoma viral em RNA, a replicação é bloqueada. Reversores podem ser selecionados para deletar a maioria das estruturas em ganchos por um evento de recombinação que usa uma variedade de moléculas de tRNA para restabelecer a trasncrição reversa por detrás da estrutura em ganchos. Este mecanismo foi denominado recombinação de indutor de ganchos mediado por tRNA (HITME).

0023 HEMOPHILIA A [F8C, EX15DEL]
In a patient (JH29) with severe hemophilia A and a translocation t(X;17), Antonarakis et al. (1995) found deletion of exon 15.

O exon 15 foi translocado para o cromossomo 17.

Foi o único caso de hemofilia a por translocação que eu encontrei na lista do OMIM. Isso foi achado num só paciente.

OMIM

189918 TRANSFER RNA LYSINE 1; TRK1
Alternative titles; symbols
tRNA LYSINE 1
Gene map locus 17p13.1

OMIM 590060 tRna Lys, Mitochondrial
Segundo parágrafo
Tradução de Isabela Matheus

O protozoário kinetoplastidio, incluindo a Leishmania, tem envolvido sistemas especializados para importação de tRNAs codificados do núcleo para dentro das mitocôndrias. Mahata et al (2006) descobriu que o complexo de RNA da Leishmania pode entrar nas células humanas através de um caminho dependente da proteína caveolina-1, onde esta induziu a importação de tRNAs citosólicos endogenos, incluindo o tRNA lys, e restaurou a função mitocondrial num híbrido gene mitocondrial MTTK. Mahata et al. sugeriram que o uso do complexo proteico para modular as funções mitocondriais pode ajudar no gerenciamento das neuromiopatias associadas ao tRNA mitocondrial.

CAPÍTULO DO LIVRO : HIV-1: MOLECULAR BIOLOGY AND PATHOGENESIS, VIRAL MECHANISMS, 2ND EDITION - 2000/2007
KUAN-TEH JEANG
COLEÇÃO ADVANCES IN PHARMACOLOGY
EDITORA ELSEVIER

TRADUÇÃO E OBSERVAÇÕES: ISABELA MATHEUS (ESCOLARIDADE SUPERIOR INCOMPLETO)

IMPLICAÇÕES DO TRATAMENTO NO RESERVATÓRIO LATENTE PARA HIV-1
Susan Peterson, Alison P. Reid, Scott Kim, and Robert . Siliciano

1)Visão Geral do Capítulo


Este capítulo explora a definição e o mecanismo do reservatório latente, resistência e as implicações do tratamento e o impacto do reservatório latente no desenvolvimento de drogas futuras. O reservatório viral é um tipo de célula ou local anatômico onde o vírus ou as células infectadas persistem com replicação cinética (metabólica) e/ou taxa de renovação mais lenta do que o principal local de depósito da atividade de replicação do vírus obs1. O reservatório estável para o HIV-1 é criado quando o receptor CD4 ativado de células T que estão se convertendo em células de memória é infectado. O DNA viral torna-se interado ao DNA do cromossomo da célula. Esta integração aos genomas de longa vida das células de memória proporciona um mecanismo de arquivamento de todas as maiores formas de vírus que tenham circulado nu indivíduo infectado, inclusive as variantes virais que apresentem resistência às drogas anti-retrovirais. Isto torna as decisões quanto ao tratamento particularmente difíceis sob a luz do fato de que os ensaios de avaliação de resistência não conseguem acessar os conteúdos do reservatório latente. Diversas abordagens para calcular esse desafio foram exploradas, incluindo interrupções do tratamento programadas, o que ultimamente provou ser ineficiente, bem como desenvolvimento de drogas com altas barreiras à resistência, e o desenvolvimento de novas classes de drogas com novo mecanismo de ação. Esforços para combater o reservatório latente através da intensificação da terapia de alta atividade anti-retroviral (HAART) e ativação de agentes têm desafortunadamente apresentado apenas um sucesso limitado, e novas abordagens serão necessárias se a erradicação é para ser atingida.

2) Introdução


A descoberta do reservatório latente nas células TCD4 quiescentes (em descanso) fundamentalmente mudaram o caminho pelo qual os pacientes, fisiologistas e cientistas conceitualizaram o tratamento da infecção pelo HIV-1. O reservatório latente é agora amplamente reconhecido como uma enorme barreira para a cura da infecção pelo HIV-1, e a terapia anti-retroviral não é mais oferecida com a esperança na erradicação da infecção . Atualmente a supressão da replicação viral por longo tempo tornou-se um gol terapêutico. Em adição, o reservatório é responsável pela persistência da resistência a drogas em pacientes infectados. Este capítulo explora a natureza e os mecanismos do HIV-1 latente, as implicações da resistência a drogas e o impacto do reservatório latente no desenvolvimento de futuras drogas.

OBS1: No corpo, o vírus pode ser replicado mais favoravelmente em uma determinada região.

3)O Que é Reservatório Latente?


A – O Tipo Celular e Localização


O termo reservatório é freqüentemente usado na literatura sobre virologia, nem sempre de modo preciso. Isto é entretanto importante no início para esclarecer o exato significado de um reservatório viral. O reservatório viral é um tipo de célula ou uma localização anatômica em que o vírus ou as células infectadas por ele persistem com replicação cinética lenta ou a taxa de duplicação mais lenta do que a principal fonte de atividade de replicação viral. O vírus no reservatório precisa ter competência para replicar-se e está em algum local protegido dos efeitos do sistema imunológico, medicação antiviral e deterioração bioquímica. Um reservatório para o HIV-1 foi identificado em células TCD4 quiescentes por meio de experimentos que recobram a competência da replicação do vírus proveniente dessa população de células. Tem sido aceita a hipótese de que outros tipos de células, incluindo aas linhagens de monócitos e macrófagos, que podem também servir como reservatórios para o vírus. De fato, macrófagos servem como uma importante origem do vírus em estágios tardios da infecção quando células TCD4 sofrem larga depleção. Enquanto macrófagos infectados aparecem para lançar a continuidade do vírus, eles duplicam mais lentamente do que as células TCD4 e assim podem ser considerados um reservatório.


A-1. Reservatório Versus Compartimento


Os termos reservatório e compartimento são freqüentemente confundidos. As taxas de replicação cinética e por duplicação OBS2 não precisam ser diferentes em um compartimento viral. Em vez disso, existe um obstáculo entre o compartimento e o resto do organismo que só raramente é transposto. Este obstáculo leva a uma divergente evolução entre as duas populações virais do compartimento e do resto do corpo. Exemplos de compartimentos incluem o trato genital e o sistema nervoso central. Critérios filogenéticos podem ser usados para diferentes reservatórios e compartimentos. Seqüências extraídas do reservatório de um paciente apresentarão uma diversidade desenvolvida e a expressão de seqüências divergentes do mais recente antecessor comum decrescida. Isso reflete o fato de que um reservatório contém seqüências depositadas em diferentes fases da infecção. Isso é claramente demonstrado por análises do reservatório latente do HIV-1 em células TCD4 quiescentes onde o arquivo do tipo selvagem e dos tipos resultantes de resistência a drogas permanecem.

OBS2: A primeira se dá como a expressão do vírus em RNA e proteínas para formação de novos vírions que serão liberados com a lise da célula. A segunda se refere à duplicação do genoma viral concomitantemente à intérfase (duplicação do cromossomo) e subseqüente mitose celular .





Em contraste, seqüências provindas de um compartimento demonstrarão diversidade reduzida e serão agrupadas separadamente na árvore filogenética. A penetração da droga nesses compartimentos é uma importante preocupação quando designa um regime anti-‑retroviral pois baixos níveis da droga nesses compartimentos podem, a princípio, liderar o desenvolvimento de resistência nos mesmos. Por exemplo, se um componente de um regime de três drogas falha em atingir um nível apropriado no sistema nervoso central, então o vírus deste compartimento estará exposto apenas a duas drogas anti-retrovirais, aumentando o risco do avanço da resistência.


A-2. Mecanismo de Latência


O HIV-1 surgiu como sendo replicado nas células TCD4 ativadas. Muitos dos fatores anfitriões necessários para replicação são pobremente/ incorretamente expressados ou são isolados em forma inativa nas células TCD4 quiescentes. As células TCD4 ativadas que são infectadas e produtivas morrem muito rápido como resultado de ambos os ataques do vírus e do sistema imunológico. Entretanto, se uma célula TCD4 ativada está no processo de conversão para uma célula de memória quiescente quando torna-se infectada, o HIV-1 pode solidamente integrar-se no DNA da célula hospedeira e persistir por toda a vida dessa célula. O HIV-1 integra-se mais comumente em íntrons de genes ativos transcritosOBS3. Desse modo, o estado de latência não é conseqüência da inacessibilidade do pró-vírus ao aparato transcricional. Pelo contrário, a latência resulta de outros fatores incluindo os níveis inadequados de transcrição do hospedeiro e da seqüência Tat do HIV-1, uma proteína viral (enzima) que normalmente auto-regula a expressão do gene do HIV-1.


A-3. HAART

Existem correntemente vinte e uma drogas anti-retrovirais aprovadas pela FDA (Food and Drug Administration of The United States Departments of Health and Human Services) que podem ser divididas em quatro classes baseadas em seu mecanismo de ação. HAART (terapia de alto impacto) consiste da combinação de três ou mais drogas anti-retrovirais, usualmente de, no mínimo, duas classes. O regime HAART mais usado consiste de dois inibidores de nucleosídios de transcriptase reversa (NRTIs) e ou um inibidor de protease (PI) ou um inibidor de transcriptase reversa não direcionado a nucleosídio (NNRTI).

OBS3: Genes que apresentam grande demanda de transcrição são mais ativos. E genes com deficiência seqüencial do tipo pontual que apresentam UGA antes do final do éxon transformam um período do éxon em seqüencia não transcrita, porém não UTR (que se apresenta apenas nas extremidades do gene completo). Por isso, estes trechos descartados da transcrição podem oferecer ao vírus as mesmas condições favoráveis de integração no íntron que é degradado na maturação do mRNA. Dessa forma, genes que apresentam este defeito seqüencial sem sentido deveriam ser mais propensos a receber o genoma viral, que pode ser alocado inclusive no trecho correspondente do éxon do mesmo gene normal.



Estudos anteriores sobre a dinâmica viral por Ho e Perelson demonstraram que a monoterapia pode decrescer a carga viral em um paciente para mais de três logaritmos nas primeiras três semanas, e que na HAART a carga viral decresce em um exponencial padrão bifásico de níveis indetectáveis em menos de dois meses.
Análises da viremia (presença do vírus no sangue) residual em pacientes tratados com HAART têm demonstrado que esta desacelera e em alguns casos pára a evolução viral, mas como um resultado da existência dos estabelecimentos de reservatórios, a HAART não pode curar a infecção por HIV-1.


A-4. O Reservatório Latente como uma Barreira para a Cura


Em uma pessoa infectada por HIV-1, aproximadamente 1/106 (1 x – 106) células TCD4 quiescentes encobrem vírus competentes para a replicação. Assim sendo, o quantitativo de células infectadas em estado latente é pequeno. Entretanto, a meia-vida dessas células T infectadas em estado latente tem sido estimada em quarenta e quatro (44) meses. Em função de sua freqüência e de sua meia-vida, a erradicação poderia levar setenta três (73) anos para completar a supressão da replicação viral. Encurtar esta meia-vida no intuito de atingir a erradicação do reservatório latente tem sido o objetivo de inúmeras estratégias diferentes.


4) Resistência: Mecanismo de Armazenagem no Reservatório Latente e suas Implicações Clínicas


A-O Desenvolvimento de Resistência

O último objetivo da terapia anti-retroviral é a supressão do nível viral no plasma para menos de cinqüenta (50) cópias por ml, minimizando a evolução viral e a resistência emergente. Causas comuns de falência do tratamento e o desenvolvimento de resistência para as terapias anti-retrovirais incluem a não aderência, a combinação inapropriada de drogas antagonistas, a monoterapia, as quais foram comumente praticadas no começo dos anos noventa, quando havia poucas opções de drogas avaliáveis. Sub-ótimos regimes inibem parcialmente a replicação e exercem uma pressão seletiva no vírus selvagem levando as variantes resistentes a tornarem-se dominantes. O problema da resistência é exacerbado pelo fato de que quando qualquer espécie viral resistente torna-se a população dominante secundária para a terapia ineficiente, o vírus é arquivado no reservatório latente. Isso causa ao paciente uma perpétua resistência a drogas motivando a pressão seletiva. Além disso, se a terapia é descontinuada, os vírus selvagens mais adaptados ressurgem do reservatório latente como espécie dominante no plasma, particularmente se a capacidade de replicação das espécies resistentes for significativamente reduzida por suas mutações.


B-A Interrupção do Tratamento
A rápida reemergência do vírus selvagem como dominante no plasma após a cessação da terapia anti-retroviral levou alguns pesquisadores a acreditar que as variantes resistentes eram transitórias e facilmente eliminadas em abstenção da ação seletiva. Entretanto, não está claro que variantes resistentes sejam estocadas no reservatório latente justamente quando não são muito detectáveis no plasma de pacientes que interromperam a terapia e que tem um vírus selvagem no plasma. Este princípio é ilustrado pela experiência com a estratégia terapêutica o “programa de interrupção do tratamento” em pacientes cuja terapia sucumbiu. A idéia por trás desses estudos era de que um tratamento interrompido poderia trazer o retorno do vírus selvagem, tornando os pacientes mais propensos a responder a um regime eficiente. Isso ocorreu desde que ficou claro que as viroses, resistentes a drogas, e já arquivadas, conferem permanente resistência a drogas e que estas variantes podem ressurgir quando a terapia é reiniciada. Dessa forma, pacientes que suportam a interrupção do tratamento para esse propósito não respondem melhor à terapia de resgate do que pacientes que mudaram diretamente para o regime de resgate, e demonstraram uma taxa alta de eventos adversos relatados da derrota da supressão viral durante a interrupção.

C- A Pulsação e o Relacionamento com o Reservatório Latente

Apesar de as drogas anti-retrovirais poderem reduzir a carga viral em níveis indetectáveis pelos ensaios ultrassensíveis de RT-PCR (Reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa), o reservatório latente persiste e serve como um arquivo para o vírus selvagem, tão bem quanto qualquer variante resistente que possa surgir de uma terapia não supressiva anterior. Quando as células TCD4 quiescentes infectadas em estado de latência passam por ativação, a auto-regulação da expressão do gene viral pode levar à produção de vírions que podem ser detectados como nível baixo de viremia. Não está claro que a maioria dos pacientes sob a terapia HAART que têm carga viral abaixo do limite de detecção dos ensaios clínicos atuais tenham uma viremia residual contínua menor que cinqüenta (50) cópias por mililitro. Isto pode refletir a liberação de vírus a partir dos reservatórios. Somado a isso, alguns pacientes têm oscilado em elevações de viremia para a classe detectável (> 50 cópias/ml). Essas oscilações são denominadas pulsações. Em freqüentes amostras, as pulsações podem ser detectadas na maioria dos pacientes em terapia anti-retroviral supressiva. Estudos clínicos têm demonstrado que esses aumentos transitórios da carga viral não são associados com a evolução viral e podem representar uma variação estatística em torno da expressão da carga viral que é ligeiramente inferior ao limite de detecção. O achado de que estas oscilações podem ser viremia sem evolução viral sugere que enquanto não for possível curar o HIV-1 com o tratamento anti-retroviral corrente, os pacientes podem manter uma supressão crônica de replicação viral.

IMPLICAÇÕES DO TRATAMENTO NO RESERVATÓRIO LATENTE PARA HIV-1
Susan Peterson, Alison P. Reid, Scott Kim, and Robert . Siliciano

V- Experimentos quanto ao Genótipo e ao Fenótipo: as Implicações do Tratamento no Reservatório Latente


A resistência à droga é o problema dominante no gerenciamento da infecção por HIV‑1, e isto é importante para compreender como a existência de um reservatório latente para o HIV-1 afeta as decisões clínicas considerando o uso de drogas anti-retrovirais em pacientes que apresentam resistência. Dois tipos dos maiores testes são usados para detectar a resistência e determinar o melhor tratamento anti-retroviral para um paciente, são eles os ensaios de genótipo e fenótipo. Nenhum dos dois detecta a resistência das viroses no reservatório latente.


A-Ensaios sobre Genótipo (composição genética)

Os clínicos em geral solicitam um ensaio do genótipo para resistência quando u paciente infectado do HIV-1 vem a ser avaliado pela primeira vez, justamente para a iniciação do tratamento, durante a gravidez, e na eventual falência do tratamento. Esse ensaio envolve níveis populacionais de seqüência da transcriptase reversa (RT) e a protease de genes para procurar por mutações de resistência presentes nessas regiões. Por que a extensiva informação é analisada considerando a correlação entre o genótipo e o fenótipo (características físicas como estrutura espacial, relação cm o ambiente, etc), os resultados seqüencias podem ser usados para predizer os níveis de resistência de um indivíduo para as drogas anti-retrovirais. Enquanto este ensaio é relativamente barato, rápido e reprodutível, ele só amplifica as espécies mais dominantes no plasma e pode perder mutações em quaisquer espécies menos prevalentes e das viroses no reservatório latente. Adicionalmente, nem todas as mutações resistentes são conhecidas para novas drogas, e o perfil do complexo de resistência requer perícia para interpretação.

B- Ensaios sobre Fenótipo

Ensaios de fenótipo são geralmente reservados para pacientes altamente experimentados no tratamento e cujo regime corrente venha falindo ou para aqueles com padrão complexo de resistência. O ensaio envolve a inserção de transcriptase reversa (RT) e protease de genes do vírus do paciente dentro de um suporte para o relatório do vírus. A replicação é, então, monitorada em uma única vez, em análises de linhagens de células transformadas na presença de dosagens de diferentes concentrações de drogas. Esse ensaio é considerado mais caro, mais oneroso do que o ensaio de genótipo. Isto determina a resistência a drogas singularmente mais rápido do que combinações e pode apenas detectar resistência para as espécies dominantes no plasma. Assim como o ensaio de genótipo, este requer uma carga viral no plasma de, no mínimo quinhentas a mil cópias por mililitro. Entretanto, a interpretação desse ensaio é, de longe, mais fácil e correta, e ela considera a estimativa da complexa interação entre a resistência a drogas por mutação. Enquanto esse ensaio proporciona informação útil para determinar o regime mais efetivo para um vírus com o complexo padrão de resistência por mutações, existem algumas questões sobre o fato de os ensaios envolverem linhagem de células de laboratório que não refletem “in vivo” as condições de infecção. Além disso, este ensaio, só calcula drogas individualmente e pode não contabilizar a sinergia ou o efeito antagônico da combinação de drogas.

C- O Reservatório Latente e Ensaios de Suscetibilidade a Drogas

Os Ensaios de genótipo e de fenótipo não refletem necessariamente a resistência arquivada no reservatório latente. Os clínicos usam esses ensaios para contabilizar a população viral dominante no plasma no momento do ensaio. Entretanto, pelo fato de as variantes virais arquivadas no reservatório latente não serem detectadas por estes ensaios, os clínicos são radicais em confiar em sua experiência no histórico do tratamento do paciente tão bem quanto em seu julgamento clínico para determinar o mais efetivo regime anti-retroviral para o paciente.

VI- Desenvolvimento da Droga: Levando em conta o Reservatório Latente

A-O Problema da Mutação Sobreposta

Ao desenvolver novas drogas anti-retrovirais dentro de uma classe estabelecida, é da maior importância o cálculo de um possível impacto das conhecidas mutações que conferem resistência para além da classe inteira de antiretrovirais. A prévia exposição a drogas de uma dada classe pode gerar mutações resistentes que podem persistir no reservatório latente e comprometer futuras respostas aos agentes da mesma classe. Mutações preexistentes que conferem resistência a outros agentes, da mesma classe, são conhecidas como mutações sobrepostas. Os NNRII (inibidor não-nucleosídico de transcriptase reversa) são a classe mais importante para a qual isto é aplicado pois existe um número de mutações pontuais que confere completa resistência a toda avaliação dos NNRTIs.

OBS4: Mutação do aminoácido K (lisina =AAG ou AAA) na posição 103, para o aminoácido asparagina (asn = AAU ou AAC)

O novo NNRTI mais promissor é o ETRAVIRINE, o qual não é afetado por K103N(OBS4), uma das mais comuns mutações para NNRTI. Múltiplas mutações são necessáias para que haja completa resistência a esta droga.

B- Alta Barreira à Resitência

Para uma droga anti-retroviral, a barreira genética para resistência depende do número de mutações necessárias para conferir a resistência à droga e da velocidade com que essas mutações se desenvolvem sob pressão seletiva. Alguns anti-retrovirais como os NNRTIs têm uma baixa barreira de resistência, sendo somente uma mutação o suficiente para alto nível de resistência a toda classe. Uma vez que uma mutação de resitência ao NNRTI semelhante à K103N ou Y181COBS5 se desenvolve, esta pode ser arquivada no reservatório latente e conferir perpétua resistência àquela classe de agentes (drogas). Outros anti‑retrovirais como os PIs (inibidor de protease) têm alta barreira à resistência, requerendo múltiplas mutações que característicamente acumulam-se sobre longos períodos de tempo.

B-1. Darunavir

O recentemente aprovado PI duranavir está sendo usado amplamente em regimes de resgate; sua eficácia é reduzida somente com dez ou mais mutações para PI ou com as acumulações de mutações de resistência específica para o darunavir. Isso torna o duranavir eficiente em pacientes que tiveram falência em múltiplos regimes contendo PI. Recentemente estruturas de cristal visualizadas do duranavir no sítio de protease ativo revelaram dois (2) diferentes prolongamentos ligados a dois diferentes sítios simultaneamente. A alta barreira do duranavir à resistência pode ser relatada pelo ato de que a droga atua em dois sítios ligados, desse modo requerendo a alteração simultânea desses dois lócus para perder a eficácia.

C- Aumento de Suscetibilidade

As mutações de resistência a anti-retrovirais selecionadas por uma droga ocasionalmente confere o aumento da suscetibilidade a outras drogas. Existem dois principais exemplos desse fenômeno.

I-Interação do AZT (zidovudine) com 3TC (lamivudine)
OBS5: Mutação de tirosina (UAU ou UAC) para cisteína (UGU ou UGC), na posição 181. OBS6: Mutação de metiodina (AUG, códon iniciador de transcrição) para valina (GUU,GUC, GUG ou GUA) O primeiro exemplo é a supressão de resistência para o THYMIDINE, análogo ao zidovudine (AZT) que é induzida pela mutação M184Vobs6 causada pelo lamivudine (3TC) e
pelo emtricitabine (FTC). Quando a mutação M184V coexiste com mutações análogas do thymidine em uma distensão de resistência, o vírus continua a ser resistente para ambos FTC e 3TC, mas sua resistência ao AZT está atenuada pelo efeito da mutação M184V. A mutação Y181C para NNRTI em combinação com a mutação M184V é também suficiente para reverter a resistência ao AZT. Estudos subseqüentes têm demonstrado que a mutação M184V não só atenua a resistência ao AZT, mas também induz a hiper-suscetibilidade para o AZT em pacientes sem mutações análogas para thymidine. Isso parece ser reportado ao fato de que a M184V interfere na remoção dependente de ATP do AZT do clone de DNA terminado no sítio ativo da transcriptase reversa. Outras mutações para NRTI (inibidores de nucleosídeos da transcriptase reversa) que também têm sido apresentadas como indutoras de hiper‑sensibilidade ao AZT incluem mutações nas posições Q151 e Y115 (Q é glutamina, CAG ou CAA; e Y é tirosina, UAU ou UAC).

II- Hiper-suscetibilidade ao NNRTI

O segundo exemplo de hipersuscetibilidade é aquele causado pela mutação para NRTI (inibidor de transcriptase reversa nucleosídico). Progressivamente, as mutações para NRTI vêm sendo associadas à hiper-suscetibilidade aos NNRTIs. Isso é presumivelmente devido ao fato de que estas mutações que conferem resistência aos NRTIs são localizadas pero do sítio da transcriptase reversa e induzem mudanças na conformação que podem afetar o sítio de ligação dos NNRTIs próximos.

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Susan Peterson, Alison P. Reid, Scott Kim, and Robert . Siliciano

III- Mutações hiper-sensibilizadoras e o Reservatório Latente

Mutações a drogas anti-retrovirais que induzem a hipersensibilidade são arquivadas no reservatório latente da mesma maneira que todas as outras mutações. Entretanto, para manifestar seu efeito na droga desejada, a hipersensibilidade do vírus precisa ser mantida por terapia continuada com drogas indutoras. Por exemplo, muitos pacientes usuários do AZT continuam tomando 3TC (ou FTC) ainda quando têm uma mutação M184V documentada. Nessa situação, o 3TC mantém a seleção sobre a variante resistente. Se o 3TC fosse descontinuado, variantes arquivadas carentes dessa mutação emergiriam. Embora a resistência do vírus ao 3TC pudesse ser preservada no reservatório latente, as vantagens relatadas para a reduzida saúde (emagrecimento) e para a hipersensibilidade ao análogo thymidine da variante M184V poderia ser efetivamente perdida.

D- Novas Classes

Para pacientes experimentados em tratamentos que venham a falhar em todos os regimes correntes, novas classes de drogas são cruciais para atingir a supressão viral. Novas classes de drogas como os inibidores de integrase e inibidores de inserção (na cromatina) são diversamente afetadas por mutações sobrepostas presentes no vírus do plasma ou no vírus do reservatório latente e podem oferecer aos paciente de longo tratamento a opção de uma nova terapia. Novas classes de drogas podem também aperfeiçoar uma parte dos efeitos padrões e melhorar a complacência dos regimes simplificados.

D-1. Novos Mecanismos

OBS7: diketona é uma molécula contendo 2 grupamentos carbonila. Por exemplo: CH3COCH2COCH3.

OBS8: TNX é a abreviatura da proteína Tenascin X (OMIM 600985). As tenascin são uma família de proteínas de matriz extracelular, ou seja, que compõe a substância intercelular de um tecido. O lócus gênico é 6p21.3, ou seja, fica no cromossomo 6, no braço p, que é o braço curto, no segmento 21. Chamou a atenção por sua expressão na interação com tecidos na embriogênese e sua acentuada expressão em tumores. Nos camundongos (cujo gene é 73% idêntico ao humano) a TNX apresenta um motivo similar ao fibrinogênio no terminal C, ou seja, na extremidade da proteína que termina em carboxila (COOH) e contém um resíduo de cysteína (aminoácido codificado por UGU ou UGC)no terminal N que termina em amino (NH2) – o grupo amino se liga ao grupo carboxila liberando H2O, e, assim, os aminoácidos vão se unindo na cadeia peptídica. A TNX humana contém 4.267 aminoácidos e 33 repetições de fibronectina III.

OBS9: SCH-C. É a proteína constituinte do receptor CCR%, denominada Chemokine (OMIM 601373). Em 1997, a análise estrutura do genoma do CCR5 demonstrou que este contem 4 éxons e 2 íntrons. Não há íntrons entre o segundo e o terceiro éxons. A seqüência é rica em AT e poucos motivos TATA ou CAAT (promotores), com um a montante do primeiro éxon e outro a jusante, incluindo a região dos íntrons entre o primeiro e o terceiro éxons. A complexa alternativa de “splicing” (corte dos íntrons após o transcrito de mRNA , de acordo com o posicionamento dos dinucleotídeos GU-AG ou AT-AC, que sempre existem no início e no final dos íntrons, para que este seja liberado no citoplasma contendo apenas os éxons) no lado 5’ UTR (Untranslated Region que ficam uma em cada ponta de cada gene) e os 4 éxons torna o CCR% sujeito a múltiplas transcrições. Mas apesar das seqüências regulatórias e os éxons serem polimórficos, a seqüência protéica não é. Lócus gênico 3p21. Inibidores de integrase são ácidos diketoOBS7 que inibem a reação de transmissão da fita que liga o DNA viral ao DNA celular. Drogas semelhantes ao T-20 (enfuvirtidine) bloqueiam a reação de fusão mediada pelo envelope protéico gp41, prevenindo a entrada de vírions na célula. Outras drogas que estão atualmente sob a fase I e II de testes, incluindo TNX355OBS8, SCH-COBS9, e AMD3100OBS10, bloqueiam os co-receptores CD4, CCR5 E CXCR, respectivamente, prevenindo a entrada do vírus na célula.

















E- Reservatório Latente como uma Mira para o Desenvolvimento de Drogas no Futuro
Dado que o reservatório latente tem sido identificado como primeira barreira para a cura da infecção por HIV-1, um número de estratégias para reduzir o tamanho do rservatório estão correntemente sob investigação.

I-Intensificação
A estabilidade do reservatório latente é mais provavelmente devida à inerente estabilidade das células T de memória, e não há clara evidência de que novos vírus estejam sendo estocados nos reservatórios latentes de pacientes com supressão de viremia abaixo de 50 cópias / ml. Como resultado, não é provável que a simples intensificação do regime HAART terá um impacto significativo na queda do reservatório latente.

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II-Agentes Ativos

O uso de agentes ativos semelhantes a citocinas têm sido proposto como um método de forçar o vírus para fora do reservatório latente. Enquanto estudos envolvendo IL-2 e IL-12 não têm sido promissores nesse sentido, estudos envolvendo IL-7OBS11 têm produzido de 50 a 70% o decréscimo de células infectadas em estado latente. Inibidores de histona (a proteína que compõe a cromatina que envolve a dupla fita de DNA cromossômico), de diacetilase OBS12, semelhante ao ácido”valproic”OBS13, têm sido estudados em um esforço para “lavar” o vírus do reservatório latente. Entretanto, a fundamentação lógica para esta estratégia foi baseada na premissa de que o HIV-1 se integra na heterocromatinaOBS14. De fato, dados experimentais sugerem que o HIV-1 se intera em íntrons de genes ativos. Um pequeno teste com ácido “valproic” sugere um possível efeito na redução do tamanho do reservatório latente, não obstante a significação de uma pequena redução de tamanho do reservatório não esteja clara. A Prostratina, um éster formol que estimula a proteína C (uma quinase, proteína que transmite sinal intramembrânico através do GTP, guanosina trifosfato, estimulando reações catalíticas na célula), pode também ativar vírus latentes enquanto simultaneamente regula para baixo os receptores C4, CCR5 e CXCR4. A proteína Tat exógena tem sido também usada para ativar vírus latentes, e acompanhar os estudos será necessário para mais adiante investigar seus efeitos. Agentes anti-CD3 e IL-2 também têm sido estudados, embora essas abordagens parecerem limitadas pela toxidade associada a ativação das células T.
É importante ter em mente que a erradicação parcial do reservatório latente não será de benefício para pacientes porque alguma célula infectada residual tem potencial para reacender a infecção. Portanto, essas abordagens para lavar para fora o vírus latente só seriam úteis se proporcionassem a verdadeira eliminação do reservatório latente.

OBS10: AMD. ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE; AMD1. OMIM 180980. Lócus gênico 6q21-q22. É essencial para proliferação celular e promoção tumoral. O gene de AMD foi mapeado nos comossomos 6 e X. A AMD1, do cromossomo 6, não foi encontrada em expressão amplificada nos cânceres de colo (intestino), mas a seqüência AMD2, mapeada no cromossomo Xq22-q28 (o gene da hemofilia A, fator VIII da coagulação fica em Xq28) é, de fato, um pseudogene (um gene adquirido, ou copiado por erro de transcrição, crossing-over, etc.)

OBS11: IL é a abreviatura de inteleucina. O sistema imune é mediado por fatores chamados citocinas que regulam o desenvolvimento destas células e seu comportamento, servindo como mensageiros químicos. Os pesquisadores deram a estes fatores vários nomes diferentes, como fator mitogênico de timócitos, TM, fator de crescimento de células T, TCGF e fator auxiliador de células killer, KHF. Em 1979, por funcionarem como sinalizadores entre linfócitos, foi cunhado o nome genérico interleucina para denominar os fatores derivados dos macrófagos e células T. A IL-2 age na estimulação da proliferação de células T e osteoclastos, formadoras dos ossos. É produzida nas células Th0 e Th1. A IL‑12 é produzida nas células B e nos macrófagos e sua função principal é ativar células NK (killer) e promover a geração de células TCD4+Th1. A IL-7 é produzida em células do estroma (o emaranhado fibroso) da medula óssea e do timo, e em algumas células T. Sua função é determinar o crescimento de células pré-B e pré-T. (Informações do Livro: Imunologia d Eli Benjamini, Richard Coico e Geofrey Sunshine,Ed. Guanabara Koogan.)

OBS12: DEACETYLASE. Deacylase : desacilase é qualquer enzima que cataliza a clivagem hidrolítica de um grupamento acil (R-CO-) em uma ligação éster; também inclui enzimas que clivam ligações amida e compostos acil semelhantes. (Dicionário Stedman.)
OMIM 606543, Lócus gênico 7p21-p15. A acetilação e desacetilação mediada por acetiltransferases de histona, e desacetilases de histona desempenham um papel na regulação da expressão gênica.

OBS13: ÁCIDO VALPRÓICO é um anticonvulsionante usado para tratar os distúrbios convulsivos; também empregado como um sal sódico. (Dic. Stedman)

OBS14: HETEROCROMATINA. Funcionalmente a heterocromatina é definida como uma região em que não há genes ativos e em que há muitas seqüências de DNA repetitivo. Genes ativos localizados na proximidade da região da heterocromatina tornam-se inativos. Essas regiões são o centrômero, onde se apóiam os fusos mitóticos na divisão celular, os telômeros, nas pontas dos cromossomos. A heterocromatina pode ser condensada, como nos centrômeros ou frouxa. (Genética, Texto e Atlas – Eberhard Passarge)