300005 METHYL-CpG-BINDING PROTEIN 2; MECP2
Gene map locus Xq28

CLONAGEM

Lewis e outros (1992) identificaram e clonaram a Mecp2 da biblioteca de cDNA do cérebro de um rato. A proteína deduzida em 492 aminoácidos tem uma massa molecular de 53 quilo-dáltons e é rica em aminoácidos básicos e sítios com potencial de fosforilação. Manchas de imunofluorescência mostraram que a distribuição da Mecp2 ao longo dos cromossomos paraleliza com as metil-CpG (dinucleotídio CG cuja citosina foi metilada, recebeu um grupo –CH3). No camundongo, a Mecp2 está concentrada na heterocromatina pericentromérica (na periferia do centrômero), a qual contém aproximadamente 40% de toda metilcitosina-5 genômica. Diferente da proteína 1 de ligação a CpG-metil (MBD1;156535), a MECP2 é capaz de ligar-se a um único par metil-CpG. Nan de outros (1993) clonaram o gene da Mecp2 do rato e definiram o domínio de ligação ao metil CpG (MBD). O MBD tem o comprimento de 85 aminoácidos e liga-se exclusivamente ao DNA que contém uma ou mais CpGs simetricamente metiladas.
Usando uma prova de MECP2 do rato para rastrear uma biblioteca de cDNA do músculo esquelético humano, D’Esposito e outros (1996) isolaram o homólogo humano, o qual codifica uma proteína deduzida em 485 aminoácidos. As proteínas humana e do rato compartilham 93% de identidade de toda a sequência e 100% de identidade na região MBD. Análises de Northern blot detectaram um transcrito de 1.8 quilobases em todos os tecidos analisados, com o nível mais alto de expressão no coração e no músculo esquelético.

Mnatzakanian e outros (2004) identificaram uma isoforma anteriormente desconhecida da MECP2 chamada MECP2B. Eles referiram-se À isoforma conhecida como MECP2A. O transcrito MECP2B utiliza o éxon 1 da MECP2, salta o éxon 2, e depois usa a lente total dos éxons 3 e 4. A MECP2B é expressada em todos os tecidos, incluindo o cérebro fetal e adulto e sub-regiões do cérebro. No cérebo adulto do Homem, a expressão da MECP2B é 10 vezes mais alta do que a da MECP2A.

ESTRUTURA DO GENE

Reichwald e outros (2000) determinaram que o gene MECP2 tem quarto éxons.

MAPEAMENTO

Quaderi e outros (1994) mapearam o gene Mecp2 do camundongo em um interval de 40 quilobases entre a L1cam e Rsvp no centro de expansão do cromossomo X do caundongo, junto ao marcador microsatélite DXMit1. Esta região é conhecida por ser sinteticamente equivalente ao Xq28 humano, e , com exceção do F8A (o FVIII contém uma ilha CpG a partir da qual dois genes são transcritos, o F8A na direção oposta ao FVIII e o F8B na mesma direção.), a ordem dos lócus está conservada entre as duas espécies. Por isso, D’Esposito e outros (1996) esperavam que o gene MECP2 estivesse localizado entre a L1CAM e o lócus de visão colorida RCP/GCP. Um filtro contendo todas as YACs (plasmídio de genoma de levedura) localizadas entre esses dois pontos foi hibridizado com a prova da Mecp2 do rato, e 3 YACs sobrepostas foram positivas para o MECP2, localizando o MECP2 em aproximadamente 70 quilobases centrôméricas em relação ao conjunto de visualização colorida RCP/GCP. Por fluorescência de hibridização em sítio, Vilain e outros (1996) confirmaram a posição de mapeamento da MECP2 no Xq28.

FUNÇÃO DO GENE

A inativação dos genes ligados ao X está usualmente associada com a metilação das ilhas CpG na extremidade 5 do final do gene. Proteínas que reconhecem e ligam-se a bases metiladas no DNA incluem a proteína de ligação a DNA metilado MECP2. Para determinar se este gene é expressado a partir do cromossomo X inativado, Adler e outros (1995) usaram um sistema de translocação autossoma/X (de um cromossomo não sexual para o X) no camundongo, no qual a expressão do alelo Mecp2 no cromossomoX inativado pode ser ensaiada. Os resultados desses experimentos indicaram que a Mecp2 está sujeita à inativação do X no camundongo. D’Esposito e outros (1996) demonstraram que o gene MECP2 em humanos está sujeito à inativação do X.
Para descobrir se a localização da MECP2 na heterocromatina depende da metilação do DNA, Nan e outros (1996) expressaram transitoriamente a fusão protéica Mecp2-LacZ em células cultivadas. A Proteína intacta foi mirada na heterocromatina em células de tipo selvagem mas foi insuficientemente localizada em células mutantes com baixos níveis de metilação do DNA genômico. Deleções dentro da Mecp2 mostraram que a localização na heterocromatina requereu o domínio de 85 aminoácidos de ligação a metil-CpG mas não o restante da proteína. Assim, a Mecp2 é uma proteína de ligação a metil-CpG “in vivo” e é aceitavelmente o maior mediador das conseqüências posteriores à metilação do DNA.

A MECP2 é uma proteína abundante no cromossomo que liga-se expecificamente ao DNA metilado “in vitro” e depende do metil-CpG para sua distribuição no cromossomo “in vivo”. Para avaliar sua significação funcional, Tate e outros (1996) mutaram o gene ligado ao X em células tronco embrionárias de um camundongo macho usando uma construção com um gene alvejador do gene sem promotor contendo um gene repórter lacZ (gene repórter é aquele que leva o gene que está sendo ligado a ele para transfecção em células onde será estudada sua função). As células tronco embrionárias (ES) mutantes carentes da MECP2 cresceram com o mesmo vigor que a linha parental e foram capazes de considerável diferenciação. Embriões quiméricos derivados de várias linhagens mutantes independentes, entretanto, exibiram defeitos no desenvolvimento com uma severidade que foi positivamente correlacionada com a distribuição das células mutantes. Os resultados demonstraram aos autores que a MECP2, assim como a DNA metiltransferase (DNMT1; 126375), é dispensável nas células tronco mas é essencial para o desenvolvimento embrionário.

Nan e outros (1997) descobriram que a Mecp2 recombinante do rato reprimiu a transcrição “in vitro” de promotores metilados mas não reprimiu promotores não metilados. Além disso, a Mecp2 foi capaz de deslocar a histona H1 (HIF1;142709) da cromatina pré-reunida que contém metil-CpG. Essas propriedades, junto com a abundância de Mecp2 e a alta freqüência de seus sítios de ligação de dois pares de bases, sugeriu um papel como um repressor de transcrição global em genomas de vertebrados. Nan e outros (1998) estudaram o mecanismo de repressão pela Mecp2. A Mecp2 liga-se disciplinadamente aos cromossomos de modo dependente da metilação. Ela contém um domínio de repressão transcricional (TRD) que pode funcionar a uma distância “in vitro” e “in vivo”. Nan e outros (1998) mostraram que a região da Mecp2 onde se localiza o TRD associa-se com um complexo co-repressor contendo o repressor transcricional mSin3A e desacetilases de histona (veja HDAC1;601241). A repressão transcricional “in vivo” é ajudada pelo inibidor de desacetilase trichostatina A, indicando que a desacetilação de histonas (e/ou de outras proteínas) é um componente essencial desse mecanismo de repressão. Os dados sugeriram que dois mecanismos globais de regulação do gene, metilação do DNA e desacetilação da histona, podem estar ligados pela Mecp2. Em oócitos de Xenopus (sapo), a metilação do DNA silencia dominantemente a transcrição através da reunição de uma série nucleossômica repressiva. Jones e outros (1998) descobriram que o silenciamento conferido pela Mecp2 e o DNA metilado pode ser ajudado pela inibição da desacetilase da histona, facilitando o remodelamento da cromatina e a ativação transcricional.
(Obs.: As desacetilases de histona (HDAC) são uma classe de enzimas que removem grupos acetil de um ε-N- acetil (acetil epsilon N) do aminoácido lisina em uma histona. Sua ação é oposta à da acetiltransferase de histona. Os caules da histona são normalmente positivamente carregados devido a grupos amina presentes em seus aminoácidos lisina e arginina. Essas cargas positivas ajudam aos caules das histonas a interagirem com e ligarem-se a grupos fosfato negativamente carregados na espinha do DNA. A acetilação, a qual ocorre normalmente numa célula, neutraliza as cargas positivas na histona pela alteração das aminas em amidas e diminui a habilidade das histonas para ligarem-se ao DNA. Esse processo permite a expansão da cromatina, permitindo à transcrição genética ter lugar. As desacetilases das histonas removem estes grupos acetil, aumentando a carga positiva dos caules das histonas e aumentando a ligação de alta afinidade entre as histonas e a coluna de DNA. Este processo condensa a estrutura de DNA prevenindo a transcrição.In.bioisolutions.blogspot.com Obs.2: a repressão transcricional se refere à repressão da transcrição de um gene e, para isso, a cromatina tem que estar solta da histona.)

Ohki e outros (2001) relataram a estrutura em solução do MBD conservado do MBD1 humano ligado ao DNA metilado. A ligação ao DNA cria um laço no MBD1 para dobrar para dentro de uma nova e principal interface de ligação ao DNA. O reconhecimanto de grupos metil e sequências CG no sítio de metilação é devido a 5 resíduos altamente conservados que formam uma área hidrofóbica. Os autores concluíram que a estrutura indica como o MBD pode acesar o nucleossomo do DNA sem encontrar interferência dos estérica (interferência estérica é o bloqueio bioquímico devido ao tamanho das moléculas reagentes que impediria a aproximação necessária para a interação entre os átomos) do cerne das histonas.

Shahbazian e outros (2002) investigaram a distribuição espacial e temporal da proteína Mecp2 durante o desenvolvimento do camundongo e do homem. Através de análises de Western blot, eles descobriram que a Mecp2 no camundongo adulto e abundante no cérebro, pulmões, e baço, pouca no coração e rins e escassamente detectável no fígado, estômago e intestino delgado. Não existe correlação óbvia entre os níveis da proteína e os níveis de RNA, sugerindo que a tradução deva ser regulada pós-transcricionalmente por fatores específicos dos tecidos. O período de tempo de expressão da Mecp2 no camundongo e no homem correlacionou-se à maturação do sistema nervoso central, com a estruturas mais velhas ontogeneticamente (com estruturas anteriores no desenvolvimento do indivíduo) tais como o cordão da espinha e o tronco encefálico tornando-se positivo antes das novas estruturas tais como o hipocampo e o córtex cerebral. No córtex, a Mecp2 apareceu primeiro nas células Cajal-Retzius, depois nos neurônios das camadas corticais mais profundas e mais maduras. A proteína Mecp2 estava eventualmente presente em uma maioria de neurônios mas ausente nas células gliais. Shahbazian e outros (2002) sugeriram que a Mecp2 pode tornar-se abundante somente uma vez que um neurônio tenha alcançado um certo grau de maturidade.

Chen e outros (2003) descobriram que a MECP2 liga-se seletivamente ao promotor III do BDNF (113505) e funciona para reprimir a expressão do gene BDNF (OMIM 113505: Durante o desenvolvimento vertebral normal, mais de 80% dos neurônios em diversas populações de células dentro do sistema nervoso em formação morre. Pensa-se que este é um mecanismo que adequa números de neurônios a estabilizarem a apropriada densidade de inervação com órgãos efetores ou outras populações neuronais. E várias instâncias, a mira de inervação de uma população de neurônios tem sido mostrada por ter um papel crucial na regulação de neurônios sobreviventes. Alvos de inervação neuronal produzem um limitado suprimento de fatores neurotróficos, e a competição entre os neurônios respondedores a estes fatores determina qual neurônio sobreviverá. Em adoção ao fator de crescimento do nervo (NGF;162030), o BDNF tem sido purificado a mostrado in vivo por reduzir a quantidade de morte celular neuronal ocorrendo naturalmente em porções do sistema nervoso periférico (Hofer e Barde, 1988). A despolarização da membrana dispara a fosforilação dependente de cálcio e a liberação da MECP2 do promotor III do BDNF, dessa forma facilitando a transcrição. Chen e outros (2003) concluíram que a MECP2 atua num papel chave no controle da atividade neuronal dependente da regulação do gene e que a desregulação desse processo pode apoiar a patologia da síndrome de Rett (312750).

Martinowich e outros (2003) relataram que o aumento na síntese do BDNF em neurônios do camundongo após a despolarização correlaciona-se com uma diminuição na metilação da CpG dentro da região regulatória do gene BDNF. Além disso, a transcrição aumentada do BDNF envolve a dissociação do complexo de repressão MECP2-desacetilase de histona-Sin3A do seu promotor. (Sin3A; 607776 - Obs.: Complexos protéicos contendo SIN3A atuam como co-repressores dependentes da desacetilase de histona (veja HDAC1;601241). A SIN3A atua contém múltiplos domínios de interação proteína-proteína e serve como uma estrutura na qual o complexo co-repressor se reúne (Fleischer e outros, 2003). Martinowich e outros (2003) concluíram que o remodelamento da cromatina relacionado à metilação do DNA é importante para a regulação da atividade dependente do gene que pode ser crítica para a plasticidade neural.

Martinowich e outros (2003) propuseram um modelo no qual a metilação do DNA e seu relacionado remodelamento da cromatina atual em papéis críticos na regulação da transcrição do gene em resposta à atividade neuronal. A metilação CpG em qualquer sítio crítico pode aumentar a probabilidade de ligação da MECP2, a qual pode recrutar desacetilases de histona e a H3-K9 metiltransferase para mediar o remodelamento da cromatina inativa, ou pode diretamente induzir a compactação da cromatina para reprimir a expressão do gene.


Em embriões Xenopus, Stancheva e outros (2003) descobriram que a Mecp2 com o truncamento R168X (de Arg para ter. Pode ser de Arg [caa para fim taa, ou de arg aga para fim tga]?) não foi capaz de interagir com o complexo Smrt (NCOR2;600848: Co-repressor de receptor nuclear. O silenciamento transcricional mediado por receptores nucleares é importante no desenvolvimento, diferenciação e oncogênese. O mecanismo que dá suporte esse efeito é uma chave para o entendimento das bases moleculares da ação hormonal. Chen e Evans (1995) identificaram um fator de interação a receptor, o qual eles designaram SMRT, como um mediador de silenciamento (co-repressor) para receptores de hormônio da tiróide e retinóides (derivados de ácido retinóico)) ou ativar completamente a Hiry2a, um repressor neuronal regulado pela Notch, durante a neurogênese primária. Esse rompimento da atividade da Mecp2 resultou no padrão anormal dos neurônios primários durante a diferenciação neuronal.
Expressando cDNAs de roedores em células embrionárias de rim human, Kimura e Shiota (2003) mostraram que a Dnmt1 interagia diretamente com a Mecp2. A Dnmt1 formou complexos com as HDAC bem como com a Mecp2, mas a interação de Mecp2 com a Dnmt1 não ligava-se à Hdac1. A Mecp2 pode formar complexos com DNA fartamente metilado e semi-metilado. Os complexos de Mecp2 imunopreciptados mostraram a atividade da metiltransferase no DNA semi-metilado. Kimura e Shiota (2003) concluíram que a DNMT1 associa-se à MECP2 de modo a desempenhar a manutenção da metilação durante a divisão celular.

Georgel e outros (2003) usaram criomicroscopia e tomografia de microscópio eletrônico para caracterizar complexos formados entre a MECP2 humana recombinante e 12-mer séries nucleossômicas (séries de 12 nucleossomos? Obs.: Nucleossomo é cada unidade de histona enrolada pela fita de DNA). Em taxas molares de perto de uma MECP2 por nucleossomo, a ligação de MECP2 converteu a extensão da série de nucleossomos em estruturas compactadas de 60S elipsoidais. Em taxas molares de mais de um MECP2 por nucleossoma, as partículas 60S reuniram-se em supra-estruturas oligoméricas morfologicamente definidas. A habilidade da MECP2 para mediar a compactação da cromatina não requer seu MBD. Georgel e outros (2003) concluíram que a MECP2 é uma proteína de condensação da cromatina que media a reunião de novas estruturas secundárias da cromatina ( obs.: o dobramento da cromatina em estruturas secundárias).

Harikrishnan e outros (2005) descobriram que a BRM (SMARCA2;600014) associou-se com a MECP2 nos fibroblastos do camundongo e em células de leucemia linfoblástica T humanas, e a associação era funcionalmente relacionada com a repressão. A metilação do promotor especificou o recrutamento da MECP2 e da BRM, e a inibição da metilação causou sua liberação. O complexo co-repressor MECP2-BRM foi recrutado diretamente para o gene FMR1 (omim 309550 - Xq27.3 : A proteina de ligação seletiva a RNA FMRP forma um complexo ribonucleoproteico mensageiro que se associa com poli-ribossomos, sugerindo que ela esteja envolvida na tradução (Jin e outros, 2004). O gene FMR1 está mutado na syndrome mental do X frágil (300624) e na syndrome de ataxia (incapacidade de controlar o movimento muscular voluntário (tremor) (FXTAS; 300623))., e a deleção somática em células de X frágil aliviou a repressão. Harikrishnan e outros (2005) concluíram que ambos a MECP2 e o complexo SWI/SNF estão envolvidos na repressão dos genes.

Klose e outros (2005) descobriram que sítios genômicos ocupados pela MECP2 e pela MBD2 (603547) eram principalmente mutuamente exclusivos. A MBD2 era capaz de colonizar sítios vagos pela depleção da MECP2, mas o inverso não ocorre. A seleção artificial de sítios de ligação da MECP2 “in vitro” demonstrou que a MECP2 requereu uma corrida de A/T de quatro ou mais pares de bases adjacentes ao grupo metil-CpG para a ligação eficiente ao DNA. Klose e outros (2005) concluíram que o metil-CpG é necessário, mas não é o suficiente para a ligação da MECP2.

Nan e outros (2007) descobriram que a MECP2 interage com a STRX (300032), uma DNA helicase/ATPase que está mutada na síndrome do retardamento mental/alfa-talassemia (301040). Estudos em células cultivadas de camundongos mostraram que a MECP2 mirou o domínio C terminal helicase da ATRX para focos da heterocromatina. A localização da ATRX na heterocromatina foi atrapalhada em neurônios de camundongos nulos para Mecp2. Os achados sugerem que o rompimento da interação entre a MECP2 e a ATRX leva à alterações patológicas que contribuem para o retardamento mental.

Schule e outros (2007) descobriram que células linfoblastóides e células do cérebro de pacientes com mutações em MECP2 mostraram impressão normal dos genes gravados PEG3 (601483) e PEG10 (609810), indicando que a proteína MECP2 não é necessária para que a impressão normal ocorra.

Chahrour e outros (2008) examinaram padrões de expressão do gene no hipotálamo de camundongos que ou careciam ou expressavam demais a MECP2. Em ambos os modelos, a disfunção da MECP2 induziu mudanças nos níveis de expressão de centenas de genes, mas como esperado, a maioria dos genes (aproximadamente 85%) pareceu ser ativada pela MECP2. Chahrour e outros (2008) então, selecionaram 6 genes, SST (182450), OPRK1 (165196), MEF2C (600662), GAMT (601240), GPRIN1 (611239), e A2BP1 (605104), e confirmaram que a MECP2 liga-se a seus promotores. Além disso, Chahrour e outros (2008) mostraram que a MECP2 associa-se com o ativador ranscricional CREB1 (123810) no promotor de um alvo ativado, mas não a um alvo reprimido. Chahrour e outros (2008) concluíram que seus estudos sugeriram que a MECP2 regula a expressão de uma ampla escala de genes no hipotálamo e que ela pode funcionar como um ativador ou como um repressor da transcrição.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=300005