*600024 LAMIN B RECEPTOR; LBR - TRADUÇÃO PARCIAL
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=600024
Alternative titles; symbols
LMN2R
Gene map locus 1q42.1TEXT
CLONAGEM
O envelope nuclear é composto de lamina nuclear, complexos de poros nucleares e de membranas nucleares. As membranas nucleares podem ser divididas em três domínios morfologicamente distintos, mas interconectados: o lado de fora da membrana nuclear, o lado de dentro da membrana nuclear e o poro da membrana nuclear. A membrana nuclear interna é adjacente à lamina, uma rede intermediária de proteínas filamentares chamadas laminas. A lamina nuclear é uma estrutura descontínua que ocupa somente a fração da periferia nuclear, e em alguns pontos, a membrana nuclear interna pode interagir diretamente com a cromatina. Várias proteínas integrais do envelope nuclear dentro da membrana que podem ser associadas com a lamina e a cromatina foram identificadas. A primeira foi a proteína aviária chamada receptor de lamina B (LBR) que liga-se “in vitro” à lamina B. Subseqüentemente, uma LBR de mamíferos, homóloga à aviária, foi identificada através de reação cruzada de auto-anticrpos de pacientes com cirrose biliar primária.
ESTRUTURA DO GENE
Schuler e outros (1994) mostraram por mapeamento de restrição que as unidades de transcrição do LBR humano estendem-se aproximadamente por 35 quilobases. Um sítio de iniciação de transcrição está localizado aproximadamente a 4 quilobases no 5-primer (lado 5’ da fita) para o código de iniciação da tradução. O gene LBR contém 13 éxons codificadores de proteínas. O domíno nucleoplasmático é codificado pelos éxons 1-4, e o domínio hidrofóbico, com oito segmentos supostamente transmembrânicos, é codificaado pelos éxons 5-13. O domínio hidrofóbico é homólogo aos polipeptídeos da levedura, sugerindo que este nobre gene eucariótico pode ter envolvido recombinações entre um gene que codificava uma proteína nuclear solúvel e um gene de proteína de membrana similar àqueles da levedura.
MAPEAMENTO
Wydner e outros (1996) mapearam o gene LBR em 1q42.1 por hibridização fluorescente em sítio.
GENÉTICA MOLECULAR
A anomalia de Pelger-Huet é uma desordem autossômica dominante caracterizada por forma nuclear e organização da cromatina anormais nos granulócitos do sangue. Indivíduos afetados apresentam neutrófilos com núcleos hipolobulados (com poucas divisões ?) com cromatina grosseira/impura. Indívíduos presumdos homozigotos tem núcleo de neutrófilo ovóide, bem com degraus variantes de retardo no desenvolvimento, epilepsia, e anormalidades no esqueleto. A separação de homozigotos de uma linhagem extinta de coelhos mostrou condrodistrofia (distúrbio no desenvolvimento dos primórdios cartilaginosos dos ossos longos, principalmente nas placas epifisárias, resultando em interrupção no crescimento, nanismo no qual os membros são anormalmente curtos, mas a cabeça e o tronco normais; herança autossômica recessiva; sin. condrodisplasia) , anomalias no desenvolvimento e aumento da mortalidade pré e pós-natal em associação com a anomalia de Pelger-Huet. Através de varredura por ampla ligação genômica, Hoffmann e outros (2002) mostraram que a anomalia de Pelger-Huet está lgada a 1q41-q43. No gene LBR, o qual reside nesta região, eles identificaram um sítio de splicing, 2 mutações de troca de sentido (alterando o aminoácido ou inserindo um código de finalização da tradução), e duas sem sentido. O receptor de lamina B, um membro da família esterol-redutase, está evolucionariamente conservado e integra a membrana nuclear internamente; ele alveja a heterocromatina e as laminas da membrana nuclear. Hoffman e outros (2002) acharam que células linfoblastóides de indivíduos heterozigotos afetados com a anomalia de Peler-Huet mostraram reduzida expressão do receptor de laminaB, e células homozigotas com a respectiva anomalia de Pelger-Huet contém somente vestígios deste receptor. Eles acharam que a expressão do receptor de lamina afetava a forma do núcleo do neutrófilo e a distribuição da cromatina de modo dependente de sua dosagem. Desde que o receptor de lamina B possa ser uma esterolredutase, a perda da maior parte da expressão de LBR poderá levar a mudanças no metabolismo do esterol que causa aormalidades no desenvolvimento, como tem sido mostrado pelo altamente homólogo delta-7 esterol redutase (DHCR7), o qual é mutante na síndrome de Smith-Lemli-Opitz.
A calcificação-“moth-eaten” por hidropsia (acúmulo excessivo de líquido aquoso em um tecido ou cavidade do corpo, sinônimo de acordo com seu caráter e localização, de ascite, anasarca, edema, etc) ectópica (fora do lugar) (HEM), ou Greenberg, displasia do esqueleto, é uma condrodistrofia autossômica recessiva de curso letal, caracterizada por hidropsia fetal, membros curós, e calcificação condro-óssea (relativa à cartilagem e ao osso, seja como uma mistura dos dois tecidos ou como uma junção entre os dois, comoa união de uma costela e sua cartilagem costal) anormal. Waterham e outros (2003) acharam elevados níveis da cholesta-8 (colestano 8?), 14-di-3-beta-ol em fibroblastos da pele cultivados de um feto de 18 semanas com displasia esquelética HEM, compatível com uma deficiência da enzima biosintética do colesterol 3-beta-hidroxiesterol delta (14)-redutase. Análises de seqüências de dois genes candidatos codificando a supostas redutases 3-beta-hidroxiesterl delta(14), TM7SF2 e LBR, identificaram uma mutação no gene LBR que resultava numa proteína truncada. A mãe saudável apresentou núcleo hipolobulado em 60% dos granulócitos. Waterham e outros (2003) assim sugeriram que anomalia clássica de Pelger-Huet representa o estado heterozigoto da deficiência desta redutase. Waterham e outros (2003) estabeleceram que a dysplasia esquelética HEM era a sexta desordem herdada relativamente à biossíntese do colesterol para a qual as bases moleculares estavam resolvidas. Uma estrutura anormal da cromatina do granulócito ocorre em indivíduos heteroziotos e homozigotos com a anomalia de Pelger-Huet e severas anomalias esqueléticas ocorrem em indivíduos com displasia esquelética HEM homozigótica, o que indica que o receptor de lamina B tem duas funções fisiolóicas diferentes: preservação da estrutura da cromatina através da promoção da ligação da heterocromatina com a membrana nuclear interna e funcionando como uma primária esterol delta(14)-redutase na biossíntese do colesterol. Waterham e outros (2003) estabeleceram que a última função foi algo inesperada, como todas as enzimas envolvidas na biossíntese do colesterol “postqualene” tem sido localizadas na membrana do Retículo Endoplasmático, uma vez que o receptor de lamina B está presente (ao menos predominantemente) no interior da membrana nuclear. A este respeito, o produto do gene de TM7SF2 pareceu, a priori, um melhor candidato, pois está localizado na membrana do Retículo Endoplasmático e também exibe atividade esterol delta(14)-redutase.
Seguindo estudos de ligação em duas família com anomalia Pelger-Huet, Best e outros (2003) seqüenciaram o gene LBR e identificaram duas mutaçõespresentes em estados heterozigóticos. Em adição, o gene LBR foi seqüenciado em um único homem inglês com anomalia Pelger-Huet e uma terceira mutação foi identificada.
segunda-feira, 14 de julho de 2008
RECEPTOR DE LAMININA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=150370
150370 LAMININ RECEPTOR 1; LAMR1
Alternative titles; symbols
LAMBRRIBOSOMAL PROTEIN SA; RPSALAMININ RECEPTOR, 67-KD; 67LR
Gene map locus 3p21.3
TEXT
CLONAGEM
Gehlsen e outros (1988) isolaram um receptor para a laminina, uma proteína adesiva de fundação de membrana, a partir de células de glioblastoma (glioma é qualquer neoplasia derivada de um dos diferentes tipos de células que formam o tecido intersticial do cérebro, da medula espinhal, da neuro-hipófise e da retina) humano por afinidade cromatográfica com laminina. Essas células de glioblastoma RuGli foram mais tarde apresentadas como células de rato (Gehlsen e outros, 1988). Este receptor tem uma estrutura heterodmérica similar àquela dos receptores para outras proteínas da matriz extracelular tal como fibronectina e vitronectina. A incorporação da laminina nas membranas dos lisossomos torna possível aos lisossomas atacar superfícies celulares revestidas com lamininas. Bignon e outros (1991) clonaram dois cDNAs do receptor de laminina humano de 67 quilodáltons. Eles descobriram que esses clones hibridizam com muitos fragmentos de restrição em análises de Southern blot em humanos. Os padrões particulares foram contados para através da presença de mais de 16 e 21 cópias do gene de receptor de laminina por genoma haplóide no genoma humano e do camundongo, respectivamente. Em contraste, uma única cópia do gene foi encontrado na galinha. Pseudogenes foram identificados nos cromossomos 3, 12, 14 e X. As características sugeriram que o gene do receptor de laminina pertence a uma família de retroposon (retro-transposon) nos mamíferos. Lafreniere e outros (1993) demonstraram que um pseudogene do receptor da laminina, o qual eles simbolizaram LAMRP4, está localizado em Xq13 num segmento de 2.6-Mb (mega-bases) que também contém o gene Xist (OMIM 314670).
Yow e outros (1988) clonaram um cDNA de carcinoma do cólon humano codificador da proteína de ligação à laminina. O cDNA hibridizou com um transcrito de 1.2-quilo-bases, o nível do qual foi aproximadamente 9 vezes mais alto no carcinoma do cólon do que nas colônias adjacentes do epitélio normal. A proteína deduzida em 295 aminoácidos tem segmentos C-terminais altamente carregados negativamente e carece de seqüência consenso de sinal no teminal N, hélices alfa anfipáticas (com propriedades distintas, como uma hélice alfa hidrofóbica e outra hidrofílica), e sítios de glicosilação no terminal N.
Satoh e outros (1992) clonaram cDNAs codificadores do receptor de laminina de 67- quilo-dáltons de células humanas e de uma linhagem de células de câncer pulmonar humanas. Eles demonstraram que o nível de transcritos de receptor de laminina no na linhagem de células de câncer de pulmão era mais alto do que nas células pulmonares.
Tohgo e outros (1994) descobriram que a seqüência de aminoácidos da sub-unidade riobossomal 40S do rato é 99% idêntica à proteína humana de ligação à laminina com 68 quilodáltons, indicando que a subunidade 40S é idêntica à proteína de ligação à laminina.
ESTRUTURA DO GENE
O precursor, de 37 quilodáltons, do receptor de laminina 67-kD, chamado 37LRP, é um polipeptídeo cuja expressão é consistentemente sobre-regulada no carcnoma agressivo. Este parece ser uma proteína multifuncional envolvida na maquinaria de tradução, tem sido identificada como uma proteína p40 associada ao ribossomo. Jackers e outros (1996) isolaram o gene ativo de 37LRP/p40. Eles descobriram que o gene contém 7 éxons e 6 íntrons. Experimentos de proteção de ribonuclease sugeriram múltiplos sítios de iniciação de transcrição. A área do promotor não traz o TATA Box, mas contém quatro sítios Sp1(fator de transcrição com lócus em 12q13). O primeiro íntron também é rico e GC, contendo cinco sítios Sp1. O íntron 4 contem uma seqüência cheia de pequenos snRNA E2 (RNE2) entre os nucleotídeos 4365 e 4516, e o íntron 3 contém seqüências ALU.
FUNÇÃO DO GENE
Montuori e outros (1999) investigaram a expressão dos receptores de laminina integrina em culturas de tiróide primárias normais; em células tiroideanas normais imortalizadas (TAD-2); e linhagens celulares tumorais da tireóide (ARO) amorfas, foliculares (WRO) e papilares (NPA); sete tumorais tiroideanas (quatro carcinmas papilares e três foliculares); e glândulas normais da tireóide. A despeito da presença de vários receptores de laminina integrina, a adesão de células TAD-2, NPA e ARO às lamininas-1 imobilizadas foi pobre, uma vez que células WRO e as células derivadas do carcinoma folicular apresentaram uma forte adesão. Não obstante, as células WRO e derivadas de carcinoma folicular apresentaram a expressão de um receptor de laminna não-integrina, o receptor de alta afinidade com laminina, de 67 quilodáltons (67LR). Células TAD-2, NPA e ARO bem como de papeira nodular, adenoma tóxico (adenoma é uma neoplasia benigna), adenoma folicular, e células derivadas do carcinoma papilar não expressavam o 67LR. A expressão nas células de carcinoma folicular de um 67LR funcional, de alta afinidade, junto com receptores de integrina laminina não-funcionais, pode ser responsável pela tendência das células de carcinoma folicular à metástase por mediação de contatos estáveis entre as membranas basais.
Chen e outros (2002) acharam que as células T normais e leucêmicas produzem GNRH2 e GNRH1. A exposião de células cancerosas humanas ou do camndongo a GNRH2 ou a GNRH1 dispararam a transcrição do gene novamente e a expressão do receptor de laminina na superfície da célula, o qual está envolvido a adesão celular e migração e na invasão tumoral e metástase. GNRH2 ou GNRH1 também induziram a adesão à laminina e a quimiotaxia junto a SDF1 (CXCL12), e aumentaram a entrada “in vivo” de linfoma T metastásico no baço e na medula óssea. O direcionamento de células T normais para dentro de órgãos específicos foi reduzido nos camundongos com falta de GNRH1. Um antaonista específico para o receptor de GNRH1 bloqueou GNRH1, mas não os efeitos induzidos por GNRH2, o que foi sugestivo da sinalização através de receptores distintos. Chen e outros (2002) sugeriram que GNRH2 e GNRH1, secretados a partir dos nervos de modo autócrino (por auto-estimulação) ou parácrino (efeitos do hormônio restritos ao local) , interage diretamente com células T e disparam a transcrição do gene, adesão, quimiotaxia e direcionamento a órgãos específicos.
MODELO ANIMAL
A displasia ventricular direita arritmogênica (capaz de induzir à arritmia) (ARVD) é uma cadiomiopatia hereditária que causa morte súbita nos jovens. Asano e outros (2004) descobriram uma linhagem de camundongos com displasia ventricular direita herdada (RVD) causada pela mutação do gene do receptor 1 de lamnina (Lamr1). Esse lócus continha um retrotransposon de processamento no íntron que era transcrito no camudongo com RVD. A introdução do gene Lamr1 mutado no camundongo normal por reprodução ou por injeção direta causou suscetibilidade para RVD, a qual era similar àquela vista no camundongo RVD. Um estudo “in vitro” de cardiomiócitos (células do coração) expressando o produto de Lamr1 mutado mostraram precoce morte celular acompanhada pela alteração da arquitetura da cromatina. Eles acharam que a proteína1 da heterocromatina (HP1) ligava-se especificamente ao Lamr1 mutante. HP1 é um regulador dinâmico de sítios da heterocromatina, sugerindo que o LAMR1 mutante impede um processo crucial da regulação transcricional. De fato, a Lamr1 mutante causou mudanças específicas na expressão do gene nos cardiomiócitos, como detectado por análises de fragmentos de gene. Asano e outros (2004) concluíram que produtos do transposon de Lamr1 interagem com HP1 para causar a degeneração dos cardiomiócitos. Esse mecanismo pode também contriuir para a etiolgia da ARVD humana. Eles notaram que o gene humano na LAMR1 mapeia em 3p21 e que a frorma da ARVD, ARVD5, mapeia em 3p23.
MAPEAMENTO DO GENE
Por hibridização fluorescente em sítio, Jackers e outros (1996) localizaram o gene LAMR1 em 3p21.3. Kenmochi e outros (1998) mapearam o gene LAMR1, o qual eles denominaram RPSA, no 3p usando células somáticas híbridas e painéis de radiação de mapeamento híbridos.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=150370
150370 LAMININ RECEPTOR 1; LAMR1
Alternative titles; symbols
LAMBRRIBOSOMAL PROTEIN SA; RPSALAMININ RECEPTOR, 67-KD; 67LR
Gene map locus 3p21.3
TEXT
CLONAGEM
Gehlsen e outros (1988) isolaram um receptor para a laminina, uma proteína adesiva de fundação de membrana, a partir de células de glioblastoma (glioma é qualquer neoplasia derivada de um dos diferentes tipos de células que formam o tecido intersticial do cérebro, da medula espinhal, da neuro-hipófise e da retina) humano por afinidade cromatográfica com laminina. Essas células de glioblastoma RuGli foram mais tarde apresentadas como células de rato (Gehlsen e outros, 1988). Este receptor tem uma estrutura heterodmérica similar àquela dos receptores para outras proteínas da matriz extracelular tal como fibronectina e vitronectina. A incorporação da laminina nas membranas dos lisossomos torna possível aos lisossomas atacar superfícies celulares revestidas com lamininas. Bignon e outros (1991) clonaram dois cDNAs do receptor de laminina humano de 67 quilodáltons. Eles descobriram que esses clones hibridizam com muitos fragmentos de restrição em análises de Southern blot em humanos. Os padrões particulares foram contados para através da presença de mais de 16 e 21 cópias do gene de receptor de laminina por genoma haplóide no genoma humano e do camundongo, respectivamente. Em contraste, uma única cópia do gene foi encontrado na galinha. Pseudogenes foram identificados nos cromossomos 3, 12, 14 e X. As características sugeriram que o gene do receptor de laminina pertence a uma família de retroposon (retro-transposon) nos mamíferos. Lafreniere e outros (1993) demonstraram que um pseudogene do receptor da laminina, o qual eles simbolizaram LAMRP4, está localizado em Xq13 num segmento de 2.6-Mb (mega-bases) que também contém o gene Xist (OMIM 314670).
Yow e outros (1988) clonaram um cDNA de carcinoma do cólon humano codificador da proteína de ligação à laminina. O cDNA hibridizou com um transcrito de 1.2-quilo-bases, o nível do qual foi aproximadamente 9 vezes mais alto no carcinoma do cólon do que nas colônias adjacentes do epitélio normal. A proteína deduzida em 295 aminoácidos tem segmentos C-terminais altamente carregados negativamente e carece de seqüência consenso de sinal no teminal N, hélices alfa anfipáticas (com propriedades distintas, como uma hélice alfa hidrofóbica e outra hidrofílica), e sítios de glicosilação no terminal N.
Satoh e outros (1992) clonaram cDNAs codificadores do receptor de laminina de 67- quilo-dáltons de células humanas e de uma linhagem de células de câncer pulmonar humanas. Eles demonstraram que o nível de transcritos de receptor de laminina no na linhagem de células de câncer de pulmão era mais alto do que nas células pulmonares.
Tohgo e outros (1994) descobriram que a seqüência de aminoácidos da sub-unidade riobossomal 40S do rato é 99% idêntica à proteína humana de ligação à laminina com 68 quilodáltons, indicando que a subunidade 40S é idêntica à proteína de ligação à laminina.
ESTRUTURA DO GENE
O precursor, de 37 quilodáltons, do receptor de laminina 67-kD, chamado 37LRP, é um polipeptídeo cuja expressão é consistentemente sobre-regulada no carcnoma agressivo. Este parece ser uma proteína multifuncional envolvida na maquinaria de tradução, tem sido identificada como uma proteína p40 associada ao ribossomo. Jackers e outros (1996) isolaram o gene ativo de 37LRP/p40. Eles descobriram que o gene contém 7 éxons e 6 íntrons. Experimentos de proteção de ribonuclease sugeriram múltiplos sítios de iniciação de transcrição. A área do promotor não traz o TATA Box, mas contém quatro sítios Sp1(fator de transcrição com lócus em 12q13). O primeiro íntron também é rico e GC, contendo cinco sítios Sp1. O íntron 4 contem uma seqüência cheia de pequenos snRNA E2 (RNE2) entre os nucleotídeos 4365 e 4516, e o íntron 3 contém seqüências ALU.
FUNÇÃO DO GENE
Montuori e outros (1999) investigaram a expressão dos receptores de laminina integrina em culturas de tiróide primárias normais; em células tiroideanas normais imortalizadas (TAD-2); e linhagens celulares tumorais da tireóide (ARO) amorfas, foliculares (WRO) e papilares (NPA); sete tumorais tiroideanas (quatro carcinmas papilares e três foliculares); e glândulas normais da tireóide. A despeito da presença de vários receptores de laminina integrina, a adesão de células TAD-2, NPA e ARO às lamininas-1 imobilizadas foi pobre, uma vez que células WRO e as células derivadas do carcinoma folicular apresentaram uma forte adesão. Não obstante, as células WRO e derivadas de carcinoma folicular apresentaram a expressão de um receptor de laminna não-integrina, o receptor de alta afinidade com laminina, de 67 quilodáltons (67LR). Células TAD-2, NPA e ARO bem como de papeira nodular, adenoma tóxico (adenoma é uma neoplasia benigna), adenoma folicular, e células derivadas do carcinoma papilar não expressavam o 67LR. A expressão nas células de carcinoma folicular de um 67LR funcional, de alta afinidade, junto com receptores de integrina laminina não-funcionais, pode ser responsável pela tendência das células de carcinoma folicular à metástase por mediação de contatos estáveis entre as membranas basais.
Chen e outros (2002) acharam que as células T normais e leucêmicas produzem GNRH2 e GNRH1. A exposião de células cancerosas humanas ou do camndongo a GNRH2 ou a GNRH1 dispararam a transcrição do gene novamente e a expressão do receptor de laminina na superfície da célula, o qual está envolvido a adesão celular e migração e na invasão tumoral e metástase. GNRH2 ou GNRH1 também induziram a adesão à laminina e a quimiotaxia junto a SDF1 (CXCL12), e aumentaram a entrada “in vivo” de linfoma T metastásico no baço e na medula óssea. O direcionamento de células T normais para dentro de órgãos específicos foi reduzido nos camundongos com falta de GNRH1. Um antaonista específico para o receptor de GNRH1 bloqueou GNRH1, mas não os efeitos induzidos por GNRH2, o que foi sugestivo da sinalização através de receptores distintos. Chen e outros (2002) sugeriram que GNRH2 e GNRH1, secretados a partir dos nervos de modo autócrino (por auto-estimulação) ou parácrino (efeitos do hormônio restritos ao local) , interage diretamente com células T e disparam a transcrição do gene, adesão, quimiotaxia e direcionamento a órgãos específicos.
MODELO ANIMAL
A displasia ventricular direita arritmogênica (capaz de induzir à arritmia) (ARVD) é uma cadiomiopatia hereditária que causa morte súbita nos jovens. Asano e outros (2004) descobriram uma linhagem de camundongos com displasia ventricular direita herdada (RVD) causada pela mutação do gene do receptor 1 de lamnina (Lamr1). Esse lócus continha um retrotransposon de processamento no íntron que era transcrito no camudongo com RVD. A introdução do gene Lamr1 mutado no camundongo normal por reprodução ou por injeção direta causou suscetibilidade para RVD, a qual era similar àquela vista no camundongo RVD. Um estudo “in vitro” de cardiomiócitos (células do coração) expressando o produto de Lamr1 mutado mostraram precoce morte celular acompanhada pela alteração da arquitetura da cromatina. Eles acharam que a proteína1 da heterocromatina (HP1) ligava-se especificamente ao Lamr1 mutante. HP1 é um regulador dinâmico de sítios da heterocromatina, sugerindo que o LAMR1 mutante impede um processo crucial da regulação transcricional. De fato, a Lamr1 mutante causou mudanças específicas na expressão do gene nos cardiomiócitos, como detectado por análises de fragmentos de gene. Asano e outros (2004) concluíram que produtos do transposon de Lamr1 interagem com HP1 para causar a degeneração dos cardiomiócitos. Esse mecanismo pode também contriuir para a etiolgia da ARVD humana. Eles notaram que o gene humano na LAMR1 mapeia em 3p21 e que a frorma da ARVD, ARVD5, mapeia em 3p23.
MAPEAMENTO DO GENE
Por hibridização fluorescente em sítio, Jackers e outros (1996) localizaram o gene LAMR1 em 3p21.3. Kenmochi e outros (1998) mapearam o gene LAMR1, o qual eles denominaram RPSA, no 3p usando células somáticas híbridas e painéis de radiação de mapeamento híbridos.
sábado, 12 de julho de 2008
REPRODUÇÃO DO SITE http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=142461
*142461 HEPARAN SULFATE PROTEOGLYCAN OF BASEMENT MEMBRANE; HSPG2
Alternative titles; symbols
PERLECAN; PLC
Gene map locus 1p36.1
TEXTO
DESCRIÇÃO
O sulfato de heparina proteoglicano (proteoglicanos são glicosaminoglicanos {mucopolssacarídeos} ligados a cadeias protéicas em complexos covalentes encontrados na matriz extracelular do tecido conjuntivo) é um componente principal de membranas basais, onde a molécula pode estar envolvida na estabilização de outras moléculas e na adesão celular. Esta forma de HSPG, conhecida como HSPG2 ou “perlecan”, é codificada por um gene que está mapeado no cromossomo 1. O gene para a forma do FSPG assossiado à superfície celular dos fibroblastos tem sido mapeado no cromossomo 8 humano.
CLONAGEM
Wintle e outros (1990) isolaram dois clones parciais codificando diferentes domínios do cerne da proteína de HSPG no camundongo. Análises de Southern blot sugeriram que o gene existe em uma cópia única no camundongo; presumidamente, o mesmo é verdade para o ser humano. Dodge e outros (1991) estudaram dois clones de DNA sobrepondos-se a HSPG2 de uma biblioteca de cólon humano (a divisão do intestino grosso que se extende do ceco até o reto). A seqüência deduzida de aminoácidos demonstrou 87% de identidade entre o homem e o camundongo. Cohen e outros (1993) estabeleceram que o perlecan é uma proteína de aproximadamente 467 quilodáltons compreendendo 5 domínios, dos quais somente o primeiro, a região de ligação a sulfato de heparina e única. Os outros quatro domínios são homólogos ao receptor de LDL (lipoproteína de baixa densidade), sendo a região N-terminal da laminina (um grande componente glicoprotéico multimérico da membrana basal; principalmente de suas lâminas não coradas; um importante componente protéico do glomérulo renal), braços curtos A e B, NCAM e o terminal C globular da cadeia A da laminina, respectivamente.
FUNÇÃO DO GENE
Iozzo e outros (1997) descobriram que a transcrição do perlecan é sobre-regulada por TGF-beta.
O perlecan, um proteoglicano de sulfato de heparina ubíquo, processa primariamente atributos de promotores de crescimento e angiogênicos através da ação como co-receptor para o fator básico de crescimento de fibroblastos, FGF2. Sharma e outros (1998) bloquearam a expressão do perlecan usando tanto constitutivo dirigido por CMV como sintéticos anti-senso indutíveis por doxiciclina (antibiótico de amplo espectro). O crescimento de células de carcinoma no cólon foi marcadamente atenuado na obliteração da expressão do gene de perlecan e esses efeitos co-relacionaram-se com a reduzida responsividade a e afinidade para o fator de crescimento de queratinócito (célula da epiderme viva e determinado epitélio oral que produz queratina no processo de diferenciação em células mortas e totalmente queratinizadas do estrato córneo) mitogênico, FGF7. O perlecan exógeno reconstituiu eficientemente a atividade de FGF7 nas células deficientes de perlecan. Em ambos, xenoenxerto (enxertos do animal de uma espécie para o animal de outra espécie) induzido por células de carcinoma do cólon humano e aloenxerto (enxerto entre indivíduos geneticamente não-idênticos, mas da mesma espécie) induzido por células de melanoma do camundongo altamente invasivas, a supressão do perlecan causou substancial inibição do crescimento do tumor e neo-vascularização. Assim, perlecan é um potente indutor de crescimento de tumor e da angiogênese (desenvolvimento de novos vasos sangüíneos) “in vivo”, e intervenções terapêuticas marcado essa chave moduladora de progressão de tumor pode melhorar o tratamento do câncer.
Através de análises de leveduras duplamente híbridas e de co-iunoprecipitação com o domínio III de HSPG2 como isca, Mongiat e outros (2001) demonstraram que o queratinócito FGFBP1 interage com HSPG2 (FGFBP1, ou HBP17, liga-se aos fatores de crescimento do fibroblasto ácidos(FGF1) e base (FGF2) de modo reversível. Ele também se liga a perlecan). Análises de deleção determinaram que o FGFBP1 liga-se ao Segundo motive EGF do domínio III, fechado para o sítio de ligação para FGF7. Análises imunohistoquímicas demonstraram a co-localização de FGFBP1 com HSPG2 no estroma pericelular de células escamosas de carcinomas.
ESTRUTURA DO GENE
Cohen e outros (1993) noticiaram que o gene HSPG2 é composto de 94 éxons expandindose num total de 120 quilobases, e que lá parecem estar múltiplos sítios de iniciação de transcrição.
Iozzo e outros (1997) caracterizaram a região promotora de HSPG2.
Nicole e outros (2000) descobriram que o gene HSPG2 contém 97 éxons.
MAPEAMENTO
Usando um clone de cDNA para hibridização em sítio, Wintle e outros (1990) assinaram o gene HSPG2 no cromossomo humano 1p36.1. Dodge e outros (1991) demonstraram por análises de Southern blot de DNA de células somáticas híbridas humanas e de roedores, incluindo sub-clones com quebras espontâneas ou de translocações específicas do cromossomo humano 1, que o gene HSPG2 situa-se na parte telomérica de 1p. Por uma combinação de análises de células somáticas híbridas e hibridização em sítio, Kallunki e outros (1991) assinaram o gene SPG2 em 1p36.1-p35. Chakravarti e outros (1991) mapearam o gene no cromossomo 4 do camundongo por análise de segregação de lentes de fragmentos de restrição variantes (RFLVs) em fitas recombinantes de camundongo consangüíneos. Eles se referiram ao gene como perlecan (Plc).
MOLECULAR GENETICS
Schwartz-Jampel Syndrome Type 1
A syndrome de Schwartz-Jampel de tipo 1(SJS1) é uma desordem autossômica ressessiva caracterizada por permanente miotonia (relaxamento tardio de um músculo após uma forte contração, ou contração prolongada após estimulação mecânica (como por percussão) ou breve estimulação elétrica; devida a anormaldade da membrana muscular, especificamente dos canais iônicos) e displasia do esqueleto (desenvolvimento tecidual anormal, no caso dos ossos são mais de 120), resultando em estatura reduzida, cifoescoliose, arqueamento das diáfises (parte longa dos ossos em oposição às epífises, que são as extremidades e as apófises, sendo as protuberâncias), e epífises irregulares. Em três famílias com SJS1, Nicole e outros (2000) identificaram mutações no gene HSPG2. Os achados relevaram a importância de perlecan, não somente na manuenção da integridade da cartilagem, mas também na regulagem de exercitabilidade do músculo. Perlecan está presente no endomísio (a bainha do tecido conjuntivo fina que circunda uma fibra muscular), a bainha do tecido conectivo envolvendo as fibras dos músculos do esqueleto individual, onde a maioria das desordens miotônicas surgem de mutações em genes codificadores de canais iônicos de portão de voltagem. Uma possível explicação para a hiper-excitabilidade muscular com mutações em perlecan pode envolver a modulação da expressão canal iônico ou a função através de sua interação com perlecan.
Arikawa-Hirasawa e outros (2002) identficaram cinco diferentes mutações no gene perlecan em três pacientes não-relacionados com a síndrome de Schwartz-jampel. Mutações heterozigóticas em dois pacientes com SJS (os quais eram geneticamete heterozigotos) tanto produziram uma perlecan truncada com falta do domínio V quanto resultaram em significativamente reduzidos níveis de perlecan de tipo saudável.
Stum e outros (2006) identificaram 25 diferentes mutações em HSPG2 , incluindo 22 novas mutações, distribuídas em todo o gene de 35 pacientes de 23 famílias com SJS1. Análises de mRNA de HSPG2 e imuno-tingimento de perlecan em fibroblastos de pacientes demonstraram um efeito hipomórfico e de perda de função. Mutações truncadas resultaram da decadência de mediação de mRNA não-senso (mRNAs com mutações não-senso, aquela que altera um nucleotídeo gerando um códon finalizador, geraram uma proteína perlecan truncada, incompleta), enquanto mutações sem-sentido envolvendo resíduos de cisteína (aquela própícia à formação de íons) levaram à retenção intracelular de perlecan. Mutações não estabelecidas foram identificadas e nenhuma correlação foi observada quanto a genótipo/fenótipo.
Dyssegmental Dysplasia, Silverman-Handmaker Type
Em paciente com tipo Silverman-Handmaker da dysplasia dis-segmental (DDSH), Arikawa-Hirasawa e outros (2001) acharam duplicações homozigóticas e mutações pontuais heterozigóticas no gene HSPG2, todas previstas como causadoras de uma seqüência de finalização, resultando em uma proteína com o cerne truncado. Perlecan trucada não foi secretada pelos fibroblastos dos paciente, mas foi degradada em fragmentos menores dentro das células.
*142461 HEPARAN SULFATE PROTEOGLYCAN OF BASEMENT MEMBRANE; HSPG2
Alternative titles; symbols
PERLECAN; PLC
Gene map locus 1p36.1
TEXTO
DESCRIÇÃO
O sulfato de heparina proteoglicano (proteoglicanos são glicosaminoglicanos {mucopolssacarídeos} ligados a cadeias protéicas em complexos covalentes encontrados na matriz extracelular do tecido conjuntivo) é um componente principal de membranas basais, onde a molécula pode estar envolvida na estabilização de outras moléculas e na adesão celular. Esta forma de HSPG, conhecida como HSPG2 ou “perlecan”, é codificada por um gene que está mapeado no cromossomo 1. O gene para a forma do FSPG assossiado à superfície celular dos fibroblastos tem sido mapeado no cromossomo 8 humano.
CLONAGEM
Wintle e outros (1990) isolaram dois clones parciais codificando diferentes domínios do cerne da proteína de HSPG no camundongo. Análises de Southern blot sugeriram que o gene existe em uma cópia única no camundongo; presumidamente, o mesmo é verdade para o ser humano. Dodge e outros (1991) estudaram dois clones de DNA sobrepondos-se a HSPG2 de uma biblioteca de cólon humano (a divisão do intestino grosso que se extende do ceco até o reto). A seqüência deduzida de aminoácidos demonstrou 87% de identidade entre o homem e o camundongo. Cohen e outros (1993) estabeleceram que o perlecan é uma proteína de aproximadamente 467 quilodáltons compreendendo 5 domínios, dos quais somente o primeiro, a região de ligação a sulfato de heparina e única. Os outros quatro domínios são homólogos ao receptor de LDL (lipoproteína de baixa densidade), sendo a região N-terminal da laminina (um grande componente glicoprotéico multimérico da membrana basal; principalmente de suas lâminas não coradas; um importante componente protéico do glomérulo renal), braços curtos A e B, NCAM e o terminal C globular da cadeia A da laminina, respectivamente.
FUNÇÃO DO GENE
Iozzo e outros (1997) descobriram que a transcrição do perlecan é sobre-regulada por TGF-beta.
O perlecan, um proteoglicano de sulfato de heparina ubíquo, processa primariamente atributos de promotores de crescimento e angiogênicos através da ação como co-receptor para o fator básico de crescimento de fibroblastos, FGF2. Sharma e outros (1998) bloquearam a expressão do perlecan usando tanto constitutivo dirigido por CMV como sintéticos anti-senso indutíveis por doxiciclina (antibiótico de amplo espectro). O crescimento de células de carcinoma no cólon foi marcadamente atenuado na obliteração da expressão do gene de perlecan e esses efeitos co-relacionaram-se com a reduzida responsividade a e afinidade para o fator de crescimento de queratinócito (célula da epiderme viva e determinado epitélio oral que produz queratina no processo de diferenciação em células mortas e totalmente queratinizadas do estrato córneo) mitogênico, FGF7. O perlecan exógeno reconstituiu eficientemente a atividade de FGF7 nas células deficientes de perlecan. Em ambos, xenoenxerto (enxertos do animal de uma espécie para o animal de outra espécie) induzido por células de carcinoma do cólon humano e aloenxerto (enxerto entre indivíduos geneticamente não-idênticos, mas da mesma espécie) induzido por células de melanoma do camundongo altamente invasivas, a supressão do perlecan causou substancial inibição do crescimento do tumor e neo-vascularização. Assim, perlecan é um potente indutor de crescimento de tumor e da angiogênese (desenvolvimento de novos vasos sangüíneos) “in vivo”, e intervenções terapêuticas marcado essa chave moduladora de progressão de tumor pode melhorar o tratamento do câncer.
Através de análises de leveduras duplamente híbridas e de co-iunoprecipitação com o domínio III de HSPG2 como isca, Mongiat e outros (2001) demonstraram que o queratinócito FGFBP1 interage com HSPG2 (FGFBP1, ou HBP17, liga-se aos fatores de crescimento do fibroblasto ácidos(FGF1) e base (FGF2) de modo reversível. Ele também se liga a perlecan). Análises de deleção determinaram que o FGFBP1 liga-se ao Segundo motive EGF do domínio III, fechado para o sítio de ligação para FGF7. Análises imunohistoquímicas demonstraram a co-localização de FGFBP1 com HSPG2 no estroma pericelular de células escamosas de carcinomas.
ESTRUTURA DO GENE
Cohen e outros (1993) noticiaram que o gene HSPG2 é composto de 94 éxons expandindose num total de 120 quilobases, e que lá parecem estar múltiplos sítios de iniciação de transcrição.
Iozzo e outros (1997) caracterizaram a região promotora de HSPG2.
Nicole e outros (2000) descobriram que o gene HSPG2 contém 97 éxons.
MAPEAMENTO
Usando um clone de cDNA para hibridização em sítio, Wintle e outros (1990) assinaram o gene HSPG2 no cromossomo humano 1p36.1. Dodge e outros (1991) demonstraram por análises de Southern blot de DNA de células somáticas híbridas humanas e de roedores, incluindo sub-clones com quebras espontâneas ou de translocações específicas do cromossomo humano 1, que o gene HSPG2 situa-se na parte telomérica de 1p. Por uma combinação de análises de células somáticas híbridas e hibridização em sítio, Kallunki e outros (1991) assinaram o gene SPG2 em 1p36.1-p35. Chakravarti e outros (1991) mapearam o gene no cromossomo 4 do camundongo por análise de segregação de lentes de fragmentos de restrição variantes (RFLVs) em fitas recombinantes de camundongo consangüíneos. Eles se referiram ao gene como perlecan (Plc).
MOLECULAR GENETICS
Schwartz-Jampel Syndrome Type 1
A syndrome de Schwartz-Jampel de tipo 1(SJS1) é uma desordem autossômica ressessiva caracterizada por permanente miotonia (relaxamento tardio de um músculo após uma forte contração, ou contração prolongada após estimulação mecânica (como por percussão) ou breve estimulação elétrica; devida a anormaldade da membrana muscular, especificamente dos canais iônicos) e displasia do esqueleto (desenvolvimento tecidual anormal, no caso dos ossos são mais de 120), resultando em estatura reduzida, cifoescoliose, arqueamento das diáfises (parte longa dos ossos em oposição às epífises, que são as extremidades e as apófises, sendo as protuberâncias), e epífises irregulares. Em três famílias com SJS1, Nicole e outros (2000) identificaram mutações no gene HSPG2. Os achados relevaram a importância de perlecan, não somente na manuenção da integridade da cartilagem, mas também na regulagem de exercitabilidade do músculo. Perlecan está presente no endomísio (a bainha do tecido conjuntivo fina que circunda uma fibra muscular), a bainha do tecido conectivo envolvendo as fibras dos músculos do esqueleto individual, onde a maioria das desordens miotônicas surgem de mutações em genes codificadores de canais iônicos de portão de voltagem. Uma possível explicação para a hiper-excitabilidade muscular com mutações em perlecan pode envolver a modulação da expressão canal iônico ou a função através de sua interação com perlecan.
Arikawa-Hirasawa e outros (2002) identficaram cinco diferentes mutações no gene perlecan em três pacientes não-relacionados com a síndrome de Schwartz-jampel. Mutações heterozigóticas em dois pacientes com SJS (os quais eram geneticamete heterozigotos) tanto produziram uma perlecan truncada com falta do domínio V quanto resultaram em significativamente reduzidos níveis de perlecan de tipo saudável.
Stum e outros (2006) identificaram 25 diferentes mutações em HSPG2 , incluindo 22 novas mutações, distribuídas em todo o gene de 35 pacientes de 23 famílias com SJS1. Análises de mRNA de HSPG2 e imuno-tingimento de perlecan em fibroblastos de pacientes demonstraram um efeito hipomórfico e de perda de função. Mutações truncadas resultaram da decadência de mediação de mRNA não-senso (mRNAs com mutações não-senso, aquela que altera um nucleotídeo gerando um códon finalizador, geraram uma proteína perlecan truncada, incompleta), enquanto mutações sem-sentido envolvendo resíduos de cisteína (aquela própícia à formação de íons) levaram à retenção intracelular de perlecan. Mutações não estabelecidas foram identificadas e nenhuma correlação foi observada quanto a genótipo/fenótipo.
Dyssegmental Dysplasia, Silverman-Handmaker Type
Em paciente com tipo Silverman-Handmaker da dysplasia dis-segmental (DDSH), Arikawa-Hirasawa e outros (2001) acharam duplicações homozigóticas e mutações pontuais heterozigóticas no gene HSPG2, todas previstas como causadoras de uma seqüência de finalização, resultando em uma proteína com o cerne truncado. Perlecan trucada não foi secretada pelos fibroblastos dos paciente, mas foi degradada em fragmentos menores dentro das células.
quarta-feira, 9 de julho de 2008
OSTEONECROSES
Roberto Ezequiel Heymann e Daniel Feldman
Introdução
As osteonecroses não são entidades clínicas definidas, mas, resultantes de diversas condições que em maior ou menor grau determinam insuficiência do suprimento sangüíneo, com morte celular em todos os compartimentos do osso (hematopoiético, medula gordurosa e tecido mineralizado). Por esse motivo, também são chamadas de necrose óssea avascular ou necrose óssea asséptica.
A incidência da osteonecrose (ON) não está bem estabelecida. Nos EUA, estima-se em 15 mil novos casos por ano. Um estudo japonês em 1988, mostrou que ocorreram entre 2.500 e 3 mil casos de ON não-traumática da cabeça femoral: 34,7% eram devidos ao uso de corticosteróides (CEs); 21,8%, ao abuso do álcool; e37,1%, idiopáticas. Os homens são mais acometidos que as mulheres (8:1), não havedo dados sobre raça ou cor. A maioria dos casos ocorre antes dos 50 anos.
Fisiopatogenia
A diminuição ou interrupção mecânica do fluxo sangüíneo ao osso acometido é o mecanismo comum envolvido na maioria das condições associadas à ON. Duas ou três horas após a instalação da isquemia (sustação do fluxo sangüíneo), ocorre a morte de osteócitos e a necrose de adipócitos e da medula óssea hematopoiética ocorrem mais rapidamente do que o normal. No entanto, os sinais histológicos de necrose óssea somente se tornam evidentes após 24 a 72 horas. Em poucas situações pode ocorrer osteonecrose, não por diminuição de fluxo arterial, mas sim pela citotoxidade sobre os osteócitos.
Os mecanismos que podem levar a osteonecrose são:
1) Traumas:
Nos casos de trauma, a lesão é evidente, pois ocorre ruptura arterial, prejudicando o suprimento sangüíneo local. A prevalência de ON de cabeça femoral é de 10 a 25% após a luxação traumática do quadril, e entre 15 a 50% após fraturas. A duração da correção da luxação também é importante, visto que a ON associada tem prevalência dobrada se esta for corrigida 12 ou mais horas após a ocorrência.
2)Oclusão vascular
Alterações primárias das arteríolas, vênulas e dos capilares podem tornar as ONs equivalentes à doença coronariana no osso. Estudos histopatológicos dos vasos de ossos dom ON demonstram trombose, presença de gotículas de gordura e aumento de espessura das paredes, quando comparados a ossos com osteoartrose. Como observado em pacientes coronariopatas, os pacientes com ON compartilham fatores de risco semelhantes, como o uso de corticosteróides (CEs), diabetes melitus, vasculopatias, alcoolismo, hiperlipidemia e hiperviscosidade. Na síndrome do mergulhador e na anemia falciforme a ON é imputada à obstrução dos sinusóides por bolhas de nitrogênio ou por hemácias falcizadas. Estados de hiper-coagulação, como a trombofilia hereditária e deficiências de fibrinólise podem levar à diminuição do fluxo sangüíneo por trombose desses vasos.
Nas doenças difusas do tecido conjuntivo, principalmente no lúpus eritematoso sistêmico, as condições vasculares aqui descritas estão presentes com muita freqüência, justificando o elevado número de pacientes com ON (10%). De maneira surpreendente, estudos recentes não têm conseguido demonstrar correlação entre a presença de anticorpos antifosfolípides (definitivamente pró-trombóticos) e osteonecrose.
O uso de CE e o etilismo parecem aumentar o risco de desenvolver ON, por meio da embolia gordurosa. A assciação de CE e ON são cirunstanciais e baseadas em associações entre ON e a terapia com CE em inúmeras doenças reumatológicas e respiratórias, em pacientes que se submenteram a transplante de órgãos e em pacientes com síndrome de Cushing. A média da dose cumulativa de CE é de 4,32 mg e doses superiores a 20mg apresentam maior risco, principalmente em pacientes transplantados renais. Embolia gordurosa pulmonar e renal já tem sido demonstrada como decorrente de esteatose hepática, e alguns autores têm sido capazes de provocar ON experimental após injeção intra-arterial de lipidol. Etretanto, a origem das gotículas gordurosas encontradas nos vasos dos ossos com ON não está definida. Além do fígado, a desestabilização e a coalescência de lipoproteínas e o rompimento da medula óssea gordurosa podem sem fontes das mesmas.
3)Hipertensão intramedular
O CE também tem sido implicado em aumentar o tamanho dos adipócitos, aumentando o volume da medula gordurosa e da pressão intramedular, diminuindo o fluxo sangüíeo. Na doença de Gaucher ocorre acúmulo de glucocerebrosídeos, aumentando a pressão intramedular e favorecendo a ON.
4)Citotoxidade direta sobre os osteócitos
A radioterapia e a quimioterapia são causas menos freqüentes de ON. O CE também acelera a apoptose dos osteócitos, diminui a atividade osteoblástica e aumenta o catabolismo da matriz óssea.
5)Idiopática
Em algumas situações não há nenhuma etiologia de base que possa explicar o aparecimento de ON, sendo consideradas idiopáticas.
DIAGNÓSTICOS
O pronto diagnóstico da ON permite um tratamento mais precoce, favorecendo um resultado final melhor. O acometimento de mais de uma articulação é muito freqüente. Esse fato deve alertar o médico a investigar outras articulações quando o diagnóstico de ON for estabelecido.
Alterações radiográficas
Nos estágios iniciais da doença as radiologias simples são normais, mas outros métodos podem ser utilizados para o diagnóstico precoce. As alterações radiológicas mais precoces incluem osteopenia, área central radioluscente com borda esclerótica e esclerose linear. Nenhuma desses é específica de osteonecrose. Posteriormente, aparece linha radioluscente subcondral (sinal do crescente, ou da casca do ovo), denotando fratura subcondral. A alteração é praticamente patognomônica de osteonecrose, assim como as alterações posteriores, como o achatamento da epífise e o colapso total com manutenção do espaço articular. Em fases mais tardias, ocorre processo de osteoartrite secundária, com diminuição do espaço articular e formação de osteófitos.
Diagnósticos diferenciais
Nos estágios III (sinal do crescente) e IV(achatamento ou colapso) as radiografias são características, não havendo qualquer dificuldade para o diagnóstico. Quando os primeiros exames radiológicos mostram estágios V (achatamento ou colapso somado a diminuição do espaço intra articular) e VI (destruição total), é impossível fazer o diagnóstico diferencial com outras causas de destruição articular. Entretanto, nessas fases, a dúvida perde interesse prático, pois a conduta será sempre a mesma, ou seja, há indicação de prótese articular.
O diagnóstico diferencial mais difícil ocorre nos estágios I (alteração isolada da ressonância magnética nuclear que delimita o tecido necrótico do normal e uma linha representando o tecido de granulação hipervascular, em casos avançados pós-colapso deixa de ter utilidade) e II (radiografia, cintilografia óssea, RMN e Tomografia computadorizada alterados sem colapso). No primeiro, todas as afecções inflamatórias articulares devem ser consideradas, e a realização da ressonância magnética é obrigatória. A entidade mais difícil de ser afastada é a algoneurodistrofia transitória (especialmente do quadril), que requer dados da história e dos antecedentes do indivíduo para ser diferenciada.
Roberto Ezequiel Heymann e Daniel Feldman
Introdução
As osteonecroses não são entidades clínicas definidas, mas, resultantes de diversas condições que em maior ou menor grau determinam insuficiência do suprimento sangüíneo, com morte celular em todos os compartimentos do osso (hematopoiético, medula gordurosa e tecido mineralizado). Por esse motivo, também são chamadas de necrose óssea avascular ou necrose óssea asséptica.
A incidência da osteonecrose (ON) não está bem estabelecida. Nos EUA, estima-se em 15 mil novos casos por ano. Um estudo japonês em 1988, mostrou que ocorreram entre 2.500 e 3 mil casos de ON não-traumática da cabeça femoral: 34,7% eram devidos ao uso de corticosteróides (CEs); 21,8%, ao abuso do álcool; e37,1%, idiopáticas. Os homens são mais acometidos que as mulheres (8:1), não havedo dados sobre raça ou cor. A maioria dos casos ocorre antes dos 50 anos.
Fisiopatogenia
A diminuição ou interrupção mecânica do fluxo sangüíneo ao osso acometido é o mecanismo comum envolvido na maioria das condições associadas à ON. Duas ou três horas após a instalação da isquemia (sustação do fluxo sangüíneo), ocorre a morte de osteócitos e a necrose de adipócitos e da medula óssea hematopoiética ocorrem mais rapidamente do que o normal. No entanto, os sinais histológicos de necrose óssea somente se tornam evidentes após 24 a 72 horas. Em poucas situações pode ocorrer osteonecrose, não por diminuição de fluxo arterial, mas sim pela citotoxidade sobre os osteócitos.
Os mecanismos que podem levar a osteonecrose são:
1) Traumas:
Nos casos de trauma, a lesão é evidente, pois ocorre ruptura arterial, prejudicando o suprimento sangüíneo local. A prevalência de ON de cabeça femoral é de 10 a 25% após a luxação traumática do quadril, e entre 15 a 50% após fraturas. A duração da correção da luxação também é importante, visto que a ON associada tem prevalência dobrada se esta for corrigida 12 ou mais horas após a ocorrência.
2)Oclusão vascular
Alterações primárias das arteríolas, vênulas e dos capilares podem tornar as ONs equivalentes à doença coronariana no osso. Estudos histopatológicos dos vasos de ossos dom ON demonstram trombose, presença de gotículas de gordura e aumento de espessura das paredes, quando comparados a ossos com osteoartrose. Como observado em pacientes coronariopatas, os pacientes com ON compartilham fatores de risco semelhantes, como o uso de corticosteróides (CEs), diabetes melitus, vasculopatias, alcoolismo, hiperlipidemia e hiperviscosidade. Na síndrome do mergulhador e na anemia falciforme a ON é imputada à obstrução dos sinusóides por bolhas de nitrogênio ou por hemácias falcizadas. Estados de hiper-coagulação, como a trombofilia hereditária e deficiências de fibrinólise podem levar à diminuição do fluxo sangüíneo por trombose desses vasos.
Nas doenças difusas do tecido conjuntivo, principalmente no lúpus eritematoso sistêmico, as condições vasculares aqui descritas estão presentes com muita freqüência, justificando o elevado número de pacientes com ON (10%). De maneira surpreendente, estudos recentes não têm conseguido demonstrar correlação entre a presença de anticorpos antifosfolípides (definitivamente pró-trombóticos) e osteonecrose.
O uso de CE e o etilismo parecem aumentar o risco de desenvolver ON, por meio da embolia gordurosa. A assciação de CE e ON são cirunstanciais e baseadas em associações entre ON e a terapia com CE em inúmeras doenças reumatológicas e respiratórias, em pacientes que se submenteram a transplante de órgãos e em pacientes com síndrome de Cushing. A média da dose cumulativa de CE é de 4,32 mg e doses superiores a 20mg apresentam maior risco, principalmente em pacientes transplantados renais. Embolia gordurosa pulmonar e renal já tem sido demonstrada como decorrente de esteatose hepática, e alguns autores têm sido capazes de provocar ON experimental após injeção intra-arterial de lipidol. Etretanto, a origem das gotículas gordurosas encontradas nos vasos dos ossos com ON não está definida. Além do fígado, a desestabilização e a coalescência de lipoproteínas e o rompimento da medula óssea gordurosa podem sem fontes das mesmas.
3)Hipertensão intramedular
O CE também tem sido implicado em aumentar o tamanho dos adipócitos, aumentando o volume da medula gordurosa e da pressão intramedular, diminuindo o fluxo sangüíeo. Na doença de Gaucher ocorre acúmulo de glucocerebrosídeos, aumentando a pressão intramedular e favorecendo a ON.
4)Citotoxidade direta sobre os osteócitos
A radioterapia e a quimioterapia são causas menos freqüentes de ON. O CE também acelera a apoptose dos osteócitos, diminui a atividade osteoblástica e aumenta o catabolismo da matriz óssea.
5)Idiopática
Em algumas situações não há nenhuma etiologia de base que possa explicar o aparecimento de ON, sendo consideradas idiopáticas.
DIAGNÓSTICOS
O pronto diagnóstico da ON permite um tratamento mais precoce, favorecendo um resultado final melhor. O acometimento de mais de uma articulação é muito freqüente. Esse fato deve alertar o médico a investigar outras articulações quando o diagnóstico de ON for estabelecido.
Alterações radiográficas
Nos estágios iniciais da doença as radiologias simples são normais, mas outros métodos podem ser utilizados para o diagnóstico precoce. As alterações radiológicas mais precoces incluem osteopenia, área central radioluscente com borda esclerótica e esclerose linear. Nenhuma desses é específica de osteonecrose. Posteriormente, aparece linha radioluscente subcondral (sinal do crescente, ou da casca do ovo), denotando fratura subcondral. A alteração é praticamente patognomônica de osteonecrose, assim como as alterações posteriores, como o achatamento da epífise e o colapso total com manutenção do espaço articular. Em fases mais tardias, ocorre processo de osteoartrite secundária, com diminuição do espaço articular e formação de osteófitos.
Diagnósticos diferenciais
Nos estágios III (sinal do crescente) e IV(achatamento ou colapso) as radiografias são características, não havendo qualquer dificuldade para o diagnóstico. Quando os primeiros exames radiológicos mostram estágios V (achatamento ou colapso somado a diminuição do espaço intra articular) e VI (destruição total), é impossível fazer o diagnóstico diferencial com outras causas de destruição articular. Entretanto, nessas fases, a dúvida perde interesse prático, pois a conduta será sempre a mesma, ou seja, há indicação de prótese articular.
O diagnóstico diferencial mais difícil ocorre nos estágios I (alteração isolada da ressonância magnética nuclear que delimita o tecido necrótico do normal e uma linha representando o tecido de granulação hipervascular, em casos avançados pós-colapso deixa de ter utilidade) e II (radiografia, cintilografia óssea, RMN e Tomografia computadorizada alterados sem colapso). No primeiro, todas as afecções inflamatórias articulares devem ser consideradas, e a realização da ressonância magnética é obrigatória. A entidade mais difícil de ser afastada é a algoneurodistrofia transitória (especialmente do quadril), que requer dados da história e dos antecedentes do indivíduo para ser diferenciada.
quarta-feira, 2 de julho de 2008
Reprodução do site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=107770
*107770 LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR-RELATED PROTEIN 1; LRP1
Alternative titles; symbols
LIPOPROTEIN RECEPTOR-RELATED PROTEIN; LRPALPHA-2-MACROGLOBULIN RECEPTOR; A2MRAPOLIPOPROTEIN RECEPTOR; APRAPOLIPOPROTEIN E RECEPTOR; APOERCD91CED1, C. ELEGANS, HOMOLOG OF
Gene map locus 12q13.1-q13.3
TEXT
CLONING
Hertz e outros (1988) clonaram um cDNA para o receptor relacionado à lipoproteína de baixa densidade (LRP) em virtude de sua restrita homologia com o receptor de LDL. A proteína de 4.544 aminoácidos contém um único segmento transmembranal. Análises de Northern blot detectaram a LRP1 no fígado, cérebro e pulmões. A proteína demonstrou forte ligação com cálcio. Kristensen e outros (1990) e Strickland e outros (1990) demonstraram que LRP é idêntico ao receptor de alfa-macroglobulina 2 (A2MR). Como o receptor de manose-6-fosfato, a molécula A2MR/LRP é provavelmente bifuncional.
No nematódeo de vida livre Caenorhabditis elegans, Yochem e Grenwald (1993) isolaram e seqüenciaram um gene mais longo que 23 kb que codifica uma grande proteína integrante da membrana com uma estrutura prevista similar à da LRP dos mamíferos. O produto de 4.753 aminoácidos prognosticado pelo gene de C.elegans repartiu-se em número próximo ao idêntico e de acordo com os motivos de seqüência de aminoácidos do LRP humano, e vários éxons do gene do LRP de C.elegans corresponderam aos éxons de partes relacionadas ao gene da LRP humano.
GENE FUNCTION
Kounnas e outros (1995) demonstraram que LRP media a endocitose e a degradação de proteínas precursoras amilóides (amilóides: proteínas que parecem iguais ao microscópio, mas são quimicamente diferentes) secretadas (APP), sugerindo que um único caminho metabólico liga duas moléculas implicadas na patofisiologia da doença de Alzheimer (AD). Narita e outros (1997) demonstraram que A2M, por via de LRP, media a remoção e degradação de amilóides-beta geradas por APP, o principal componente das placas amilóides em Alzheimer.
Kang e outros (2000) demonstraram “in vitro” que LRP1 é requerida para a remoção mediada por A2M de beta-amilóide 40 e 42 por via um mecanismo celular de absorção mediado por receptor. Análises do tecido do cérebro humano morto demonstraram que a expressão de LRP normalmente declina com a idade, e que a expressão de LRP em cérebro com Alzheimer foi significativamente mais baixa do que nos controles. No grupo AD, altos níveis de LRP foram co-relacionados com o ataque de AD e morte em idade avançada. Kang e outros (2000) concluíram que a expressão reduzida de LRP é um fator de risco que contribui para a AD, possivelmente pelo impedimento da remoção da beta-amilóide solúvel.
A proteína gp96 “choque de calor” (TRA1) é uma proteína intracelular capaz de acompanhar antígenos exógenos, de tumores ou células infectadas por vírus, para células apresentadoras de antígenos por apresentação ao complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I em preferência às moléculas de classe II, dessa forma elicitando respostas de células T CD8 positivas. Usando o sistema de camundongo, Binder e outros (2000) determinaram que o receptor para gp96 é CD91 (A2MR) e que A2M, uma proteína encontrada no sangue, inibe a ligação de gp96 a CD91. Eles propuseram que CD91 atua como um sensor para morte de células necróticas nos tecidos, desencadeando respostas imunes pró-inflamatórias.
Basu e outros (2001) usaram proteínas choque de calor marcadas por fluorescência (HSPs) para mostrar que não somente GP96, mas também HSP90 (HSPCA), HSP70 (HSPA1A) e calreticulina (CALR) usam CD91 como um receptor comum. A habilidade dessas células para ligar HSPs é correlata à habilidade dependente de TAP [O trasportador de ATP-binding cassette TAP transloca peptídeos do citosol para as moléculas do complexo maior de histocompatibilidade de classe I (MHCI) à espera no retículo endoplasmático. TAP é feita de polipeptídeos TAP1 e TAP2.]e proteossomo para constituírem peptídeos acompanhados por HSP.
Forus e outros (1991) descobriram que os genes APR e GLI são co-amplificados numa linha de células de rabdomiossarcoma (neoplasia maligna derivada da musculatura estriada, que acontece no coração das crianças).
Wang e outros (2003) demonstraram que o ativador tecidual do plasminogênio (tPA) sobre-regula a MMP9 em células em cultura e “in vivo”. Os níveis de MMP9 foram baixos em tPA inativados comparados com camundongos de tipo selvagem após a isquemia cerebral localizada. Em células do endotélio microvascular cerebral humanas, MMP9 foi sobre-regulada quando tPA recombinante foi adicionado. O RNA de interferência sugeriu que esta resposta foi mediada pela LRP1, a qual avidamente liga-se a tPA e possui propriedades sinalizadoras.
Desde que BACE e APP interagem e trafegam uma com a outra, e APP interage com e trafega com LRP1, von Arnim e outros (2005) investigaram interações entre BACE1 e LRP1. Eles descobriram que BACE1 interagiu com a cadeia leve de LRP1 na superfície celular em associação com a camada lipídica. A interação entre BACE-LRP1 leva ao aumento na clivagem do domínio extracelular de LRP1 e subseqüente liberação do domínio intracelular da membrana. Von Arnim e outros (2005) concluíram que LRP1 é um substrato de BACE.
Kinchen e outros (2005) demonstraram que em C. elegans, CED1 (LRP1), CED6 e CED7 são requeridas para reorganização de actina em torno do corpo de célula em apoptose, e que CED1 e CED6 co-localizam entre si e com a actina em volta da célula morta. Além disso, Kinchen e outros (2005) descobriram que a GTPase de CED10 (RAC) atua geneticamente a jussante dessas proteínas para mediar a remoção do corpo, ligando funcionalmente os dois caminhos de absorção e identificando a modulação de sinalização de CED1, CED6 e CED7 como reguladores contra-corrente de ativação de Rac.
Gaultier e outros (2008) descobriram que células de Schwann em roedores com nervos lesados exibiram aumento de expressão de Lrp1. Um fragmento solúvel de Lrp1 com uma cadeia alfa intacta (sLrp-alfa) foi repelido pelas células Schwann in vitro e no sistema nervoso periférico após injúria. Injeção de sLrp1-alfa no nervo ciático do camundongo anterior a uma injúria de constrição crônica inibiu a ativação de p38 Mapk (MAPK14) e diminuiu a expressão de Tnf-alfa e de IL1-beta no local. sLrp-alfa também inibiu a dor neuropática induzida espontaneamente pela injúria e diminuiu a expressão de citocina inflamatória na espinha dorsal, onde o processamento da dor neuropática ocorre. Em células de Schwann cultivadas do rato, astrócitos e micróglias (pequenas células da neuroglia que podem tornar-se fagocíticas em áreas de lesão ou inflamação neural), sLrp-alfa inibiu a ativação induzida de Tnf-alfa de p38 e Erk/Mapk.
MAPPING
Myklebost e outros (1989) mapearam o gene da proteína ligada à LRP em 12q13-q14 por estudo de DNA de células híbridas humanas e de camundongo e por hibridização em sítio; o símbolo APOER foi usado incialmente devido à suposta função de receptor.
Através de análises de pulso em campo de gel, Forus e outros (1991) descobriram que os genes da APR e GLI são estritamente situados; provas dos dois genes hibridizados para fragmentos de DNA de peso molecular de 300-400 kb. Mais análises de restrição detalhadas demonstraram que a região intergênica era de 200 e 300 kb (Forus e Myklebost, 1992). Hilliker e outros (1992) confirmaram a determinação em 12q13-q14 usando ambas hibridizaões não isotópica e isotópica no sítio. Também por hibridização no sítio, eles determinaram o lócus correspondente no camundongo, no cromossomo 15. Binder e outros (2000) ressaltaram que a gl96 e CD91 mepeiam no braço longo do cromossomo 12.
MOLECULAR GENETICS
Association with Alzheimer disease
O gene da proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade foi um candidato atrativo para a doença de Alzheimer por várias razões. O LRP multifuncional tem sido apresentado por funcionar como um receptor para o tubo ascendente de apolipoproteínas-E contendo partículas de lipoproteínas dos neurônios. O alelo de apoE4 é fortemente associado com um aumento do risco de tardio estabelecimento da doença de Alzheimer familial e ambos estabelecimentos tardio e precoce esporádico de AD. O receptor de LRP é proeminentemente localizado em regiões soma (parte axial do corpo, isto é, cabeça, pescoço, tronco e cauda, excluindo os membros) e próximo ao processamento dos neurônios. Em um estudo de caso-controle de 183 pacientes com AD familial e esporádica e 118 controles, Lendon e outros (1997) descobriram uma moderada associação (razão de ocorrência = 1.57. P=0,024) entre AD e o polimorfismo de um alelo de 87 pares de base de uma repetição de quatro nucleotídeos localizado na extremidade 5 do gene do LRP1. Além disso, Pericak-Vance e outros (1997) descobriram num método de seleção genômica e análises seguintes de 54 famílias com AD múltiplas de estabelecimento tardio, quatro regiões potencialmente abrigando genes AD; uma dessas regiões, no cromossomo 12, foi localizada aproximadamente 10 cM próximo do LRP1. Scott e outros (1998) examinaram 144 famílias com AD múltipla de estabelecimento tardio, 436 casos de AD esporádica, e 240 controles e não descobriram evidências de uma ligação ou associação do LRP1 com AD. Seus dados indicaram que a variação genética no gene LRP1 não é o maior fator de risco na etiologia da doença de Alzheimer.
Aproximadamente 157 pacientes com AD de estabelecimento tardio (85 com uma história familiar e 72 sem uma história familiar), Kang e outros (1997) descobriram aumentada freqüência de um polimorfismo C766T do alelo C no éxon 3 do gene da LRP1 comparado aos controles, embora o alelo C fosse comum nos controles. Os autores sugeriram que o polimorfismo, predito como silenciador, pode estar em desequilíbrio de ligação com o suposto lócus de suscetibilidade a AD vizinho. Estudos de Hollenbach e outros (1998) e Baum e outros (1998) tembém proporcionaram evidências do aumento da freqüência do alelo 766C em pacientes com AD. McIlroy e outros (2001) não encontraram associação com o polimorfismo do éxon 3 e o desenvolvimento de AD.
Kang e outros (2000) notaram que a LRP e seus ligantes, APOE e alfa-2-macroglobulina, são geneticamente associados com AD.
ANIMAL MODEL
Boucher e outros (2003) desenvolveram camundongos com inativação em tecidos específicos com falta de Lrp1 somente nas células vasculares da musculatura lisa. Para aumentar a suscetibilidade ao desenvolvimento de lesões ateroscleróticas (depósito de lipídios irregularmente distribuídos na camada íntima de artérias de grosso e médio calibre) espontâneas, estes animais foram cruzados (hibridizados) com camundongos inativos para o receptor de LDL a fim de gerar camundongos Ldlr-/Lrp- na musculatura lisa. A presença ou ausência da expressão de Lrp1 nas células da musculatura lisa não tiveram efeito no colesterol do plasma ou nos níveis de triglicerídeos no camundongo em dieta normal nem em dieta rica em colesterol. Entretanto, aortas da musculatura lisa dos camundongos Lpr- foram consistentemente distendidas e dilatadas. Essa diferença aumentou ao longo do tempo e foi acompanhada por engrossamento da parede da aorta, pronunciada aterosclerose, e formação de aneurisma. Boucher e outros (2003) demonstraram que Lrp1 forma um complexo com o receptor de PDGF (veja PDGFR1). A inativação do Lrp1 nas células vasculares da musculatura lisa do camundongo causou super-expressão de PDGFR e a ativação anormal da sinalização de PDGFR, resultando no rompimento da camada elástica, proliferação das células da musculatura lisa, formação de aneurisma e marcada suscetibilidade para a aterosclerose induzida por colesterol. O desenvolvimento dessas anormalidades foi reduzido por tratamento com Gleevec, um inibidor da sinalização de PDGF. Assim, Boucher e outros (2003) concluíram que LRP1 tem um papel como eixo da proteção da integridade da parede vascular e na prevenção da aterosclerose através do controle da ativação de PDGFR.
May e outros (2004) descobriram que camundongo com ruptura marcada no gene de Lrp1 em diferenciados neurônios pós-mitóticos demonstraram hiperatividade e constante tremor, e desenvolvimento tardio de postura distônica com cifose toráxica aumentada, andar bamboleante, e membros traseiros enfraquecidos, sugerindo distúrbio nervoso motor ou excitação motora. O camundongo transgênico faleceu prematuramente aos nove meses de idade. A morfologia do cérebro foi normal com nenhuma perda neuronal maior, sugerindo uma anormalidade funcional na neurotransmissão. In vitro, LRP1 co-imunoprecipitou e co-localizou-se com a proteína pós-sináptica (sinapse é o pareamento, ponto por ponto, de cromossomos homólogos durante a prófase da meiose) PSD95 e com as sub-unidades NR2A e NR2B do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Tratamento dos neurônios com NMDA reduziu a interação de Lrp1 e Psd95. May e outros (2004) concluíram que LRP1 atua num papel de procedimento e função motora através da regulação de mecanismos de sinalização pós-sináptica através da interação com receptores de NMDA.
Hofmann e outros (2007) geraram um camundongo com inativação específica do adipócito do LRP1 e observaram remoção retardada de lipídeos após a refeição, reduzido peso corporal, pouca reserva de gordura, adipócitos vasios de lipídio marrom, maior tolerância a glucose, e elevado dispêndio de energia devido ao aumento da termogênese da musculatura. Adicionalmente, o camundongo mutante era resistente à obesidade induzida por dieta de gordura e intolerância à glucose. Hofmann e outros (2007) concluíram que LRP1 é um regulador crítico da homeostase da energia do adipócito.
*107770 LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR-RELATED PROTEIN 1; LRP1
Alternative titles; symbols
LIPOPROTEIN RECEPTOR-RELATED PROTEIN; LRPALPHA-2-MACROGLOBULIN RECEPTOR; A2MRAPOLIPOPROTEIN RECEPTOR; APRAPOLIPOPROTEIN E RECEPTOR; APOERCD91CED1, C. ELEGANS, HOMOLOG OF
Gene map locus 12q13.1-q13.3
TEXT
CLONING
Hertz e outros (1988) clonaram um cDNA para o receptor relacionado à lipoproteína de baixa densidade (LRP) em virtude de sua restrita homologia com o receptor de LDL. A proteína de 4.544 aminoácidos contém um único segmento transmembranal. Análises de Northern blot detectaram a LRP1 no fígado, cérebro e pulmões. A proteína demonstrou forte ligação com cálcio. Kristensen e outros (1990) e Strickland e outros (1990) demonstraram que LRP é idêntico ao receptor de alfa-macroglobulina 2 (A2MR). Como o receptor de manose-6-fosfato, a molécula A2MR/LRP é provavelmente bifuncional.
No nematódeo de vida livre Caenorhabditis elegans, Yochem e Grenwald (1993) isolaram e seqüenciaram um gene mais longo que 23 kb que codifica uma grande proteína integrante da membrana com uma estrutura prevista similar à da LRP dos mamíferos. O produto de 4.753 aminoácidos prognosticado pelo gene de C.elegans repartiu-se em número próximo ao idêntico e de acordo com os motivos de seqüência de aminoácidos do LRP humano, e vários éxons do gene do LRP de C.elegans corresponderam aos éxons de partes relacionadas ao gene da LRP humano.
GENE FUNCTION
Kounnas e outros (1995) demonstraram que LRP media a endocitose e a degradação de proteínas precursoras amilóides (amilóides: proteínas que parecem iguais ao microscópio, mas são quimicamente diferentes) secretadas (APP), sugerindo que um único caminho metabólico liga duas moléculas implicadas na patofisiologia da doença de Alzheimer (AD). Narita e outros (1997) demonstraram que A2M, por via de LRP, media a remoção e degradação de amilóides-beta geradas por APP, o principal componente das placas amilóides em Alzheimer.
Kang e outros (2000) demonstraram “in vitro” que LRP1 é requerida para a remoção mediada por A2M de beta-amilóide 40 e 42 por via um mecanismo celular de absorção mediado por receptor. Análises do tecido do cérebro humano morto demonstraram que a expressão de LRP normalmente declina com a idade, e que a expressão de LRP em cérebro com Alzheimer foi significativamente mais baixa do que nos controles. No grupo AD, altos níveis de LRP foram co-relacionados com o ataque de AD e morte em idade avançada. Kang e outros (2000) concluíram que a expressão reduzida de LRP é um fator de risco que contribui para a AD, possivelmente pelo impedimento da remoção da beta-amilóide solúvel.
A proteína gp96 “choque de calor” (TRA1) é uma proteína intracelular capaz de acompanhar antígenos exógenos, de tumores ou células infectadas por vírus, para células apresentadoras de antígenos por apresentação ao complexo maior de histocompatibilidade (MHC) de classe I em preferência às moléculas de classe II, dessa forma elicitando respostas de células T CD8 positivas. Usando o sistema de camundongo, Binder e outros (2000) determinaram que o receptor para gp96 é CD91 (A2MR) e que A2M, uma proteína encontrada no sangue, inibe a ligação de gp96 a CD91. Eles propuseram que CD91 atua como um sensor para morte de células necróticas nos tecidos, desencadeando respostas imunes pró-inflamatórias.
Basu e outros (2001) usaram proteínas choque de calor marcadas por fluorescência (HSPs) para mostrar que não somente GP96, mas também HSP90 (HSPCA), HSP70 (HSPA1A) e calreticulina (CALR) usam CD91 como um receptor comum. A habilidade dessas células para ligar HSPs é correlata à habilidade dependente de TAP [O trasportador de ATP-binding cassette TAP transloca peptídeos do citosol para as moléculas do complexo maior de histocompatibilidade de classe I (MHCI) à espera no retículo endoplasmático. TAP é feita de polipeptídeos TAP1 e TAP2.]e proteossomo para constituírem peptídeos acompanhados por HSP.
Forus e outros (1991) descobriram que os genes APR e GLI são co-amplificados numa linha de células de rabdomiossarcoma (neoplasia maligna derivada da musculatura estriada, que acontece no coração das crianças).
Wang e outros (2003) demonstraram que o ativador tecidual do plasminogênio (tPA) sobre-regula a MMP9 em células em cultura e “in vivo”. Os níveis de MMP9 foram baixos em tPA inativados comparados com camundongos de tipo selvagem após a isquemia cerebral localizada. Em células do endotélio microvascular cerebral humanas, MMP9 foi sobre-regulada quando tPA recombinante foi adicionado. O RNA de interferência sugeriu que esta resposta foi mediada pela LRP1, a qual avidamente liga-se a tPA e possui propriedades sinalizadoras.
Desde que BACE e APP interagem e trafegam uma com a outra, e APP interage com e trafega com LRP1, von Arnim e outros (2005) investigaram interações entre BACE1 e LRP1. Eles descobriram que BACE1 interagiu com a cadeia leve de LRP1 na superfície celular em associação com a camada lipídica. A interação entre BACE-LRP1 leva ao aumento na clivagem do domínio extracelular de LRP1 e subseqüente liberação do domínio intracelular da membrana. Von Arnim e outros (2005) concluíram que LRP1 é um substrato de BACE.
Kinchen e outros (2005) demonstraram que em C. elegans, CED1 (LRP1), CED6 e CED7 são requeridas para reorganização de actina em torno do corpo de célula em apoptose, e que CED1 e CED6 co-localizam entre si e com a actina em volta da célula morta. Além disso, Kinchen e outros (2005) descobriram que a GTPase de CED10 (RAC) atua geneticamente a jussante dessas proteínas para mediar a remoção do corpo, ligando funcionalmente os dois caminhos de absorção e identificando a modulação de sinalização de CED1, CED6 e CED7 como reguladores contra-corrente de ativação de Rac.
Gaultier e outros (2008) descobriram que células de Schwann em roedores com nervos lesados exibiram aumento de expressão de Lrp1. Um fragmento solúvel de Lrp1 com uma cadeia alfa intacta (sLrp-alfa) foi repelido pelas células Schwann in vitro e no sistema nervoso periférico após injúria. Injeção de sLrp1-alfa no nervo ciático do camundongo anterior a uma injúria de constrição crônica inibiu a ativação de p38 Mapk (MAPK14) e diminuiu a expressão de Tnf-alfa e de IL1-beta no local. sLrp-alfa também inibiu a dor neuropática induzida espontaneamente pela injúria e diminuiu a expressão de citocina inflamatória na espinha dorsal, onde o processamento da dor neuropática ocorre. Em células de Schwann cultivadas do rato, astrócitos e micróglias (pequenas células da neuroglia que podem tornar-se fagocíticas em áreas de lesão ou inflamação neural), sLrp-alfa inibiu a ativação induzida de Tnf-alfa de p38 e Erk/Mapk.
MAPPING
Myklebost e outros (1989) mapearam o gene da proteína ligada à LRP em 12q13-q14 por estudo de DNA de células híbridas humanas e de camundongo e por hibridização em sítio; o símbolo APOER foi usado incialmente devido à suposta função de receptor.
Através de análises de pulso em campo de gel, Forus e outros (1991) descobriram que os genes da APR e GLI são estritamente situados; provas dos dois genes hibridizados para fragmentos de DNA de peso molecular de 300-400 kb. Mais análises de restrição detalhadas demonstraram que a região intergênica era de 200 e 300 kb (Forus e Myklebost, 1992). Hilliker e outros (1992) confirmaram a determinação em 12q13-q14 usando ambas hibridizaões não isotópica e isotópica no sítio. Também por hibridização no sítio, eles determinaram o lócus correspondente no camundongo, no cromossomo 15. Binder e outros (2000) ressaltaram que a gl96 e CD91 mepeiam no braço longo do cromossomo 12.
MOLECULAR GENETICS
Association with Alzheimer disease
O gene da proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade foi um candidato atrativo para a doença de Alzheimer por várias razões. O LRP multifuncional tem sido apresentado por funcionar como um receptor para o tubo ascendente de apolipoproteínas-E contendo partículas de lipoproteínas dos neurônios. O alelo de apoE4 é fortemente associado com um aumento do risco de tardio estabelecimento da doença de Alzheimer familial e ambos estabelecimentos tardio e precoce esporádico de AD. O receptor de LRP é proeminentemente localizado em regiões soma (parte axial do corpo, isto é, cabeça, pescoço, tronco e cauda, excluindo os membros) e próximo ao processamento dos neurônios. Em um estudo de caso-controle de 183 pacientes com AD familial e esporádica e 118 controles, Lendon e outros (1997) descobriram uma moderada associação (razão de ocorrência = 1.57. P=0,024) entre AD e o polimorfismo de um alelo de 87 pares de base de uma repetição de quatro nucleotídeos localizado na extremidade 5 do gene do LRP1. Além disso, Pericak-Vance e outros (1997) descobriram num método de seleção genômica e análises seguintes de 54 famílias com AD múltiplas de estabelecimento tardio, quatro regiões potencialmente abrigando genes AD; uma dessas regiões, no cromossomo 12, foi localizada aproximadamente 10 cM próximo do LRP1. Scott e outros (1998) examinaram 144 famílias com AD múltipla de estabelecimento tardio, 436 casos de AD esporádica, e 240 controles e não descobriram evidências de uma ligação ou associação do LRP1 com AD. Seus dados indicaram que a variação genética no gene LRP1 não é o maior fator de risco na etiologia da doença de Alzheimer.
Aproximadamente 157 pacientes com AD de estabelecimento tardio (85 com uma história familiar e 72 sem uma história familiar), Kang e outros (1997) descobriram aumentada freqüência de um polimorfismo C766T do alelo C no éxon 3 do gene da LRP1 comparado aos controles, embora o alelo C fosse comum nos controles. Os autores sugeriram que o polimorfismo, predito como silenciador, pode estar em desequilíbrio de ligação com o suposto lócus de suscetibilidade a AD vizinho. Estudos de Hollenbach e outros (1998) e Baum e outros (1998) tembém proporcionaram evidências do aumento da freqüência do alelo 766C em pacientes com AD. McIlroy e outros (2001) não encontraram associação com o polimorfismo do éxon 3 e o desenvolvimento de AD.
Kang e outros (2000) notaram que a LRP e seus ligantes, APOE e alfa-2-macroglobulina, são geneticamente associados com AD.
ANIMAL MODEL
Boucher e outros (2003) desenvolveram camundongos com inativação em tecidos específicos com falta de Lrp1 somente nas células vasculares da musculatura lisa. Para aumentar a suscetibilidade ao desenvolvimento de lesões ateroscleróticas (depósito de lipídios irregularmente distribuídos na camada íntima de artérias de grosso e médio calibre) espontâneas, estes animais foram cruzados (hibridizados) com camundongos inativos para o receptor de LDL a fim de gerar camundongos Ldlr-/Lrp- na musculatura lisa. A presença ou ausência da expressão de Lrp1 nas células da musculatura lisa não tiveram efeito no colesterol do plasma ou nos níveis de triglicerídeos no camundongo em dieta normal nem em dieta rica em colesterol. Entretanto, aortas da musculatura lisa dos camundongos Lpr- foram consistentemente distendidas e dilatadas. Essa diferença aumentou ao longo do tempo e foi acompanhada por engrossamento da parede da aorta, pronunciada aterosclerose, e formação de aneurisma. Boucher e outros (2003) demonstraram que Lrp1 forma um complexo com o receptor de PDGF (veja PDGFR1). A inativação do Lrp1 nas células vasculares da musculatura lisa do camundongo causou super-expressão de PDGFR e a ativação anormal da sinalização de PDGFR, resultando no rompimento da camada elástica, proliferação das células da musculatura lisa, formação de aneurisma e marcada suscetibilidade para a aterosclerose induzida por colesterol. O desenvolvimento dessas anormalidades foi reduzido por tratamento com Gleevec, um inibidor da sinalização de PDGF. Assim, Boucher e outros (2003) concluíram que LRP1 tem um papel como eixo da proteção da integridade da parede vascular e na prevenção da aterosclerose através do controle da ativação de PDGFR.
May e outros (2004) descobriram que camundongo com ruptura marcada no gene de Lrp1 em diferenciados neurônios pós-mitóticos demonstraram hiperatividade e constante tremor, e desenvolvimento tardio de postura distônica com cifose toráxica aumentada, andar bamboleante, e membros traseiros enfraquecidos, sugerindo distúrbio nervoso motor ou excitação motora. O camundongo transgênico faleceu prematuramente aos nove meses de idade. A morfologia do cérebro foi normal com nenhuma perda neuronal maior, sugerindo uma anormalidade funcional na neurotransmissão. In vitro, LRP1 co-imunoprecipitou e co-localizou-se com a proteína pós-sináptica (sinapse é o pareamento, ponto por ponto, de cromossomos homólogos durante a prófase da meiose) PSD95 e com as sub-unidades NR2A e NR2B do receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Tratamento dos neurônios com NMDA reduziu a interação de Lrp1 e Psd95. May e outros (2004) concluíram que LRP1 atua num papel de procedimento e função motora através da regulação de mecanismos de sinalização pós-sináptica através da interação com receptores de NMDA.
Hofmann e outros (2007) geraram um camundongo com inativação específica do adipócito do LRP1 e observaram remoção retardada de lipídeos após a refeição, reduzido peso corporal, pouca reserva de gordura, adipócitos vasios de lipídio marrom, maior tolerância a glucose, e elevado dispêndio de energia devido ao aumento da termogênese da musculatura. Adicionalmente, o camundongo mutante era resistente à obesidade induzida por dieta de gordura e intolerância à glucose. Hofmann e outros (2007) concluíram que LRP1 é um regulador crítico da homeostase da energia do adipócito.
sábado, 28 de junho de 2008
REPRODUÇÃO PARCIAL DE : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300384
*300384 EMERIN; EMD
Alternative titles; symbols
STA, INCLUDED
Gene map locus Xq28
TEXTO
DESCRIÇÃO
O gene EMD codifica uma proteína ubíqua, emerim, que é encontrada ao longo da borda de muitos tipos de células e é um membro da família de proteínas associadas à lâmina nuclear. Mutações no gene EMD tem sido estabelecidas como causadoras da distrofia muscular de tipo Emery-Dreifuss.
CLONAGEM
Bione e outros (1993) construíram um mapa transcricional da região 2-Mb do Xq28 ao qual a distrofia muscular Emery-Dreifuss tem sido mapeada através de estudos de ligação. Dentro desta região, eles identificaram o gene STA. Bione e outros (1994) determinaram que STA (EMD) codifica uma proteína de 254 aminoácidos, denominada emerin, a qual carece de um peptídeo sinal, contem um domínio longo no terminal N, e é hidrofílica exceto por uma região hidrofóbica de 20 aminoácidos em seqüência na região do terminal C. Ela tem vários sítios de fosforilação putativos e um sítio com potencial de glicosilação. Análises de Northern blot demonstraram a expressão ubíqua de um transcrito principal de aproximadamente 1-kb, com alta expressão no músculo esquelético e no coração e abundante expressão em outros tecidos, incluindo o colo, testículos, ovário e placenta. Bione e outros (1994) sugeriram que a emerin pertença a uma classe de proteínas de cauda ancorada na membrana das rotas secretoras envolvidas no transporte vesicular.
Manilal e outros (1996) desenvolveram um painel de doze anticorpos monoclonais para um largo fragmento de cDNA de emerin preparado através de PCR e expressado como uma proteína recombinante em E.coli. Estes anticorpos detectaram quatro diferentes epítopos na emerin. Todos os anticorpos monocloais reconheceram uma proteína de 34-kD em todos os tecidos testados. Estudos de imunofluorescência e fracionamento celular confirmaram que a emerin está localizada na membrana nuclear. Similaridades entre as seqüências de aminoácidos e a localização celular sugeriram que a emerin seja um membro da família de proteínas associadas à lamina nuclear.
Small e outros (1997) isolaram e caracterizaram o gene complete da emerin do camundongo. O gene da emerin no camundongo tem 2.9 kb, compreende 6 éxons e codifica uma proteína 73% idêntica à proteína humana. Assim como o humano, o gene codifica uma proteína rica em serina similar à proteína 2 associada à lâmina (LAP2) e apresenta críticos sítios de f
fosforilação de LAP2.
FUNÇÃO DO GENE
Cartegni e outros (1997) relataram que a emerin se localiza no interior da membrane nuclear por via de seu domínio hidrofóbico no terminal C, porém que no coração e miocardiocites cultivadas, ela também está associada com os discos intercalados. Eles propuseram um papel genérico para a emerin na ancoragem da membrana ao citoesquelet. No envelope nuclear, a emerin atua num papel onipresente (ubíquo) e indispensável em associação à membrana nuclear com a lâmina. No coração, ela é específicamente localizada nos desmossomos ( local de adesão entre duas células epiteliais) e aderentes fasciais (lâmina de tecido fibroso).
Desmossomos e aderentes fasciais ancoram em filamentos intermediários contendo desmina e as bandas de mio-filamentos sarcoméricos, respectivamente. Eles consistem de glicoproteínas adesivas transmembranas, membros da superfamília das caderinas, e das proteínas citoplasmáticas tais como vinculina, caterinas e proteínas ligantes de actina. Dferentes classificações da mesma ou de proteínas similares nos desmossomos, aderentes fasciais, adesões pontuais, e outras junções adesivas parecem conferir funções específicas para assegurar/proteger a comunicação célula-célula e a adesão restrita entre as células e para com a matriz extracelular.
O papel desse complexo de variadas proteínas é melhor demonstrad pela existência de muitas doenças genéticas que perturbam a adesão e, no coração, através de dramáticas conseqüências de placoglobina (um produto da reação da globina com alguma substância) (gama-catenina) inativa (Ruiz e outros, 1996): camundongos com placoglobina -/- morreram na metade da gestação devido à ruptura dos ventrículos. No coração, a específica localização da emerin nos desmossomos e aderentes fasciais, pode contar para defeitos característicos de condução descritos em pacientes com distrofia muscular Emery-Dreifuss.
Yorifuji e outros (1997) igualmente demonstraram que a emerin está localizada no interior da membrana nuclear. Estudos de localização ultra-estrutural da proteína no músculo esquelético humano e em células HeLa (primeiras células de um carcinoma cervical humano; obs: carcinoma no pescoço deve ser genericamente relacionado a qualquer tecido nesta localização?), usando crioseções (seções de frio) ultrafinas, demonstraram que partículas áureas coloidais etiquetadas imunologicamente estavam localizadas na superfície nucleoplásmica do interior da membrana nuclear, mas não no poro nuclear. Eles interpretaram seus resultados como indicadores de que a emerin ancora no interior da membrana nuclear através da extensão hidrofóbica e projeta-se a partir da região hidofílica para o plasma nuclear onde interage com a lâmina nuclear. Eles especularam que a emerin contribui na manutenção da estrutura e estabilidade nuclear, assim como para as funções nucleares, particularmente nos tecidos musculares que sofrem tensão severa com rigorosos movimentos de contraçõe-relaxamento e fluxo de cálcio.
Através de análises de mutação, Lee e outros (2001) determinaram que várias, mas não todas, as doenças ligadas à mutação na emerim mapeiam para um domínio central de ligação à lamina A (LMNA: Laminas são proteínas estruturais componentes da lâmina nuclear), e que mutações nesta região rompem a interação entre emerin e lamina A. Eles também descobriram que a emerin liga-se diretamente à BAF (BANF1), uma proteína de ligação ao DNA, e que esta ligação requer resíduos conservados no terminal N do domínio LEM da emerin. Todas as doenças ligadas a proteínas da emerin permanecem ativas para ligação com BAF tanto “in vitro” quanto “in vivo”.
Haraguchi e outros (2001) visualizaram uma co-localização entre emerin e BAF no cerne da região de cromossomos durante a telófase em células HeLa. Uma emerin defeituosa mutante na ligação com BAF in vitro falhou em localizar-se neste cerne em vivo e subseqüentemente falhou em localizar-se no envelope nuclear reformado. Em células HeLa expressando uma BAF mutante que não apresentou a localização do cerne, emerin endógenas falharam em localizar-se na região do cerne durante a telófase e não se reuniu dentro do envelope nuclear durante a interfase subseqüente. Esta BAF mutante também dominantemente deslocou LAP2-beta e a lamina A do envelope nuclear. Haraguchi e outros (2001) concluíram que BAF é requerida para a reunião da emerin com as laminas de tipo A no envelope nuclear em reforma durante a telófase e pode mediar sua estabilidade na interfase subseqüente.
Jaque e Stevenson (2006) examinaram a suscetibilidade de macrófagos primários para infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) seguindo pequenos RNA de interferância mediadores do silenciamento das laminas nucleares e várias proteínas associadas à lamina. Eles descobriram que o sileciamento da emerin e de BAF preveniu (impediu) a infecção com HIV-1, mas não o vírus da leucemia murina, através da prevenção da integração do vírus dentro do DNA hospedeiro. Análises de imunoprecipitação da cromatina identificaram a emerin e a BAF como co-fatores cooperadores do HIV-1, e análises de mutação demonstraram que o cDNA viral não se associou com a BAF defeituosa na ligação com emerin ou com a emerin sem o domínio LEM. Jacque e Stevenson (2006) concluíram que o cDNA do HIV-1, após entrar no núcleo, tem que interagir com emerin para o contato com a cromatina, e eles sugeriram que moléculas que impedem essas interações devem promover uma infecção abortiva do HIV-1 na célula.
ESTRUTURA DO GENE
Bione e outros (1995) relataram a seqüência do gene EMD, a qual tem o comprimento de 2.100 pares de bases. O gene contém seis éxons.
MAPEAMENTO
Bione e outros (1994) identificaram o gene EMD num mapa transcricional de Xq28.
*300384 EMERIN; EMD
Alternative titles; symbols
STA, INCLUDED
Gene map locus Xq28
TEXTO
DESCRIÇÃO
O gene EMD codifica uma proteína ubíqua, emerim, que é encontrada ao longo da borda de muitos tipos de células e é um membro da família de proteínas associadas à lâmina nuclear. Mutações no gene EMD tem sido estabelecidas como causadoras da distrofia muscular de tipo Emery-Dreifuss.
CLONAGEM
Bione e outros (1993) construíram um mapa transcricional da região 2-Mb do Xq28 ao qual a distrofia muscular Emery-Dreifuss tem sido mapeada através de estudos de ligação. Dentro desta região, eles identificaram o gene STA. Bione e outros (1994) determinaram que STA (EMD) codifica uma proteína de 254 aminoácidos, denominada emerin, a qual carece de um peptídeo sinal, contem um domínio longo no terminal N, e é hidrofílica exceto por uma região hidrofóbica de 20 aminoácidos em seqüência na região do terminal C. Ela tem vários sítios de fosforilação putativos e um sítio com potencial de glicosilação. Análises de Northern blot demonstraram a expressão ubíqua de um transcrito principal de aproximadamente 1-kb, com alta expressão no músculo esquelético e no coração e abundante expressão em outros tecidos, incluindo o colo, testículos, ovário e placenta. Bione e outros (1994) sugeriram que a emerin pertença a uma classe de proteínas de cauda ancorada na membrana das rotas secretoras envolvidas no transporte vesicular.
Manilal e outros (1996) desenvolveram um painel de doze anticorpos monoclonais para um largo fragmento de cDNA de emerin preparado através de PCR e expressado como uma proteína recombinante em E.coli. Estes anticorpos detectaram quatro diferentes epítopos na emerin. Todos os anticorpos monocloais reconheceram uma proteína de 34-kD em todos os tecidos testados. Estudos de imunofluorescência e fracionamento celular confirmaram que a emerin está localizada na membrana nuclear. Similaridades entre as seqüências de aminoácidos e a localização celular sugeriram que a emerin seja um membro da família de proteínas associadas à lamina nuclear.
Small e outros (1997) isolaram e caracterizaram o gene complete da emerin do camundongo. O gene da emerin no camundongo tem 2.9 kb, compreende 6 éxons e codifica uma proteína 73% idêntica à proteína humana. Assim como o humano, o gene codifica uma proteína rica em serina similar à proteína 2 associada à lâmina (LAP2) e apresenta críticos sítios de f
fosforilação de LAP2.
FUNÇÃO DO GENE
Cartegni e outros (1997) relataram que a emerin se localiza no interior da membrane nuclear por via de seu domínio hidrofóbico no terminal C, porém que no coração e miocardiocites cultivadas, ela também está associada com os discos intercalados. Eles propuseram um papel genérico para a emerin na ancoragem da membrana ao citoesquelet. No envelope nuclear, a emerin atua num papel onipresente (ubíquo) e indispensável em associação à membrana nuclear com a lâmina. No coração, ela é específicamente localizada nos desmossomos ( local de adesão entre duas células epiteliais) e aderentes fasciais (lâmina de tecido fibroso).
Desmossomos e aderentes fasciais ancoram em filamentos intermediários contendo desmina e as bandas de mio-filamentos sarcoméricos, respectivamente. Eles consistem de glicoproteínas adesivas transmembranas, membros da superfamília das caderinas, e das proteínas citoplasmáticas tais como vinculina, caterinas e proteínas ligantes de actina. Dferentes classificações da mesma ou de proteínas similares nos desmossomos, aderentes fasciais, adesões pontuais, e outras junções adesivas parecem conferir funções específicas para assegurar/proteger a comunicação célula-célula e a adesão restrita entre as células e para com a matriz extracelular.
O papel desse complexo de variadas proteínas é melhor demonstrad pela existência de muitas doenças genéticas que perturbam a adesão e, no coração, através de dramáticas conseqüências de placoglobina (um produto da reação da globina com alguma substância) (gama-catenina) inativa (Ruiz e outros, 1996): camundongos com placoglobina -/- morreram na metade da gestação devido à ruptura dos ventrículos. No coração, a específica localização da emerin nos desmossomos e aderentes fasciais, pode contar para defeitos característicos de condução descritos em pacientes com distrofia muscular Emery-Dreifuss.
Yorifuji e outros (1997) igualmente demonstraram que a emerin está localizada no interior da membrana nuclear. Estudos de localização ultra-estrutural da proteína no músculo esquelético humano e em células HeLa (primeiras células de um carcinoma cervical humano; obs: carcinoma no pescoço deve ser genericamente relacionado a qualquer tecido nesta localização?), usando crioseções (seções de frio) ultrafinas, demonstraram que partículas áureas coloidais etiquetadas imunologicamente estavam localizadas na superfície nucleoplásmica do interior da membrana nuclear, mas não no poro nuclear. Eles interpretaram seus resultados como indicadores de que a emerin ancora no interior da membrana nuclear através da extensão hidrofóbica e projeta-se a partir da região hidofílica para o plasma nuclear onde interage com a lâmina nuclear. Eles especularam que a emerin contribui na manutenção da estrutura e estabilidade nuclear, assim como para as funções nucleares, particularmente nos tecidos musculares que sofrem tensão severa com rigorosos movimentos de contraçõe-relaxamento e fluxo de cálcio.
Através de análises de mutação, Lee e outros (2001) determinaram que várias, mas não todas, as doenças ligadas à mutação na emerim mapeiam para um domínio central de ligação à lamina A (LMNA: Laminas são proteínas estruturais componentes da lâmina nuclear), e que mutações nesta região rompem a interação entre emerin e lamina A. Eles também descobriram que a emerin liga-se diretamente à BAF (BANF1), uma proteína de ligação ao DNA, e que esta ligação requer resíduos conservados no terminal N do domínio LEM da emerin. Todas as doenças ligadas a proteínas da emerin permanecem ativas para ligação com BAF tanto “in vitro” quanto “in vivo”.
Haraguchi e outros (2001) visualizaram uma co-localização entre emerin e BAF no cerne da região de cromossomos durante a telófase em células HeLa. Uma emerin defeituosa mutante na ligação com BAF in vitro falhou em localizar-se neste cerne em vivo e subseqüentemente falhou em localizar-se no envelope nuclear reformado. Em células HeLa expressando uma BAF mutante que não apresentou a localização do cerne, emerin endógenas falharam em localizar-se na região do cerne durante a telófase e não se reuniu dentro do envelope nuclear durante a interfase subseqüente. Esta BAF mutante também dominantemente deslocou LAP2-beta e a lamina A do envelope nuclear. Haraguchi e outros (2001) concluíram que BAF é requerida para a reunião da emerin com as laminas de tipo A no envelope nuclear em reforma durante a telófase e pode mediar sua estabilidade na interfase subseqüente.
Jaque e Stevenson (2006) examinaram a suscetibilidade de macrófagos primários para infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) seguindo pequenos RNA de interferância mediadores do silenciamento das laminas nucleares e várias proteínas associadas à lamina. Eles descobriram que o sileciamento da emerin e de BAF preveniu (impediu) a infecção com HIV-1, mas não o vírus da leucemia murina, através da prevenção da integração do vírus dentro do DNA hospedeiro. Análises de imunoprecipitação da cromatina identificaram a emerin e a BAF como co-fatores cooperadores do HIV-1, e análises de mutação demonstraram que o cDNA viral não se associou com a BAF defeituosa na ligação com emerin ou com a emerin sem o domínio LEM. Jacque e Stevenson (2006) concluíram que o cDNA do HIV-1, após entrar no núcleo, tem que interagir com emerin para o contato com a cromatina, e eles sugeriram que moléculas que impedem essas interações devem promover uma infecção abortiva do HIV-1 na célula.
ESTRUTURA DO GENE
Bione e outros (1995) relataram a seqüência do gene EMD, a qual tem o comprimento de 2.100 pares de bases. O gene contém seis éxons.
MAPEAMENTO
Bione e outros (1994) identificaram o gene EMD num mapa transcricional de Xq28.
sábado, 14 de junho de 2008
Tradução
CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, Feb. 2008, p. 284–292 Vol. 15, No. 2
1556-6811/08/$08.00_0 doi:10.1128/CVI.00221-07
Copyright © 2008, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Therapeutic Immunization with Human Immunodeficiency Virus Type 1
(HIV-1) Peptide-Loaded Dendritic Cells Is Safe and Induces
Immunogenicity in HIV-1-Infected Individuals_
Nancy C. Connolly,1 Theresa L. Whiteside,4 Cara Wilson,2,3 Venkatswarlu Kondragunta,5
Charles R. Rinaldo,2,6 and Sharon A. Riddler2,6*
Received 31 May 2007/Returned for modification 7 August 2007/Accepted 9 October 2007
A administração de potente terapia anti-retroviral (ART) resulta num dramático declínio da morbideza e mortalidade devida à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) para a maioria das pessoas tratadas. A iniciação da terapia anti-retroviral é normalmente acompanhada de decréscimo substancial na carga viral do HIV-1 e aumento da contagem de linfócitos TCD4. Estudos com sobrevventes de longo prazo e cm sujeitos tratados durante a infecção aguda demonstram que respostas vigorosas de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos para o HIV-1 e fortes respostas de linfócitos T Helpers 1 (TH1) correlacionam-se com o controle de longo prazo da replicação do HIV-1 na ausência de terapia, resultando em prolongada sobrevivência livre de sintomas.
Desafortunadamente, a limitada restauração de células T-Helpers específicas para o HIV-1 e a reatividade das CTLs em pessoas com infecção crônica do HIV-1 em terapia anti-retroviral comanda a terapia vitalícia e geralmente persistente, não obstante o baixo nível da replicação viral. Enquanto as respostas imunes inata e adquirida parecem ser responsáveis pelo controle inicial da viremia na infecção aguda do HIV-1, a ocorrência de respostas imunes naturalmente parece enfraquecer sobre o tempo na maioria dos indivíduos infectados, resultando na progressão da doença.
Indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral com supressão da carga viral plasmática progressivamente perdem as células T citotóxicas específicas para o HIV-1, sugerindo que a viremia persistente é requerida para as altas freqüências de células T citotóxicas específicas para o HIV-1. Na infecção crônica do HIV-1, a descontinuidade da terapia anti-retroviral tem sido uniformemente acompanhada de um rápido retorno de RNA do HIV-1 no plasma correspondente ao pré-tratamento, níveis estáveis de estado, indicando a persistência do reservatório do HIV e ausência de controle imune. Por estas razões, estratégias imunoterapêuticas com o potencial de suprimir a replicação viral e com a meta de elicitar ampla, robusta e durável resposta de TH1 e CTLs específicas para o HIV-1 são necessárias.
Células dendríticas (DC) são conhecidas por desempenhar um crítico papel na geração de respostas imunes altamente específicas contra uma variedade de patógenos. As DC adquirem antígenos na periferia e, no momento de ativação apropriada, migram para os linfonodos, onde elas iniciam a geração de respostas de células TCD4 e TCD8 antígeno-específicas. As DC tem sido extensivamente usadas como adjuvantes e carregadoras de antígenos nas estratégias vacinais para uma variedade de enfermidades, malignidades primárias, para induzir as respostas de células T antígeno-específicas com pequena ou nenhuma toxidade.
Nós e outros propusemos que células dendríticas expressando antígenos poderiam ser uma efetiva imunoterapia para a infecção do HIV-1. Para testar este de conceito, num estudo seguro de fase I, nós usamos células dendríticas autólogas (da própria pessoa) carregadas com peptídeos de CTLs restritos ao HLA*A0201, imunodominante, incluindo três diferentes peptídeos do HIV-1 e um peptídeo da proteína matrix de um único vírus influenza A para imunização. Vacinas baseadas em peptídeos são limitadas pela necessidade de especificidade para o HLA (o alelo do HLA pode não reagir ao peptídeo).
Por isso nós escolhemos para este estudo três peptídeos de HIV-1 CTL que representam um subconjunto seleto de peptídeos do HIV-1 de síntese altamente conservada os quais foram derivados de três proteínas estruturais principais do HIV-1 (Env, Gag e Pol. OBS.: as mesmas usadas na vacina do Dr. Luis Cláudio Arraes) e que exibiram reação cruzada com o complexo maior de histocompatibilidade ligando-se à família supertipo HLA-A2. Cada um desses peptídeos-epítopos de HIV-1 CTL induz a recuperação de respostas de CTLs nos indivíduos infectados pelo HIV-1. O peptídeo 58-66 (do aminoácido 58 ao 66) da proteína matrix do vírus influenza A representa um epítopo dominante reconhecido pela maioria dos indivíduos positivos para o HLA*A0201. Isso tem sido seguramente e efetivamente usado como um imunógeno em numerosos estudos de vacinação. Aqui nós apresentamos os resultados dos testes clínicos da fase I designada para avaliar a segurança e a executividade de células dendríticas autólogas carregadas com peptídeos sintetizados do HIV-1.
MATERIALS AND METHODS ...
RESULTADOS
Praticipantes do estudo.
As característcas da linha de base desse estudo de população estão listadas na Tabela 1. Os sujeitos estudados foram na maior parte homens (15/18) e brancos (16/18), com idade média de 44 anos. A média de contagem de células TCD4, da linha de base foi de 645 células por milímetro cúbico (ml), e profundeza da média de células TCD4 foi 259 células por mm3 (n_17); seis sujeitos tiveram contagem de células TCD4 profundas de 150 células/mm3, e um sujeito não contagem de células TCD4 profundas em valor avaliável. Todos os sujeitos completaram ao todo 24 semanas de acompanhamento; um deles retirado em acordo (após 24 semanas) e um segundo faleceram devido a causas não informadas nesse estudo vacinal (40 semanas).
Segurança.
As imunizações com peptídeos do HIV de células dendríticas autólogas foram em geral seguras e bem toleradas. Dezessete indivíduos receberam ambas as doses da vacina. Um deles (alta dose, s.c) experimentou um grau de febre 3 nunca registrado (1040F) no dia seguinte à primeira vacinação, o que foi considerado relativo à vacina, e na segunda vacina retido. Nenhum outro evento de graduação de 3 ou 4 laboratorial ou clínico informado nesse estudo foi observado. A contagem de células TCD4 permaneceu estável e as cargas virais permaneceram suprimidas em menos de 50 cópias/ml durante o acompanhamento.
A produção da vacina.
Um indivíduo (de baixa dose, i.v.) foi incapaz de suportar leucaférese (um procedimento em que os leucócitos são removidos do sangue coletado e o restante do sangue é retransfundido para o doador) devido a irreularidades anatômicas. Para este indivíduo, células dendríticas abundantes foram obtidas a partir de 100 ml de sangue periférico retiradas uma semana antes de cada dose vacinal. Para os sujeitos remanescentes, as células dendríticas substanciais foram geradas de um único produto de leucaférese para permitir a preparação das múltiplas doses vacinais. As células dendríticas geradas dos participantes do estudo eram similares às células dendríticas obtidas de um grupo de pessoas voluntárias (controle) não infectadas com respeito ao rendimento, viabilidade, pureza e fenótipo (tabela 2) (descritos em mais detalhes adiante). O rendimento principal foi de 9.1_107 (raio de ação 1.3_107 para 2.7_108) para o grupo de controle não infectado. A viabilidade principal e a pureza foram 93% (alcance 69 a 99%) e 100% (alcance 47% para 100%), respectivamente, comparada com 90% (alcance, 85% para 95%) e 77% (alcance, 75% para 89%) para o grupo de controle não infectado. A produção de IL-12p70, uma medição da função das células dendríticas, foi variável mas estatisticamente não diferente daquela dos doadores normais. Não houve estatisticamente diferenças significativas entre as características fenotípicas das células dendríticas imaturas ou de mDC (células dendríticas maduras) geradas de monócitos dos 18 participantes do estudo com infecção crônica do HIV-1 e as dos 15 doadores normais, como demonstrado previamente.
Respostas imunológicas.
Na linha de base, 9 dos 18 indivíduos tiveram respostas para um ou mais peptídeos do HIV-1, e 12 dos 18 tiveram resposta ao peptídeo da proteína matrix do vírus A. Três indivíduos tiveram respostas significativas para todos os quatro peptídeos. Seguindo a vacinação, em agregamento, aumentos estatísticamente significativos na freqüência de células TCD8 respondedoras ao Gag do HIV-1 (P_0.02) e ao Pol do Hiv-1 (P_0.04) foram observadas na sexta semana. Nenhuma diferença significativa foi observada entre as rotinas de administração i.v. e s.c. Uma diferença significativa foi observada entre as doses alta e baixa na quarta semana para o Env do HIV-1 (P_0.04), e uma tendência em direção à resposta significativa foi observada na quarta semana para Gag (P_0.07) e nas sexta (P_0.1) e oitava (P_0.05) semanas para o Pol do HIV-1. As variabilidades interindividuais consideráveis foram registradas no aumento geral de respostas de células TCD8, e o resultado significativo foi atribuível à fortes respostas vistas com células de alguns indivíduos. Finalmente, nós investigamos o efeito de pré-ART CD4 (CD4 profundas anti-retrovirais anteriores à terapia) profundas através do agrupamento de pacientes baseado por suas CD4 profundas (150 versus 150 células /mm3). Uma tênue tendência em direção à mais imunogenicidade no grupo com mais células CD4+ profundas foi observada, particularmente na sexta semana para o Env do HIV-1 (P_0.1), mas diferenças muito significativas não foram notadas.
Discussão.
Neste estudo, nós demonstramos que a vacinação com células dendríticas autólogas cadenciadas com HLA-A2 restrita aos peptídeos do HIV-1 foi segura e executável na infecção crônica pelo HIV-1, em sujeitos tratados com terapia anti-retroviral (ART). Além disso, embora somente duas vacinas tenham sido dadas, a geração de respostas imunológicas específicas ao HIV-1 foram observadas na situação da infecção crônica por HIV-1.
A vacinação com base em células dendríticas representa uma ferramenta potencialmente promissora para aumentar a resposta imunológica do portador contra a infecção pelo HIV-1. Esse estudo representa a maior e mais completo teste descrito de vacinação com células dendríticas autólogas em indivíduos tratados com ART e determina fundamentalização para futuros testes de aumento imunogênico utilizado em terapias baseadas na imunidade. Terapias de base imunológica nesta população tem o potencial de ser uma adição crucial avaliável para a terapia anti-retroviral corrente desde que nós nos empenhemos para a cura mais do que meramente o tratamento da infecção por HIV-1. A despeito de anos de pesquisa, permance desconhecido se a manipulação da imunidade é segura e se pode diminuir a viremia e aumentar o controle imunológico em pessoas infectadas cronicamente pelo HIV-1. Nosso teste examinou a segurança e a eficácia de uma terapia vacinal em sujeitos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral.
Os resultados desse estudo assim como caracterização adicional das propriedades das células dendríticas dos participantes do estudo na linha de base indicaram que células dendríticas derivadas de monócitos obtidas por leucaférese de sujeitos infectados cronicamente pelo HIV-1 com carga viral suprimida foi, com poucas exceções, fenotipicamente e funcionalmente comparável às células dendríticas de doadores normais.
As seleções de antígenos e adjuvantes são de importância crucial em todas as estratégias vacinais. O uso de células dendríticas como adjuvante para vacinação foi largamente desenvolvido em testes contra o câncer, em que o uso de peptídeos sintéticos como antígenos tem muitas vantegens: eles são relativamente fáceis de produzir, são hábeis para o monitoramento de respostas celulares peptídeo-específicas, eles excluem a possibilidade de infecção por produto vacinal, e eles minimizam o risco de geração de imunidade contra antígenos próprios. Por essas razões, os peptídeos sintéticos específicos do HIV-1 foram escolhidos para esta fase I de estudo de segurança e executabilidade de imunização baseada em células dendríticas nesse grupo tratado com terapia anti-retroviral. Permanece desconhecido, e é um assunto para mais estudos, qual emergirá como um antígeno ótimo para vacinação contra o HIV-1, enquanto terapia ou profilaxia. Aqui nós demonstramos que a administraação de somente duas doses de células dendríticas expostas a peptídeos sintéticos, embora com relativamente limitada especificidade, representa uma estratégia imunogênica potencial e executável.
A marca das estratégias imunoterapêuticas para infecção por HIV-1, i.e., para diminuir a carga viral e aumentar a contagem de células CD4, é conhecida através de anos de testes clínicos e observações correlatas com decréscimo da morbidade e da mortalidade resultante da infecção por HIV-1. Esse estudo não foi designado nem atribuído para detectar uma respota imunológica ou clínica. A despeito disso, nós demonstramos não somente que as cargas virais e a contagem de CD4 permaneceu inalterada, mas que certamente os indivíduos apresentaram aumento em sua resposta de células T CD8 específica para peptídeos do HIV-1.
Os resultados de outras três fases I de testes baseadas em imunização terapêutica com células dendríticas autólogas foram publicados recentemente. Lu e outros (Lu, W., L. C. Arraes, W. T. Ferreira, and J. M. Andrieu. 2004. Therapeuticdendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection Nat. Med. 10:1359–1365) usaram células dendríticas autólogas cadenciadas com HIV-1 autólogos inativados em 18 sujeitos brasileiros naïve (não expostos) ART (à terapia anti-retroviral). Essas imunizações com células dendríticas pareceram ser seguras e resultaram em um aumento da imunidade de células T CD4 e CD8 específicas para o HIV-1.
Esse efeito imunológco foi associado com a diminuição dos níveis de RNA do HIV no plasma em quatro de doze sujeitos. Finalmente, Ide e outros administraram células dendríticas cadenciadas com peptídeos do HIV-1 em quatro indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral que subseqüentemente foram submetidos à interrupção analítica do tratamento. A vacinação com células dendríticas foi segura, com dois dos quatro sujeitos demonstrando significativas respostas de interferon de células T CD8 ao para alguns peptídeos do HIV-1.
Enquanto os métodos de maturação de células dendríticas, antígenos e populações de pacientes desses estudos variaram em comparação àquele em nosso teste clínico, existem similaridades suficientes para concluir, baseado na segurança e no limitado sucesso clínico dessa terapia, que a administração de vacinas com células dendríticas autólogas apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para o tratamento da infecção crônica do HIV-1. Nosso teste de fase I demonstrou, num primeiro momento, que a vacinação com células dendríticas autólogas maturadas e cadenciadas com HLA-A2 restrito aos peptídeos do HIV-1 foi executável e segura num conjunto de indivíduos infectados pelo HIV-1 tratados com terapia anti-retroviral. Nós também demonstramos que um significativo aumento na freqüência das células T CD8 responsivas aos peptídeos do HIV-1 foi alcançada em seguida à vacina de células dendríticas cadenciadas com o peptídeo. Nós temos demonstrado que uma alta dose ( de 5 milhões a 10 milhões de células dendríticas) pareceu se mais efetiva do que uma baixa dose (de 1 milhão a 3 milhões de células dendríticas) no aumento das freqüências de células T reativas aos peptídeos do HIV-1.
Foi observada variabilidade inter-intividual significante na resposta imunológica para os peptídeos da vacina, com uma tendência em direção à melhor resposta entre aqueles com mais células T CD4 profundas. Nós não observamos diferenças na imunigenicidade entre as rotas s.c e i.v de administração.
Este estudo foi limitado por uma relativamente pequena amostra que consistiu predominantemente de sujeitos do sexo masculino com restrita escala de idade. Sumariamente, nosso estudo representa um avanço significativo em mostrar que sob condições rigorosamente controladas, doses muito pequenas de um limitado antígeno pode ser imunogênica em um subgrupo de indivíduos, e por isso isso apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para a infecção crônica do HIV-1. Estudos adicionais com pontos virológicos são urgentemente necessários para avaliar combinações alternativas de antígenos em células dendríticas e aumentar nossa compreensão dos mecanismos responsáveis pela variabilidade da resposta imunológica entre os individuos.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Carol Oriss, Chris Tripoli, and Pat Paulson for their
invaluable work coordinating this study. Thanks also go to Joanna
Stanson, Toni Temples, and the entire IMCPL staff for product preparation
and outcome analysis. We express our sincere appreciation for
the generosity and dedication of our study volunteers.
This work was supported by NIH grants PO1-AI55794 and PO1-
DE12321 and NIH/NCRR/GCRC grant M01-RR000056.
1556-6811/08/$08.00_0 doi:10.1128/CVI.00221-07
Copyright © 2008, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Therapeutic Immunization with Human Immunodeficiency Virus Type 1
(HIV-1) Peptide-Loaded Dendritic Cells Is Safe and Induces
Immunogenicity in HIV-1-Infected Individuals_
Nancy C. Connolly,1 Theresa L. Whiteside,4 Cara Wilson,2,3 Venkatswarlu Kondragunta,5
Charles R. Rinaldo,2,6 and Sharon A. Riddler2,6*
Received 31 May 2007/Returned for modification 7 August 2007/Accepted 9 October 2007
A administração de potente terapia anti-retroviral (ART) resulta num dramático declínio da morbideza e mortalidade devida à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) para a maioria das pessoas tratadas. A iniciação da terapia anti-retroviral é normalmente acompanhada de decréscimo substancial na carga viral do HIV-1 e aumento da contagem de linfócitos TCD4. Estudos com sobrevventes de longo prazo e cm sujeitos tratados durante a infecção aguda demonstram que respostas vigorosas de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos para o HIV-1 e fortes respostas de linfócitos T Helpers 1 (TH1) correlacionam-se com o controle de longo prazo da replicação do HIV-1 na ausência de terapia, resultando em prolongada sobrevivência livre de sintomas.
Desafortunadamente, a limitada restauração de células T-Helpers específicas para o HIV-1 e a reatividade das CTLs em pessoas com infecção crônica do HIV-1 em terapia anti-retroviral comanda a terapia vitalícia e geralmente persistente, não obstante o baixo nível da replicação viral. Enquanto as respostas imunes inata e adquirida parecem ser responsáveis pelo controle inicial da viremia na infecção aguda do HIV-1, a ocorrência de respostas imunes naturalmente parece enfraquecer sobre o tempo na maioria dos indivíduos infectados, resultando na progressão da doença.
Indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral com supressão da carga viral plasmática progressivamente perdem as células T citotóxicas específicas para o HIV-1, sugerindo que a viremia persistente é requerida para as altas freqüências de células T citotóxicas específicas para o HIV-1. Na infecção crônica do HIV-1, a descontinuidade da terapia anti-retroviral tem sido uniformemente acompanhada de um rápido retorno de RNA do HIV-1 no plasma correspondente ao pré-tratamento, níveis estáveis de estado, indicando a persistência do reservatório do HIV e ausência de controle imune. Por estas razões, estratégias imunoterapêuticas com o potencial de suprimir a replicação viral e com a meta de elicitar ampla, robusta e durável resposta de TH1 e CTLs específicas para o HIV-1 são necessárias.
Células dendríticas (DC) são conhecidas por desempenhar um crítico papel na geração de respostas imunes altamente específicas contra uma variedade de patógenos. As DC adquirem antígenos na periferia e, no momento de ativação apropriada, migram para os linfonodos, onde elas iniciam a geração de respostas de células TCD4 e TCD8 antígeno-específicas. As DC tem sido extensivamente usadas como adjuvantes e carregadoras de antígenos nas estratégias vacinais para uma variedade de enfermidades, malignidades primárias, para induzir as respostas de células T antígeno-específicas com pequena ou nenhuma toxidade.
Nós e outros propusemos que células dendríticas expressando antígenos poderiam ser uma efetiva imunoterapia para a infecção do HIV-1. Para testar este de conceito, num estudo seguro de fase I, nós usamos células dendríticas autólogas (da própria pessoa) carregadas com peptídeos de CTLs restritos ao HLA*A0201, imunodominante, incluindo três diferentes peptídeos do HIV-1 e um peptídeo da proteína matrix de um único vírus influenza A para imunização. Vacinas baseadas em peptídeos são limitadas pela necessidade de especificidade para o HLA (o alelo do HLA pode não reagir ao peptídeo).
Por isso nós escolhemos para este estudo três peptídeos de HIV-1 CTL que representam um subconjunto seleto de peptídeos do HIV-1 de síntese altamente conservada os quais foram derivados de três proteínas estruturais principais do HIV-1 (Env, Gag e Pol. OBS.: as mesmas usadas na vacina do Dr. Luis Cláudio Arraes) e que exibiram reação cruzada com o complexo maior de histocompatibilidade ligando-se à família supertipo HLA-A2. Cada um desses peptídeos-epítopos de HIV-1 CTL induz a recuperação de respostas de CTLs nos indivíduos infectados pelo HIV-1. O peptídeo 58-66 (do aminoácido 58 ao 66) da proteína matrix do vírus influenza A representa um epítopo dominante reconhecido pela maioria dos indivíduos positivos para o HLA*A0201. Isso tem sido seguramente e efetivamente usado como um imunógeno em numerosos estudos de vacinação. Aqui nós apresentamos os resultados dos testes clínicos da fase I designada para avaliar a segurança e a executividade de células dendríticas autólogas carregadas com peptídeos sintetizados do HIV-1.
MATERIALS AND METHODS ...
RESULTADOS
Praticipantes do estudo.
As característcas da linha de base desse estudo de população estão listadas na Tabela 1. Os sujeitos estudados foram na maior parte homens (15/18) e brancos (16/18), com idade média de 44 anos. A média de contagem de células TCD4, da linha de base foi de 645 células por milímetro cúbico (ml), e profundeza da média de células TCD4 foi 259 células por mm3 (n_17); seis sujeitos tiveram contagem de células TCD4 profundas de 150 células/mm3, e um sujeito não contagem de células TCD4 profundas em valor avaliável. Todos os sujeitos completaram ao todo 24 semanas de acompanhamento; um deles retirado em acordo (após 24 semanas) e um segundo faleceram devido a causas não informadas nesse estudo vacinal (40 semanas).
Segurança.
As imunizações com peptídeos do HIV de células dendríticas autólogas foram em geral seguras e bem toleradas. Dezessete indivíduos receberam ambas as doses da vacina. Um deles (alta dose, s.c) experimentou um grau de febre 3 nunca registrado (1040F) no dia seguinte à primeira vacinação, o que foi considerado relativo à vacina, e na segunda vacina retido. Nenhum outro evento de graduação de 3 ou 4 laboratorial ou clínico informado nesse estudo foi observado. A contagem de células TCD4 permaneceu estável e as cargas virais permaneceram suprimidas em menos de 50 cópias/ml durante o acompanhamento.
A produção da vacina.
Um indivíduo (de baixa dose, i.v.) foi incapaz de suportar leucaférese (um procedimento em que os leucócitos são removidos do sangue coletado e o restante do sangue é retransfundido para o doador) devido a irreularidades anatômicas. Para este indivíduo, células dendríticas abundantes foram obtidas a partir de 100 ml de sangue periférico retiradas uma semana antes de cada dose vacinal. Para os sujeitos remanescentes, as células dendríticas substanciais foram geradas de um único produto de leucaférese para permitir a preparação das múltiplas doses vacinais. As células dendríticas geradas dos participantes do estudo eram similares às células dendríticas obtidas de um grupo de pessoas voluntárias (controle) não infectadas com respeito ao rendimento, viabilidade, pureza e fenótipo (tabela 2) (descritos em mais detalhes adiante). O rendimento principal foi de 9.1_107 (raio de ação 1.3_107 para 2.7_108) para o grupo de controle não infectado. A viabilidade principal e a pureza foram 93% (alcance 69 a 99%) e 100% (alcance 47% para 100%), respectivamente, comparada com 90% (alcance, 85% para 95%) e 77% (alcance, 75% para 89%) para o grupo de controle não infectado. A produção de IL-12p70, uma medição da função das células dendríticas, foi variável mas estatisticamente não diferente daquela dos doadores normais. Não houve estatisticamente diferenças significativas entre as características fenotípicas das células dendríticas imaturas ou de mDC (células dendríticas maduras) geradas de monócitos dos 18 participantes do estudo com infecção crônica do HIV-1 e as dos 15 doadores normais, como demonstrado previamente.
Respostas imunológicas.
Na linha de base, 9 dos 18 indivíduos tiveram respostas para um ou mais peptídeos do HIV-1, e 12 dos 18 tiveram resposta ao peptídeo da proteína matrix do vírus A. Três indivíduos tiveram respostas significativas para todos os quatro peptídeos. Seguindo a vacinação, em agregamento, aumentos estatísticamente significativos na freqüência de células TCD8 respondedoras ao Gag do HIV-1 (P_0.02) e ao Pol do Hiv-1 (P_0.04) foram observadas na sexta semana. Nenhuma diferença significativa foi observada entre as rotinas de administração i.v. e s.c. Uma diferença significativa foi observada entre as doses alta e baixa na quarta semana para o Env do HIV-1 (P_0.04), e uma tendência em direção à resposta significativa foi observada na quarta semana para Gag (P_0.07) e nas sexta (P_0.1) e oitava (P_0.05) semanas para o Pol do HIV-1. As variabilidades interindividuais consideráveis foram registradas no aumento geral de respostas de células TCD8, e o resultado significativo foi atribuível à fortes respostas vistas com células de alguns indivíduos. Finalmente, nós investigamos o efeito de pré-ART CD4 (CD4 profundas anti-retrovirais anteriores à terapia) profundas através do agrupamento de pacientes baseado por suas CD4 profundas (150 versus 150 células /mm3). Uma tênue tendência em direção à mais imunogenicidade no grupo com mais células CD4+ profundas foi observada, particularmente na sexta semana para o Env do HIV-1 (P_0.1), mas diferenças muito significativas não foram notadas.
Discussão.
Neste estudo, nós demonstramos que a vacinação com células dendríticas autólogas cadenciadas com HLA-A2 restrita aos peptídeos do HIV-1 foi segura e executável na infecção crônica pelo HIV-1, em sujeitos tratados com terapia anti-retroviral (ART). Além disso, embora somente duas vacinas tenham sido dadas, a geração de respostas imunológicas específicas ao HIV-1 foram observadas na situação da infecção crônica por HIV-1.
A vacinação com base em células dendríticas representa uma ferramenta potencialmente promissora para aumentar a resposta imunológica do portador contra a infecção pelo HIV-1. Esse estudo representa a maior e mais completo teste descrito de vacinação com células dendríticas autólogas em indivíduos tratados com ART e determina fundamentalização para futuros testes de aumento imunogênico utilizado em terapias baseadas na imunidade. Terapias de base imunológica nesta população tem o potencial de ser uma adição crucial avaliável para a terapia anti-retroviral corrente desde que nós nos empenhemos para a cura mais do que meramente o tratamento da infecção por HIV-1. A despeito de anos de pesquisa, permance desconhecido se a manipulação da imunidade é segura e se pode diminuir a viremia e aumentar o controle imunológico em pessoas infectadas cronicamente pelo HIV-1. Nosso teste examinou a segurança e a eficácia de uma terapia vacinal em sujeitos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral.
Os resultados desse estudo assim como caracterização adicional das propriedades das células dendríticas dos participantes do estudo na linha de base indicaram que células dendríticas derivadas de monócitos obtidas por leucaférese de sujeitos infectados cronicamente pelo HIV-1 com carga viral suprimida foi, com poucas exceções, fenotipicamente e funcionalmente comparável às células dendríticas de doadores normais.
As seleções de antígenos e adjuvantes são de importância crucial em todas as estratégias vacinais. O uso de células dendríticas como adjuvante para vacinação foi largamente desenvolvido em testes contra o câncer, em que o uso de peptídeos sintéticos como antígenos tem muitas vantegens: eles são relativamente fáceis de produzir, são hábeis para o monitoramento de respostas celulares peptídeo-específicas, eles excluem a possibilidade de infecção por produto vacinal, e eles minimizam o risco de geração de imunidade contra antígenos próprios. Por essas razões, os peptídeos sintéticos específicos do HIV-1 foram escolhidos para esta fase I de estudo de segurança e executabilidade de imunização baseada em células dendríticas nesse grupo tratado com terapia anti-retroviral. Permanece desconhecido, e é um assunto para mais estudos, qual emergirá como um antígeno ótimo para vacinação contra o HIV-1, enquanto terapia ou profilaxia. Aqui nós demonstramos que a administraação de somente duas doses de células dendríticas expostas a peptídeos sintéticos, embora com relativamente limitada especificidade, representa uma estratégia imunogênica potencial e executável.
A marca das estratégias imunoterapêuticas para infecção por HIV-1, i.e., para diminuir a carga viral e aumentar a contagem de células CD4, é conhecida através de anos de testes clínicos e observações correlatas com decréscimo da morbidade e da mortalidade resultante da infecção por HIV-1. Esse estudo não foi designado nem atribuído para detectar uma respota imunológica ou clínica. A despeito disso, nós demonstramos não somente que as cargas virais e a contagem de CD4 permaneceu inalterada, mas que certamente os indivíduos apresentaram aumento em sua resposta de células T CD8 específica para peptídeos do HIV-1.
Os resultados de outras três fases I de testes baseadas em imunização terapêutica com células dendríticas autólogas foram publicados recentemente. Lu e outros (Lu, W., L. C. Arraes, W. T. Ferreira, and J. M. Andrieu. 2004. Therapeuticdendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection Nat. Med. 10:1359–1365) usaram células dendríticas autólogas cadenciadas com HIV-1 autólogos inativados em 18 sujeitos brasileiros naïve (não expostos) ART (à terapia anti-retroviral). Essas imunizações com células dendríticas pareceram ser seguras e resultaram em um aumento da imunidade de células T CD4 e CD8 específicas para o HIV-1.
Esse efeito imunológco foi associado com a diminuição dos níveis de RNA do HIV no plasma em quatro de doze sujeitos. Finalmente, Ide e outros administraram células dendríticas cadenciadas com peptídeos do HIV-1 em quatro indivíduos infectados pelo HIV-1 em terapia anti-retroviral que subseqüentemente foram submetidos à interrupção analítica do tratamento. A vacinação com células dendríticas foi segura, com dois dos quatro sujeitos demonstrando significativas respostas de interferon de células T CD8 ao para alguns peptídeos do HIV-1.
Enquanto os métodos de maturação de células dendríticas, antígenos e populações de pacientes desses estudos variaram em comparação àquele em nosso teste clínico, existem similaridades suficientes para concluir, baseado na segurança e no limitado sucesso clínico dessa terapia, que a administração de vacinas com células dendríticas autólogas apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para o tratamento da infecção crônica do HIV-1. Nosso teste de fase I demonstrou, num primeiro momento, que a vacinação com células dendríticas autólogas maturadas e cadenciadas com HLA-A2 restrito aos peptídeos do HIV-1 foi executável e segura num conjunto de indivíduos infectados pelo HIV-1 tratados com terapia anti-retroviral. Nós também demonstramos que um significativo aumento na freqüência das células T CD8 responsivas aos peptídeos do HIV-1 foi alcançada em seguida à vacina de células dendríticas cadenciadas com o peptídeo. Nós temos demonstrado que uma alta dose ( de 5 milhões a 10 milhões de células dendríticas) pareceu se mais efetiva do que uma baixa dose (de 1 milhão a 3 milhões de células dendríticas) no aumento das freqüências de células T reativas aos peptídeos do HIV-1.
Foi observada variabilidade inter-intividual significante na resposta imunológica para os peptídeos da vacina, com uma tendência em direção à melhor resposta entre aqueles com mais células T CD4 profundas. Nós não observamos diferenças na imunigenicidade entre as rotas s.c e i.v de administração.
Este estudo foi limitado por uma relativamente pequena amostra que consistiu predominantemente de sujeitos do sexo masculino com restrita escala de idade. Sumariamente, nosso estudo representa um avanço significativo em mostrar que sob condições rigorosamente controladas, doses muito pequenas de um limitado antígeno pode ser imunogênica em um subgrupo de indivíduos, e por isso isso apresenta uma promessa substancial como estratégia imunoterapêutica para a infecção crônica do HIV-1. Estudos adicionais com pontos virológicos são urgentemente necessários para avaliar combinações alternativas de antígenos em células dendríticas e aumentar nossa compreensão dos mecanismos responsáveis pela variabilidade da resposta imunológica entre os individuos.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Carol Oriss, Chris Tripoli, and Pat Paulson for their
invaluable work coordinating this study. Thanks also go to Joanna
Stanson, Toni Temples, and the entire IMCPL staff for product preparation
and outcome analysis. We express our sincere appreciation for
the generosity and dedication of our study volunteers.
This work was supported by NIH grants PO1-AI55794 and PO1-
DE12321 and NIH/NCRR/GCRC grant M01-RR000056.
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